CN101856368A

CN101856368A - 鳄胆素及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101856368A
Application number: CN201010192702A
Authority: CN
Inventors: 陈清西; 熊佑熊; 邱乒乒; 康劲翮; 张剑; 李华亮; 张祥盛
Original assignee: TAILAND SRIRACHA TIGER ZOO CO Ltd; Xiamen University
Current assignee: Fujian Tuo dragon industry limited liability company
Priority date: 2010-06-07
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2030-06-07
Also published as: CN101856368B

Abstract

鳄胆素及其制备方法与应用，涉及一种鳄鱼产品。提供鳄胆素及其制备方法和鳄胆素在制备抗肿瘤药物中的应用。将暹罗鳄鳄鱼胆去除胆囊壁，得胆汁混合物；在胆汁混合物中加入生理盐水，搅拌抽提，离心后，取上清，过滤，得鳄胆素；或将暹罗鳄鳄鱼胆去除胆囊壁，得胆汁混合物；在胆汁混合物中加入乙醇，浸渍，提取，合并提取液，旋转蒸发仪真空蒸发、浓缩至无醇味，得乙醇提取物浸膏；将乙醇提取物浸膏用水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种有机溶剂，进行萃取分离，将萃取液真空浓缩去除有机溶剂，得鳄胆素。所制备的鳄胆素是一种具有抗肿瘤功效的活性物质，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

鳄胆素及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种鳄鱼产品，尤其是涉及一种鳄胆素及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症，医学术语亦称恶性肿瘤，中医学中称岩，是控制细胞生长增殖机制失常，组织和器官异常增生、弱化或丧失应有功能所致的一种古老的疾病。在中国，癌症已经成为死亡率最高的疾病，取代了心血管疾病成为危害人类生命的“头号杀手”。据世界卫生组织统计，每年世界有1100万人患上癌症，而死于癌症人数约600万，占全球死亡人数的12％。中国癌症发病占全球的20.3％，每年新增癌症患者220万，死亡140万，平均每3分钟就有1.3人死于癌症，而且癌症的发病率呈急剧上升的趋势。随着生命科学的迅猛发展和癌症研究的不深入，寻找高效抗肿瘤药物已成为人类攻克癌症最重要的课题之一。自从20世纪40年代应用第一个抗肿瘤药物——氮芥成功地治疗恶性淋巴瘤以来，抗肿瘤药物的研究已取得了很大的发展。现今临床应用的绝大多数化疗药物属细胞毒类，针对不同的作用靶点，通过抑制细胞生长、繁殖、诱导细胞分化、凋亡等达到治疗肿瘤的目的。目前抗肿瘤药物研究已进入一个全新的阶段，已不局限于传统的细胞毒药物、分化诱导剂、生物反应调节剂，面临着思路、理论及技术的更新。

鳄鱼是一种古老的爬行动物，《本草纲目》等古代医学典籍中均有关于鳄鱼药用价值的记载。早在南北朝时期的《本草经集注》就有对鳄鱼甲的记载：“味辛，微温。......主心腹癥瘕、伏坚、积聚、寒热。”《本草拾遗》称鼍甲“主恶疮，腹内癥瘕”。明代李时珍的《本草纲目》“鳞部”第四十三卷则详细记载了：“鼍(即鳄)甲主治心腹症瘕；伏坚积聚；肉：主治少气吸吸，足不立地；别录湿气邪气、诸蛊内症瘕、恶疱。脂：主治摩风及恶疮。......。”上述症瘕主要是指现代医学中的卵巢癌，积聚指现代医学中的肝癌。由此可见，鳄鱼具有防止和抵抗肿瘤的药用价值的论断具有历史依据。

公开号为CN1465351的发明专利申请提供一种抗癌新制品鳄鱼免疫抗癌丸，是以人工饲养的鳄鱼的皮甲、肉骨、胆汁、血液等经加工精制后作为主要成分。本品对部分白血病及已有转移的中、晚期癌症患者，收到较好效果。服用本品无任何毒性或副作用。

发明内容

本发明的目的在于提供鳄胆素及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供鳄胆素在制备抗肿瘤药物中的应用。。

本发明所述鳄胆素的制备方法包括以下步骤：

1)将暹罗鳄鳄鱼胆去除胆囊壁，得胆汁混合物；

2)在胆汁混合物中加入生理盐水，搅拌抽提，离心后，取上清，过滤，得鳄胆素。在步骤2)中，所述生理盐水的质量浓度可为0.9％；所述搅拌抽提的时间可为1h；所述离心，是20000g离心20min；所述微孔滤膜，可采用0.22μm微孔滤膜。

本发明所述鳄胆素的另一种制备方法包括以下步骤：

1)将暹罗鳄鳄鱼胆去除胆囊壁，得胆汁混合物；

2)在胆汁混合物中加入乙醇，浸渍，提取，合并提取液，旋转蒸发仪真空蒸发、浓缩至无醇味，得乙醇提取物浸膏；

3)将乙醇提取物浸膏用水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种有机溶剂，进行萃取分离，将萃取液真空浓缩去除有机溶剂，得鳄胆素；

在步骤2)中，所述乙醇可采用体积浓度为70％乙醇；所述提取，可分三次提取。

在步骤3)中，所述水，可采用蒸馏水；所述进行萃取分离，可按溶剂极性依次递增法进行萃取分离，每种溶剂萃取3次。

所得鳄胆素可采用C₁₈反向高效液相色谱进行鳄胆素成分分析。

本发明所制备的鳄胆素是一种具有抗肿瘤功效的活性物质，可用于制备抗肿瘤药物。

本发明利用有机溶剂分级萃取等现代生化技术对鳄鱼胆汁进行分离纯化，得到具有抗肿瘤活性的提取物(称为鳄胆素)，并证明鳄胆素在抗肿瘤药物中的应用。尤其是鳄胆素在抑制肝癌SMMC-7721细胞、胆管癌QBC939细胞、宫颈癌Hela细胞这3株肿瘤细胞的增殖，诱导3种肿瘤细胞凋亡方面具有良好的效应。

附图说明

图1为鳄胆素HPLC洗脱图。色谱条件：色谱柱为SB-C18；检测波长：210nm；流动相比例：甲醇-水(7∶3)，流速1mL/min。横坐标为时间(min)，纵坐标为响应强度(mAU)。经高效液相色谱分离后，得到11个主峰，各峰的保留时间分别为1.595min，2.274min，2.608min，3.630min，5.170min，5.753min，7.663min，12.081min，12.444min，14.596min，31.265min。

图2为鳄胆素对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响。图中横坐标为鳄胆素的浓度(μg/mL)，纵坐标为细胞增殖抑制率(％)，以未加鳄胆素为实验对照组。a为24h，b为48h，c为72h。

图3为普通光学显微镜下观察鳄胆素对肝癌SMMC-7721细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组肝癌SMMC-7721细胞，B为用鳄胆素150μg/mL处理48h后的肝癌细胞。标尺为50μm。

图4为姬姆萨染色光学显微镜下观察鳄胆素对肝癌SMMC-7721细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组肝癌SMMC-7721细胞，B为用鳄胆素150μg/mL处理48h后的肝癌细胞。标尺为25μm。

图5为Hoechst33258染色荧光显微镜下观察鳄胆素对肝癌SMMC-7721细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组肝癌SMMC-7721细胞，B为用鳄胆素150μg/mL处理48h后的肝癌细胞。标尺为25μm。

图6AO/EB染色荧光显微镜下观察鳄胆素对肝癌SMMC-7721细胞细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组肝癌细胞，B为用鳄胆素200μg/mL处理48h后的肝癌细胞。标尺为25μm。

图7为PI单染流式细胞术检测鳄胆素对肝癌SMMC-7721细胞周期的影响。A为未加鳄胆素的对照组肝癌SMMC-7721细胞，B为用鳄胆素160μg/mL处理48h后的肝癌细胞。横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞个数。

图8为Annexin V/PI双染流式细胞术检测肝癌SMMC-7721细胞凋亡。A为肝癌SMMC-7721细胞对照组，B为经160μg/mL鳄胆素处理组肝癌细胞；横坐标为磷脂结合蛋白AnnexinV的荧光强度，纵坐标为碘化丙碇的荧光强度。

图9为鳄胆素对胆管癌QBC939细胞增殖的影响。图中横坐标为鳄胆素浓度(μg/mL)，纵坐标为细胞增殖抑制率(％)，以未加鳄胆素为实验对照组。横坐标为浓度(μg/mL)，纵坐标为抑制度(％)；a为24h，b为48h，c为72h。

图10为普通光学显微镜下观察鳄胆素对胆管癌QBC939细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组QBC939细胞，B为用鳄胆素250μg/mL处理48h后的胆管癌细胞。标尺为50μm。

图11为姬姆萨染色光学显微镜下观察鳄胆素对胆管癌QBC939细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组胆管癌细胞，B为用鳄胆素200μg/mL处理48h后的胆管癌细胞。标尺为25μm。

图12为Hoechst33258染色荧光显微镜下观察鳄胆素对胆管癌QBC939细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组胆管癌QBC939细胞，B为用鳄胆素200μg/mL处理48h后的胆管癌细胞。标尺为25μm。

图13为PI单染流式细胞术检测鳄胆素对胆管癌QBC939细胞周期的影响。A为未加鳄胆素的对照组胆管癌QBC939细胞，B为用鳄胆素200μg/mL处理48h后的胆管癌细胞。横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞个数。

图14为Annexin V/PI双染流式细胞术检测胆管癌QBC939细胞凋亡。A为胆管癌QBC939细胞对照组，B为经100μg/mL鳄胆素处理组胆管癌细胞。横坐标为磷脂结合蛋白AnnexinV的荧光强度，纵坐标为碘化丙碇的荧光强度。

图15为鳄胆素对宫颈癌Hela细胞增殖的影响。图中横坐标为鳄胆素的浓度(μg/mL)，纵坐标为细胞增殖抑制率(％)，以未加鳄胆素为实验对照组。横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞个数。

图16为普通光学显微镜下观察鳄胆素对宫颈癌Hela细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组宫颈癌Hela细胞，B为用鳄胆素200μg/mL处理48h后的宫颈癌细胞。标尺为50μm。

图17为姬姆萨染色光学显微镜下观察鳄胆素对宫颈癌Hela细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组宫颈癌Hela细胞，B为用鳄胆素200μg/mL处理48h后的宫颈癌细胞。标尺为25μm。

图18为Hoechst33258染色荧光显微镜下观察鳄胆素对宫颈癌Hela细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组宫颈癌Hela细胞，B为用鳄胆素200μg/mL处理48h后的宫颈癌细胞。标尺为25μm。

图19为AO/EB染色荧光显微镜下观察鳄胆素对宫颈癌Hela细胞形态的影响。A为未加鳄胆素的对照组Hela细胞，B为用鳄胆素200μg/mL处理48h后的Hela细胞。标尺为25μm。

图20为PI单染流式细胞术检测鳄胆素对宫颈癌Hela细胞周期的影响。A为未加鳄胆素的对照组宫颈癌Hela细胞，B为用鳄胆素200μg/mL处理48h后的宫颈癌细胞。横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞个数。

具体实施方式

实施例1

鳄胆素的制备方法：

①将暹罗鳄鳄鱼胆去除胆囊壁，得胆汁混合物。向其中加入质量浓度为0.9％的生理盐水，搅拌抽提1h，20000g离心20min，取上清，0.22μm微孔滤膜过滤，获得鳄胆素，4℃冰箱保存。

②将暹罗鳄鳄鱼胆去除胆囊壁，得胆汁混合物。向其中加入体积浓度为70％乙醇超声浸渍分三次提取，合并提取液，旋转蒸发仪真空蒸发、浓缩至无醇味，获得乙醇提取物浸膏；将浸膏用适量的蒸馏水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种有机溶剂，按溶剂极性依次递增法进行萃取分离，每种溶剂萃取3次，将萃取液真空浓缩去除有机溶剂，获得鳄胆素，4℃保存备用。

③采用C₁₈反向高效液相色谱进行鳄胆素成分分析，结果见图1。

实施例2鳄胆素对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用

以鳄胆素为效应物，应用MTT法研究了鳄胆素对人肝癌SMMC-7721细胞生长的影响。实验结果表明：鳄胆素对SMMC-7721细胞抑制作用较强(图2)，IC₅₀值为158.6μg/mL，其抑制作用表现出了明显的浓度效应和时间效应，当鳄胆素浓度为100、150、200、250、300μg/mL时，作用24h后，抑制率分别为11％、23％、66％、91％、97％，作用48h后，抑制率分别为11％、42％、71％、93％、100％。

倒置光学显微镜下对肝癌细胞形态进行观察，可见对照组细胞结构紧密；经鳄胆素作用后的细胞形态发生改变，表现为细胞变圆、体积缩小、细胞间隙增加，细胞肿胀、胞浆中出现空泡，部分细胞失去贴壁能力(图3)。

经姬姆萨(Giemsa)染色后对照组细胞形态完整，呈不规则分布；而用鳄胆素处理过的细胞，细胞变圆、皱缩、细胞核固缩、浓聚。表明鳄胆素可抑制肝癌细胞增殖，对细胞的生长产生影响(图4)。

Hoechst 33258染色后，荧光显微镜下观察发现，未经鳄胆素处理组肝癌细胞在荧光显微镜下发出微弱蓝色荧光，而经鳄胆素作用48h后，细胞核内呈现出浓度致密的颗粒状强蓝色荧光，还有一些细胞形成大小不等的凋亡小体(图5)。

AO/EB染色后，荧光显微镜下观察发现，未加药组细胞呈绿色荧光；而鳄胆素加药组细胞发黄色、橙色、橘红色荧光，细胞数量明显减少(图6)。

采用碘化丙锭(PI)单染的方法研究了鳄胆素对SMMC-7721细胞细胞周期的影响。实验结果表明不同浓度的鳄胆素作用SMMC-7721细胞48h后，与对照组相比各实验组细胞的G₀/G₁期比例增加，随着鳄胆素浓度的增大和作用时间的延长，凋亡率增加，这些结果表明，鳄鱼胆汁使细胞阻滞于G₀/G₁期，然后诱导细胞发生凋亡，PI单染流式细胞术检测鳄胆素对肝癌SMMC-7721细胞周期的影响参见图7，PI单染流式细胞术检测鳄胆素处理肝癌细胞48h后，周期数据分析结果参见表1。

表1

Annexin V是一种相对分子质量为35000大小的Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，与细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸PS具有高度的亲和性^[71]，可作为敏感的探针检测细胞膜表面的PS位置。将Annexin V进行异硫氰酸荧光素(FITC)标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但处于凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染上红色。所以，Annexin V-FITC/PI双染检测可用来区分正常细胞，早期凋亡细胞及坏死细胞或晚期凋亡细胞。Annexin V-FITC/PI双染检测结果显示不同浓度鳄胆素作用肝癌细胞24h后，对照组细胞自发早期凋亡率为9.31％，120、140、160μg/mL鳄胆素实验组细胞早期凋亡率分别为28.48％、46.74％、51.76％，与对照组相比，凋亡明显(图8)。随着胆汁浓度的增加，细胞凋亡率呈浓度依赖性增加。

实施例3鳄胆素对人胆管癌细胞QBC939的抑制作用

以鳄胆素为效应物，应用MTT法研究了鳄胆素对人胆管癌细胞QBC939细胞生长的影响。实验结果表明：鳄胆素对胆管癌细胞QBC939的抑制作用表现出了明显的浓度效应和时间效应。当作用时间为48h，胆素作用于QBC939细胞的IC₅₀分别为200μg/mL和45μg/mL。(图9)

倒置光学显微镜下观察可见，对照组细胞结构紧密；鳄胆素作用后的胆管癌细胞形态发生改变，表现为细胞变为圆形、体积缩小、细胞间隙增加，胞浆中出现空泡，部分细胞由于失贴壁能力而悬浮(图10)。

经姬姆萨(Giemsa)染色后对照组细胞形态完整，呈不规则分布；而用鳄胆素处理过的细胞，细胞变圆、皱缩、细胞核固缩、浓聚。表明鳄胆素可抑制胆管癌细胞增殖，对细胞的生长产生影响(图11)。

Hoechst 33258染色后，荧光显微镜下观察发现，未经鳄胆素处理组胆管癌细胞在荧光显微镜下发出微弱蓝色荧光，而经鳄胆素作用48h后，细胞核内呈现出浓度致密的颗粒状强蓝色荧光，还有一些细胞形成大小不等的凋亡小体(图12)。

PI单染流式细胞术检测结果显示，不同浓度的鳄胆素作用胆管癌QBC939细胞48h后，与对照组相比各实验组细胞出现了明显的S期和G2/M期细胞周期阻滞。这些结果表明，鳄鱼胆素使细胞阻滞于S期和G2/M期，然后诱导细胞发生凋亡，PI单染流式细胞术检测鳄胆素对胆管癌QBC939细胞周期的影响参见图13，PI单染流式细胞术检测鳄胆素处理胆管癌细胞48h后，周期数据分析结果参见表2。

表2

Annexin V-FITC/PI双染检测结果显示100μg/mL鳄鱼胆素作用胆管癌QBC939细胞48h后，细胞早期凋亡率由对照组细胞的0.99％升高至20.93％，凋亡明显。与对照组相比，凋亡明显(图14)。

实施例4鳄胆素对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用

以鳄胆素为效应物，应用MTT法研究了鳄胆素对人子宫颈癌Hela细胞生长的影响。实验结果表明：实验结果表明：鳄胆素对Hela细胞的抑制作用表现出了明显的浓度效应和时间效应(图15)，当鳄胆素浓度为25、50、100、150、200μg/mL时，作用24h后，各浓度的抑制率分别为15.15％、18.65％、44.38％、68.79％、73.68％，IC₅₀为119.9μg/mL；48h时，各浓度的抑制率分别为15.16％、30.46％、50.87％、74.88％、81.971％，IC₅₀为105.3μg/mL；72h时，各浓度的抑制率分别为15.34％、27.49％、48.65％、63.39％、91.42％，IC₅₀为95.8μg/mL。

倒置光学显微镜下观察到对照组的Hela细胞平铺贴壁生长，细胞轮廓清晰，细胞之间排列密集，铺满时呈马赛克状排列，呈不规则多角形、圆形或卵圆形，细胞间无接触抑制；而经鳄胆素处理后的细胞形态发生明显改变，表现为细胞数量明显减少，形态轮廓变得不清晰，细胞明显变圆，且皱缩变形，细胞间连接减少，细胞脱壁而至悬浮状态。(图16)。这一结果说明，鳄胆素能改变Hela细胞形态学特征，并有效抑制细胞的生长。

经姬姆萨(Giemsa)染色后对照组Hela细胞，其染色结果对比度好、细胞核着色清晰，细胞形态完整，呈不规则分布，核仁清晰可见，染色质分布均匀，细胞质较少；而经不同浓度鳄胆素处理过的Hela细胞，细胞明显变圆、皱缩变形，细胞体积明显变小，细胞核固缩、浓，聚核染色质呈致密深染。(图17)

Hoechst 33258染色后，荧光显微镜下观察发现，未经鳄胆素处理组Hela细胞在荧光显微镜下发出弥散均匀的微弱蓝色荧光，细胞核未见浓缩致密染色，而经鳄胆素作用48h后，细胞核内出现致密深染的颗粒状、新月体状结构，并发出强蓝色荧光，呈现的染色质高度凝集边缘化这一凋亡典型特征，还有一些细胞形成大小不等的凋亡小体(图18)。

AO/EB染色后，荧光显微镜下观察发现，对照组Hela细胞呈明亮的绿色荧光，且细胞形态完整，着色均一；而经鳄胆素作用后的Hela细胞数量明显减少，并发出凋亡细胞所呈现的橙色荧光，在有的细胞中还可见到核碎片及凋亡小体。(图19)。说明鳄胆素能够诱导Hela细胞发生凋亡。

PI单染流式细胞术检测结果显示不同浓度的鳄胆素处理Hela细胞48h后，其细胞周期与对照组相比G₀/G₁期的细胞明显增多，而G₂/M期的细胞明显减少，且在细胞周期DNA直方图G1峰期前面均出现明显的DNA亚二倍体峰，即凋亡峰，且峰面积随着药物浓度的增加而增加，说明鳄胆素既能够将细胞阻滞于G₀/G₁期，并能够诱导细胞发生凋亡，PI单染流式细胞术检测鳄胆素对宫颈癌Hela细胞周期的影响参见图20，PI单染流式细胞术检测鳄胆素处理宫颈癌细胞48h后，周期数据分析结果参见表3。

表3

本发明所采用的是暹罗鳄胆，由泰国是拉差龙虎园提供。

本发明经实验证明，鳄胆素在抑制肝癌SMMC-7721细胞、胆管癌QBC939细胞、宫颈癌Hela细胞等3株肿瘤细胞的增殖，诱导3种肿瘤细胞凋亡方面具有良好的效应。因此可用于制备抗肿瘤细胞的药物。

Claims

1.鳄胆素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将暹罗鳄鳄鱼胆去除胆囊壁，得胆汁混合物；

2)在胆汁混合物中加入生理盐水，搅拌抽提，离心后，取上清，过滤，得鳄胆素。

2.如权利要求1所述的鳄胆素的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述生理盐水的质量浓度为0.9％。

3.如权利要求1所述的鳄胆素的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述搅拌抽提的时间为1h；所述离心，是20000g离心20min。

4.如权利要求1所述的鳄胆素的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。

5.如权利要求1～4所述的鳄胆素的制备方法制备的鳄胆素。

6.鳄胆素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将暹罗鳄鳄鱼胆去除胆囊壁，得胆汁混合物；

7.如权利要求6所述的鳄胆素的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述乙醇是体积浓度为70％乙醇；所述提取，分三次提取。

8.如权利要求6所述的鳄胆素的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述进行萃取分离，是按溶剂极性依次递增法进行萃取分离，每种溶剂萃取3次。

9.如权利要求6～8所述的鳄胆素的制备方法制备的鳄胆素。

10.如权利要求5或9所述鳄胆素在制备抗肿瘤药物中的应用。