CN101842476A - 用于递送生物防治真菌以减少黄曲霉毒素的水分散性制剂 - Google Patents

用于递送生物防治真菌以减少黄曲霉毒素的水分散性制剂 Download PDF

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CN101842476A CN200880104739A CN200880104739A CN101842476A CN 101842476 A CN101842476 A CN 101842476A CN 200880104739 A CN200880104739 A CN 200880104739A CN 200880104739 A CN200880104739 A CN 200880104739A CN 101842476 A CN101842476 A CN 101842476A
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Abstract

包含真菌的非产毒菌株的分生孢子的制剂是一种有用的防治农产品特别是那些人类和动物消费的农产品如花生、玉米、棉花和木本坚果的毒素污染的生物防治剂。本发明的制剂是适合于喷洒的水分散性颗粒制剂，包括非产毒的和/或非产黄曲霉毒素的黄曲菌菌株，其能够抑制产生黄曲霉毒素的真菌生长，并进一步能够抑制产毒的真菌产生黄曲霉毒素。也显示了制备该制剂的方法。

Description

用于递送生物防治真菌以减少黄曲霉毒素的水分散性制剂
发明背景
发明领域
本发明涉及水分散性颗粒制剂和制备该制剂的方法，该水分散性颗粒制剂包含用于减少食物和饲料产品(feed commodities)特别是玉米中黄曲霉毒素污染的生物防治剂(biocontrol agent)。该水分散性颗粒制剂包括包埋入粒状基质中的生物防治剂，当加入水性溶剂时粒状基质是可分散的。该生物防治剂是非产毒和非产黄曲霉毒素的黄曲霉(Aspergillus flavus)菌株，其能够抑制产生黄曲霉毒素的真菌的建群，并且其还能够抑制产毒真菌产生黄曲霉毒素。本发明的水分散性颗粒制剂在贮存和野外条件下显示高度的稳定性。
相关技术描述
许多真菌产生对于它们的生长或生殖不是必要的次生代谢物。当对人或家畜有毒时，这些代谢物分类为真菌毒素。四种较重要的产生真菌毒素的真菌属是曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉菌属(Penicillium)和链格孢属(Alternaria)(Council for Agricultural Scienceand Technology[CAST].2003.Task Force Report 139，Ames，IA)。这些真菌产生真菌毒素，其可能不利地影响各种食品和饲养产品——包括玉米、棉籽、谷粒、花生和木本坚果——的质量和供应。
估计真菌毒素使美国和加拿大的饲料和家畜业付出了每年五十亿的总损失；黄曲霉毒素——一类由曲霉(Aspergillus spp.)产生的真菌毒素——是最受关注的(Robbens和Cardwell.2005.Aflatoxin and FoodSafety，Abbas，H.K.(Ed.)，CRC Press，Boca Raton，FL，pp.1-12)。由黄曲菌(A.flavus)产生的、在食品和饲料中作为污染物普遍存在的两类主要真菌毒素是黄曲霉毒素B1和B2(Payne，G.S.1992.Critical Rev.PlantSci.10：423-440)。黄曲霉毒素B1(AFB1)被认为是效力最大和最普遍的(International Agency for Research on Cancer-World Health Organization[IRAC-WHO].1993.IARC Monographs on the Evaluation ofCarcinogenic Risks to Humans，Lyon，France，pp.56，467-488)。污染的发生率最常见与黄曲菌相关(Diener等，1987.Ann.Rev.Phytopath.25：249-270)。该真菌能够在宽温度范围即10℃-43℃和宽水活度范围(0.82-0.998)生长(Food and Agriculture Organization of the United Nations/International Atomic Energy Agency[FAO/IAEA].2001.FAO Food andNutrition Paper，FAO，Rome，Italy，pp.73，75-93)。然而，干旱条件、机械损伤或病虫害通常使玉米中收获前黄曲霉毒素污染加重。
当前在人食物和动物饲料中允许的最大黄曲霉毒素水平是20μg/kg(CAST，同上；van Egmond and Jonker.2004.J.Toxicol.-Toxin Rev.23：273-293)。虽然在农产品上真菌毒素是不可避免的，但是利用良好的农艺实践可以控制这些污染物的水平。已经建议了数种收获前黄曲霉毒素管理策略(Betran和Isakeit.2004.Agron.J.96：565-570)，具有不同程度的成功。一种最有希望的控制策略是使用非产毒的黄曲菌进行生物防治(Dorner，J.W.2004.J.Toxicol.-Toxin Rev.23：425-450).Brown等，(1991.J.FoodProtect.54：623-626)说明，通过用非产毒的黄曲菌菌株对玉米穗进行直接伤害和注射，黄曲霉毒素水平可以被抑制。与Brown等的机械直接递送策略相相比，间接递送到土壤是更常用的。这里，土壤接种物一般为活泼的、非产毒的黄曲菌菌株，其起初在谷粒上培养。这些谷粒充当生物防治黄曲菌菌株繁殖的营养源，并且作为土壤处理物被施加到目标农作物上。虽然在谷粒上，但是非产毒的菌株充足地形成孢子、通过风或水传播，并且与地方产黄曲霉毒素菌株竞争资源，共同地引起黄曲霉毒素水平的降低。该土壤处理策略在花生(Dorner等，1992.J.Food Protect.55：888-892)、棉花(Cotry，P.J.1994.Phytopath.84：1270-1277)和玉米(Dorner等，1999.J.FoodProtection 62：650-656)中已经成功。对密西西比三角洲(Mississippi Delta)玉米生产，实施了使用土壤施加接种的类似策略(Abbas等，2006.Biocontrol Sci.Tech.16：437-449)。密西西比三角洲玉米研究鉴别出K49——一种非产毒的黄曲菌菌株，其显示出在四年的野外试验中黄曲霉毒素污染显著减少和良好的建群潜力。
虽然有以上处理策略的成功，但是在进行降低以便在商业农业环境中实施方面存在相关局限性。因此，仍有发展直接空气递送方式的需求，以有效地在收获前玉米中减轻黄曲霉毒素污染，并减轻应用对最佳环境条件的依赖性。
发明概述
我们已经开发了一种组合物，其是包含生物防治剂的水分散性颗粒制剂，能够作为可喷射的分生孢子悬浮液应用，以防止食物和饲料中的黄曲霉毒素污染，以及制备该水分散性颗粒制剂的方法。
依照本发现，本发明的一个目的是提供包含单独的非产黄曲霉毒素和非产毒的黄曲菌菌株的水分散性颗粒制剂，其能够作为生物防治剂发挥作用并抑制黄曲霉毒素-产生真菌的增殖，因而防止食物和饲料中的黄曲霉毒素污染。在本发明优选的实施方式中，称为K49的非产毒菌株被提供。
配制没有生存力损失的和在贮存和野外条件下具有高度稳定性的生物防治剂也是本发明的一个目的。
本发明的另一目的是制备干净的、易于操作的和具有相对低农作物毒性的生物防治产品。
本发明进一步的目的是包装生物防治剂为能够应用于传统农业喷雾器的制剂。
由随后的描述，本发明的其它目的和优点将变得容易明白。
发明详述
我们已经开发了包含非产毒的生物防治黄曲菌菌株的水分散性颗粒制剂的制备方法。将配制的和非配制的非产毒菌株K49的接种与土壤接种相比较，以确定对建群潜力的影响以及野外玉米中黄曲霉毒素的水平。进行该比较以评估减轻收获前玉米的黄曲霉毒素污染的直接递送方式。当对配制的和非配制的分生孢子的喷雾应用进行比较时，发现相似水平的建群和黄曲霉毒素减少。本发现的重要意义在于使用传统应用技术的适当的生物防治产品能够被开发来减轻玉米中黄曲霉毒素污染。黄曲霉毒素水平的极大减少以及生物防治菌株的明显建立支持了这样的假设——用于减少玉米中黄曲霉毒素污染的最有效方法可以是直接应用生物防治剂到玉米的黄曲霉毒素-易感器官或生殖器官。
添加高竞争力的、非产毒的黄曲菌菌株到土壤的方法已经被常规地使用，并已经导致农作物中较低浓度的毒素，这是由于曲霉属(Aspergillus)非产毒菌株变得对土壤微生物群具有生物竞争性，并阻止了通常发生在季末干旱期间的产生毒性的菌株的形成。通过竞争性的取代，土壤中自然发现的真菌的产毒菌株被添加到土壤的非产毒或非产黄曲霉度素的菌株取代。因此，遭受季末干旱压力的任何作物主要被不能产生毒素的生物竞争性菌株侵占。
但是，使用谷粒接种以控制玉米中黄曲霉毒素引起缺点，例如1)当农作物在个体发育的晚期时，固体基质的施加或许难于商业化使用，2)某些生物因素、非生物因素和天气因素能够限制或延迟分生孢子从颗粒点源分散到玉米的空气区域，和3)在野外施加的谷物上正在进行的孢子形成也许会引起健康和安全问题。最终，生物防治方法的成功由动力学或黄曲菌群落间的生物竞争控制。配制的和非配制的K49分生孢子都被应用于玉米生殖组织并且对它们对黄曲霉毒素水平的影响进行比较。当直接喷洒到玉米穗上时，配制的和非配制的分生孢子都高效地减少玉米中的黄曲霉毒素污染。尽管配制的材料被制备并储存了十一个月，但在由新收获的分生孢子组成的配制和非配制材料间没有发现效果差异。由于新产生的生物防治剂的应用不可能是商业可行的选择，因此能够有效地递送生物防治剂的稳定制剂为控制玉米和其他易受真菌毒素污染的农作物中的黄曲霉毒素提供了重要的和商业可行的选择。应用中使用的材料浓度也是不同的。本研究中的配制材料以9kg/ha应用；而基于谷物的土壤接种常规地以从20到200kg/ha的比率应用(Abbas等，2006；Cotty；Dorner等，1998；同上)。此处描述的进一步最优化的制剂以及涉及喷雾应用的方法可以进一步减少每单位面积控制玉米中黄曲霉毒素所需的制剂量。
本发明的方法适用于任何农产品，该农产品生长用于人类消费和/或动物饲料，和/或被真菌毒素损害并能够从直接应用到植物上的目标部位而受益，诸如，例如玉米、棉花、木本坚果和橄榄。
为了本发明的目的，真菌制剂或真菌农业生物防治组合物指微生物制剂，其中微生物包括，基本上由，或由曲霉属的非产毒的或非产黄曲霉毒素的菌株组成。真菌配制的制剂可以包含一种或多种曲霉属的非产毒或非产黄曲霉毒素的菌株。曲霉属的非产毒菌株包括不产生黄曲霉毒素或环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid(CPA))的任何菌株。曲霉属的非产黄曲霉毒素的菌株包括不产生毒素黄曲霉毒素但继续产生环匹阿尼酸(CPA)的任何菌株。用于本发明目的的农业生物防治组合物包括真菌的非产毒菌株或多种非产毒菌株，或者真菌的非产黄曲霉毒素菌株或多种非产黄曲霉毒素菌株，其被埋入农业上可接受的载体中，其中载体可以是真菌能够附着并且对用该组合物处理的真菌或农作物无害的任何载体。非产毒菌株的实例包括黄曲菌K49。在本发明中尤其有用的真菌是具有非产毒黄曲菌K49——被称为NRRL 30797——的鉴别特征的菌株。这些特征是不能产生毒素黄曲霉毒素和CPA并且当施加在土壤生长的农产品时能够具有生物竞争性。非产黄曲霉毒素的菌株的实例包括黄曲菌CT3。在本发明中也特别有用的真菌是具有非产黄曲霉素的黄曲菌菌株CT3——被称为NRRL 30798——的鉴别特征的菌株。这些特征是不能产生黄曲霉毒素并且当施加在土壤生长的农产品时能够具有生物竞争性。
当曲霉属的非产毒和非产黄曲霉毒素的菌株被培养为颗粒食物来源如麦子、大米、黑麦等上的单个菌株时，这些食物来源，当它们被充分建群时，包含每克食物来源大约108个菌落形成单位(CFU)的真菌。对这些颗粒食物来源，接种谷物在大约35℃进行温育。经过24小时的生长后，用手摇晃接种的麦子并再次温育24小时，进一步用手摇匀。通过确定接种物中黄曲霉毒素的浓度，接种菌株的建群得到证实。如果干燥至临界水含量以下，接种产品能够被储存在大约5℃大约2个月或更长时间。
曲霉属的非产毒和非产黄曲霉毒素的菌株以有效减少农产品中毒素水平的量被施加在植物上。此处所用的“减少毒素水平”是指与没有依据本发明的方法处理的农产品所预期的相比毒素数量减少。测量和比较毒素水平的任何精确的方法均可用于这种对比，这对本领域的技术人员来说是明显的。
此处所用的“以有效……量”、“有效……量”或“有效量”是指所给予的真菌制剂量，其中给予的效果是减少农产品的毒素污染。
实施例
现在已对本发明做了一般描述，通过引用一些具体的实施例将更好地理解本发明，在本文中包括这些实施例只是进一步阐述本发明，并不意在限制如权利要求所限定的本发明的范围。
实施例1
黄曲霉菌株
非产毒的黄曲菌菌株K49(NRRL 30797)和产黄曲霉毒素菌株F3W4(NRRL 30796)在4℃被保持在硅胶上，并证实其适当的表型特征、黄曲霉毒素概况、菌核的形成以及菌落形态以及在研究开始之前分生孢子的形成(Abbas等，2006.Biocontrol Science and Technology 16：437-449)。
实施例2
配制材料和水分散性颗粒制剂
平均粒度小于1微米的煅烧高岭土在如下水分散性颗粒制剂(WG)中被用作载体。羧甲基纤维素钠被用作除了海藻糖之外的粘结剂。海藻糖被用作多功能调配剂。这种二糖策略地包括在制剂中，作为渗透保护剂、应用后粘结剂或粘着剂以及潜在的K49的营养源。特别地，制剂中干成分的组成是：作为载体的76-90％纤维石(Satintone)5HB、作为粘结剂的1-4％Nilyn XL 90和作为渗透保护剂、应用后粘结剂和K49的营养源的5-20％海藻糖。在高剪切搅拌器中混合干成分直至目视为均匀，然后混合入大约510毫升0.1％(w/v)胨溶液中，该胨溶液包含5％总干量的海藻糖和K49分生孢子——以每500克干成分4×108CFUs/g湿混合物。从麦芽汁琼脂平板中用小等分的0.1％胨溶液采集分生孢子。因此，分生孢子被埋入配制的颗粒中。不含黄曲菌分生孢子的对比颗粒如上述制备和处理。
除了煅烧高岭土的粘土可被用于本发明的制剂，即，可以使用任何具有合适尺寸的粘土，即具有与生物尺寸相当的尺寸，和具有不导致喷雾器系统堵塞的足够小尺寸。因此，可以使用其它可能的硅酸盐粘土和粘土混合物，如，例如，膨润土、高岭石和绿土，包括蒙脱石和贝得石(beidellite)。
使用装备有1.2mm或2.0mm模具的锅式制粒机(LCI Corp)分别制备上述混合物，并真空干燥至水活度为大约0.30。2.0mm和1.2mm的颗粒被分别指定为产品1和产品2。颗粒被储存在4℃直至大约330天，在此期间通过铺在半选择性介质上，间歇地测定黄曲菌繁殖体(propagule)的存活率。使用往复式摇晃(30分钟，每分钟100次来回)将三份样品均化在水琼脂(0.2％w/v)中，连续稀释并铺在修饰的玫瑰红Bengal介质上(MDRB；Horn和Dorner.1998.Mycologia 90：767-776)。
干燥后立即对分生孢子颗粒制剂进行的分析指出其＞3×108cfu/g。观察到相对高水平的黄曲菌菌株K49的存活率，因为在配制的K49在4℃储存11个月之后没有发生进一步的生存力损失(表1)。但是，在储存2年之后观察到活真菌繁殖体仅下降50％。
配制颗粒包含埋入的生物防治剂，此处为K49分生孢子。在与水(如实施例5中)或其它水性溶液接触时，颗粒分散或分解，释放出生物防治剂并可用作生物防治剂起作用。
表1.黄曲菌菌株K49水分散性颗粒的存活率
Figure GPA00001037766300071
Figure GPA00001037766300081
给出的数据是三次重复的平均值±标准偏差。
实施例3
分生孢子和固体接种物制剂
对非配制的分生孢子接种物产品，储备培养物被转移到40个马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板中并在28℃、12小时光照(165μmol/m2/s1)和12小时黑暗体系中温育5-7天。用水性Tween20(0.2％w/v)将分生孢子和菌丝体从平板上刮下来。经过两层粗棉布(cheesecloth)过滤，从分生孢子悬浮液中除去植物真菌结构。使用血细胞计数器测量分生孢子的密度率，并调整至最终浓度为4.1×106分生孢子/mL。
如别处所述(Abbas等，2006，见上)，麦子被用于作对土壤接种的接种载体。麦子种子在水中水合过夜、排水，并在121℃聚丙烯袋(1kg/袋，含200ml水)中高压灭菌1小时。最初的黄曲菌接种物是5天大的PDA培养物，每袋3cm2大小，在35℃温育。35℃下48小时之后，麦子被完全建群。然后通过手动震荡使这一产品变均匀，并储存在4℃直至用于野外试验。
实施例4
野外建群针杆测定(Pin Bar Assay)
针杆(pin bar)接种技术(Windham等，2003.J.Toxicol.-Toxin Rev.22：313-325)被用于确定玉米的相对建群，通过将未配制的K49分生孢子悬浮液与2005年在Stoneville和Elizabeth，Mississippi进行的野外试验中的K49的WG制剂相比较进行。草甘膦抗性的杂交玉米(Garst 8270rr)被用在Stoneville试验中，而表达苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素基因的杂种(Agrigold A6333bt)被用在Elizabeth试验中。在25天，抽丝中期(mid-silking)(凹粒生长(dent kernels development))之后，玉米穗被接种。玉米穗(每次处理100个)在抽丝中期阶段使用针杆(100毫米长的三排12个缝衣针安装在木块上，每个有6毫米的尖端暴露)，分别用配制的(15g/L)或未配制的分生孢子悬浮液(5×106分生孢子/mL)接种。将针杆浸泡在分生孢子悬浮液中，并且针杆被压进穗中。在针杆接种之后的各个间隙，每次处理时收集十个接种的穗，并且基于计数和视觉上评估真菌在每个玉米粒上的生长，测定接种区域玉米粒的总数和被侵染的玉米粒数量。
在2005年使用针杆接种测定(表2)，在两个地点观察到类似的作为配制的和未配制的分生孢子引入的菌株K49的最终玉米粒建群水平。在Stoneville点(非-BT杂交)观察到的玉米粒K49建群最初的速率比Elizabeth点(BT杂交)的速率更快。Stoneville测试早于Elizabeth测试10天接种，并且气候情况可能影响建群速率。在Stoneville点，非接种对照的黄曲菌建群发生率比Elizabeth点更大。这个差异可归因于BT杂交(Elizabeth点)的使用，其降低了欧洲玉米螟(coreborer)的发生率(Dowd，B.W.2003.J.Toxicology-Toxin Review 22：327-350)。在Elizabeth地点，与非配制的分生孢子相比，接种后5和7天，产品1接种的穗中观察到更快的玉米粒建群，而在Stoneville地点，与非配制的分生孢子相比，接种后7天，两种制剂都引起优良的建群。在Stoneville地点，接种后5天以及在Elizabeth地点接种后9天，与产品2相比，在产品1中观察到菌株K49优良的建群。制剂和制剂的老化(储存20天)对K49分生孢子的建群没有不利影响，并且在某些早前的日期，配制K49的建群比未配制的分生孢子更活跃。基于这些初步的结果，产品1(2.0mm直径WG)被选择应用在第二年的野外试验中。表2.在两个地点，K49作为水分散性颗粒或游离分生孢子施加接种之后玉米粒的建群
Figure GPA00001037766300091
Figure GPA00001037766300101
每天取十次重复的平均值。后面有同一字母的值在95％置信水平明显不同。BT＝包含BT构建物的杂种，RR＝修改以抵抗草甘膦的杂种。
实施例5
野外试验黄曲霉毒素控制以及菌株建立
野外研究在2006年在Stoneville，MS进行，以评估叶面施用生物学控制无毒菌株K49以减轻黄曲菌的产黄曲霉毒素分离物的侵染和减轻黄曲霉毒素污染的功效。2006年4月14日在Stoneville，Ms的Dundee粉砂瓤土土壤里种植玉米(DK C69-70RR)。使用随意排列的完整分块设计的实验设计，在3块里重复6种处理。每个实验单元由三排9.36米(1.06米宽)组成，其中一排被处理过(中心25到30株植物)，两排是未处理缓冲。七种处理由以下组成：1)非处理对照；2)接种了产黄曲霉毒素的黄曲菌菌株F3W4(20kg/ha)的麦子接种物的土壤；3)接种了K49的麦子制剂的土壤；4)接种了F3W4和K49麦子的土壤；5)K49挤出颗粒的悬浮液；和6)新收获K49分生孢子的喷雾悬浮液的悬液。
在6月26日(抽丝阶段早期)，产黄曲霉毒素菌株F3W4以及无毒菌株K49的麦子接种物以20kg/ha的比率被施加在适合的小块地上。6月30日(抽丝阶段中期)，使用手持喷雾器施加喷雾接种物(处理5和6)。喷雾由悬浮在4升0.2％w/v Tween 20中的56g配制产品组成，以每块地大约600毫升的比率施加。喷雾直接针对植株的上部三分之一处，对准穗。在生理成熟期(8月17日)，在离处理排中心6米长度内的所有穗都被手工收割、干燥、脱壳并磨粉。
曲霉属繁殖体密度的调查和分离物表征使用选择性介质评估。磨粉谷物样品在0.2％w/v水琼脂中均化，连续稀释并铺在MDRB琼脂上。菌落形成单元(cfu)在5天的温育后计算。每块地的三十个菌落被转移到CD-PDA(有0.3％β-环糊精的PDA)并在28℃连续黑暗中温育5天，基于暴露于氨气后菌落的着色和颜色的改变评估黄曲霉毒素的产生(Abbas等，2004.Canad.J.Microbiol.50：193-199)。
所有的野外资料、建群测定、曲霉属回收和毒素表型，以及黄曲霉毒素污染使用统计分析系统(SAS.2001.
Figure GPA00001037766300111
Proprietary SoftwareRelease 8.2，Windows version 5.1.2600.SAS Institute Inc.Cary，NC)的PROC GLM进行分析。使用Fisher最小显著差法(Least SignificantDifference)进行平均分离(mean separation)。
从磨粉玉米回收的黄曲菌cfu数范围在log5.4到6.3繁殖体/g谷物，其中用K49的未配制分生孢子喷雾处理过的玉米具有最高的回收率(表3)。这一建群水平远高于在以前的研究中玉米内发现的回收率范围在log3.4到4.4cfu/g谷物的黄曲菌繁殖体计数(Abbas等，2006，同上)。在配制的和未配制的K49喷雾应用中发现产黄曲霉毒素分离物的比例最低(4％到6％)(表3)。在所有其它的处理中，观察到相似水平的产黄曲霉毒素分离物(50％到71％)并且并不显著受非产毒的菌株K49或产毒的菌株F3W4接种土壤的影响。
表3.在不同接种处理下来自玉米的黄曲菌分离物的回收率
处理   黄曲菌(log10cfu/g)   产毒的分离物(％)
  未接种   5.5bc   69a
  K49麦子接种   5.7b   52a
  F3W4麦子接种   5.7b   71a
  F3W4+K49麦子接种   5.6bc   50a
  F3W4麦子接种+K49配制喷雾   5.4c   4b
  F3W4麦子接种+K49未配制分生孢子   6.3a   6b
  LSD(Pr＞0.05水平)   0.2   42
三次重复的平均值，后面有同一字母的值在95％置信水平明显不同。
从平均cfu数和两种表型的频率，分别对配制喷雾、未配制喷雾以及所有其余处理测定无毒：产毒比例为24∶1、15∶1和1∶1。以前的研究指出，玉米穗上的K49建群能够被土壤接种增强(Abbas等，2006，同上)；但是，这在本次研究中未被观察到(表3)。对这种差异的可能的解释是，本次研究中K49的土壤接种物被施加在抽丝阶段中期；而早期的研究中，接种物施加在个体发育的V6阶段。在对棉花的研究中，Cotty(同上)观察到，与作为喷雾接种物施加时的46％和在未处理的对照区为25％相比，当作为土壤接种物施加时，67％的从棉花圆荚回收的黄曲菌与引入的非产毒菌株在同样的植物相容性组中。这表明，在这些Arizona野外试验中通过喷雾应用实现了更低程度的生物防治菌株的建立。
接受了配制的或未配制的K49喷雾处理的玉米中产黄曲霉毒素黄曲菌的低回收率水平表明，通过直接施加到玉米的繁殖结构上时引入的非产毒K49菌株，明显建立、建群和竞争性取代了产毒曲霉属。
实施例6
黄曲霉毒素测定和曲霉属回收率
依据Abbas等(2002，2006，同上)，使用商业的ELISA试剂盒(Neogen Corp，Lansing MI)定量测定了黄曲霉毒素的浓度。三份磨粉玉米的副样品(20g)在高速往复式摇床上、在100mL甲醇(70％)中萃取30分钟，并离心澄清(10分钟，8000×g)，用ELISA分析甲醇萃取液。本次测定中检测限为5ng/g总黄曲霉毒素。
在这些野外研究中，在对照的未处理区和土壤接种了产黄曲霉毒素F3W4侵染麦子的对照区中，从自然侵染观察到相对高水平的黄曲霉毒素污染。分别地，观察到428和635μg/kg黄曲霉毒素，其中这两种对照处理的样品中有很大的不同(表4)。但是，当无毒K49作为侵染的麦子颗粒进行土壤施加到未处理的或同时用F3W4土壤接种处理的土地上时，黄曲霉毒素水平分别明显地(P＜0.05)减少至44和223μg/kg。在此，与仅接种F3W4的玉米相比，土壤施加K49和F3W4导致玉米中平均黄曲霉毒素水平显著下降(～400μg/kg)。但是，接种了K49和F3W4侵染谷物的玉米中黄曲霉毒素水平与未处理的对照并无显著不同。
表4.各种接种处理影响的玉米中的黄曲霉毒素水平
  处理   黄曲霉毒素浓度(μg/kg)
  未接种   428ab
  K49小麦接种   44c
  F3W4小麦接种   635a
  F3W4+K49小麦接种   223bc
  F3W4小麦接种+K49配制的喷雾   18c
  F3W4小麦接种+K49未配制的分生孢子   21c
  LSD(Pr＞0.05水平)   287
三次重复的平均值，后面有同一字母的值在95％置信水平无显著不同。
在以前的K49作为土壤施加被引入的研究中，当存在丰富的天然黄曲霉毒素发生时，相对于未处理的土地，玉米黄曲霉毒素污染减少了58％到76％(Abbas等，2006，同上)。当土壤接种了产黄曲霉毒素分离物F3W4时，在小麦上与K49的共同接种使黄曲霉毒素污染减少了74％到95％，这相对于土壤仅接种F3W4的土地中的黄曲霉毒素浓度。在其他研究中，在两种不同的非产黄曲霉毒素曲霉属种建群的相同大米混合物处理的玉米地里，黄曲霉毒素在两个连续年里减少了66％到87％，这相对于未处理的玉米地中的黄曲霉毒素水平(Dorner等，1999，同上)。关于黄曲霉毒素百分比的减少，我们的90％和65％的结果与以前的研究是一致的。虽然K49的土壤应用使得黄曲霉毒素污染大大减少，但对于使用玉米作为食品或饲料储备来说，黄曲霉毒素浓度仍高于规定的界限。
用配制的或未配制的K49分生孢子悬浮液在土壤被产黄曲霉毒素的F3W4侵染的地里对玉米进行喷洒处理导致～615μg/kg的平均黄曲霉毒素浓度降低。具体来说，与只接受了F3W4的土壤应用的对照地中635μg/kg的黄曲霉毒素水平相比，在F3W4土壤穿刺的土地中直接施加配制的或未配制的K49到玉米的生殖结构上显著地(P＜0.05)使黄曲霉毒素水平分别减小到18和21μg/kg。因此，与K49间接土壤应用的65％相比，大于97％的平均黄曲霉毒素浓度的减少归因于K49的喷洒接种。在棉花中，谷物施加使黄曲霉毒素污染减小了75％，而当非产黄曲霉毒素的菌株被喷洒应用到生殖组织时，没有观察到影响(Cotty，同上)。但是，这些棉花实验是在Arizona进行的，那里的环境因素(低相对湿度和高温)可能限制了建立空气应用接种的成功。
由于玉米与棉花或花生的解剖学不同，对玉米而言土壤接种可能不是最有效的生物防治策略。尽管在棉花和花生中固体接种广泛使用和可靠地成功，但该方法并未被商业用于控制玉米的黄曲霉毒素。在本研究中，土壤处理和喷洒处理之间的结果差异可以用施加方法来解释。虽然花生的果实结构是在土壤表面下方，但土壤应用涉及到靠近侵染的地方。另外，棉花的繁殖结构分布在第三到第十二节，相对地靠近土壤表面。对比而言，玉米是生长快、相对较高的草本物种，在高于土壤两米的地方产生脆弱的生殖结构。为了建群和随后替换玉米上的本地产黄曲霉毒素菌株，对土壤施加的生物防治剂，具有一致的和均一的转移机理的高水平接种物可能是需要的，以达到并保持在空中的目标位置，即玉米穗。而在直接喷洒应用情况下，这一要求也许是不必要的，如同本研究所阐明的那样。将直接喷洒应用配制的K49用于商业目的的进一步优点是容易得到可行的稳定的K49分生孢子制剂。
在本说明书内提及的所有出版物和专利通过引用并入本文，其引用程度如同每篇单独的出版物或专利具体地和单独地指明通过引用并入一样。
为了阐明和描述本发明的目的，呈现了本发明的前述描述和一些代表性实施方式以及细节。这并非是穷尽性的或并非限制本发明到公开的精确形式。对本领域的技术人员来说将明显的是，可以在其中作出改变和变动而不背离本发明的范围。

Claims (29)

1.一种水分散颗粒生物防治制剂，包括：(1)减小食品和饲料产品的黄曲霉毒素污染的生物防治剂；(2)粘结剂；(3)具有渗透保护性和粘合性的试剂；(4)载体试剂，和(5)营养源，其中所述生物防治剂在悬浮液中，其中渗透保护粘合剂的量占完整制剂干重量的大约5-20％的范围，其中所述试剂和营养源作为掺混的混合物存在于所述制剂中，其中所述生物防治剂被包埋入所述混合物的基质中，并且一旦分散在水中即释放以发挥作用。
2.根据权利要求1所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述生物防治剂是有效量的非产毒或非产黄曲霉毒素的曲霉属菌株的分生孢子制剂。
3.根据权利要求2所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述曲霉属菌株选自米曲霉(Aspergillus oryzae)、黄曲霉、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)以及它们的混合物。
4.根据权利要求3所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述非产毒的曲霉属菌株是黄曲霉菌株K49。
5.根据权利要求1所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述粘结剂是羧甲基纤维素钠。
6.根据权利要求5所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述制剂包含大约4％的羧甲基纤维素钠
7.根据权利要求1所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述渗透保护粘合剂是海藻糖。
8.根据权利要求7所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述制剂包括大约20％的海藻糖。
9.根据权利要求1所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述载体试剂是具有与所述分生孢子的尺寸相当的尺寸以及具有足够小以不导致喷洒器系统堵塞的尺寸的粘土。
10.根据权利要求9所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述载体试剂是硅酸盐粘土或粘土混合物。
11.根据权利要求10所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述硅酸盐粘土或粘土混合物是煅烧高岭土、膨润土、高岭石或绿土。
12.根据权利要求11所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述载体试剂是煅烧高岭土.
13.根据权利要求12所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述制剂包括大约75-90％煅烧高岭土。
14.根据权利要求11所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述绿土是蒙脱石或贝得石。
15.根据权利要求1所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述营养源是海藻糖.
16.根据权利要求1所述的水分散颗粒生物防治剂制剂，其中所述制剂是能够在最小的搅动/搅拌下保持为悬浮液的可喷洒分散液。
17.根据权利要求16所述的制剂，其中所述可喷洒分散液是水溶液。
18.一种制备水分散颗粒制剂中生物防治剂的方法，包括以下步骤：
(a)将包含羧甲基纤维素钠、海藻糖和硅酸盐粘土或粘土混合物的干成分混合直到目视为均匀；
(b)将有效量的非产毒的或非产黄曲霉毒素的曲霉属分生孢子悬浮在包含海藻糖或其它已知的渗透保护剂/营养剂的胨溶液中，以形成含分生孢子的溶液；和
(c)将所述干成分与所述含分生孢子的溶液混合在一起，以形成所述水分散颗粒生物防治制剂。
19.根据权利要求18所述的制备水分散颗粒制剂中生物防治剂的方法，其中所述硅酸盐粘土或粘土混合物包括煅烧高岭土、膨润土、高岭石或绿土。
20.根据权利要求18所述的制备水分散颗粒制剂中生物防治剂的方法，其中所述硅酸盐粘土或粘土混合物是煅烧高岭土。
21.一种制备水分散颗粒制剂中生物防治剂的方法，包括权利要求18所述的步骤，并进一步包含在真空下干燥所述制剂以获得真空干燥颗粒的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述真空干燥颗粒被再分散到水中，以产生可喷洒制剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述真空干燥颗粒被再分散到水中，以产生包含0.2-2.0％(w/v)颗粒的可喷洒制剂。
24.根据权利要求18所述的方法，其中水分散颗粒生物防治制剂是在长期储存后能够保持108-109CFUs/g的稳定制剂。
25.根据权利要求18所述的方法，其中水分散颗粒生物防治制剂是生物防治剂的稳定制剂，其在长期储存后保持其表型和其对农作物活跃建群的特性。
26.一种减少食品和饲料产品的黄曲霉毒素污染的方法，包括将通过下述方法制备的生物防治制剂施加到所述商品：
(a)将包含羧甲基纤维素钠、海藻糖和硅酸盐粘土或粘土混合物的干成分混合直到目视为均匀；
(b)将有效量的非产毒的或非产黄曲霉毒素的曲霉属分生孢子悬浮在包含海藻糖的胨溶液中，以形成含分生孢子的溶液；和
(c)将所述干成分与所述含分生孢子的溶液混合在一起，以形成水分散颗粒生物防治制剂。
27.根据权利要求26所述的减少食品和饲料产品的黄曲霉毒素污染的方法，其中所述硅酸盐粘土或粘土混合物包括煅烧高岭土、膨润土、高岭石或绿土。
28.根据权利要求27所述的减少食品和饲料产品的黄曲霉毒素污染的方法，其中所述硅酸盐粘土或粘土混合物是煅烧高岭土。
29.根据权利要求26-28的任何一项所述的方法，其中所述产品选自花生、玉米、棉籽、谷粒、橄榄和木本坚果。
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