CN101857840A - 用于降解石油的生物菌群悬浮剂及其制备和应用方法 - Google Patents
用于降解石油的生物菌群悬浮剂及其制备和应用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101857840A CN101857840A CN201010170964A CN201010170964A CN101857840A CN 101857840 A CN101857840 A CN 101857840A CN 201010170964 A CN201010170964 A CN 201010170964A CN 201010170964 A CN201010170964 A CN 201010170964A CN 101857840 A CN101857840 A CN 101857840A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- genus bacillus
- bacteria suspension
- bacillus
- suspending agent
- flora
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种生物降解处理技术领域的用于降解石油的生物菌群悬浮剂及其制备和应用方法，由1～2体积份的DQ5芽孢杆菌菌悬液、1体积份的DQ10芽孢杆菌菌悬液、1～2体积份的DQ11肠杆菌菌悬液、1体积份的DQ16芽孢杆菌菌悬液、0.5-1体积份的DQ26芽孢杆菌菌悬液、1体积份的DQ62芽孢杆菌菌悬液以及0.5-1体积份的DQ85芽孢杆菌菌悬液组成。本发明与单一菌株相比具有更高的降解效率，构建方法简单，容易控制，重复性好，且选用菌株易于培养。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物降解处理技术领域的悬浮剂及其制备和应用方法，具体是一种用于降解石油的生物菌群悬浮剂及其制备和应用方法。
背景技术
石油是重要的能源和化工资源。随着现代化工业的发展，对石油的需求日益增加。现在世界每年石油产量为30多亿吨，而在开采运输、炼制和使用过程中，由于种种原因，石油泄漏及其废弃物造成对土壤和水资源造成了严重污染。特别是近几十年来海底油田的发现和开采以及油轮事故的频发，对海洋产生了严重的污染。大庆油田和华北油田采油井周边土壤石油污染严重，含油量在4.8×104～7.7×104mg·kg-1。大庆油田石油开发区污染土壤面积超过75％，农业开发区污染面积超过20％。我国每年排入大海的石油达11.5万吨，并且呈增长趋势。目前，我国近海海域石油平均浓度已达0.055mg/L。泄漏石油以及炼化过程中产生的油泥、含油废水等废弃物进入土壤造成土壤生态系统结构与功能的破坏，从而毒害植物生长，破坏地表植被，造成粮食减产；同时渗透进入地下水，对水体造成严重污染。石油污染海洋后可以通过食物链在人体内富集对人类健康造成严重危害，同时，石油污染物进入海洋会对水生生物的生长、发育、繁殖及整个生态系统产生巨大破坏，如Exxon公司的Valdez号沉船事故在4个月里造成多达30,000只的海鸟死亡。石油污染使得渔业资源逐步衰退，造成巨大经济损失。
目前，石油污染问题已经成为世界各国普遍关注的问题。然而现有的对石油污染的物理化学方法，如海上流出油的治理技术：1)油障；2)油船回收；3)油的吸附材料；4)油处理剂，和陆地流出油处理技术：1)防油堤；2)挡油堤等等，均不能彻底治理石油污染，并且容易引起二次污染。
微生物修复技术由于其成本低、操作简便、无二次污染、治理彻底等优势越来越受到各国研究者的重视。目前，国内外已经分离筛选出大量的石油降解菌株，但是由于地理因素、气候因素、菌株降解底物限制以及石油组分的复杂性等各种因素的影响，单一菌株只能降解石油组分中的一种或者部分组分，难以达到彻底修复的要求。而混合菌群由于代谢多样性和降解过程中的协同作用，在石油污染的修复过程中能表现出极大优势，已成为近年来研究的热点。
经过对现有技术的检索发现，Ye S，Huang L，Yao O，Ding M，Hu Y，Ding D(2005)Investigation on bioremediation of oil-polluted wetland at Liaodong Bay in northeast China.Appl.Microbiol.Biotechnol.71：543-548.(中国东北辽东海湾油污染湿地生物修复研究 应用微生物学与生物技术71：543-548)中记载了一个由不动杆菌，假单胞菌和无色杆菌三种细菌组成的人工菌群(Ye et al.2005)。
进一步检索发现，Juteau P，Bisaillon J，Lépine F，Ratheau V，Beaudet R，Villemur R(2003)Improving the biotreatment of hydrocarbons-contaminated soils by addition of activated sludgetaken from the wastewater treatment facilities of an oil refinery.Biodegradation 14：31-40.(添加炼油厂废水处理设备中的活性污泥对烃污染土壤修复的促进作用。生物降解14：31-40.)中记载了一个天然菌群对原油的降解(Juteau et al.2003)。但是该现有技术涉及的菌群降解速率较低，而且天然菌群在扩增和传代过程中难以保证菌群的稳定性。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于降解石油的生物菌群悬浮剂及其制备和应用方法，与单一菌株相比具有更高的降解效率，构建方法简单，容易控制，重复性好，且选用菌株易于培养。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种用于降解石油的生物菌群悬浮剂，由1～2体积份的DQ5芽孢杆菌菌悬液、1体积份的DQ10芽孢杆菌菌悬液、1～2体积份的DQ11肠杆菌菌悬液、1体积份的DQ16芽孢杆菌菌悬液、0.5-1体积份的DQ26芽孢杆菌菌悬液、1体积份的DQ62芽孢杆菌菌悬液以及0.5-1体积份的DQ85芽孢杆菌菌悬液组成。
所述的DQ5芽孢杆菌菌悬液、DQ10芽孢杆菌菌悬液、DQ11肠杆菌菌悬液、DQ16芽孢杆菌菌悬液、DQ26芽孢杆菌菌悬液、DQ62芽孢杆菌菌悬液以及DQ85芽孢杆菌菌悬液的OD620nm为10～12。
所述的DQ5芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5CCTCC M 2010078的菌悬液；
所述的DQ10芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10CCTCC M 2010079的菌悬液；
所述的DQ11肠杆菌菌悬液为肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11CCTCC M 2010084的菌悬液；
所述的DQ16芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16CCTCC M 2010080的菌悬液；
所述的DQ26芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M 2010081的菌悬液；
所述的DQ62芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62CCTCC M 2010082的菌悬液；
所述的DQ85芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85CCTCC M 2010083的菌悬液；
上述菌株均已于2010年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码：430072。
本发明涉及上述用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，通过将芽孢杆菌及肠杆菌分别单独进行斜面培养得到菌体后依次经一级种子培养、扩大培养和菌体收集得到芽孢杆菌及肠杆菌对应的二级种子菌体悬浮液并配置成用于降解石油的生物菌群悬浮剂。
所述的芽孢杆菌及肠杆菌包括：芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5CCTCC M 2010078、芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10CCTCC M 2010079、肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11CCTCCM 2010084、芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16CCTCC M 2010080、芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M 2010081、芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62CCTCC M 2010082和芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85CCTCC M 2010083。
所述的斜面培养是指：在30±1℃环境下将芽孢杆菌及肠杆菌培养于LB固体斜面培养基中18～24小时得到菌体；
所述的LB固体斜面培养基通过以下方式获得：配制10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl，余量为蒸馏水，然后加入16g/L的琼脂粉，最后在121℃条件下灭菌20分钟得到LB固体斜面培养基。
所述的一级种子培养是指：将菌体在无菌条件下用接种环接1～4环于100mL LB液体培养基中并进行振荡培养，得到一级种子菌体。
所述的振荡培养是指：在30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期；
所述的扩大培养是指：以体积比为5％～8％的接种量，将一级种子培养后的菌体置于1000mL LB液体培养基中，在30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期；
所述的LB液体培养基的组分为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L的NaCl溶液，余量为蒸馏水。
所述的菌体收集是指：在5000转/分条件下离心8分钟后收集扩大培养后的菌体，并用生理盐水洗涤3～4次，最后用生理盐水重新配成OD620nm达到10～12之间的二级种子菌体悬浮液；
所述的配置成人工构建菌群是指：将芽孢杆菌及肠杆菌对应的二级种子菌体悬浮液混合后得到用于降解石油的生物菌群悬浮剂。
本发明涉及上述用于降解石油的生物菌群悬浮剂的应用方法，将人工构建菌群按照体积比5％～10％的接种量接入含石油100g/L的无机盐培养基中，在25～35℃条件下搅拌处理10～12天实现降解。
所述的无机盐培养基通过以下方式制备得到：配置KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 4g/L、NH4Cl 1g/L以及质量百分比为1％的CaCl2 2mL、质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2mL、质量百分比为1％的FeCl3200μL、维生素混合液200μL、离子混合液5mL以及1L蒸馏水，然后置于121℃条件下灭菌20分钟。
所述的离子混合液的组分及其含量为：ZnCl2 0.5g/L、FeCl2 0.5g/L、MnCl2·4H2O 0.5g/L、Na2MoO4·2H2O 0.1g/L、CuCl2·2H2O 0.05g/L、Na2WO4·2H2O 0.05g/L、HCl 120mmol/L，余量为蒸馏水。
所述的维生素混合液的组分及其含量为：400mg/L泛酸钙(Calcium pantothenate)、200mg/L肌醇(Inositol)、400mg/L尼克酸/烟酸(Niacin)、400mg/L VB6(Pyridoxinehydrochloride)、200mg/L对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)、0.5mg/L VB12(Cyanocobalamin)，余量为蒸馏水。
上述生物菌群悬浮剂对含石油10％(100g/L)的水体中原油降解率达到87.5％。而单一菌株对原油降解率仅为10％～64％，显示人工构建菌群降解原油效率明显高于单一菌株。对处理过程中各菌株存活利用变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturinggradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)分析表明各菌株在处理过程中稳定存在。
本发明的显著效果及优点在于：
(1)人工构建的菌群降解效率明显高于单一菌株，避免了单一菌株处理能力的局限；
(2)不同于活性污泥和氧化塘等驯化菌群，本发明构建的人工菌群结构简单，容易控制，重复性好，且选用菌株易于培养。
(3)经PCR-DGGE实验证明上述人工构建菌群在处理过程中各菌株稳定存活，表明了该人工构建菌群的稳定性。
总之，应用本发明所述人工构建菌群在含石油废水的处理中具有很大的应用潜力。
附图说明
图1人工构建菌群及组成菌群的各单一菌株对原油的降解。
其中：A，人工构建菌群处理石油废水过程原油降解曲线。(-■-)人工构建菌群对原油的降解；(-□-)未接菌对照中原油含量；B，组成菌群的单一菌株对原油降解率。
图2PCR-DGGE图谱检测废水处理过程中的菌群动态变化。
其中：泳道0d，处理前菌群结构图谱；泳道1d，处理1天后菌群结构图谱；泳道3d，处理3天后菌群结构图谱图谱；泳道5d，处理5天后菌群结构图谱图谱；泳道7d，处理7天后菌群结构图谱图谱；泳道10d，处理10天后菌群结构图谱图谱。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
人工构建菌群对石油废水的处理
选取芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5CCTCC M 2010078，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10CCTCC M 2010079，肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11CCTCC M 2010084，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16CCTCC M 2010080，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M2010081，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62CCTCC M 2010082以及芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85CCTCC M 2010083菌株分别进行如下操作：
(1)斜面培养：将上述各菌株接种于LB固体斜面培养基上，30±1℃培养菌体18～24小时；
(2)一级种子培养：将步骤(1)培养的菌体，无菌条件下用接种环接1～4环于100mLLB液体培养基中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期，制得一级种子；
(3)扩大培养：以体积比为5％～8％的接种量，接一级种子于1000mL LB液体培养基中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期，制得二级种子；
(4)收集菌体：在5000转/分条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3～4次；之后用生理盐水重新配成OD620nm达到10～12之间的菌悬液，备用；
(5)构建人工菌群：以体积比计，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5CCTCC M 2010078∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10CCTCC M 2010079∶肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11CCTCC M 2010084∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16CCTCC M 2010080∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M 2010081∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62CCTCC M2010082∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85CCTCC M 2010083为2∶1∶2∶1∶0.5∶1∶0.5的比例将步骤(4)制得的菌液混合，构建人工菌群；
(6)人工菌群处理石油废水：将构建的人工菌群按照体积比5％～10％的接种量接入含原油10％(100g/L)的无机盐培养基中。在25～35℃条件下搅拌处理10天，以未接菌的含油废水作为对照。
(7)处理结束后，分别用等体积正己烷、二氯甲烷和氯仿萃取，合并有机相，室温下氮气吹至恒重。重量法计算原油降解率为87.5％(见图1A)。
上述无机盐培养基，其配方为：
1L蒸馏水含有：KH2PO4 0.5g，K2HPO4 4g，NH4Cl 1g，质量百分比为1％的CaCl22mL，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2mL，质量百分比为1％的FeCl3 200μL，维生素混合液200μL，离子混合液5mL。121℃条件下灭菌20分钟。
上述的离子混合液的配方为，1L蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，1L蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培养基配方如下，1L蒸馏水中含：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，121℃条件下灭菌20分钟。
实施例2
人工构建菌群对石油废水的处理
选取芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5CCTCC M 2010078，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10CCTCC M 2010079，肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11CCTCC M 2010084，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16CCTCC M 2010080，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M2010081，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62CCTCC M 2010082以及芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85CCTCC M 2010083菌株分别进行如下操作：
(1)斜面培养：将上述各菌株接种于LB固体斜面培养基上，30±1℃培养菌体18～24小时；
(2)一级种子培养：将步骤(1)培养的菌体，无菌条件下用接种环接1～4环于100mLLB液体培养基中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期，制得一级种子；
(3)扩大培养：以体积比为5％～8％的接种量，接一级种子于1000mL LB液体培养基中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期，制得二级种子；
(4)收集菌体：在5000转/分条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3～4次；之后用生理盐水重新配成OD620nm达到10～12之间的菌悬液，备用；
(5)构建人工菌群：以体积比计，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5CCTCC M 2010078∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10CCTCC M 2010079∶肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11CCTCC M 2010084∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16CCTCC M 2010080∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M 2010081∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62CCTCC M2010082∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85CCTCC M 2010083为1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例将步骤(4)制得的菌液混合，构建人工菌群；
(6)人工菌群处理石油废水：将构建的人工菌群按照体积比5％～10％的接种量接入含原油10％(100g/L)的无机盐培养基中。在25～35℃条件下搅拌处理7天，以未接菌的含油废水作为对照。
(7)处理结束后，分别用等体积正己烷、二氯甲烷和氯仿萃取，合并有机相，室温下氮气吹至恒重。重量法计算原油降解率为77.6％。
上述无机盐培养基，其配方为：
1L蒸馏水含有：KH2PO4 0.5g，K2HPO4 4g，NH4Cl 1g，质量百分比为1％的CaCl22mL，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2mL，质量百分比为1％的FeCl3200μL，维生素混合液200μL，离子混合液5mL。121℃条件下灭菌20分钟。
上述的离子混合液的配方为，1L蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，1L蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培养基配方如下，1L蒸馏水中含：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，121℃条件下灭菌20分钟。
实施例3
单一菌株对石油废水的处理
选取芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5CCTCC M 2010078，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10CCTCC M 2010079，肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11CCTCC M 2010084，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16CCTCC M 2010080，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M2010081，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62CCTCC M 2010082以及芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85CCTCC M 2010083菌株分别进行如下操作：
(1)斜面培养：将上述各菌株接种于LB固体斜面培养基上，30±1℃培养菌体18～24小时；
(2)一级种子培养：将步骤(1)培养的菌体，无菌条件下用接种环接1～4环于100mLLB液体培养基中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期，制得一级种子；
(3)扩大培养：以体积比为5％～8％的接种量，接一级种子于1000mL LB液体培养基中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期，制得二级种子；
(4)收集菌体：在5000转/分条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3～4次；之后用生理盐水重新配成OD620nm达到10～12之间的菌悬液，备用；
(5)单一菌株处理石油废水：将单一菌株的菌悬液按照体积比5％～10％的接种量接入含原油10％(100g/L)的无机盐培养基中。在25～35℃条件下搅拌处理10天，以未接菌的含油废水作为对照。
(7)处理结束后，分别用等体积正己烷、二氯甲烷和氯仿萃取，合并有机相，室温下氮气吹至恒重。重量法计算原油降解率为10％～64％(图1B)。
上述无机盐培养基，其配方为：
1L蒸馏水含有：KH2PO4 0.5g，K2HPO4 4g，NH4Cl 1g，质量百分比为1％的CaCl22mL，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2mL，质量百分比为1％的FeCl3200μL，维生素混合液200μL，离子混合液5mL。121℃条件下灭菌20分钟。
上述的离子混合液的配方为，1L蒸馏水含有：ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，1L蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培养基配方如下，1L蒸馏水中含：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，121℃条件下灭菌20分钟。
实施例4
PCR-DGGE检测处理废水过程中菌群的动态变化
选取芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5CCTCC M 2010078，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10CCTCC M 2010079，肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11 CCTCC M 2010084，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16CCTCC M 2010080，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M2010081，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62 CCTCC M 2010082以及芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85CCTCC M 2010083菌株分别进行如下操作：
(1)斜面培养：将上述各菌株接种于LB固体斜面培养基上，30±1℃培养菌体18～24小时；
(2)一级种子培养：将步骤(1)培养的菌体，无菌条件下用接种环接1～4环于100mLLB液体培养基中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期，制得一级种子；
(3)扩大培养：以体积比为5％～8％的接种量，接一级种子于1000mL LB液体培养基中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期，制得二级种子；
(4)收集菌体：在5000转/分条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3～4次；之后用生理盐水重新配成OD620nm达到10～12之间的菌悬液，备用；
(5)构建人工菌群：以体积比计，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5 CCTCC M 2010078∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10 CCTCC M 2010079∶肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11CCTCC M 2010084∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16CCTCC M 2010080∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M 2010081∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62CCTCC M2010082∶芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85CCTCC M 2010083为2∶1∶2∶1∶0.5∶1∶0.5的比例将步骤(4)制得的菌液混合，构建人工菌群；
(6)人工菌群处理石油废水：将构建的人工菌群按照体积比5％～10％的接种量接入含原油10％(100g/L)的无机盐培养基中。在25～35℃条件下搅拌处理10天。
(7)分别在0、1、3、5、7、10天取样，提取菌群基因组，polymerase chain reaction(PCR)扩增16S rDNA序列V3区，进行PCR-DGGE分析。
PCR-DGGE分析(图2)表明上述人工构建菌群的各菌株在废水处理过程中稳定存在，表明了上述人工构建菌群具有很好的稳定性，具有重大实际应用潜力。
上述无机盐培养基，其配方为：
1L蒸馏水含有：KH2PO4 0.5g，K2HPO4 4g，NH4Cl 1g，质量百分比为1％的CaCl22mL，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2mL，质量百分比为1％的FeCl3200μL，维生素混合液200μL，离子混合液5mL。121℃条件下灭菌20分钟。
上述的离子混合液的配方为，1L蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，1L蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。上述LB培养基配方如下，1L蒸馏水中含：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，121℃条件下灭菌20分钟。
Claims (16)
1.一种用于降解石油的生物菌群悬浮剂，其特征在于，由1～2体积份的DQ5芽孢杆菌菌悬液、1体积份的DQ10芽孢杆菌菌悬液、1～2体积份的DQ11肠杆菌菌悬液、1体积份的DQ16芽孢杆菌菌悬液、0.5-1体积份的DQ26芽孢杆菌菌悬液、1体积份的DQ62芽孢杆菌菌悬液以及0.5-1体积份的DQ85芽孢杆菌菌悬液组成。
2.根据权利要求1所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂，其特征是，所述的DQ5芽孢杆菌菌悬液、DQ10芽孢杆菌菌悬液、DQ11肠杆菌菌悬液、DQ16芽孢杆菌菌悬液、DQ26芽孢杆菌菌悬液、DQ62芽孢杆菌菌悬液以及DQ85芽孢杆菌菌悬液的OD620nm为10～12。
3.根据权利要求1所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂，其特征是，所述的DQ5芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5 CCTCC M 2010078的菌悬液；所述的DQ10芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10 CCTCC M 2010079的菌悬液；所述的DQ11肠杆菌菌悬液为肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11 CCTCC M 2010084的菌悬液；所述的DQ16芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16 CCTCC M 2010080的菌悬液；所述的DQ26芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26 CCTCC M 2010081的菌悬液；所述的DQ62芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62 CCTCC M 2010082的菌悬液；所述的DQ85芽孢杆菌菌悬液为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ85 CCTCC M 2010083的菌悬液。
4.一种根据权利要求1所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，其特征在于，通过将芽孢杆菌及肠杆菌分别单独进行斜面培养得到菌体后依次经一级种子培养、扩大培养和菌体收集得到芽孢杆菌及肠杆菌对应的二级种子菌体悬浮液并配置成用于降解石油的生物菌群悬浮剂。
5.根据权利要求4所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，其特征是，所述的芽孢杆菌及肠杆菌包括：芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ5 CCTCC M 2010078、芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ10 CCTCC M 2010079、肠杆菌(Enterobacter sp.)DQ11 CCTCC M2010084、芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ16 CCTCC M 2010080、芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ26CCTCC M 2010081、芽孢杆菌(Bacillus sp.)DQ62 CCTCC M 2010082和芽孢杆菌(Bacillussp.)DQ85 CCTCC M 2010083。
6.根据权利要求4所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，其特征是，所述的斜面培养是指：在30±1℃环境下将芽孢杆菌及肠杆菌培养于LB固体斜面培养基中18～24小时得到菌体。
7.根据权利要求6所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，其特征是，所述的LB固体斜面培养基通过以下方式获得：配制10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl，余量为蒸馏水，然后加入1.6g/L的琼脂粉，最后在121℃条件下灭菌20分钟得到LB固体斜面培养基。
8.根据权利要求4所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，其特征是，所述的一级种子培养是指：将菌体在无菌条件下用接种环接1～4环于100mL LB液体培养基中。
9.根据权利要求4所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，其特征是，所述的振荡培养是指：在30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期。
10.根据权利要求4所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，其特征是，所述的扩大培养是指：以体积比为5％～8％的接种量，将一级种子培养后的菌体置于1000mLLB液体培养基中，在30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养12～18小时至对数生长期中期。
11.根据权利要求4所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，其特征是，所述的菌体收集是指：在5000转/分条件下离心8分钟后收集扩大培养后的菌体，并用生理盐水洗涤3～4次，最后用生理盐水重新配成OD620nm达到10～12之间的二级种子菌体悬浮液。
12.根据权利要求4所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的制备方法，其特征是，所述的配置成人工构建菌群是指：将芽孢杆菌及肠杆菌对应的二级种子菌体悬浮液混合后得到用于降解石油的生物菌群悬浮剂。
13.一种根据权利要求1所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的应用方法，其特征在于，将人工构建菌群按照体积比5％～10％的接种量接入含石油100g/L的无机盐培养基中，在25～35℃条件下搅拌处理10～12天实现降解。
14.根据权利要求13所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的应用方法，其特征是，所述的无机盐培养基通过以下方式制备得到：配置KH2PO40.5g/L、K2HPO44g/L、NH4Cl1g/L以及质量百分比为1％的CaCl22mL、质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2mL、质量百分比为1％的FeCl3200μL、维生素混合液200μL、离子混合液5mL以及1L蒸馏水，然后置于121℃条件下灭菌20分钟。
15.根据权利要求13所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的应用方法，其特征是，所述的离子混合液的组分及其含量为：ZnCl20.5g/L、FeCl20.5g/L、MnCl2·4H2O0.5g/L、Na2MoO4·2H2O 0.1g/L、CuCl2·2H2O 0.05g/L、Na2WO4·2H2O 0.05g/L、HCl 120mmol/L，余量为蒸馏水。
16.根据权利要求13所述的用于降解石油的生物菌群悬浮剂的应用方法，其特征是，所述的维生素混合液的组分及其含量为：400mg/L泛酸钙、200mg/L肌醇、400mg/L尼克酸/烟酸、400mg/L VB6、200mg/L对氨基苯甲酸、0.5mg/L VB12，余量为蒸馏水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010170964 CN101857840B (zh) | 2010-05-12 | 2010-05-12 | 用于降解石油的生物菌群悬浮剂及其制备和应用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010170964 CN101857840B (zh) | 2010-05-12 | 2010-05-12 | 用于降解石油的生物菌群悬浮剂及其制备和应用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101857840A true CN101857840A (zh) | 2010-10-13 |
| CN101857840B CN101857840B (zh) | 2013-02-27 |
Family
ID=42944002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010170964 Active CN101857840B (zh) | 2010-05-12 | 2010-05-12 | 用于降解石油的生物菌群悬浮剂及其制备和应用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101857840B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102659252A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-09-12 | 山东大学 | 一种处理含石油废水的方法 |
| CN102730904A (zh) * | 2012-05-10 | 2012-10-17 | 上海交通大学 | 一种高含聚采油污水的生物处理方法 |
| CN103833182A (zh) * | 2014-02-20 | 2014-06-04 | 上海交通大学 | 一种采油污水的生物处理方法及设备 |
| CN106698678A (zh) * | 2017-01-13 | 2017-05-24 | 江苏大学 | 芽孢杆菌在降解芳香族化合物中的应用 |
| CN110846248A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-02-28 | 天津大学 | 一种用于多环芳烃降解的人工混菌体系及其应用方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101603018A (zh) * | 2009-07-07 | 2009-12-16 | 南开大学 | 降解石油、修复石油污染土壤生态菌制剂及其制备方法 |
-
2010
- 2010-05-12 CN CN 201010170964 patent/CN101857840B/zh active Active
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102730904A (zh) * | 2012-05-10 | 2012-10-17 | 上海交通大学 | 一种高含聚采油污水的生物处理方法 |
| CN102659252A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-09-12 | 山东大学 | 一种处理含石油废水的方法 |
| CN103833182A (zh) * | 2014-02-20 | 2014-06-04 | 上海交通大学 | 一种采油污水的生物处理方法及设备 |
| CN103833182B (zh) * | 2014-02-20 | 2015-12-09 | 上海交通大学 | 一种采油污水的生物处理方法及设备 |
| CN106698678A (zh) * | 2017-01-13 | 2017-05-24 | 江苏大学 | 芽孢杆菌在降解芳香族化合物中的应用 |
| CN110846248A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-02-28 | 天津大学 | 一种用于多环芳烃降解的人工混菌体系及其应用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101857840B (zh) | 2013-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yuan et al. | Synergistic degradation of crude oil by indigenous bacterial consortium and exogenous fungus Scedosporium boydii | |
| Shukla et al. | Bioremediation: developments, current practices and perspectives | |
| Popp et al. | Bacterial diversity in the active stage of a bioremediation system for mineral oil hydrocarbon-contaminated soils | |
| Tam et al. | Effectiveness of bacterial inoculum and mangrove plants on remediation of sediment contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons | |
| CN103981119B (zh) | 含油污泥中石油高效降解菌及菌组的应用 | |
| CN103215204B (zh) | 高效降解菲的节杆菌菌株及其应用 | |
| CN101857840B (zh) | 用于降解石油的生物菌群悬浮剂及其制备和应用方法 | |
| CN104388328B (zh) | 降解5环和6环多环芳烃的菌株及其获取方法、应用 | |
| JP2008528029A (ja) | 扱い難い有機物および重金属の汚染修復のための界面活性生体触媒 | |
| Al-Dossary et al. | Biodegradation of crude oil using Aspergillus species | |
| CN104745506A (zh) | 一株石油烃降解菌及其应用 | |
| CN101972774A (zh) | 受油污污染湿地的微生物修复方法 | |
| CN110669692A (zh) | 一种稠油降粘降解混合菌剂的制备方法及应用方法 | |
| Asadirad et al. | Effects of indigenous microbial consortium in crude oil degradation: a microcosm experiment | |
| CN104046580B (zh) | 用于降解多环芳烃类有机污染物的鞘氨醇杆菌菌株及其应用 | |
| JP2003102469A (ja) | 油分分解菌およびその菌株を用いた油分分解方法 | |
| CN104745515A (zh) | 一种降解多环芳烃的不动杆菌及其应用 | |
| Parreira et al. | Microbial biodegradation of aromatic compounds in a soil contaminated with gasohol | |
| Conlon et al. | Ecopiling: Beneficial Soil Bacteria, Plants, and Optimized Soil Conditions for Enhanced Remediation of Hydrocarbon Polluted Soil | |
| Hassanshahian et al. | Degradation of naphthalene by bacterial isolates from the Gol Gohar Mine, Iran | |
| CN104673683B (zh) | 一株耐盐多环芳烃降解菌Tzyjm及其在海洋污染环境中的应用 | |
| Kern et al. | Characterization of methyl tert-butyl ether-degrading bacteria from a gasoline-contaminated aquifer | |
| CN102659252A (zh) | 一种处理含石油废水的方法 | |
| Akinsanola et al. | Bioremediation of Soils Contaminated with Both Petroleum Hydrocarbons and Heavy Metals | |
| CN104099266B (zh) | 用于降解多环芳烃类有机污染物的无色杆菌菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |