CN102453686B

CN102453686B - 利用D-glucal抑制黄曲霉毒素产生的方法

Info

Publication number: CN102453686B
Application number: CN 201010521546
Authority: CN
Inventors: 刘春明; 张晋丹; 晏石娟; 韩莉妲
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2030-10-27
Also published as: CN102453686A

Abstract

本发明公开了一种D-glucal在抑制黄曲霉毒素产生中的应用。本发明提供了D-glucal在抑制黄曲霉毒素产生中的应用。本发明还提供了D-glucal在制备抑制产生黄曲霉毒素的抑制剂中的应用。本发明的实验证明，D-glucal可以抑制黄曲霉毒素的产生，避免黄曲霉毒素对人类的危害。

Description

利用D-glucal抑制黄曲霉毒素产生的方法

技术领域

本发明涉及一种利用D-glucal抑制黄曲霉毒素产生的方法。

背景技术

D-glucal中文名称：D-葡萄烯糖，中文同义词D-葡萄烯糖；D-葡萄糖烯；葡萄糖烯；葡萄烯糖；D-己烯糖，分子式：C6H10O4，分子量：146.14。CAS：13265-84-4；结构式：

D-glucal是有机合成和药物合成中重要的原料，D-glucal为葡萄糖氧化酶的抑制剂。

黄曲霉毒素是自然界存在的毒性和致癌性最高的化合物之一。农产品中黄曲霉毒素污染严重威胁食品安全，而且造成巨大的经济损失。对黄曲霉菌和毒素的研究近半个世纪，已经阐明了与毒素合成有关的基因簇，并且发现了许多外界因素影响黄曲霉毒素的合成，但这些外界因子如何激活黄曲霉菌内在的毒素合成途径仍不清楚。例如，已知碳源在调节毒素合成中起着重要的作用，含简单糖的培养基支持黄曲霉毒素合成，而脂和淀粉不支持毒素合成。2000年YU等人鉴定并克隆了糖利用基因簇，这个基因簇和黄曲霉毒素基因簇毗邻，包括4个基因，其中HxtA编码一个六糖运输蛋白，用于调控糖的跨膜运输，而且有研究表明HxtA基因与毒素合成途径基因的表达同步；SugR基因编码一个含锌指功能域的调节蛋白；glcA基因编码葡萄糖苷酶，负责从淀粉或寡糖中释放葡萄糖；nadA基因编码NADH氧化酶，可能涉及重新氧化NADH到NAD+。但是有关糖利用基因簇和毒素合成关系的研究未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供D-葡萄烯糖和/或其类似物和/或其衍生物在抑制黄曲霉毒素和/或黄曲霉孢子产生中的应用。

本发明提供了D-葡萄烯糖和/或其类似物和/或其衍生物在制备抑制黄曲霉毒素和/或黄曲霉孢子产生的产品中的应用。

本发明的另一个目的是提供D-葡萄烯糖和/或其类似物和/或其衍生物在制备抑制黄曲霉毒素和/或黄曲霉孢子产生的产品中的应用。

本发明提供了D-葡萄烯糖和/或其类似物和/或其衍生物在制备抑制产生黄曲霉毒素和/或黄曲霉孢子的抑制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种抑制黄曲霉毒素和/或黄曲霉孢子生成的黄曲霉培养方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用添加D-葡萄烯糖的黄曲霉培养基培养黄曲霉，得到培养物。

所述D-葡萄烯糖在添加D-葡萄烯糖的黄曲霉培养基中的浓度为0.0025g/ml-0.04g/ml；所述D-葡萄烯糖在添加D-葡萄烯糖的黄曲霉培养基中的浓度具体为0.0025g/ml、0.005g/ml、0.01g/ml、0.02g/ml或0.04g/ml。

1L所述黄曲霉培养基按照如下方法制备：将50g葡萄糖、3g(NH₄)₂SO₄、2gMgSO₄·7H₂O、10g KH₂PO₄、700mg Na₂B₄O₇·10H₂O、680mg NaMoO₄·2H₂O、10mg FeSO₄·7H₂O、300mg CuSO₄·5H₂O、1.76g ZnSO₄·7H₂O和110mg MnSO₄·H₂O溶于水中，用水补至1L，得到黄曲霉培养基。

所述培养温度为28℃，所述培养时间为2天-5天，所述培养时间具体为5天。

所述培养为在容器与外界进行气体交换条件下进行。

所述培养容器与外界进行气体交换是通过在所述培养容器的开口处覆盖透气膜实现的。

所述黄曲霉为黄曲霉(Aspergillus flavus)CGMCC NO.3.2890。

本发明的实验证明，D-glucal可以抑制黄曲霉毒素的产生，避免黄曲霉毒素对人类的危害，本研究利用代谢组学手段，通过比较不同外界条件下产毒与否的全景代谢物变化，从代谢水平上了解毒素产生与环境因素的关系，寻找毒素合成相关的代谢途径，并通过阻断合成途径减少毒素的合成。

附图说明

图1为D-glucal抑制黄曲霉孢子在花生子叶上形成

图2为D-glucal抑制黄曲霉毒素在GMS培养基上合成

图3为D-glucal对毒素合成相关基因表达的影响

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、D-glucal抑制黄曲霉毒素产生

黄曲霉Aspergillus flavus(CGMCC N0.3.2890)，购自中国科学院微生物所菌种保藏中心；菌种的启动培养：将-80℃甘油冻存的菌种取少量均匀涂布于PDA 培养基上活化，在37℃透气条件下培养4天，可以观察到绿色的孢子产生。

孢子计数：(比浊法)将黄曲霉孢子用0.05％Tween20水反复冲洗，孢子最终呈分散颗粒，倍比稀释，分别用血球计数板计数，并取2.5ml倒入比色杯中，于OD600nm处测定光吸收，建立孢子浓度的标准曲线，待测孢子只需测定OD_600nm光吸收，通过计算确定孢子数。用Tween20(0.05％体积百分含量)水稀释分别获得密度为1X10⁵孢子悬液、1X10⁶孢子悬液、1X10⁷的孢子悬液，悬液当天配置当天使用。

1、D-glucal对黄曲霉菌的孢子数量的影响：

利用花生子叶为培养基质：用的花生为品种名为鲁花14号的花生(购自山东省花生研究所)，将花生去皮，去胚芽，用0.5％(质量百分含量)次氯酸钠水溶液消毒5分钟，然后用无菌水冲洗3次，晾干。分为如下四组，一组一个三角瓶，每个三角瓶中放10粒花生子叶：

Blank组：不接种黄曲霉孢子悬液；

0g组：接种1ml黄曲霉孢子悬液(1X10⁶)；

0.02g组：接种1ml黄曲霉孢子悬液(1X10⁶)和0.02g的D-glucal(D-葡萄烯糖，购于北京偶合科技公司，产品目录号13265-84-4)；

0.04g组：接种1ml黄曲霉孢子悬液(1X10⁶)和0.04g的D-glucal；

将上述四组28℃透气培养(用透气膜封口三角瓶)5天，实验重复三次，结果取平均值。结果如图1所示，图1A为孢子观察图，图1B为孢子数量统计图。0g组的孢子数量为2.57X10⁸/毫升；0.02g组的孢子数量为1.72X10⁸/毫升；0.04g组的孢子数量为6.3X10⁷/毫升；

可以看出，0.04g组能够明显抑制菌丝体生长并且抑制孢子的产生。

2、D-glucal抑制黄曲霉菌产生黄曲霉毒素：

1L所述GMS液体合成培养基按照如下方法制备：将50g葡萄糖、3g(NH₄)₂SO₄、2g MgSO₄·7H₂O、10g KH₂PO₄、700mg Na₂B₄O₇·10H₂O、680mg NaMoO₄·2H₂O、10mg FeSO₄·7H₂O、300mg CuSO₄·5H₂O、1.76g ZnSO₄·7H₂O和110mg MnSO₄·H₂O溶于水中，用水补至1L，得到GMS液体合成培养基。

将不同量的D-glucal添加到GMS液体合成培养基中，使D-glucal在所述含有D-葡萄烯糖的培养基中的浓度为0g/ml、0.0025g/ml、0.005g/ml、0.01g/ml、0.02g/ml、0.04g/ml，分别得到的6种培养基：含有0g/ml D-葡萄烯糖的培养基、含有0.0025g/ml D-葡萄烯糖的培养基、含有0.005g/ml D-葡萄烯糖的培养基、含有0.01g/ml D-葡萄烯糖的培养基、含有0.02g/ml D-葡萄烯糖的培养基、含有0.04g/ml D-葡萄烯糖的培养基；6种培养基的PH值均为4.28。

分别将黄曲霉孢子悬液接种到以上6种培养基上培养，具体分为6组培养：

0g/ml组：接种黄曲霉孢子悬液于1ml含有0g/ml D-葡萄烯糖的培养基中，使黄曲霉孢子的终浓度为(1X10⁵)；

0.0025g/ml组：接种黄曲霉孢子悬液于1ml含有0.0025g/ml D-葡萄烯糖的培养基中，使其终浓度为(1X10⁵)；

0.005g/ml组：接种黄曲霉孢子悬液于1ml含有0.005g/ml D-葡萄烯糖的培养基中，使其终浓度为(1X10⁵)；

0.01g/ml组：接种黄曲霉孢子悬液于1ml含有0.01g/ml D-葡萄烯糖的培养基中，使其终浓度为(1X10⁵)；

0.02g/ml组：接种黄曲霉孢子悬液于1ml含有0.02g/ml D-葡萄烯糖的培养基中，使其终浓度为(1X10⁵)；

0.04g/ml组：接种黄曲霉孢子悬液于1ml含有0.04g/ml D-葡萄烯糖的培养基中，使其终浓度为(1X10⁵)；

以上6组的培养容器均为24孔板，用透气膜将板封闭2层，将培养板置于28℃培养箱中培养5天后，提取以上6组培养物的黄曲霉毒素，提取方法：分别将以上6组24孔板中的培养物全部吸出，转移至2ml的离心管中，分别加入0.5毫升的氯仿，漩涡震荡30秒，12,000RPM 10分钟，取氯仿相，分别得到6组黄曲霉毒素。

TLC方法检测6组的黄曲霉毒素，检测方法：

各取6组黄曲霉毒素20微升点于TLC硅胶板上，同时将黄曲霉毒素标准品点于板上。将点了样的薄层板放入盛有20毫升展开剂(氯仿∶丙酮9∶1)的展开槽中，由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，待展开剂前沿前进至距薄层板最上方1cm处取出薄层板，在通风橱内挥干薄层板表面溶剂，然后用紫外光灯(365nm波长检测)照射检出斑点。

黄曲霉毒素标品为标准毒素物质aflatoxins B1，B2，G1和G2的混合物(浓度均为10微克/毫升)，购于Sigma。

结果如图2a所示，st为标准品(aflatoxins B1、B2、G1、G2的混合物)，可以看出，与0组相比，加入不同浓度的D-glucal均能明显抑制毒素的合成，以0.04g组最为显著。

进一步用HPLC方法检测上述不同浓度D-glucal处理样品的氯仿相中所含黄曲霉毒素的量，检测方法：梯度洗脱：3分钟55％H₂O，20％CH₃CN，25％CH₃OH；3.1分钟62％H₂O，38％CH₃OH；6分钟62％H₂O38％CH₃OH；流速1ml/min，柱温设定40度，10ul进样量，DAD测定360nm，色谱柱：Zorbax SB 4.6X150mm 5um。此处用的标品为aflatoxins B1、G1的混合物。

标品为aflatoxins B1的保留时间为4.95分钟，G1的保留时间为3.731分钟。样品中黄曲霉毒素B1的保留时间为4.87分钟，黄曲霉毒素G1的保留时间为3.69分钟。

28℃透气，GMS固体合成培养基下，不同浓度D-glucal处理的样品中的(第5天)黄曲霉毒素的含量具体见图2b(黄曲霉毒素B1)和2c(黄曲霉毒素G1)所示：

黄曲霉毒素B1的含量分别为：0g/ml组为29.60微克/毫升，0.0025g/ml组为17.27微克/毫升，0.005g/ml组为15.21微克/毫升，0.01g/ml组为1.80微克/毫升，0.02g/ml组为0.48微克/毫升，0.04g/ml组为0微克/毫升；

黄曲霉毒素G1的含量分别为：0g/ml组为4.21微克/毫升，0.0025g/ml组为2.89微克/毫升，0.005g/ml组为2.28微克/毫升，0.01g/ml组为0.36微克/毫升，0.02g/ml组为0.17微克/毫升，0.04g/ml组为0微克/毫升。

3.D-glucal对相关基因表达的影响

将上述2中的0g/ml组(control)和0.04g/ml组(D-glucal)培养3天的菌丝体，分别置于研钵中，加液氮研磨成粉末，取50-100mg转移至2ml离心管中，分别加入0.5ml的Trizol匀浆，依据厂家(Invitrogen)手册提取RNA，然后用Promega公司的polyAT tract mRNA isolation system III提取试剂盒提取mRNA，用ToYoBo公司的Rever tra Ace逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA，作为模板用于Q-PCR检测。采用TAKARA公司SYBR Premix Ex Tag试剂盒，Rotor-gene PCR仪进行Q-PCR检测。Q-PCR具体参数见表1：

表1PCR反应参数

基因名引物序列PCR条件

Aflo F(aflO)GTCGCATATGCCCCGGTCGG 94℃0.5min

(genbank号 R(aflO)GGCAACCAGTCGGGTTCCGG (94℃30sec，62.5℃30sec；

7914313) 72℃30sec)-40cycles

aflR F(aflR)CAACCTGATGACGACTGATA 94℃0.5min

(genbank号 R(aflR)ACAATCCTCGCCCACCATAC (94℃30sec，55℃30sec；

483326) 72℃30sec)-40cycles

aflS F(aflS)CGAGTCGCTCAGGCGCTCAA 94℃0.5min

(genbank号 R(aflS)GCTCAGACTGACCGCCGCTC (94℃30sec，62.5℃30sec；

7914325) 72℃30sec)-40cycles

-Tubulin F(β-tubulin)： 94℃0.5min

(内标，所有基CCAAGAACATGATGGCTGCT (94℃ 30sec，55℃ 30sec；

因的相对表达量 R( β-tubulin)：72℃ 30sec)-40cycles

都需要用它来计CTTGAAGAGCTCCTGGATGG

算)(genbank

号166495)

cypA F(cypA)： 94℃ 0.5min

(genbank号CGGCGGTCCCTCTTTTCCCG； (94℃ 30sec，62.5℃

7914333) R(cypA)： 30sec；72℃ 30sec)

TGCGTCGTGAGGTCGGAGGT；--40cycles

nadA F(nadA)：ACGGAGAAGGTCCGTCCGG 94℃ 0.5min

(genbank号 R(nadA)：CCTCACGCGCACGACACAGT；(94℃ 30sec，62.5℃

7909678) 30sec；72℃ 30sec)

--40cycles

hxtA F(HxtA)：GCAGGCGTGGAACGCAGTCT；94℃ 0.5min

(genbank号 R(HxtA)：ATGCGACAACCGCACTGCCA (94℃ 30sec，61℃ 30sec；

7909677) 72℃30sec)-40cycles

GlcA F(Glc)：GCGCCCATCACCGACCCAAA 94℃ 0.5min

(genbank号 R(Glc)：GCGGTCAAAGCCCACTGCCT (94℃ 30sec，61℃ 30sec；

7909676) 72℃ 30sec)-40cycles

sugR F(Sug)：CCCTTGTGTGCACCGCAACCCA 94℃ 0.5min

(genbank号 R(Sug)：CGTTCAGCCGGGGAAAGCGA (94℃ 30sec，61℃ 30sec；

7909675) 72℃30sec)-40cycles

Note：引物AFLR和-Tubulin序列来自M Tominaga-2006；其余引物均为本实验室设计

实验重复三次，结果取平均数±标准差。以下的表达量均为相对表达量，都是以-Tubulin为内标。

结果如图3所示，从3A看出，

control组aflR的表达量为0.86±0.07，

D-glucal组aflR的表达量为0.89±0.05；

control组aflS的表达量为0.97±0.07，

D-glucal组aflS的表达量为0.72±0.04；

与control组相比，D-glucal组的转录因子aflR和共调节因子aflS的表达受D-glucal影响不大；

从3B和3C中看出，

control组AflO的表达量为11.55±1.06，

D-glucal组AflO的表达量为4.11±0.15；

control组cypA的表达量为1.03±0.20，

D-glucal组cypA的表达量为0.36±0.04；

说明D-glucal能够明显抑制AflO及cypA的表达，AflO编码O-甲基转移酶，用于酶促毒素前体DMST合成ST(杂色曲霉素，为黄曲霉毒素的前体)；cypA编码细胞色素P450单氧化酶，负责黄曲霉毒素G1和G2合成。

从3D中看出，结果图3D显示：

control组nadA的表达量为1.04±0.20，

D-glucal组nadA的表达量为0.36±0.02；

control组sugR的表达量为0.26±0.00，

D-glucal组sugR的表达量为0.34±0.00；

control组GlcA的表达量为0.45±0.03，

D-glucal组GlcA的表达量为0.45±0.01；

control组hxtA的表达量为0.51±0.03，

D-glucal组hxtA的表达量为0.59±0.04；

D-glucal能够明显抑制nadA(糖利用基因簇基因)的表达，对sugR(糖利用基因簇基因)，GlcA(糖利用基因簇基因)和hxtA(糖利用基因簇基因)的表达没有大的影响。

从上述实验可以看出，D-glucal作为葡萄糖氧化酶的抑制剂，能够抑制黄曲霉在葡萄糖合成培养基上合成毒素。这种抑制作用是通过调节毒素合成相关基因的表达实现的。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

<120>利用D-glucal抑制黄曲霉毒素产生的方法

<160>18

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

gtcgcatatg ccccggtcgg 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

ggcaaccagt cgggttccgg 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>3

caacctgatg acgactgata 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>4

acaatcctcg cccaccatac 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>5

cgagtcgctc aggcgctcaa 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>6

gctcagactg accgccgctc 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>7

ccaagaacat gatggctgct 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>8

cttgaagagc tcctggatgg 20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>9

cggcggtccc tcttttcccg 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>10

tgcgtcgtga ggtcggaggt 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>11

acggagaagg tccgtccggg 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>12

cctcacgcgc acgacacagt 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>13

gcaggcgtgg aacgcagtct 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>14

atgcgacaac cgcactgcca 20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>15

gcgcccatca ccgacccaaa 20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>16

gcggtcaaag cccactgcct 20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>17

cccttgtgtg caccgcaacc ca 22

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>18

cgttcagccg gggaaagcga 20

Claims

1.D-葡萄烯糖在抑制黄曲霉产生黄曲霉毒素和/或黄曲霉孢子产生中的应用；所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1和/或黄曲霉毒素G1。

2.D-葡萄烯糖在制备抑制黄曲霉毒素和/或黄曲霉孢子产生的产品中的应用；所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1和/或黄曲霉毒素G1。

3.一种抑制黄曲霉毒素和/或黄曲霉孢子生成的黄曲霉培养方法，包括如下步骤：用添加D-葡萄烯糖的黄曲霉培养基培养黄曲霉，得到培养物；所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1和/或黄曲霉毒素G1；所述D-葡萄烯糖在添加D-葡萄烯糖的黄曲霉培养基中的浓度为0.0025g/ml-0.04g/ml；所述培养为在培养容器与外界进行气体交换条件下进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述D-葡萄烯糖在添加D-葡萄烯糖的黄曲霉培养基中的浓度为0.0025g/ml、0.005g/ml、0.01g/ml、0.02g/ml或0.04g/ml。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养中，培养温度为28℃，培养时间为2天-5天。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述黄曲霉为黄曲霉（Aspergillus flavus）CGMCC NO.3.2890。