CN101854943A - 舞茸提取物以及含有其的用于促进透明质酸(玻尿酸)产生的组合物 - Google Patents

舞茸提取物以及含有其的用于促进透明质酸(玻尿酸)产生的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供更有效地促进透明质酸(玻尿酸)的产生的舞茸提取物以及含有它的组合物。用纯乙醇提取干燥舞茸得到的舞茸提取物以及含有它的用于促进透明质酸(玻尿酸)产生的组合物。

Description

舞茸提取物以及含有其的用于促进透明质酸(玻尿酸)产生的组合物
技术领域
本发明涉及舞茸提取物以及含有其的用于促进透明质酸(玻尿酸)产生的组合物。
背景技术
作为舞茸的乙醇提取物，迄今为止已知有酪氨酸酶抑制效果、α-淀粉酶抑制效果、润肤效果、抑制免疫下降效果(专利文献1～3)。
本发明者对干燥舞茸子实体的纯乙醇提取物在人以及仓鼠皮脂腺显示起因于皮质生物合成促进而引起的皮质产生·分泌促进作用、以及对干皮症患者具有皮肤病态的临床改善效果提出了专利申请。即，对如下内容提出了专利申请：干燥舞茸子实体的纯乙醇提取物由于促进皮脂产生而改善皮肤屏障功能，不仅对日常的护肤有效，而且对疾病预防·治疗也有效。
另一方面，对于皮肤的抗衰老而言，皮肤结构蛋白质即胶原蛋白、赋予肌肤柔软性和弹性的弹性蛋白以及担负肌肤的保湿功能的透明质酸等的细胞外基质(ECM)关联分子的生物合成调节很重要(非专利文献1)。进而，众所周知，这些细胞外基质(ECM)关联分子的主要产生细胞是存在于皮肤真皮的纤维芽细胞。
但是，关于干燥舞茸子实体的纯乙醇提取物对细胞外基质(ECM)关联分子的表达调节，迄今为止全然不知。为此，在正常人皮肤纤维芽细胞中，在基因水平上对干燥舞茸子实体的纯乙醇提取物调节胶原蛋白、弹性蛋白以及透明质酸的产生进行了分析，结果令人惊奇地发现：干燥舞茸子实体的纯乙醇提取物会促进透明质酸合成酶的表达，即促进透明质酸(玻尿酸)的产生。
专利文献1：日本特开平2-121905号公报
专利文献2：日本特开2000-319192号公报
专利文献3：日本特开平11-263732号公报
非专利文献1：Baumann L.Skin ageing and its treatment.J.Pathol.211：241-251，2007
发明内容
本发明提供更有效地促进透明质酸(玻尿酸)的产生的舞茸提取物以及含有它的组合物。
本发明者为了解决上述课题进行了潜心研究，结果发现：干燥舞茸的纯乙醇提取物(来自舞茸的乙醇提取物)具有优异的促进透明质酸产生的效果，最终完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)用纯乙醇提取干燥舞茸而得到的舞茸提取物。
(2)根据(1)所述的舞茸提取物，其中，干燥舞茸的含水量为8重量％以下。
(3)根据(1)或(2)所述的舞茸提取物，其中，纯乙醇含有99.0容量％以上的乙醇。
(4)促进透明质酸产生的组合物，其含有(1)～(3)中任一项所述的舞茸提取物。
(5)根据(4)所述的组合物，其为化妆品形态。
(6)根据(4)所述的组合物，其为医药品形态。
(7)Rf值满足1.0≥Rf值＞0.45和/或0.07＞Rf值≥0的透明质酸产生促进洗脱物的制造方法，其包括：(a)将上述(1)所述的舞茸提取物在氯仿-甲醇(19∶1)中溶解；(b)将上述舞茸提取物的溶解液添加到用氯仿-甲醇(19∶1)平衡后的正相硅胶柱中；(c)按氯仿-甲醇(19∶1)、氯仿-甲醇(9∶1)、氯仿-甲醇(4∶1)、甲醇的顺序依次洗脱；(d)用薄层硅胶将洗脱物的一部分用氯仿-甲醇(9∶1)展开；以及(e)得到Rf值为1.0≥Rf值＞0.45和/或0.07＞Rf值≥0的洗脱物。
(8)用上述(7)所述的制造方法得到的Rf值为1.0≥Rf值＞0.45和/或0.07＞Rf值≥0的透明质酸产生促进洗脱物。
本发明能有效地促进透明质酸(玻尿酸)的产生，因此能有效地改善伴随着透明质酸(玻尿酸)的减少而产生的皮肤的损伤·异常及疾病、伴随着透明质酸(玻尿酸)的减少而产生的关节的损伤·异常及疾病、伴随着透明质酸(玻尿酸)的减少而产生的眼睛的损伤·异常及眼疾病。
附图说明
图1所示为在人皮肤纤维芽细胞中舞茸提取物促进透明质酸合成酶(HAS)的基因表达。*：对未处理组(p＜0.05)。
图2所示为在人皮肤纤维芽细胞中舞茸提取物对I型胶原蛋白α1mRNA表达的作用。***：对未处理组(p＜0.001)。
图3所示为舞茸提取物对人皮肤纤维芽细胞的弹性蛋白mRNA表达的作用。*：对未处理组(p＜0.05)。
图4所示为舞茸提取物对人皮肤纤维芽细胞的透明质酸(HA)产生的促进作用。4MU(4-甲基伞形酮、HAS抑制剂)。*和**：对未处理组(p＜0.05和0.01)。##和###：对舞茸提取物(100μg/ml)处理组(p＜0.01和0.001)。
图5所示为舞茸提取物的组分成分(M1～M5)对人皮肤纤维芽细胞的透明质酸(HA)产生的促进作用。IL-1(interleukin 1、10ng/ml)。*和**：对未处理组(p＜0.05和0.01)。
图6所示为舞茸提取物及其组分成分对人皮肤纤维芽细胞中的proMMP-1及TIMP-2基因表达的作用。用舞茸提取物及其组分成分(M1-M5)(n＝1/处理)将人纤维芽细胞处理24小时。对回收得到的细胞中的proMMP-1(A)以及TIMP-2mRNA表达(B)进行定量。舞茸提取物促进proMMP-1mRNA表达，但抑制TIMP-2基因表达。M5对proMMP-1以及TIMP-2mRNA表达几乎没有影响。另一方面，M2和M3促进proMMP-1基因表达，M1抑制TIMP-2基因表达。此外，interleukin 1α(IL-1)(10ng/ml)促进proMMP-1mRNA表达，但对TIMP-2基因表达没有影响。
图7所示为舞茸提取物对人皮肤纤维芽细胞中的pro MMP-1(A)以及TIMP-2(B)的产生的促进作用。IL-1(interleukin 1、10ng/ml)。*和**：对未处理组(p＜0.05和0.01)。
图8对将人纤维芽细胞用舞茸提取物M5组分成分(M5-1-M5-8)(n＝1/处理)处理24小时得到的细胞中的培养液中透明质酸量进行定量。在M5-3～M5-8中，观察到透明质酸量的增加。IL-1(interleukin 1、10ng/ml)。
图9是用含舞茸提取物的膏剂治疗的受试者5的治疗前后的皮肤的照片。
具体实施方式
本发明涉及用纯乙醇提取干燥舞茸而得到的舞茸提取物。
本发明的舞茸是指多孔菌科树花菌属(polyporaceae Grifola)的菌，可以例示舞茸(Grifola frondosa)、白舞茸(Grifola albicans)、猪苓(Grifolaumbellatus)、亚舞茸(Grifola gigantean)等。本发明的舞茸优选为Grifolafrondosa。舞茸可以是子实体和菌丝体的任一种，但优选子实体。
提取原料的干燥舞茸是指具有10重量％以下的含水量的舞茸。干燥舞茸具有优选为8重量％以下、更优选为7重量％以下的含水量。干燥舞茸可以采用任意方法(例如日光干燥、加热干燥、真空干燥、冷冻干燥等)将生舞茸进行脱水·干燥来得到。干燥舞茸优选为粉末形态。
本发明的纯乙醇是指在15℃下含有98.0容量％以上乙醇的乙醇。纯乙醇含有优选为99.0容量％以上、更优选为99.5容量％以上的乙醇。
关于干燥舞茸利用纯乙醇进行的提取，通过在作为原料的干燥舞茸中添加纯乙醇后，再在常温下或加热下搅拌一定时间来进行。加热温度通常为乙醇的沸点以下的温度，但在密闭容器中也可以为120℃以下的温度。优选的提取温度为常温(室温)。提取时间没有特殊限制，例如为5分～10小时左右。提取可以进行1次或2次以上。
关于提取中相对于干燥舞茸的纯乙醇的用量，相对于干燥舞茸100重量份，纯乙醇为100～1000重量份，优选为200～600重量份，更优选为300～500重量份。
提取处理后，可以通过利用滤纸或滤布的过滤或离心分离等分离方法得到纯乙醇提取液。
本发明的舞茸的纯乙醇提取物可以是上述乙醇提取液的状态。或者，纯乙醇提取物也可以是用常法从提取液中全部或部分除去乙醇后得到的提取浓缩物的状态。也就是说，还可以是实质上不含乙醇的提取粉末或含有1～50重量％乙醇的提取浓缩物的状态。含有10～15重量％乙醇的提取浓缩物由于保存性好，因而成为优选方式。纯乙醇提取物的收率相对于干燥舞茸为2～10重量％、进一步特定为3～5重量％(以固体成分的形式)。纯乙醇提取物中的有效成分不明，但纯乙醇提取物含有磷脂、植物性类固醇。
本发明包含含有上述提取物的用于促进透明质酸(玻尿酸)产生的组合物。
透明质酸是糖胺聚糖(黏多糖)的一种，具有结合了N-乙酰基-D-葡糖胺与D-葡萄糖醛酸的二糖重复的结构，可由下式表示。另外，透明质酸也被称为玻尿酸。
〔化1〕
(式中，n为1以上的整数)
本发明的组合物包括食品、尤其是用于促进透明质酸产生的食品的形态。
本发明的组合物由于促进透明质酸产生，因此能保持皮肤的保湿性，赋予皮肤水润性和柔软性及弹性，并能对紫外线引起表皮的损伤进行防御、修复、以及皮肤再生。因此，本发明包括化妆品形态的、含有上述提取物的用于促进透明质酸产生的组合物。
化妆品形态的本发明的组合物可含有配合于化妆品中的常用载体、赋形剂、添加物等。可作为防止肌肤粗糙、改善肌肤纹理、改善肌肤柔软性、改善肌肤弹性、改善肌肤皱纹和松弛、改善肌肤保湿性等的化妆品使用。作为化妆品的剂型，可以列举洗脸用(洗面霜·泡沫洗面奶·啫喱洗面奶化妆品等)、整肌用(化妆水·美容液等)、保护用(乳液·护肤霜等)、面膜·推油·按摩化妆品、隔离化妆用(粉底液·白粉等防晒霜·防晒黑化妆品等)、局部化妆用(口红·眼影·眼线液等)、沐浴用(肥皂·洗浴香波·洗浴用化妆品等)、防晒用(防晒霜·防晒黑化妆品等)、生发·护发用(生发品·生发液等)。在这些化妆品中配合以有效量、例如浓缩物(实质不含乙醇状态的舞茸提取物)换算为0.1～99.9重量％、优选1～99重量％的舞茸提取物。剩余部分配合常用载体、赋形剂或添加剂等。
此外，本发明的提取物对伴随着透明质酸产生减少而引起的皮肤损伤或皮肤病有改善效果。另外，本发明的提取物对伴随着透明质酸产生的减少而引起的关节损伤或关节疾病也具有改善效果。另外，本发明的提取物对伴随着透明质酸的减少而引起的眼睛损伤·异常和眼疾患也具有改善效果。因此，本发明包含治疗或预防上述伴随着透明质酸产生的减少而引起的损伤或疾患的医药品形态的组合物。
伴随着透明质酸产生的减少而引起的皮肤损伤或皮肤病可以列举干皮症(干燥肌)、鱼鳞癣、光老化、干癣、特应性皮炎、褥疮(bedsores)和烧伤引起的皮肤功能不全症等。最适用于光老化、干癣、特应性皮炎、褥疮(bedsores)和烧伤引起的皮肤功能不全症。
伴随着透明质酸产生的减少而引起的关节损伤或关节疾病可以列举变形性关节病和类风湿性关节炎等。最适合变形性关节病和类风湿性关节炎。
伴随着透明质酸产生的减少而引起的眼睛损伤或眼疾患可以列举角膜上皮损伤、眼睛疲劳和干眼等。优选干眼。干眼是指由于眼泪不足或眼泪成分变化而在眼睛表面产生损伤的状态，包括泪液分泌减少症和干性角膜结膜炎。
本发明中使用的治疗和预防的对象是哺乳动物，例如人、狗、猫等的宠物、羊、猪、鸡等的家畜动物，特别优选人。
医药品形态的本发明组合物可含有医药品中配合的惯用的载体、赋形剂、添加剂等。医药品的剂型例如可以列举膏剂、舌下剂、按摩油、溶液、悬浊液、洗剂、软膏、凝胶、片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆、栓剂等。在这些医药品中按有效量计例如0.1～99.9重量％、优选1～99重量％来配合舞茸提取物(实质不含乙醇的状态)。剩余部分配合常用载体、赋形剂或添加剂等。
化妆品或医药品中配合的惯用载体、赋形剂或添加剂等可以列举溶剂、植物油(例如杏仁油、蓖麻油、可可脂、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻仁油、橄榄油、棕榈油、花生油、罂粟子油、菜籽油、芝麻油、大豆油、向日葵油及茶籽油等食用油)、矿物油、脂肪油、液体石蜡、缓冲剂、保存剂、润湿剂、螯合剂、抗氧化剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、凝胶形成剂、软膏基质、栓剂基质、渗透促进剂、芳香剂及皮肤保护剂等。
溶剂可以列举水、醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、液体聚烷基硅氧烷以及它们的混合物等，但不限于这些。
缓冲剂可以列举柠檬酸、乙酸、酒石酸、乳酸、磷酸氢盐、二乙胺以及它们的混合物等，但不限于这些。
润湿剂可以列举甘油、丙二醇、戊二醇、山梨糖醇、乳酸、尿素、BG(1，3-丁二醇)、大豆甾醇以及它们的混合物等，但不限于这些。
螯合剂可以列举EDTA钠、柠檬酸以及它们的混合物等，但不限于这些。
抗氧化剂可以列举丁基羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、半胱氨酸、以及它们的混合物等，但不限于这些。
乳化剂可以列举天然橡胶(例如刺槐胶)、黄蓍胶、黄原胶；天然磷脂(例如大豆卵磷脂)；山梨糖醇酐单油酸酯衍生物；羊毛脂；羊毛醇；山梨糖醇酐酯；单甘油酯；脂肪醇(例如二十二醇)；脂肪酸酯(例如三(辛酸/癸酸)甘油酯、硬脂酸甘油酯(SE)等脂肪酸三甘油酯)；以及它们的混合物等，但不限于这些。
悬浮剂可以列举纤维素及其衍生物(例如羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等)、角叉胶、刺槐胶、阿拉伯胶、黄蓍胶以及它们的混合物，但并不限定于这些。
凝胶基质以及增粘成分可以列举液体石蜡、聚乙烯、脂肪油、胶体二氧化硅或铝、锌皂、甘油、丙二醇、黄蓍胶、羧乙烯基聚合物、硅酸镁-铝、亲水性聚合物(例如淀粉、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素以及其他纤维素衍生物等纤维素衍生物)、水膨润性亲水胶体、角叉胶、透明质酸盐(例如选择性含有氯化钠的透明质酸凝胶)、精氨酸酯(例如精氨酸丙二醇酯)以及它们的混合物等，但不限于这些。
软膏基质可以列举蜂蜡、石蜡、鲸蜡醇、棕榈酸鲸蜡酯、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、硬脂酸聚甘油-10、硬脂酸、硬脂酸PEG-150、植物油、脂肪酸的山梨糖醇酐酯、聚乙二醇、脂肪酸的山梨糖醇酐酯与氧化乙烯之间的缩合产物(例如单油酸聚氧乙烯山梨糖醇酐)以及它们的混合物等，但不限于这些。
疏水性软膏基质可以列举石蜡、植物油、动物脂、合成甘油酯、蜡、羊毛脂、液体聚烷基硅氧烷以及它们的混合物等，但不限于这些。
亲水性软膏基质可以列举固体聚乙二醇(polyethyleneglycol)等，但不限于此。此外，惯用的载体、赋形剂或添加剂等可以列举三十碳烷(アクワラン)、卵磷脂、氢化卵磷脂、四己基癸酸抗坏血酸酯、尿囊素、甘氨酸2K、糖基海藻糖、水解氢化淀粉、水解胶原蛋白、玫瑰提取物、甲基聚硅氧烷(dimethicone)、辛二醇、甜菜碱、硬脂酰谷氨酸钠、野玫瑰油、鲨肝醇、羟丙氧基脯氨酸等。
本发明的医药组合物还包含用于治疗或预防因透明质酸产生的减少而产生的疾病或障碍的药剂。
本发明使用的、对于治疗或预防因透明质酸产生的减少而产生的疾病或障碍有效的给药量，因疾病或障碍的程度、给药方法而不同，只要是对于促进透明质酸产生有效的量即可，没有限制，舞茸提取物(实质上不含乙醇的提取粉末的形态)的量为0.1～1000mg/体重kg·日，优选为1～500mg/体重kg·日，更优选为10～100mg/体重kg·日。
本发明采用的给药可以是全身给药、局部给药，全身给药、局部给药可以是经皮给药、舌下给药、口服给药、经肠给药、肌肉内给药、皮下给药、静脉给药、经鼻给药、滴眼等给药形态。优选经皮给药、舌下给药、滴眼。
因此，本发明涉及用于制造上述医药组合物的舞茸提取物的使用。另外，本发明还涉及包含向哺乳动物给予上述医药组合物的、通过促进透明质酸产生而治疗或预防因透明质酸产生的减少而产生的疾病或障碍的方法。
实施例1
以下，通过实施例等来说明本发明，但本发明不限于此。
1、舞茸提取物的制造
在舞茸的灭菌干燥粉末(含水量：6重量％、豪库特(ホクト)株式会社制的舞茸)1000g中加入纯乙醇(水分量：99.5容量％以上)4000g，在20℃的温度下搅拌18小时进行提取。通过离心分离除去残渣，用滤纸过滤所得到的上清液。从得到的滤液蒸发除去乙醇，得到舞茸的纯乙醇提取物(收量43.2g，其中固体成分37.2g和乙醇6.0g)。
2、人纤维芽细胞的培养和处理方法
正常人纤维芽细胞NB1RGB(RCB0222)从(德)理化学研究所生物资源中心购入，使用含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良依格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，从Invitrogen购入)进行培养。另外，在不存在血清的情况下实施了舞茸提取物处理。即，将在60mm dish中培养的汇合的人纤维芽细胞利用含有舞茸提取物或细胞外基质合成促进因子transforming growth factorβ(TGF-β)(20ng/ml、从R&D Systems购入)的0.2％(v/v)水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate(LAH)，从Sigma·Aldrich购入)/DMEM培养了24小时。
3、实时逆转录聚合酶链反应(Real-time reverse transcriptase-polymerasechain reaction(real-time RT-PCR))法
(1)总RNA的提取
关于细胞的总RNA的提取，使用等基因(Isogen、从Nippon Gene购入)，按下述操作法进行。即，向利用舞茸提取物或TGF-β培养的细胞中添加等基因(0.8ml)将细胞溶解，再在该溶解液中添加氯仿(0.16ml)并进行混合。离心分离(10000转/分钟、10分钟)后，回收上层的水层组分，然后添加与回收的水层同容量的异丙醇并进行混合。离心分离(10000转/分钟、10分钟)后，除去上清液，回收沉淀的RNA。在回收的RNA中进一步添加75容量％的乙醇(0.8ml)并进行混合。离心分离(10000转/分钟、10分钟)后，将上清液全部除去，将RNA风干。将提取到的总RNA溶解于不含核酸分解酶的灭菌蒸馏水中，使用分光光度计(UV-1600、岛津制作所制)测定260nm下的吸光度，由此进行定量。另外，该总RNA的提取可以不使用等基因，而根据Chomczynski P and Sacchi N的报告(Chomczynski，P.and Sacchi，N.Single-step method of RNA isolation byacid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal.Biochem.162∶156-159(1987))中记载的方法来实施。
(2)逆转录酶反应
使用QuantiTectR Reverse Transcription Kit(从QIAGEN购入)，按下述操作法进行。即，在总RNA(1μg)中加入7xg DNA Wipeout Buffer使总量为14μl，再在42℃下进行2分钟基因DNA除去反应。然后，在该基因DNA除去反应液总量中添加5x Quantiscript RT Buffer、RT Primer Mix和Quantiscript Reverse Transcriptase(RT)，使总量为20μl，再在42℃下进行15分钟逆转录反应。接着，通过95℃、3分钟的热处理停止反应，合成单链cDNA。
另外，该逆转录酶反应可以不使用QuantiTectR Reverse TranscriptionKit，而根据以下方法来实施。即，在提取的RNA溶液中混在的DNA可以通过在DNase反应溶液(40mM Tris-HCl，2mM MgCl2，0.3mM CaCl2，pH7.9)中与脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease)(5unist)反应来除去。另外，在含有提取的RNA(1μg)的水溶液11μl中，加入5x反应溶液(250mMTris-HCl，200mM KCl，30mM MgCl2，50mM dithiothreitol，pH8.3)4μl、脱氧核苷酸混合(deoxyribonucleotide mixture)溶液(含有dATP，dGTP，dCTP，dTTP各10mM)2μl、寡dT引物(oligo dT primer)(50pmol/μl)1μl、RNase抑制剂(20units/μl)1μl、RT(逆转录酶(Reverse Transcriptase)、50units/μl)1μl，使总量为20μl，再在37℃下反应1小时，即可合成互补的DNA(cDNA)。
(3)实时聚合酶链反应
以通过RT反应合成的单链cDNA为模板，使用人透明质酸合成酶(HAS)引物试剂盒(QuantiTect(注册商标)Primer Assays、从QIAGEN购入)、或对人I型胶原蛋白α1特异的引物、对人弹性蛋白特异的引物以及对人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)特异的引物进行实时聚合酶链反应。即，用灭菌蒸馏水将RT反应溶液稀释40倍，在该稀释液2μl中加入灭菌蒸馏水3μl、SYBR(注册商标)Premix Ex TaqTM II(从Takara Bio购入)6.25μl、HAS引物试剂盒1.25μl，使总量为12.5μl，在使用Thermal CyclerDice(注册商标)实时系统(Real Time System)(Takara Bio制)，进行45个循环(1循环：94℃下5秒；60℃下30秒)的PCR反应。
对于人I型胶原蛋白α1、人弹性蛋白或人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，代替HAS引物试剂盒，而分别添加上游引物(各10μM；序列号1、3、5)0.625μl和下游引物(各10μM；序列号2、4、6)0.625μl，进行同样操作。
结果通过以GAPDH为内标基因、采用比较Ct法(ΔΔCt法)相对地进行定量。ΔΔCt法是指基于只要知道扩增DNA产物达到某一量所需的循环数即可算出初始量这一理论的方法，可以将成为PCR模板的互补DNA(cDNA)的初始量表示为循环数。该方法采用1个循环的检测差异是2倍的基因量的差的理论(2-ΔΔCt)。因此，在ΔΔCt法中，与作为基准的基因(内标基因)比较，从未知检测体的循环数的增减对未知检测体的基因量进行相对定量。
除购入的人HAS(商品目录号QT00027510)引物试剂盒之外还使用的引物如下所述。
人I型胶原蛋白α1(Accession No.NM 000088.3)：上游引物(序列号1)、5’-CAGCAGATCGAGAACATCCG-3’以及下游引物(序列号2)、5’-TCTTGAGGTCACGGCAGTG-3’；
人弹性蛋白(Accession No.M36860.1)：上游引物(序列号3)、5’-TGGACTTGGAGTTGGTGTCG-3’以及下游引物(序列号4)、5’-CAGGCACTGCTGCTCCATATTT-3’；
人GAPDH(Accession No.M33197.1)：上游引物(序列号5)、5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’以及下游引物(序列号6)、5’-GGCAACAATATCCACTTTACCAGA-3’。
这些引物委托Operon Biotechnology株式会社合成而制作。
另外，该实时聚合酶链反应可以不使用QuantiTect(注册商标)PrimerAssays，而根据下述记载的PCR法来实施。即，在RT反应后的含cDNA的溶液(2μl)中，加入10x PCR反应溶液(100mM Tris-HCl，15mM MgCl2，500mM KCl，pH8.3)5μl、脱氧核苷酸混合溶液(含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mM)2μl、上游引物(10μM)2μl、下游引物(10μM)2μl、TaqDNA聚合酶(100units/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水36.5μl，使总量为50μl，实施PCR法。PCR反应以92℃下40秒、60℃下40秒、72℃下60秒为一个循环，实施35～45个循环。合成的DNA通过采用含有0.5μg/ml的溴乙锭的2重量％琼脂糖凝胶的电泳来进行分离，并将通过紫外线照射合成的DNA进行比较定量。
另外，人透明质酸合成酶(HAS)引物可以使用以下序列的引物代替试剂盒的引物。
HAS上游引物(序列号7)：5’-GTGTTATACATGTCGAGTTTACTTCC-3’
HAS下游引物(序列号8)：5’-GTCATATTGTTGTCCCTTCTTCCGC-3’
(Yamada，Y.，Itano，N.，Hata，K.，Ueda，M.，and Kimata，K.Differentialregulation by IL-1beta and EGF of expression of three different hyaluronansynthases in oral mucosal epithelial cells and fibroblasts and dermalfibroblasts：quantitative analysis using real-time RT-PCR.J.Invest.Dermatol.122：631-639，2004.)
(4)统计处理
采用费希尔(Fisher)的多变量分散分析法，测定各处理间的显著差。
4.实验结果
(1)发现在正常人纤维芽细胞中，舞茸提取物浓度依赖性地促进HASmRNA表达(图1)。即，HAS mRNA量在100μg/ml的舞茸提取物时显著增加5.4倍，在200μg/ml时显著增加22.4倍，在400μg/ml时显著增加23.0倍。另外，TGF-β(20ng/ml)也促进HASmRNA表达增加9.3倍。
(2)如图2所示，舞茸提取物不会影响I型胶原蛋白α1链的基因表达。另一方面，TGF-β(20ng/ml)显著促进该mRNA表达(2.4倍)。
(3)如图3所示，舞茸提取物不会影响弹性蛋白mRNA表达。另一方面，TGF-β(20ng/ml)显著促进该mRNA表达(4.9倍)。
5.考察
首次发现在正常人皮肤纤维芽细胞中，舞茸提取物虽然不会影响皮肤结构蛋白质的胶原蛋白和弹性蛋白的基因表达，但会促进作为赋予肌肤水润性的透明质酸的合成酶的HAS基因表达。因此，明确提示舞茸提取物是通过促进内因性保湿因子透明质酸(Carruthers J，Carruthers A.Hyaluronic acid gel in skin rejuvenation.J.Drugs Dermatol.5：959-964，2006.)的生物合成来增强肌肤的水润性的透明质酸产生促进物质(透明质酸产生促进剂)。另外，还期待舞茸提取物通过作用于纤维芽细胞使其活化，从而发挥抗衰老效果即从体内补充随着年龄增长而减少的透明质酸。此外，还期待舞茸提取物的透明质酸产生促进作用对于随着透明质酸下降而产生的变形性关节病、类风湿性关节炎以及干眼的预防、治疗也有效。
实施例2
实验方法
1、来自实施例1制备的舞茸提取物的组分成分的制备
通过采用正相硅胶(BW-300、富士硅化学株式会社制；使用内径35mm×280mm的玻璃制空心柱)的柱色谱法，将实施例1中制备的舞茸提取物(8.88g)在15ml的氯仿-甲醇(19∶1)中溶解，添加到正相硅胶后，依次改变流动相(氯仿-甲醇(19∶1、使用1000ml)→氯仿-甲醇(9∶1、使用800ml)→氯仿-甲醇(4∶1、使用800ml)→甲醇(使用1000ml))进行分离，分取各约60ml。将分取的第1份馏分作为Fr1，共分离出60份馏分。接着，从分离的总馏分(Fr1-60)中取出一部分，在薄层硅胶(TLC)板(10cm×10cm、Silica gel 60F254#1.05715.0009、默克制)中使用展开溶剂(氯仿-甲醇(9∶1))展开(展开距离：8cm)。对TLC板照射UV(254nm)后，喷雾10％硫酸试剂，然后进行加热，由此来检测分离成分。其结果是，得到由同一成分组构成的以下5组分(M1～M5)(表1)。即，将相对比移值(Rf值)为0.98≥Rf值≥0.50的馏分作为M1，将Rf值为0.45≥Rf值≥0.29的馏分作为M2，将Rf值为0.28≥Rf值≥0.16的馏分作为M3，将Rf值为0.13≥Rf值≥0.07的馏分作为M4，将Rf值为0.07＞Rf值≥0的馏分作为M5。各组分成分通过净重法算出减压干燥后的收量。另外，用100％EtOH将各成分调节至400mg/ml，添加到细胞培养体系中。
表1  舞茸提取物的5组分成分
  组分   对应馏分   收量(mg)
  M1   Fr1-5(0.98≥Rf值≥0.50)   6115
  M2   Fr6-13(0.45≥Rf值≥0.29)   481
  M3   Fr14-22(0.28≥Rf值≥0.16)   255
  M4   Fr23-47(0.13≥Rf值≥0.07)   425
  M5   Fr48-60(0.07＞Rf值≥0)   1260
实施例3
实验方法
1、来自实施例2制备的舞茸提取物组分5(M5)的组分成分的制备
通过采用正相硅胶(BW-300、富士硅化学株式会社制；使用内径40mm×300mm的玻璃制空心柱)的柱色谱法，将实施例2中制备的舞茸提取物组分5(M5)(1.2g)在20ml的氯仿-甲醇-水(4∶1∶0.1)中溶解，添加到正相硅胶后，依次改变流动相(氯仿-甲醇-水(4∶1∶0.1、使用1700ml)→甲醇(使用300ml))进行分离，分取各约50ml。将分取的第1份馏分作为Fr1，共分离出38份馏分。接着，从分离的总馏分(Fr1-38)中取出一部分，在薄层硅胶(TLC)板(10cm×10cm、Silica gel60F254#1.05715.0009、默克制)中使用展开溶剂(氯仿-甲醇-水(4∶1∶0.1))展开(展开距离：8cm)。对TLC板照射UV(254nm)后，喷雾10％硫酸试剂，然后进行加热，由此来检测分离成分。其结果是，得到由同一成分组构成的以下8组分(M5-1～M5-8)(表2)。即，将相对比移值(Rf值)为0.32≥Rf值≥0.12的馏分作为M5-1，将Rf值为0.24≥Rf值≥0.11的馏分作为M5-2，将Rf值为0.39≥Rf值≥0.11的馏分作为M5-3，将Rf值为0.39≥Rf值≥0.15的馏分作为M5-4，将Rf值为0.20≥Rf值≥0.15的馏分作为M5-5，将Rf值为0.19≥Rf值≥0.05的馏分作为M5-6，将Rf值为0.11≥Rf值≥0.05的馏分作为M5-7，将Rf值为0的馏分作为M5-8。各组分成分通过净重法算出减压干燥后的收量。另外，用100％EtOH将各成分调节至200mg/ml，添加到细胞培养体系中。
表2  舞茸提取物组分5(M5)的组分成分
  组分   对应馏分   收量(mg)
  M5-1   Fr1-3(0.32≥Rf值≥0.12)   91
  M5-2   Fr4，5(0.24≥Rf值≥0.11)   129
  M5-3   Fr6-8(0.39≥Rf值≥0.11)   152
  M5-4   Fr9，10(0.39≥Rf值≥0.15)   47
  M5-5   Fr11-13(0.20≥Rf值≥0.15)   46
  M5-6   Fr14-22(0.19≥Rf值≥0.05)   77
  M5-7   Fr23-33(0.11≥Rf值≥0.05)   122
  M5-8   Fr34-38(Rf值＝0)   476
实施例4
人纤维芽细胞的培养和处理方法
正常人纤维芽细胞NB1RGB(RCB0222)从(德)理化学研究所生物资源中心购入，使用含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良依格尔培养基(DMEM)进行培养。另外，在不存在血清的情况下实施舞茸提取物及其组分成分(M1～M5、M5-1～M5-8)的处理。即，将在24wellmultiplate或60mm dish中培养得到的汇合的人纤维芽细胞在含有舞茸提取物(25-400μg/ml)、其组分成分(100-400μg/ml)、或白细胞介素1α(10ng/ml、DS Pharma Biomedical制)的0.2％(v/v)水解乳蛋白(LAH)/DMEM中处理24小时或48小时。
为了分析HA(透明质酸)生物合成调节，在HAS抑制剂4-甲基伞形酮(4MU)(0.1-1mM、Sigma-Aldrich制)的存在下同样进行舞茸提取物处理。
2、实时逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)法
(1)总RNA的提取
关于细胞的总RNA的提取以及总RNA的定量按实施例1中3的(1)所述来进行。
(2)逆转录酶反应
使用得到的总RNA，按实施例1中3的(2)所述合成单链cDNA。
(3)实时聚合酶链反应
以通过RT反应合成的单链cDNA为模板，使用人前体胶原蛋白酶1(procollagenase1/proMMP-1引物试剂盒(QuantiTect(注册商标)PrimerAssays、商品目录号QT00014581、从QIAGEN购入)、人基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)引物试剂盒(QuantiTect(注册商标)Primer Assays、商品目录号QT00017759、从QIAGEN购入)以及对人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(序列号5、6)特异的引物，如实施例1中3的(3)所述那样，通过SYBR(注册商标)Premix Ex TaqTM II(从Takara Bio购入)，按照所附的操作方法进行45个循环(1循环：94℃下5秒；60℃下30秒)的PCR，将各cDNA扩增。结果是，以GAPDH为内标基因，采用ΔΔCt法相对地进行定量。
关于人前体胶原蛋白酶1(procollagenasel/proMMP-1)、人基质金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP-2)的PCR，使用上述引物试剂盒代替实施例1中3的(3)中的人HAS引物试剂盒，与实施例1中3的(3)同样进行。另外，也可以代替引物试剂盒，添加以下的各自的上游引物(各10μM；序列号9、11)0.625μl和下游引物(各10μM；序列号10、12)0.625μl，与实施例1中的3的(3)同样操作。
关于人proMMP-1引物，代替试剂盒的引物，使用以下序列的引物来实施。
proMMP-1上游引物(序列号9)：5’-GGTGATGAAGCAGCCCAG-3’
proMMP-1下游引物(序列号10)：5’-CAGTAGAATGGGAGAGTC-3’
(Lin，N.，Sato，T.，Takayama，Y.，Mimaki，Y.，Sashida，Y.，Yano，M.，and Ito，A.Novel anti-inflammatory actions of nobiletin，a citruspolymethoxy flavonoid，on humansynovial fibroblasts and mousemacrophages.Biochem.Pharmacol.65：2065-2071，2003.)
关于人TIMP-2引物，可以代替试剂盒的引物，而使用以下序列的引物来实施。
TIMP-2上游引物(序列号11)：5’-GGTACCAGATGGGCTGCGAG-3’
TIMP-2下游引物(序列号12)：5’-TTGGAGGCCTGCTTA-3’
(Hirata，M.，Saro，T.，Tsumagari，M.，Shimada，A.，Nakano，H.，Hashizume，K.，and Ito A.Differential regulation of the expression of matrixmetalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases by cytokines andgrowth factors in bovine endometrial stromal cells and trophoblast cell lineBT-1 in vitro.Biol.Reprod.68：1276-1281，2003.)
3、DNA定量
关于细胞内DNA量，根据Johnson-Wint和Hollis的方法(Johnson-Wint，B.，and Hollis，S.Arapid in situ deoxyribonucleic acid assay for determiningcell number in culture and tissue.Anal.Biochem.122：338-344，1982.)进行测定。即，使用0.25％(w/v)trypsin/0.02％(w/v)EDTA溶液(1.5ml)进行各处理来回收上述1中处理得到的细胞。将得到的细胞悬浮液在冰冷却下采用密闭式超声波细胞破碎装置(Cosmo Bio制)以5分钟的间隔进行200W、6秒的超声波处理，制成样品溶液。将样品溶液(100μl)与160μl的3，5-二氨基苯甲酸二盐酸盐(3，5-diaminobenzoic acid dihydrochloride)溶液(400mg/ml)(Sigma·Aldrich制)混合后，在60℃下反应45分钟。反应结束后，添加1N盐酸1.5ml，使用微孔板分析仪(Infinite F200、Tecan日本制)测定样品溶液中的荧光强度(激发波长：430nm、荧光波长：535nm)。另外，DNA量通过使用来自鲑精巢的DNA(和光纯药工业制)同样制成的校正曲线来算出。
4、HA定量
上述1的24小时或48小时培养之后回收的培养液中的HA量，采用HA ELISA试剂盒(由生化学工业购入)根据所附的操作方法进行定量。即，使回收的各处理的培养液中的HA与在附于购入试剂盒的微孔上固相化的透明质酸结合蛋白质(HABP)结合后，添加过氧化物酶结合HABP使其反应。接着，加入四甲基联苯胺和过氧化氢，用微孔板分析仪(InfiniteF200、Tecan日本制)测定450nm下的吸光度。HA量通过使用标准HA溶液同时制成的校正曲线来算出。另外，各处理中单位细胞产生的HA量是将测得的各处理的HA量除以上述3中定量得到的各处理的DNA量得到的值(ng/μgDNA)。
另外，HA定量也可以不使用HA ELISA试剂盒，而采用以下方法来实施。即，在使用碳酸盐缓冲溶液(pH8-9)将重组体人HABP(rHABP)(Cosmobio制)固相化得到的96孔板中，添加回收得到的培养液，使结合的HA进一步与生物素结合rHABP(Cosmobio制)结合。接着，添加过氧化酶结合抗生素蛋白，形成生物素-抗生素蛋白复合体。然后，加入四甲基联苯胺和过氧化氢，用微孔板分析仪(Infinite F200、Tecan日本制)测定450nm下的吸光度。HA量通过使用标准HA溶液(50-800ng/ml)同时制成的校正曲线来算出。
5、蛋白质印迹法
在上述1的24或48小时培养后回收得到的细胞培养液中，添加最终浓度3.3％(w/v)的三氯乙酸，在4℃下静置一晚，不要使蛋白质溶解。通过离心分离(10000转/分钟、10分钟)使不溶性蛋白质沉淀后，使沉淀物在含有1％(v/v)2-巯基乙醇的SDS-PAGE sample buffer中溶解，使用12.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。泳动结束后，将凝胶中的蛋白质转移到硝基纤维素膜上，按规定方法将硝基纤维素膜浸渍于粘连溶液[5％(w/v)fatty-free dry milk/80mM Na2HPO4/100mM NaCl/0.1％(v/v)Tween-20(pH7.5)]，进行1小时的粘连。用蒸馏水和PBS-T buffer[80mMNa2HPO4/100mM NaCl/0.1％(v/v)Tween-20(pH7.5)]分别洗涤2～3次后，在用1％(w/v)BSA/PBS(-)稀释了的一次抗体[sheep anti-(humanproMMP-1)或anti-(human TIMP-2)IgG、分别来自国立伦敦大学永濑秀明教授]溶液中浸渍，室温下缓慢振动8小时以上。一次抗体结合后，用蒸馏水和PBS-T buffer分别洗涤2～3次，在用1％(w/v)BSA/PBS(-)稀释了的二次抗体[peroxidase-conjugated goat anti-(sheep IgG)IgG、Sigma·Aldrich制]溶液中于室温下浸渍1小时。二次抗体结合后，在ECL-Western BlottingDetection kit的ECL-Western B lotting Detection Reagents(从AmershamBiosciences公司购入)中浸渍，准确反应1分钟。反应结束后，通过荧光图像分析仪LAS-1000plus(富士胶片公司制)对proMMP-1和TIMP-2量进行定量。
蛋白质印迹法是本领域技术人员所周知的实验方法，在公知的实验书例如神谷美智子的蛋白质实验手册(竹绳忠臣编)羊土社、p.152-157、2003等中有详细记载。
另外，抗体可以不使用上述抗体，而使用市售品的下述抗体来实施。
一次抗体
1)抗人MMP-1单克隆抗体(商品号：F-67、第一精细化学制)
2)抗人TIMP-1单克隆抗体(商品号：F-26、第一精细化学制)
二次抗体
peroxidase-conjugated rabbit anti-(mouse IgG)IgG(Sigma·Aldrich制)
6、统计处理
采用费希尔的多变量分散分析法，测定各处理间的显著差。
7.实验结果
(1)正常人纤维芽细胞NB1RGB(RCB0222)正常产生HA，舞茸提取物(25-100μg/ml)使HA的产生增强(图4)。即，关于HA量，在未处理组中为15.37±1.56μg/μgDNA，而在25μg/ml的舞茸提取物中为24.79±2.75μg/μgDNA，在50μg/ml下为26.08±2.19μg/μgDNA，在100μg/ml下为20.57±1.46μg/μgDNA。因舞茸提取物(100μg/ml)而增加了的HA的生成被HAS抑制剂的4MU(0.1-1mM)浓度依赖性抑制。舞茸提取物因促进HAS基因表达而促进HA产生。
(2)为了鉴定有助于促进HA产生的舞茸提取物成分，探讨舞茸提取物组分成分的HA产生调节。其结果是，在M1和M5组分中，检测出浓度依赖性HA产生促进作用(图5)。另外，关于相对的促进活性，M5比M1高。即，关于HA量，在未处理组中为580.21±70.65ng/ml，而在M1的25μg/ml下为883.49±159.21ng/ml，在50μg/ml下为1237.28±405.80ng/ml，在100μg/ml下为1488.19±527.23ng/ml，在M5的25μg/ml下为1041.44±186.71ng/ml，在50μg/ml下为1587.83±298.10ng/ml，在100μg/ml下为2304.25±499.97ng/ml。此外，M2-M4组分虽然在低浓度下促进HA产生，但在高浓度下反而抑制其产生。
(3)为了探讨舞茸提取物促进HA产生的特异性，探讨舞茸提取物及其组分成分对正常人纤维芽细胞正常表达的已知ECM代谢相关基因即proMMP-1和TIMP-2的基因表达的作用。舞茸提取物浓度依赖性地促进proMMP-1mRNA表达及其产生(图6A以及图7A)。但是，舞茸提取物不影响TIMP-2mRNA表达及其产生(图6B和图7B)。另一方面，舞茸提取物组分成分为：M5组分不影响proMMP-1mRNA表达(图6A)。在M2-M4中观察到proMMP-1基因表达增加(图6A)。对于TIMP-2mRNA表达，M1组分显示出了抑制倾向，但在所有组分中均几乎没有变化(图6B)。因此，暗示了可能各不相同的舞茸提取物成分促进舞茸提取物的HA产生以及proMMP-1基因表达。
(4)为了更详细阐明舞茸提取物的M5组分的HA产生促进作用，将M5组分进一步分成8个成分(M5-1～M5-8)，探讨HA产生调节。其结果是，在M5-3～M5-8组分中观察到HA产生促进(图8)。
8、考察
在正常人皮肤纤维芽细胞中，舞茸提取物促进赋予肌肤水润性的HA的合成。因此，暗示舞茸提取物会促进因重要的水润性成分HA的合成而带来的肌肤的活化和改善(例如皮肤的水分保持功能的改善)。此外，还暗示舞茸提取物的HA产生促进可能由各不相同的成分来调节。
皮肤ECM的酶的代谢促进在创伤治愈等皮肤再建中具有重要作用。认为MMP与TIMP的量的平衡对于该ECM代谢很重要。此外，过度的MMP产生亢进引起的皮肤ECM的分解增强会引起皱纹等皮肤粗糙化(皮肤老化)。首次阐明在人皮肤纤维芽细胞中舞茸提取物会促进proMMP-1mRNA及其产生。
但是，令人感兴趣的是，显示proMMP-1表达促进作用的舞茸提取物组分(M2-M4)与具有HA产生促进作用的组分(M5)不同。经鉴定显示HA产生促进作用的M5组分成分为M5-6和M5-7。即，可期待通过将舞茸提取物的成分分离使用，能减轻皮肤老化作用，进一步特殊增强肌肤的水润性。
极大地暗示我们舞茸提取物是通过促进内因性保湿因子HA的生物合成来增强肌肤水润性的新型的来源于天然物的素材。此外，还可期待舞茸提取物通过作用于纤维芽细胞使其活化，从而发挥抗衰老效果即从体内补充伴随着年龄增加而减少的HA。
实施例5
按下面的配合制作含有舞茸提取物的化妆膏。
成分名        配合量(重量％)
舞茸提取物           2.0
橄榄油               10.0
三(辛/癸酸)甘油酯    10.0
生育酚               1.0
精制水               77.0
合计                 100.0
实施例6
按下面的配合量制作含有舞茸提取物的医药用膏。
成分名            配合量(重量％)
舞茸提取物          10.0
橄榄油              10.0
三(辛/癸酸)甘油酯   10.0
生育酚              1.0
精制水              69.0
合计                100.0
实施例7
舞茸提取物对人干皮症的效果
使用实施例5所示的含有2重量％的舞茸提取物的膏剂，探讨对干皮症的效果。
试验方法
受试对象：老人保健设施“goodwell”内患干皮症而具有脱屑(是指皮肤变成角质状脱落的症状)的患者(76～97岁)12名(男性6名、女性6名)
实施期间：2006年12月～2007年1月
方法：以脱屑(是指皮肤变成角质状脱落的症状)为基准分为3个阶段(3：重症、2：中症、1：轻症)对受试者的皮肤状态进行评价，同时在受试者的皮肤上适量涂布含舞茸提取物的膏剂。涂布部位为右下腕、左下腕、右下腿、左下腿，对各部位进行评价判定。
结果
以下所示为涂布开始1周期间的受试者的皮肤状态的诊断评价度(3：重症、2：中症、1：轻症)。另外，诊断评价度：0表示治愈。
受试者1
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2006/12/4      2        1        2       2
2006/12/6      1        1        1       1
2006/12/8      1        1        1       1
2006/12/11      1       0       1       1
受试者2
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2007/1/17      1        1      2      1
2007/1/19      1        1      1      1
2007/1/22      0        0      1      1
2007/1/24      0        0      1      1
受试者3
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2006/12/6       2      2        2      3
2006/12/11      2      2        1      2
2006/12/13      1      0        0      0
受试者4
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2006/12/15      1      1        1      1
2006/12/18      0      1        0      0
2006/12/20      0      1        0      0
2006/12/22      0      0        0      0
受试者5
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2007/1/5       2      2            3      3
2007/1/8       1      1            2      2
2007/1/10      0      0            2      2
2007/1/12      0      0            2      2
受试者6
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2006/12/18      0      1        3      2
2006/12/20      0      0        2      1
2006/12/25      0      0        1      1
受试者7
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2006/12/18      1      1        1      1
2006/12/20      0      0        1      1
2006/12/22      0      0        1      1
2006/12/25      0      0        0      1
受试者8
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2006/12/29      2      3      3        3
2006/12/30      1      2      2        2
2007/1/4        1      0      2        1
受试者9
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2007/1/5       0      0        2      3
2007/1/8       0      0        2      1
2007/1/10      0      0        2      1
2007/1/12      0      0        1      1
受试者10
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2006/12/20      1      1      2        2
2006/12/22      1      0      2        2
2006/12/25      1      0      1        1
2006/12/26      1      0      1      1
2006/12/27      1      0      1      1
受试者11
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2006/12/4       1      1      2        1
2006/12/6       0      1      1        1
2006/12/8       0      1      1        1
2006/12/11      0      1      0        0
受试者12
诊断·涂布日  右下腕  左下腕  右下腿  左下腿
2006/12/18      0      1      2       1
2006/12/20      0      0      1       1
2006/12/22      0      0      1       1
2006/12/25      0      0      1       0
如上所述，涂布开始后的受试者1～12的皮肤状态的诊断评价度显示为改善。另外，在涂布后1～3天确认到由涂布含舞茸的提取物膏所带来的显著的症状改善效果。
图9是用含舞茸提取物的膏剂治疗的受试者5的治疗前后的皮肤照片。证明通过涂布含舞茸提取物的膏剂来进行治疗，可改善干皮症状。
这些结果表明舞茸提取物的含量为2重量％的膏对干皮症有治疗效果。
工业上利用的可能性
本发明的提取物促进透明质酸的产生，因此本发明的组合物可作为解决因透明质酸产生减少引起的皮肤异常·损伤及疾病的化妆品或医药品、解决关节或眼的异常·损伤及疾病的医药品使用。
序列表
<110>株式会社海马特
     高桥雅夫
     伊东晃
     佐藤隆
 
<120>舞茸提取物以及含有其的用于促进透明质酸(玻尿酸)产生的组合物
 
<130>KP12341
 
<160>12
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>人I型胶原蛋白α1上游引物
 
<400>1
cagcagatcg agaacatccg                                        20
 
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>人I型胶原蛋白α1下游引物
 
<400>2
tcttgaggtc acggcaggtg                                        20
 
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>人弹性蛋白上游引物
 
<400>3
tggacttgga gttggtgtcg                    20
 
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>人弹性蛋白下游引物
 
<400>4
caggcactgc tgctccatat tt                 22
 
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>人GAPDH上游引物
 
<400>5
ggtgaaggtc ggagtcaacg                    20
 
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>人GAPDH下游引物
 
<400>6
ggcaacaata tccactttac caga               24
 
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>human HAS上游引物
 
<400>7
gtgttataca tgtcgagttt acttcc    26
 
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>人HAS下游引物
 
<400>8
gtcatattgt tgtcccttct tccgc    25
 
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>proMMP-1上游引物
 
<400>9
ggtgatgaag cagcccag            18
 
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>proMMP-1下游引物
 
<400>10
cagtagatg ggagagtc            18
 
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>TIMP-2上游引物
<400>11
ggtaccagat gggctgcgag            20
 
<210>12
<211>15
<212>DNA
<213>人造序列
 
<220>
<223>TIMP-2下游引物
 
<400>12
ttggaggcct gctta                15

Claims (8)

1.一种舞茸提取物，其是用纯乙醇提取干燥舞茸而得到的。
2.根据权利要求1所述的舞茸提取物，其中，干燥舞茸的含水量为8重量％以下。
3.根据权利要求1或2所述的舞茸提取物，其中，纯乙醇含有99.0容量％以上的乙醇。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的舞茸提取物，其中，相对于干燥舞茸100重量份，纯乙醇为100～1000重量份。
5.一种透明质酸产生促进剂，其含有权利要求1～4中任一项所述的舞茸提取物。
6.一种组合物，其含有权利要求5所述的透明质酸产生促进剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其为化妆品的形态。
8.根据权利要求6所述的组合物，其为医药品的形态。
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