CN101851633B

CN101851633B - 一种噬菌体核酸酶及其制备和应用

Info

Publication number: CN101851633B
Application number: CN2010101872555A
Authority: CN
Inventors: 范三红; 梁亚峰; 单丽伟; 郭蔼光
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2010-05-31
Filing date: 2010-05-31
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2030-05-31
Also published as: CN101851633A

Abstract

本发明公开了一种噬菌体核酸酶及其制备和应用。所述噬菌体核酸酶基因具有SEQ ID NO.2的序列。所述噬菌体核酸酶具有SEQ ID NO.1的序列。所述的噬菌体核酸酶的制备方法，包括如下步骤：1)通过重叠延伸PCR方法人工合成该噬菌体核酸酶基因；2)将步骤1)所得基因与表达载体连接，构建重组载体；3)用所述重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，培养，表达；4)收集菌体，破碎，亲和纯化。上述核酸酶具有随机切刻和切割双链DNA的能力。本发明提供的方法能高效表达纯化获得该酶蛋白。

Description

一种噬菌体核酸酶及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种噬菌体核酸酶及其制备和应用。

背景技术

核酸酶广泛存在于病毒、原核生物和真核生物。不同核酸酶的底物专一性和作用模式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，通称为核酸酶(nuclease)。根据切割特点可分为核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶(endonuclease)。有些核酸酶对底物的切割具有序列特异性，如限制性内切酶(Restrictions enzyme)EcoR I，有些酶对底物的切割没有特别的序列偏好，如DNase I。

噬菌体基因组中通常编码一些核酸酶，这些核酸酶参与了噬菌体DNA复制、噬菌体“溶原”过程与其基因组与宿主基因组的整合，噬菌体“溶菌”过程中宿主基因组的降解和自身DNA单元的拆分。如T7噬菌体中就包含T7核酸外切酶和T7核酸内切酶I，T7核酸内切酶参与了自身DNA复制单元的拆分和宿主基因组DNA降解。如T4噬菌体中的T4核酸内切酶VII，该酶缺失导致分枝DNA中间体的累积。

随机作用的核酸酶对DNA的降解过程有所不同。大致可以分为三种：其一，有些核酸酶只随机地在DNA链中引入“切刻”，当随机切刻足够多，则会出现相邻且相对的两个切刻位点，导致DNA链的断裂。在这种催化模式中，反应初期DNA似乎没有被切割(事实上已有许多切刻位点)，当降解达到一定阈值时，DNA双链迅速崩解。其二，随机切刻的同时，“切刻”位点专一性切割的酶联合作用，导致DNA链的断裂。这种方式DNA双链的断裂是渐进的过程。其三，酶随机在DNA双链的某一位置，同时在两条链上引入切点，导致DNA直接断裂。这种方式的结果与第二种类似。生物体内核酸酶的随机切割模式主要采用前两种方式，第三种切割模式的核酸酶的活力对细胞是致命性的，其一旦作用可能导致宿主细胞死亡，因而这类酶的活性必然受到严谨的调控。

已知的核酸酶在序列上具有非常大的变异，通过对大量序列的比较发现，核酸酶序列中还是能够找到一些常见的保守序列模式。如在限制性内切酶和一些其它功能的核酸酶中包含PD-(E/D)XK序列，但反过来包含该序列模式的蛋白不一定是核酸酶。Sanger center的蛋白家族数据库中，所有包含PD-(E/D)XK序列的蛋白分在同一个分枝CL0236，该分枝中包含了44个蛋白家族，其中有17家族功能未知，功能已知的家族中，有的属于限制性内切酶，有些属于解析酶，有些属于转座酶，有些属于DNA结合蛋白。

大肠杆菌噬菌体phiv10(Escherichia phage phiv10)是一种侵染大肠杆菌的双链DNA温和噬菌体，其基因组测序完成于2006年。但关于phiv10基因组中各个基因编码产物的功能鲜有报道。phiv10-p45编码一种114个氨基酸残基的蛋白，该蛋白包含PD-(E/D)XK基序，属于功能未知的蛋白家族PF06356(DUF1064)中的一个成员。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明高效表达纯化获得该蛋白，并证明phiv10-p45具有随机切刻和随机降解双链DNA的能力，并对其催化特点进行了系统分析，为该蛋白家族首次提供了功能注解，为该家族成员的应用奠定了基础。

本发明提供一种噬菌体核酸酶基因，上述基因具有SEQ ID NO.2的序列。

本发明提供一种合成所述的噬菌体核酸酶基因的方法：通过重叠延伸PCR法将人工设计的寡核苷酸序列进行拼接，得到所述基因，其中，所述寡核苷酸序列如下：

phiv10-1CAGTGAATTCATGCGCAAACAGATCCAGGCCCTGGGTCG；

phiv10-2TGCAGATTCCGTTTTATTCATCTGACCAGTTTTCAGACGACCCAGGGCCT；

phiv10-3TGAATAAAACGGAATCTGCATACTGCCAGCACCTGGAACAGCGCAAACGTGCCGGTG；

phiv10-4CGCAGTTTGATGCCTTCGAAACGGTACCACGCGACTTCACCGGCACGTTTG；

phiv10-5AAGGCATCAAACTGCGCCTGGCTGACAACACCTTCTACACGCCAGACTTTGCC；

phiv10-6CTTCGTGCAGTTCCATTTCACCCGTCGCCAGCATCACGGCAAAGTCTGGCGT；

phiv10-7AAATGGAACTGCACGAAGTAAAAGGTTTCTGGACTGATGATGCCCGTGTCAAAAC；

phiv10-8GATAATACGGAACGGGTACTGGTCGGCGGCGACTTTAGTTTTGACACGGGCAT；

phiv10-9CAGTACCCGTTCCGTATTATCGGCGTGACCGTTAAACCGAAGAAAGCTGGTGGCGGCT；

phiv10-10CGCCAAGCTTAAAACTCTTCAATGTTCCAGCCGCCACCAGC；

本发明提供一种噬菌体核酸酶，所述核酸酶带有SEQ ID NO.2序列的基因，并进一步具有SEQ ID NO.1的序列。

本发明提供一种上述的噬菌体核酸酶的制备方法，包括如下步骤：

1)对所述噬菌体核酸酶基因进行EcoR I和Hind III双酶切；

2)将步骤1)所得基因与表达载体连接，构建重组载体，所述表达载体优选pET28a和pET21a-MBP。其中，所述pET21a-MBP载体由pET21a载体改造得到，在Nde I和EcoR I位点之间插入了MBP编码区；

3)用所述重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，培养，表达。所述大肠杆菌优选大肠杆菌ER2566；

4)收集菌体，破碎，纯化。

本发明还提供上述核酸酶在切割双链DNA中的应用。

本发明提供的技术方案能够达到以下效果：

1、本发明提供的核酸酶具有随机切割双链DNA的能力，在含Mg²⁺的缓冲溶液中，该酶可随机切刻双链DNA中的一条链，在含Mn²⁺的缓冲溶液中，该酶可随机降解双链DNA。

2、将该酶开发为产品，可应用于科学研究、临床检测、工业生产等过程。如利用该酶的随机切刻活力，在DNA链上产生随机切刻，应用于经典的切刻平移DNA标记过程，可利用随机切刻活性，实现基于PCR的全基因组扩增。利用其随机切割活力非专一性的降解DNA，以降低细胞或细菌裂解液的粘度，去除污染的DNA等。

3、本发明提供的噬菌体核酸酶的制备方法，首次高效表达纯化获得该酶蛋白。

附图说明

图1为phiv10-p45所在蛋白家族与其它三个包含PD-(E/D)XK基序家族的系统发育分析。

图2为本发明提供的人工合成的phiv10-p45序列与Genbank中原始序列的比对。

图3为phiv10-p45在大肠杆菌中的高效融合表达与纯化。

图4为phiv10-p45在不同二价金属离子缓冲溶液中的活力检测。

图5为phiv10-p45在含Mg²⁺和Mn²⁺的缓冲溶液中的催化特征。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中的实施方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1.phiv10-p45及其所在蛋白家族与其它已知蛋白家族的关系

在对T7endonuclease I进行BLAST同源序列数据库搜索时，发现一个新的功能未知的蛋白超家族PF06356(DUF1064)，该家族具有核酸酶中广泛存在的PD-(D/E)XK特征基序。为了弄清该家族成员是否是核酸酶，如果是核酸酶，其催化有什么特点等问题，选出其中跟T7 endonuclease I蛋白序列相似性较高、来自大肠杆菌噬菌体phiv10的phiv10-p45，UniPort数据库中编号为Q286X2。

图1为基于27种包含PD-(D/E)XK基序蛋白的系统发育分析，从树型可看出，所有蛋白清晰地分到了4个分枝中。phiv10-45处于一个独立的分枝，该分枝中蛋白的功能在本申请前标注为“功能未知”。另外三个分枝分别为限制性内切酶BamHI家族、噬菌体核酸酶I和SfsA DNA结合蛋白家族。多序列比对使用ClustalW2.0，系统发育树的构建使用Mega4.0软件中的Neighbor-joining完成。

图1中序列编号均为Unitport数据库中的蛋白编号，其中phiv10-p45单独用●和下划线标出，树的四个分枝分别对应于蛋白质家族数据库CL0236 clan的四个蛋白家族，PF03749、PF05367、PF06356(DUF1064)和PF02923。

实施例2.phiv10-p45基因的合成

以NCBI中大肠杆菌噬菌体phiv10的全基因组序列(NC_007804)为参考，其中编码phiv10-p45的基因位于35150到35494bp处，编码产物为一种114个氨基酸残基的小分子蛋白。以该序列为基础，利用密码子优化程序，使其密码子更适合在大肠杆菌中表达，并去除序列中部的限制性内切酶位点，优化后的序列如SEQ ID NO.2所示。

图2为优化后的序列与原始序列比对的结果。其中phiv10_p45_original为Genbank中的原始序列，phiv10_p45_synthetic为序列表中SEQ ID NO.2的序列。

采用重叠延伸PCR技术将10段人工设计的寡核苷酸序列进行拼接，获得人工合成的phiv10-p45基因。所使用的10段寡核苷酸序列如下：

phiv10-1CAGTGAATTCATGCGCAAACAGATCCAGGCCCTGGGTCG

phiv10-2TGCAGATTCCGTTTTATTCATCTGACCAGTTTTCAGACGACCCAGGGCCT

phiv10-3TGAATAAAACGGAATCTGCATACTGCCAGCACCTGGAACAGCGCAAACGTGCCGGTG

phiv10-4CGCAGTTTGATGCCTTCGAAACGGTACCACGCGACTTCACCGGCACGTTTG

phiv10-5AAGGCATCAAACTGCGCCTGGCTGACAACACCTTCTACACGCCAGACTTTGCC

phiv10-6CTTCGTGCAGTTCCATTTCACCCGTCGCCAGCATCACGGCAAAGTCTGGCGT

phiv10-7AAATGGAACTGCACGAAGTAAAAGGTTTCTGGACTGATGATGCCCGTGTCAAAAC

phiv10-8GATAATACGGAACGGGTACTGGTCGGCGGCGACTTTAGTTTTGACACGGGCAT

phiv10-9CAGTACCCGTTCCGTATTATCGGCGTGACCGTTAAACCGAAGAAAGCTGGTGGCGGCT

phiv10-10CGCCAAGCTTAAAACTCTTCAATGTTCCAGCCGCCACCAGC

其中phiv10-1和phiv10-10两段寡核苷酸中分别包含了EcoR I和Hind III切点。合成过程采用重叠延伸PCR，反应体系为100μl，其中包括5U VentDNApolymerase，phiv10-1和phiv10-10的终浓度为0.1mM，其它8段核苷酸的浓度均为0.01mM。PCR程序为95℃30s，50℃30s，72度30s，共循环30次。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR拼接产物，出现350bp左右的预期片段，并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。目的片段经EcoR I和Hind III双酶切后分别与pET28a和pET21a-MBP载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，分别在含有氨苄青霉素和卡那霉素的培养基上筛选，阳性重组子经PCR、双酶切和测序进一步进行确证，最终获得两种包含人工合成phiv10-p45基因的重组质粒：pET28a-phiv10-p45和pET21a-MBP-phiv10-p45，前者可用于表达His-tag融合的phiv10-p45，后者可用于表达麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的phiv10-p45。其中pET21a-MBP载体由pET21a载体改造而来，在Nde I和EcoR I位点之间插入了MBP编码区。

实施例3.phiv10-p45的表达纯化

将重组载体pET28a-phiv10-p45或pET21a-MBP-phiv10-p45转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，获得抗生素筛选阳性克隆。然后转入LB液体培养基培养至对数生长期，加入终浓度为0.5mM IPTG诱导表达。收集菌体，超声破碎后，分别使用Amylose或Ni-NTA亲和层析进行分离纯化。

图3为MBP和His-tag融合的phiv10-p45的表达情况。图3A为MBP融合的phiv10-p45的表达情况，图3B为His-tag融合的phiv10-p45的表达情况。其中M泳道为蛋白质标准分子量，第1泳道不含重组质粒的对照，泳道2为菌体总蛋白，泳道3为菌体可溶性总蛋白。泳道4分别为纯化后的MBP-phiv10-p45和His6-phiv 10-p45。

利用软件分析phiv10-p45的等电点和分子量，结果表明pI＝9.44，MW＝13114.1Da。

实施例4.phiv10-p45的酶学性质

一、phiv10-p45的离子依赖性

以pUC19为底物检测phiv10-p45在不同离子中的核酸酶活性。反应体系为20μl，反应缓冲液为包含20mM Tris-HCl pH7.6，50mM NaCl，2mM DTT，包含1μg pUC19，1μl phiv10-p45蛋白，不同反应管中加入了不同的金属离子(终浓度5mM)，依次为Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺，37℃温浴1h，然后用1.5％的琼脂糖凝胶分析pUC19质粒的降解情况，结果如图4所示。

图4中M泳道为DNA标准分子量，第1泳道为未加酶的对照，其余泳道依次为反应体系中加入Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺离子的结果。图右侧N、L和S分别指示切刻形式环状质粒(Nick-form)、线性质粒(Linear-form)和超螺旋环状质粒(Supercoil-form)。从图中可看出，在Mg²⁺、Mn²⁺和Co²⁺缓冲液中phiv10-p45具有DNA内切酶活力。在Mn²⁺中活力最强，其次是Mg²⁺和Co²⁺。在Ca²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺缓冲液中检测不到DNA内切酶酶活力。

二、phiv10-p45在含Mg²⁺和Mn²⁺缓冲溶液中的作用模式

为进一步分析phiv10-p45在含Mg²⁺和Mn²⁺缓冲溶液中的作用模式，使用了逐级降低酶浓度的方法(Titration)。20μl反应体系包含20mM Tris-HClpH7.6、50mM NaCl、2mM DTT、5mM MgCl₂或MnCl₂、1μg pUC19和不等量的phiv10-p45蛋白。37℃温浴1h，然后用1.5％的琼脂糖凝胶分析pUC19质粒的降解情况，结果如图5所示。

图5中，M泳道为DNA标准分子量，左侧为Mg²⁺缓冲体系，右侧为Mn²⁺缓冲体系，第6和12泳道未加酶，第1～5、7～11泳道酶浓度依次减半。由图5可知，在含Mg²⁺的缓冲溶液中，超螺旋质粒首先转变为切刻环状形式，随着酶量的增加，质粒保持切刻环状状态。在含Mn²⁺的缓冲溶液中，超螺旋质粒也首先转化为切刻环状形式，随后又转化为线性形式，随着酶浓度增加，质粒DNA被降解为更小片段，直至完全降解。

因此在含Mg²⁺的缓冲溶液中，phiv10-p45具有随机切刻活力。在含Mn²⁺的缓冲溶液中，phiv10-p45具有随机降解DNA的能力。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种噬菌体核酸酶及其制备和应用

<130>1

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>114

<212>PRT

<213>大肠杆菌噬菌体phiv10

<400>1

Met Arg Lys Gln Ile Gln Ala Leu Gly Arg Leu Lys Thr Gly Gln Met

1 5 10 15

Asn Lys Thr Glu Ser Ala Tyr Cys Gln His Leu Glu Gln Arg Lys Arg

20 25 30

Ala Gly Glu Val Ala Trp Tyr Arg Phe Glu Gly Ile Lys Leu Arg Leu

35 40 45

Ala Asp Asn Thr Phe Tyr Thr Pro Asp Phe Ala Val Met Leu Ala Thr

50 55 60

Gly Glu Met Glu Leu His Glu Val Lys Gly Phe Trp Thr Asp Asp Ala

65 70 75 80

Arg Val Lys Thr Lys Val Ala Ala Asp Gln Tyr Pro Phe Arg Ile Ile

85 90 95

Gly Val Thr Val Lys Pro Lys Lys Ala Gly Gly Gly Trp Asn Ile Glu

100 105 110

Glu Phe

<210>2

<211>345

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

atgcgcaaac agatccaggc cctgggtcgt ctgaaaactg gtcagatgaa taaaacggaa 60

tctgcatact gccagcacct ggaacagcgc aaacgtgccg gtgaagtcgc gtggtaccgt 120

ttcgaaggca tcaaactgcg cctggctgac aacaccttct acacgccaga ctttgccgtg 180

atgctggcga cgggtgaaat ggaactgcac gaagtaaaag gtttctggac tgatgatgcc 240

cgtgtcaaaa ctaaagtcgc cgccgaccag tacccgttcc gtattatcgg cgtgaccgtt 300

aaaccgaaga aagctggtgg cggctggaac attgaagagt tttaa 345

Claims

1.一种噬菌体核酸酶基因，其特征在于，所述基因为SEQ ID NO.2的序列。

2.一种合成权利要求1所述的噬菌体核酸酶基因的方法，其特征在于，通过重叠延伸PCR法将人工设计的寡核苷酸序列进行拼接，得到所述基因，其中，所述寡核苷酸序列如下：

phiv 10-1CAGTGAATTCATGCGCAAACAGATCCAGGCCCTGGGTCG；

phiv 10-2TGCAGATTCCGTTTTATTCATCTGACCAGTTTTCAGACGACCCAGGGCCT；

phiv 10-3TGAATAAAACGGAATCTGCATACTGCCAGCACCTGGAACAGCGCAAACGTGCCGGTG；

phiv 10-4CGCAGTTTGATGCCTTCGAAACGGTACCACGCGACTTCACCGGCACGTTTG；

phiv 10-5AAGGCATCAAACTGCGCCTGGCTGACAACACCTTCTACACGCCAGACTTTGCC；

phiv 10-6CTTCGTGCAGTTCCATTTCACCCGTCGCCAGCATCACGGCAAAGTCTGGCGT；

phiv 10-7AAATGGAACTGCACGAAGTAAAAGGTTTCTGGACTGATGATGCCCGTGTCAAAAC；

phiv 10-8GATAATACGGAACGGGTACTGGTCGGCGGCGACTTTAGTTTTGACACGGGCAT；

phiv 10-9CAGTACCCGTTCCGTATTATCGGCGTGACCGTTAAACCGAAGAAAGCTGGTGGCGGCT；

phiv 10-10CGCCAAGCTTAAAACTCTTCAATGTTCCAGCCGCCACCAGC。

3.一种制备由权利要求1所述的噬菌体核酸酶基因编码的噬菌体核酸酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将权利要求2得到的噬菌体核酸酶基因进行EcoR I和Hind III双酶切；

2)将步骤1)所得基因与表达载体连接，构建重组载体；

3)用所述重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，培养，表达；

4)收集菌体，破碎，纯化。

4.根据权利要求3所述的制备由权利要求1所述的噬菌体核酸酶基因编码的噬菌体核酸酶的方法，其特征在于，所述表达载体为载体pET28a和pET21a-MBP，其中，所述pET21a-MBP载体由pET21a载体改造得到，在Nde I和EcoR I位点之间插入了MBP编码区。

5.根据权利要求3所述的制备由权利要求1所述的噬菌体核酸酶基因编码的噬菌体核酸酶的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌ER2566。

6.根据权利要求3所述的制备由权利要求1所述的噬菌体核酸酶基因编码的噬菌体核酸酶的方法，其特征在于，步骤4)所述纯化方法为使用Amylose或Ni-NTA亲和层析进行分离纯化。

7.权利要求3所述方法制备得到的噬菌体核酸酶在随机切刻或切割双链DNA中的应用。