CN101843595B - 一种多肽、蛋白类药物口腔粘膜吸收剂型的组方及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多肽、蛋白类等大分子药物经口腔粘膜递药的药剂组方及制备方法和应用。此种药剂由下列组分组成：多肽、蛋白类药物、促渗透吸收剂、生物黏附剂、蛋白酶抑制剂、添加剂。此种药剂是具有粘附层、防水层的口腔粘附双层片，制备工艺为冷冻干燥法。此种药剂适于各种蛋白、多肽类药物。其要解决的关键问题是提高多肽、蛋白类药物经口腔粘膜吸收的生物利用度，增加多肽、蛋白类药物制剂的稳定性，为开发新型多肽、蛋白类药物非注射给药制剂奠定基础。

Description

一种多肽、蛋白类药物口腔粘膜吸收剂型的组方及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多肽、蛋白类等大分子药物经口腔粘膜递药的药剂组方及制备方法和应用。 

背景技术

随着基因工程药物研究的进展，蛋白和多肽药物作为很有潜力的一类药物，在临床治疗中发挥着越来越重要的作用。然而，由于胃肠道蛋白酶对蛋白和多肽药物的水解作用，这些药物基本口服无效。临床上蛋白和和多肽类药物最常用的给药方式是注射给药。当蛋白和多肽药物用于治疗慢性疾病时，如用胰岛素治疗糖尿病，长期注射给药很不方便，给患者带来极大的不便和痛苦。因此，研发蛋白和多肽类药物的各种非注射给药剂型是药物研发领域的的热点，受到高度重视。蛋白和多肽药物的非注射给药途径大都属于透粘膜吸收，主要包括肺吸入剂、口服制剂、粘膜给药制剂。其中口腔颊粘膜给药制剂以其突出的优势，受到研究者的关注。颊粘膜吸收表面积大，通透性良好，蛋白酶活性较低，血管丰富，是多肽、蛋白类药物较适合的给药途径；颊粘膜给药可避免多肽、蛋白类药物在胃肠道的降解和在肝脏的首过效应；口腔粘膜递药系统方便给药，且病人易于接受，具有较高的顺应性。然而，由于多肽、蛋白类药物分子量较大，如胰岛素分子量接近6000，亲水性强，正常生理条件下很难透过口腔粘膜吸收入血，因此如何提高该类药物在颊粘膜处的通透性，提高药物的生物利用度，是研发多肽、蛋白类药物口腔颊黏膜制剂首先需要解决的关键问题。 

影响药物经口腔粘膜渗透吸收的口腔粘膜渗透障碍主要包括口腔粘膜膜包裹颗粒、蛋白酶、唾液三方面的因素。 

口腔颊粘膜上皮的渗透障碍主要源自上皮的上三分之一到四分之一。有报道称药物(包括大分子如辣根过氧化酶和小分子如镧盐)通过口腔粘膜渗透吸收的主要阻碍，是从膜包裹颗粒排出的物质，这些物质主要包括极性脂质(磷脂、胆固醇脂和糖基神经酰胺)等。 

对于酶不稳定的药物(蛋白质及肽类)，口腔内存在的酶对药物渗透吸收也有一定的影响。与鼻腔给药、阴道给药和直肠给药相比，药物对口腔粘膜内的蛋白水解酶敏感性低很多。但是，有文献报道，口腔粘膜中的酶确实限制了蛋白质及肽类物质的吸收，比如在正常状态下，仓鼠口腔内胰岛素的降解显著大于糖尿病状态时的降解，且广谱酶抑制剂杆菌肽可以抑制各种蛋白水解酶活性。到目前为止，陆续发现的存在于动物口腔粘膜的酶主要有氨基肽酶、二肽基肽酶和二肽基羧肽酶、羧肽酶、酰胺酶、肽链内切酶、亮氨酸氨肽酶和一些特异性的酯酶。有报道指出氨基肽酶是口腔粘膜里唯一具有活性的肽酶，而肽链内切酶和羧肽酶没有活性。 

正常口腔内唾液由99.5％的水和少量蛋白质、糖蛋白和电解质组成，其中钾离子浓度为血浆的7倍，碳酸氢盐、钙、磷浓度为血浆的3倍，钠离子浓度为血浆的十分之一。正常唾液的pH是5.6-7，分泌速率约为1-2mL/min。唾液中含有a-淀粉酶(可裂解1-4糖苷键)、溶解酵素(溶解细菌细胞壁)和舌脂肪酶(分解脂肪)。口腔粘膜60％表面与唾液相接触，其厚度大约为70μm，是口腔粘膜表面的不流动层。由于唾液的清除吞咽作用，使药物在口腔内的滞留时间太短，限制了药物的渗透吸收量。因此，唾液对药物的清除作用也不容忽视。 

药物的理化性质也是影响药物经口腔粘膜渗透吸收的另一主要因素。口腔粘膜吸收遵循pH分配学说，而大部分药物属于弱电解质。药物的相对分子质量、解离度及脂溶性大小都会影响药物的渗透吸收。细胞间隙的非薄层状液相脂质和细胞膜的脂溶性，使脂溶性较高的药物几乎可以畅通无阻的渗透，但是对于肽、蛋白类等亲水性药物，其吸收速度与分子量大小有关，分子量小于100D的物质可以快速渗透吸收，渗透性随药物分子量增大而急剧下降。 

因此，由于口腔内环境的渗透障碍和多肽、蛋白类药物本身的影响，该类药物通过口腔 粘膜渗透吸收非常有限。如何提高大分子亲水性药物的渗透吸收程度是口腔粘膜递药系统研究领域面临的重大困难，目前最常用的方法是加入促吸收剂。 

一个理想的促渗透吸收剂应该具备以下特点：有效、安全、化学惰性、无生物活性、作用可逆性等。传统的促渗透吸收剂可分为表面活性剂、非离子型表面活性剂、胆汁酸盐、螯合剂等等，详见表1。新型促吸收剂也层出不穷，包括壳聚糖衍生物、各种小分子肽、氨基酸等。促吸收剂的作用大小受很多因素的影响，如药物的理化性质、递药载体的组成、黏膜组织是否用促吸收剂预处理过等。现在的研究认为，促渗透吸收剂发挥促吸收作用的机制有以下几点： 

(1)减少粘液层的粘滞性，有助于药物经旁细胞转运，增加药物进入组织的比例。如月桂氮卓酮(Azone)。(2)提取但不破坏细胞间隙的脂质，与上皮的蛋白质区域相互作用，提高膜流动性有助于药物的跨细胞转运。如十二烷基硫酸钠(SDS)。(3)增加药物在口腔黏膜的滞留时间。如壳聚糖是一种生物相容性好，可降解的高分子聚合物，具有良好的生物粘附性，可增加药物在口腔黏膜表面的滞留时间，并可干扰细胞间隙脂质的结构排列，进而减少唾液对药物的清除，增加药物渗透吸收的能力。(4)干扰细胞间脂质的排列，瞬间增加细胞间隙。乙醇具有吸取口腔黏膜脂质的功能，油酸可增加细胞间隙脂质的流动性，促进药物在皮肤的渗透吸收。然而到现在，仍没有任何一个含有促渗透吸收剂的口腔黏膜药物上市。这主要是因为促渗透吸收剂刺激性问题，还缺乏令人满意的研究结果。促渗透吸收剂的长期安全性实验，包括作用是否可逆性，有无毒性，作用靶点的选择性等等，都需要研究者们做进一步的研究。 

对于多肽、蛋白类药物，一方面需要提高其在口腔黏膜的渗透吸收能力，另一方面，不能忽视药物对口腔内蛋白水解酶的敏感性。口腔内蛋白水解酶的活性大小与回肠中的差不多。有研究指出，在白兔的口腔黏膜组织匀浆中，0.01％抑酞酶可减少70％-80％胰岛素和胰岛素前体药的降解。目前，研究中使用的酶抑制剂主要有：抑酞酶(屈来塞多)、抑氨肽酶素、嘌呤霉素、牛胆酸钠盐和苄泽35等。 

另外口腔粘膜给药剂型的研究也日趋白热化，包括片剂、贴剂、粉剂、喷雾剂、水凝胶、脂质体、溶液剂、微球和咀嚼胶等。硝酸甘油舌下片需要在口腔内溶解后才能被吸收，这使得药物在口腔内停留时间较短，易被唾液清除，且因为味觉而影响病人的顺应性。喷雾剂、咀嚼胶作用时间短暂，若不加入理想的促渗透吸收剂则多肽、蛋白类药物很难发挥疗效。传统的片剂采用压片法制备，结构致密，不利于药物的释放，限制了药物的吸收。贴剂载药量受限，应用不广。 

基于上述理论和实践，我们通过TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运模型，筛选了一系列安全有效的促渗透吸收剂，可显著促进多肽、蛋白类药物经口腔粘膜的渗透吸收，有望提高该类药物经口腔粘膜吸收的生物利用度。冻干法制备口腔粘附双层片，其海绵样多孔状结构有利于药物的释放，粘附片防水层和粘附层的双层设计，避免了药物的损失，且该法制备的肽、蛋白类药物口腔粘附片方便保存，稳定性好。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的多肽、蛋白类药物口腔粘附双层片，粘附层由多肽及蛋白类药物、促渗透吸收剂、蛋白酶抑制剂、生物粘附剂、添加剂组成，防水层由乙基纤维素组成，使得该粘附片可避免药物在口腔环境内的损失，提高肽类、蛋白类药物经口腔粘膜递药的生物利用度。该口腔粘附双层片通过冻干法制备，不损失该类药物的生物活性，且其海绵样多孔状结构有利于药物的释放，使得该口腔粘附片的稳定性增加。 

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术解决方案。 

粘附层的组方为多肽及蛋白类药物、促渗透吸收剂、蛋白酶抑制剂、生物粘附剂、添加剂。防水层的组方组成乙基纤维素。 

所述的多肽及蛋白类药物为天然提取的、人工合成的、基因重组的多肽及蛋白类药物。 

所述的促渗透吸收剂为以下几类：(1)药物及食物成分类，包括N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、灭特复星、18-β-甘草次酸(GA)、刺嫩芽中的皂苷类成分、辣椒素、啤酒花提取物、毛果槭及高良姜；(2)小分子短肽类，包括蜂毒素、产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)、酪蛋白磷酸肽(CPPs)、霍乱孤菌编码的第二毒素Zot毒素、还原型谷胱甘肽(GSH)、跨膜蛋白occludin的两个胞外泮多肽及脂肽类衍生物如C14-OP90-103；(3)壳聚糖及其衍生物类；(4)一氧化氮供体，包括硝普钠(SNP)、L-精氨酸(L-Arg)、NOC₅和NOC₁₂；(5)胆酸盐类，包括脱氧胆酸钠(SDC)、甘氨胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠；(6)脂肪酸及其衍生物，包括肉豆蔻酸酯，月桂酸酯、软脂基肉毒碱；(7)螯合剂，包括水杨酸钠、EDTA；(8)表面活性剂，包括合成表面活性剂如月桂基硫酸钠、各种烷基糖苷，非离子型表面活性剂如月桂氮酮(Azone)、月桂醇聚醚-9、月桂醇聚醚-4、吐温80、吐温20、PEG-8月桂酸酯、PEG-4月桂酸酯、甘油单月桂酸酯、4-椰纤维烷基吗啉衍生物；(9)其他，包括大豆卵磷脂(SPC)、糖酯、月桂醯胺丙基甜菜碱、磷脂酰肌醇、磷酸卵磷酯、氨基已酸、聚丙烯酸、透明质酸酶、软骨素酶、卵清酸、环糊精。 

所述的蛋白酶抑制剂为抑酞酶(屈来塞多)、抑氨肽酶素、嘌呤霉素、牛胆酸钠盐和苄泽35。 

所述的生物粘附剂为天然高分子材料明胶、果胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、壳聚糖及其衍生物等，合成高分子材料有丙烯酸聚合物卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇。 

所述的添加剂为矫味剂、抗氧剂、抑菌剂、着色剂。 

所述的矫味剂为薄荷醇、木糖醇、山梨醇。 

所述的抗氧剂为生育酚、2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚。 

所述的抑菌剂为尼泊金甲酯和尼泊金乙酯。 

所述的着色剂为天然着色剂辣椒红、甜菜红、红曲红、胭脂虫红、高粱红、叶绿素铜钠、姜黄、栀子黄、胡萝卜素、藻蓝素、可可色素、焦糖色素；合成色素胭脂红、苋菜红、日落黄、赤藓红、柠檬黄、新红、靛蓝、亮蓝、二氧化钛(白色素)。 

所述的防水层乙基纤维素为用乙醇或丙酮溶解的适当浓度的乙基纤维素溶液。 

本发明所设计的多肽、蛋白类药物口腔粘附片组方成分比例为药物1％-5％，促渗透吸收剂1％-5％，蛋白酶抑制剂1％-5％，矫味剂0.1％-2％，抗氧剂0.1％-2％、着色剂0.1％-2％，生物粘附剂80％-96％。 

本发明所设计的多肽、蛋白类药物口腔粘附片，每片80-100mg，厚度3-5mm，主药2mg。药物及辅料粉末平均颗粒在0.2-150um时较好，0.5-100um更好，1-20um之间最好。 

生产过程称取并且过筛材料，将各种辅料溶液混合均匀，倒入模具中。将模具放入-20℃冰箱预冻24h，然后用冷冻干燥机冻干24h，去除溶液中的溶剂成分，即得到口腔粘附片粘附层。接着，在其上面涂抹防水层，防水层为10％乙基纤维素溶液(用无水乙醇或者制备)，室温下放置至无水乙醇完全蒸发，即得到口腔粘附双层片，置于干燥器皿中4℃冰箱保存。 

本发明优选的促渗透吸收剂为N-乙酰-L-半胱氨酸、水溶性壳聚糖及其衍生物、一氧化氮供体、小分子肽还原型谷胱甘肽、月桂氮酮、大豆卵磷脂及上述任意两种的混合物。N-乙酰-L-半胱氨酸使用量为1.25％-8％，最优为5％，不能少于1％，不能超过10％。水溶性壳聚糖及其衍生物使用量为0.5％-5％，最优为3％，不能少于0.1％，不能超过5％。一氧化氮供体使用量为1％-6％，最优为3％，不能少于1％，不能超过10％。还原型谷胱甘肽和月桂氮酮使用量均为1％-5％，最优为5％，不能少于1％，不能超过6％。大豆卵磷脂使用量为3％-8％，最优为5％，不能少于3％，不能超过10％。 

本发明优选的粘附层生物粘附材料为壳聚糖及其衍生物、果胶、海藻酸钠、卡波姆934P及其不同比例的混合物。壳聚糖及其衍生物、果胶可单用，也可混合，比例为1∶4-4∶1，最佳为1∶4。海藻酸钠与壳聚糖的比例为1∶4-4∶1，最佳为4∶1。卡波姆934P可单用，也可与海藻酸钠混合，最优为与海藻酸钠混合，最佳比例为1∶3。 

本发明优选的蛋白酶抑制剂为抑酞酶，使用量为1％-5％，最优为2.5％。 

本发明优选的矫味剂为薄荷醇，使用量为0.1％-2％，最优为1％。 

本发明优选的抗氧剂为生育酚，使用量为0.1％-2％，最优为0.5％。 

本发明优选的着色剂为二氧化钛，使用量为0.1％-2％，最优为1％。 

本发明优选的抑菌剂为尼泊金乙酯，使用量为0.1％-0.3％，最优为0.2％。 

本发明设计的多肽、蛋白类药物口腔粘附片的制备中，对药物混合溶液的pH值有一定规定，应根据药物的稳定性来确定，最佳pH为6.5，最好不要超过8，不要低于5。 

本发明所设计的多肽、蛋白类药物口腔粘附片，可用于多种疾病的治疗，长期用药，安全可靠。 

本发明的特点是：所述的多肽、蛋白类药物口腔粘附片，适应于多种药物，新颖的处方设计及备工艺，提高了该类药物经口腔粘膜吸收的生物利用度和该类药物制剂的稳定性。其优点是：(1)本发明选择的促渗透吸收剂安全有效，可显著促进该类药物经口腔粘膜的吸收；(2)该口腔粘附片处方组成简单，原料易得，成本低廉，冻干法制备工艺简单；(3)双层设计及多孔结构避免了药物损失，利于药物的释放。由此可见，本发明所述的多肽、蛋白类药物口腔粘附片既保留了该类药物的生物活性，又解决了该类药物稳定性差、生物利用度低的问题，并首次采用冻干法制备口腔粘附片，为该类药物非注射制剂的研究奠定了基础。 

因此，本发明所述的多肽、蛋白类药物口腔粘附片，是一种新型的口腔粘膜递药系统，可用于各种多肽及蛋白类药物，为该类药物非注射制剂的研究提供了新的思路，具有广阔的市场开发前景和临床应用前景。 

附图说明

下面结合实施例附图对本发明做进一步说明。 

图1为不同浓度N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。 

图2为不同浓度一氧化氮供体硝普钠(SNP)对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。 

图3为不同浓度还原型谷胱甘肽(GSH)对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。 

图4为不同浓度L-精氨酸(Arg)对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。 

图5为不同浓度壳聚糖(CS)、壳聚糖(CS)/月桂氮酮(Azone)混合物对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。 

图6为不同浓度大豆卵磷脂(SPC)、大豆卵磷脂(SPC)/月桂氮酮(Azone)、大豆卵磷脂(SPC)/壳聚糖(CS)混合物对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。 

图7为胰岛素口腔粘附双层片的制备方法示意图。 

图8为胰岛素口腔粘附双层片的扫描电镜照片。 

图9为F1、F2、F3、F4组胰岛素口腔粘附片的体外释放度。 

表1为各促渗透吸收剂对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。 

表2为不同浓度的各促渗透吸收剂对TR146细胞相对酶活性的影响。 

表3为F1、F2、F3、F4组胰岛素口腔粘附片的体外粘附力。 

表4为F1、F2、F3、F4组胰岛素口腔粘附片的体外溶胀率。 

具体实施方式

下列实施例用以帮助描述如何实施本发明的各种实施方案。这些实施例是为了举例说明，而不是以任何方式限定本发明的范围。 

本发明提供了筛选促渗透吸收剂的方法。 

本发明还提供了制备多肽、蛋白类药物口腔粘附片的方法。 

本发明还提供了评价多肽、蛋白类药物口腔粘附片的方法。 

以下实施例均是以胰岛素作为实验药物，其他多肽、蛋白类药物口腔粘附片同样按照以下方法进行实验。 

第1步，通过146口腔粘膜上皮细胞渗透转运模型和猪口腔粘膜渗透转运模型筛选可促进胰岛素经口腔粘膜渗透的促渗透吸收剂。 

第2步，通过MTT实验和MTS/PMS实验，检测各种所筛选的促渗透吸收剂对TR146细胞的毒作用，以评价各种促渗透吸收剂的安全性。 

第3步，按照设计的处方比例，制备胰岛素的混合溶液，控制溶液的pH值。 

第4步，冻干法制备胰岛素口腔粘附片。将胰岛素混合溶液倒入模具中，-20℃冰箱预冻24h，然后冻干24h，去除溶液中的溶剂成分，即得到胰岛素口腔粘附片粘附层。接着，在其上面涂抹防水层，防水层为10％乙基纤维素溶液(用无水乙醇或者制备)，室温下放置至无水乙醇完全蒸发，即得到口腔粘附双层片，置于干燥器皿中4℃冰箱保存。 

第5步，测定胰岛素口腔粘附片的粘附力和体外释放度。 

第6步，胰岛素口腔粘附片药效学检测： 

实施例1筛选促渗透吸收剂 

采用TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运模型进行促吸收研究。吸去插入式培养皿上下各室的DMEM培养液，用HBSS缓冲液清洗TR146细胞。然后在上、下腔室分别加入HBSS溶液，平衡1h后，吸出上室HBSS溶液，加入2mL供试液(含有不同浓度的促渗透吸收剂)。按设定时间从下室取样100μL，并立即补充等量HBSS溶液。采用色谱方法，进样分析，记录得到的峰面积(A)，计算各时间点胰岛素的累积渗透量。根据得到的数据计算以下指标：①胰岛素表观渗透系数：P_app＝dQ/dt×1/(A×C₀)；②胰岛素通过插入式培养皿(无细胞时)的渗透系数：P_ins＝dQ/dt×1/(A×C₀)；③胰岛素回收率：Recovery(％)＝(X_Receiver+X_Donor+X_Filter)×100/X0；④细胞渗透系数：1/P_app＝1/P_c+1/P_ins；⑤促吸收增强比率：ER＝P_c(enhancer)/P_c(control)。其中dQ/dt表示稳态的渗透速率，A是指渗透面积(cm²)，C₀是指上腔室胰岛素的起始浓度，X_Receiver指实验结束时下腔室累计的胰岛素量，X_Donor指实验结束时上腔室剩余的胰岛素量，X_Filter指实验结束后插入式培养皿上残余的胰岛素量，Pc指胰岛素通过细胞的渗透系数，P_ins指无细胞时插入式培养皿的渗透系数，P_c(enhancer)和P_c(control)分别指NAC存在和不存在时，胰岛素跨越细胞TR146的细胞渗透系数。结果见图1、图2、图3、图4、图5、图6、表1。 

图1为不同浓度N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。从图中可以看出，10％、5％NAC均可显著促进胰岛素经口腔粘膜上皮细胞的渗透转运，与对照组相比具有统计学差异，且其促吸收作用具有明显的浓度依赖性。 

图2为不同浓度一氧化氮供体硝普钠(SNP)对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。从图中可看出，5％、1％SNP均可显著促进胰岛素经口腔粘膜上皮细胞的渗透转运，与对照组相比具有统计学差异。 

图3为不同浓度还原型谷胱甘肽(GSH)对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。从图中可看出，5％GSH均可显著促进胰岛素经口腔粘膜上皮细胞的渗透转运，与对照组相比具有统计学差异。 

图4为不同浓度L-精氨酸(Arg)对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。从图中可看出，5％Arg均可显著促进胰岛素经口腔粘膜上皮细胞的渗透转运，与对照组相比具有统计学差异。 

图5为不同浓度壳聚糖(CS)、壳聚糖(CS)/月桂氮酮(Azone)混合物对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。从图中可看出，5％CS、5％CS/1％Azone、5％CS/5％Azone均可显著促进胰岛素经口腔粘膜上皮细胞的渗透转运，与对照组相比具有统计学差异。 

图6为不同浓度大豆卵磷脂(SPC)、大豆卵磷脂(SPC)/月桂氮酮(Azone)、大豆卵磷脂(SPC)/壳聚糖(CS)混合物对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。从图中可看出，5％SPC、5％SPC/1％Azone、5％SPC/1％CS均可显著促进胰岛素经口腔粘膜上皮 细胞的渗透转运，与对照组相比具有统计学差异。 

表1为各促渗透吸收剂对胰岛素经TR146口腔粘膜上皮细胞渗透转运的影响。 

实施例2促渗透吸收剂的细胞毒作用 

用指数增长期的TR146细胞，制备2×10⁴cells/mL单细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板。48h后补充培养液80μL，然后给予20μL不含胰岛素的供试液，供试液制备方法同2.2。孵育48h后，进行MTT检测，检测波长490nm。以未被处理的细胞酶活性为100％，计算供试液处理过的细胞酶活性。计算公式：相对酶活性(％)＝(OD₁-OD₂)/(OD₃-OD₄)，OD₁是指用供试液处理过的细胞OD值，OD₂是指没有细胞仅有供试液的OD值，OD₃指未处理过的细胞OD值，OD₄是指无细胞无供试液时空白孔的OD值。本实验每组重复6孔。结果见表2。 

表2为不同浓度的各促渗透吸收剂对TR146细胞相对酶活性的影响。从表中可以看出，1％SDC、Arg组、5％Gln、Azone、SDC、SNP、Arg组和5％CS/5％Azone混合组均显著降低TR146细胞的相对酶活性，与对照组相比，具有统计学差异。其余各组细胞相对酶活性变化不大，与对照组相比无统计学意义，表明对TR146细胞的毒性较小，可作为安全有效地促渗透吸收剂用于药物制剂的研发。 

实施例3胰岛素口腔粘附片的制备 

胰岛素口腔粘附片的处方组成(mg/片) 

按照表中处方设计，将各种辅料溶液混合均匀，倒入模具中。将模具放入-20℃冰箱预冻24h，然后用冷冻干燥机冻干24h，去除溶液中的溶剂成分，即得到胰岛素口腔粘附片粘附层。接着，在其上面涂抹防水层，防水层为10％乙基纤维素溶液(用无水乙醇制备)，室温下放置至无水乙醇完全蒸发，即得到胰岛素口腔粘附双层片，置于干燥器皿中4℃冰箱保存。制备流程见图7。 

图7为胰岛素口腔粘附双层片的制备方法示意图。 

图8为胰岛素口腔粘附双层片的扫描电镜照片。如图8C所示，胰岛素口腔粘附双层片具有多孔状结构，这与传统药片的致密非孔状结构相比，有显著的差异。粘附层表面孔径直径在30μm-120μm之间(见图8A)，内部孔径直径较为均一，约150μm。防水层乙基纤维素和粘附层紧密结合，有效封闭了粘附层表面的孔状结构，使胰岛素单向释放成为可能(如图8B所示)。 

实施例4胰岛素口腔粘附片体外粘附力、体外溶胀率、体外释放度的测定 

采用自制装置测定粘附力，选用鸡蛋壳膜作为生物膜材，取新鲜生鸡蛋倾出内容物后小心剥去外面的硬壳，所得的新鲜鸡蛋壳膜即可作为供试膜材。所测粘附力结果见表3。 

取各处方粘附片6片，放入溶出度仪的转篮中，称定各初始重量W₀。然后，把转篮放入900mL人工唾液的溶出杯中，用水浴保持恒温37±0.1℃，转速100r/min。于开始实验后0.5、1、2、3、4、6、8h时取出，用滤纸吸干网篮周围的水分，称量重量W，计算不同时间各粘附片的溶胀百分率。溶胀百分率Ep的计算公式为：Ep＝[(W-W₀)/W₀]×100％。以溶胀百分率Ep对时间t进行线性回归计算溶胀速率。所测体外溶胀率见表4。 

将待测处方片剂按中国药典(2005年版II部附录XC)规定的桨法进行实验。温度为(37±0.5)℃，溶出介质为100mL人工唾液，转速100r/min，于0.5、1、2、4、6、8、10h定时取样1mL，滤过同时立即补加等量同温溶出介质。取出的样品液于214nm处测定吸收度，用标准曲线计算累积释放度。所测体外释放度见图9。 

表3为F1、F2、F3、F4组胰岛素口腔粘附片的体外粘附力。 

表4为F1、F2、F3、F4组胰岛素口腔粘附片的体外溶胀率。 

图9为F1、F2、F3、F4组胰岛素口腔粘附片的体外释放度。 

表1.各促渗透吸收剂对胰岛素渗透吸收的影响(x±s，n＝3) 

与对照组相比*P＜0.05 

表2.促渗透吸收剂对TR146细胞相对酶活性的影响(x±s，n＝6) 

与对照组相比*P＜0.05 

表3.胰岛素口腔黏附片体外黏附力(x±s，n＝3) 

表4.胰岛素口腔黏附片的体外溶胀百分率和溶胀速率(x±s，n＝3) 

Claims (1)

1.一种口腔粘附双层片，其特征在于：具有粘附层、防水层，所述的防水层为乙基纤维素，所述的粘附层由下列重量份的组分组成：

(1)

或(2)：

或(3)：

或(4)：

所述的双层片按照冷冻干燥法制备而成，生产过程为称取并且过筛材料，将各种辅料溶液混合均匀，倒入模具中，将模具放入-20℃冰箱预冻24h，然后冻干24h，去除溶液中的溶剂成分，即得到口腔粘附双层片粘附层；接着，在其上面涂抹10％乙基纤维素的无水乙醇溶液，室温下放置至无水乙醇完全蒸发，即得到口腔粘附双层片，置于干燥器皿中4℃冰箱保存。

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