CN101838648A - 抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA及其应用。本发明所述抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的脱氧核糖核酸序列为GAATCACTTGGCACGACACTT。本发明先设计含有抑制小鼠TRAF6基因的shRNA的DNA序列；接着将此DNA序列克隆至pENTR/U6载体上，再通过Gateway技术将位于重组载体pENTR/U6-TRAF6-shRNA上的此DNA序列转移至慢病毒载体CS-RfA-EG上，得到CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒，其能完全抑制小鼠TRAF6基因的表达。因此，该重组质粒对于TRAF6的功能研究以及TRAF6引起的疾病的治疗研究都具有极其重要的价值。

Description

抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种shRNA，特别涉及一种抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA及其应用。

背景技术

TNF receptor-associated factor 6(TRAF6，肿瘤坏死因子受体相关因子6)是细胞内的一个信号传导分子，具有广泛而且极其重要的生理功能，譬如其对于牙齿形成、淋巴结形成、破骨细胞形成是必不可少的；其能指导胸腺髓质微细构造的形成从而控制机体的中枢免疫耐受；此外，其也是调节性T淋巴细胞产生的关键因子，等等。

对TRAF6的功能研究常用TRAF6缺损小鼠及RNAi技术。TRAF6缺损小鼠全世界只有3个实验室拥有，尚不能广泛用于TRAF6的功能研究。目前所报道的干扰RNA未能完全抑制小鼠TRAF6基因的表达，影响了对TRAF6功能的研究。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种能完全抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA。

本发明的另一目的在于提供所述抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的应用。

本发明的再一目的在于提供一种含有所述shRNA的重组载体。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA，其脱氧核糖核酸序列如下所示：GAATCACTTGGCACGACACTT；

所述抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的应用于抑制小鼠TRAF6基因的表达，优选将所述shRNA构建于慢病毒载体上，再将由所述shRNA和慢病毒载体组成的重组质粒作用于小鼠或小鼠的细胞，达到抑制小鼠TRAF6基因表达的目的；

所述的慢病毒载体优选为CS-RfA-EG慢病毒载体；

将所述的shRNA构建于CS-RfA-EG慢病毒载体上，包括以下步骤：

(1)设计含有抑制小鼠TRAF6基因的shRNA的DNA序列，如下所示：

GAGTCACTTGGTACGATACTTGTCGAAGAGAAGTGTCGTGCCAAGTGATTC；

为了将其克隆至pENTR/U6载体上，合成以下DNA序列：

FP：5’-CACC

-3’

RP：5’-AAAA

-3’；

(2)将DNA序列FP(正义DNA链)和RP(反义DNA链)分别退火，然后置于冰上放置至少5min；接着将退火后的FP和RP按等摩尔量进行混合，孵育，沉淀，得到双链DNA片段；

(3)将pENTR/U6载体与步骤(2)得到的双链DNA片段进行连接，得到重组载体pENTR/U6-TRAF6-shRNA；

(4)通过Gateway技术将位于重组载体pENTR/U6-TRAF6-shRNA上的双链DNA片段转移至慢病毒载体CS-RfA-EG上，得到CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒。

所述退火的优选条件为于95℃退火5min；

所述孵育的优选条件为37℃孵育2h。

一种重组质粒，包含CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA慢病毒载体和含有所述shRNA的DNA序列；

所述DNA序列的序列如下所示：GAGTCACTTGGTACGATACTTGTCGAAGAGAAGTGTCGTGCCAAGTGATTC，其中斜体加粗部分为loop序列。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明所述抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA能完全抑制小鼠TRAF6基因的表达，其抑制效果与TRAF6缺损小鼠相同。将所述抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA构建于慢病毒载体上，得到的重组质粒既适合于体内研究也适合于体外研究，既可用于分裂细胞也可用于非分裂细胞，既能用于短暂研究也能用于长期观察。因此，该重组质粒对于TRAF6的功能研究以及TRAF6引起的疾病的治疗研究都具有极其重要的价值。

附图说明

图1是用流式细胞仪检测重组质粒导入小鼠MEF-1细胞的效率图，其中：A为对照组；B为实验组。

图2是标准的蛋白质印迹技术检测MEF-1中内源性的TRAF6被抑制情况，其中：

泳道1为TRAF6缺损MEF细胞中导入TRAF6表达质粒后的细胞；

泳道2为CS-RfA-EG质粒导入的小鼠MEF-1细胞；

泳道3为CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒导入的小鼠MEF-1细胞；

泳道4为TRAF6缺损小鼠MEF细胞。

图3是用IL-1刺激导入重组质粒的小鼠MEF-1细胞后的磷酸化表达检测图，其中：

A为CS-RfA-EG质粒；

B为CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒。

图4是重组质粒导入小鼠原代胸腺上皮细胞后制成的人工胸腺置于裸鼠中8周后的肺切片图，其中：

A为CS-RfA-EG质粒；

B为CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒；

箭头所示部位为出现炎性细胞浸润的部位。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)设计抑制小鼠TRAF6基因的shRNA的DNA序列，如下所示：

GAGTCACTTGGTACGATACTTGTCGAAGAGAAGTGTCGTGCCAAGTGATTC；

为了将其克隆至pENTR/U6载体上，合成以下DNA序列：

FP：5’-CACC

-3’

RP：5’-AAAA

-3’；

DNA序列由日本EXIGEN公司合成。

(2)将DNA序列FP和RP分别于95℃退火5min，然后置于冰上放置5min；接着将退火后的FP和RP按等摩尔量进行混合，37℃孵育2h，2倍冰冻的无水乙醇(加入0.1倍pH5.6的3M醋酸钠)沉淀，得到双链DNA片段；

(3)将pENTR/U6载体(购自Invitrogen公司)与步骤(2)得到的双链DNA片段进行连接，得到重组载体pENTR/U6-TRAF6-shRNA；

连接体系如下：

双链DNA片段               100ng

pENTR/U6载体                              20ng

DNA Ligation Kit Ver.2.0(购自TAKARA公司)  5μl

双蒸水补至10μl；

16℃连接30分钟，接着用1μl连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自TAKARA公司)，培养于依据分子克隆配方配制的LB固体培养基，其中含有50μg/ml的卡那霉素进行选择。生长出来的克隆即为阳性克隆，挑取阳性克隆培养于依据分子克隆配方配制的含有卡那霉素的2xYT液体培养基中，抽提，得到重组载体，通过测序，确定得到含有小鼠TRAF6基因的shRNA的重组载体pENTR/U6-TRAF6-shRNA。

(4)通过Gateway技术将位于重组载体pENTR/U6-TRAF6-shRNA上的双链DNA片段转移至慢病毒载体CS-RfA-EG上，得到CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒，得到CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒，具体操作过程如下：

pENTR/U6-TRAF6-shRNA                                  100ng

CS-RfA-EG(日本理化学研究，www.brc.riken.jp/lab/cfm/)  150ng

LR clonase II enzyme mix(购自Invitrogen公司)          1μl

TE                                                    共计9μl

25℃下反应6小时，加1μl蛋白酶K，37℃反应10分钟以清除多余的LRclonase II enzyme。接着取1μl前述反应液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自TAKARA公司)，于30℃在含有100μg/ml氨苄的LB固体培养基中培养22～24小时，生长出来的克隆即为阳性克隆。挑取阳性克隆，培养于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃下培养20小时，纯化质粒。通过Kpn I酶切质粒检测，获得了正确的重组质粒，将此重组质粒定义为：CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA，即小鼠TRAF6基因shRNA慢病毒质粒。用Qiagen公司的质粒大量提取盒提取该重组质粒。

(5)CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒抑制小鼠TRAF6基因表达的检测

A、用钙-磷质粒导入法，将CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA、pCMV-VSV-G-RSV-Rev(购自日本理化学研究所，http://www.brc.riken.jp/lab/cfm)以及pCAG-HIVgp(购自日本理化学研究所)按照5∶2∶2的比例导入到人胚肾293T细胞(购自ATCC)中，为实验组；以CS-RfA-EG、pCMV-VSV-G-RSV-Rev以及pCAG-HIVgp按照5∶2∶2的比例导入到人胚肾293 T细胞，为对照组；搜集细胞培养的上清液即得到含有CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA或者CS-RfA-EG质粒的病毒。

B、用含有CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA质粒的病毒感染小鼠MEF-1细胞(TRAF6不缺损)(购自ATCC)。感染步骤如下：将5x10⁴个MEF-1细胞与1x10⁶iu病毒液混悬于DMEM培养基中，按200μl混合液/孔的用量配制，每200μl混合液还包含10％FBS、100iu/ml的青霉素和链霉素和5μg/ml的polybrene，混匀后放于48well的平板培养皿中，37℃下培养1.5hr，加入500μl培养液(DMEM+10％FBS+100iu/ml青霉素+100iu/ml链霉素)，继续培养24hr，传代培养，用含有CS-RfA-EG质粒的病毒感染MEF-1细胞作为对照。培养35天后(长期观察)，FACS(流式细胞仪)检测质粒的导入率(质粒导入后，细胞表达GFP)，均为95％以上(如图1所示)，结果表明实验组和对照组的质粒的导入率均为95％以上。收集这些细胞，通过标准的蛋白质印迹技术(Developmental stage-dependentcollaboration between the TRAF6 and lymphotoxin pathways for B-cell follicleorganization in secondary lymphoid organs.J Immunol.2007，179(10)：6799-6807)检测MEF-1细胞中内源性的TRAF6被抑制情况。同时用TRAF6缺损小鼠MEF细胞(购自日本东京大学医科学研究所；http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/BunshiHatsugan)作为对照，同时利用Lipofectamine^TM 2000TransfectionReagent(购自Invitrogen公司，按说明书方法操作)将TRAF6表达质粒(TRAF6表达质粒详见：Identification of TRAF6，a novel tumor necrosis factorreceptor-associated factor protein that mediates signaling from an amino-terminaldomain of the CD40 cytoplasmic region.J.Biol.Chem.1996，271：28745-28748)转染到TRAF6缺损MEF细胞中，得到的细胞作为对照。结果表明CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA能完全抑制内源性的TRAF6的表达(如图2所示)。

用IL-1刺激(Two mechanistically and temporally distinct NF-kB activationpathways in IL-1signaling，Sci Signal.2009，2：ra66)A.中的用含有CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA质粒的病毒感染的小鼠MEF-1细胞(TRAF6不缺损)，通过标准的蛋白质印迹技术，可知I-kBα的磷酸化被完全抑制；而用IL-1刺激A.中的用含有CS-RfA-EG质粒的病毒感染的MEF-1细胞，I-kBα的磷酸化正常发生(如图3所示)，这些结果表明CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA能抑制内源性的TRAF6表达，从而阻断TRAF6依存的信号传导。

C.将含有CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA质粒的病毒浓缩后，感染小鼠原代胸腺上皮细胞，小鼠原代胸腺上皮细胞即为直接从胎鼠获得的胸腺上皮细胞(获得方法见：Dependence of Self-tolerance on TRAF6-directed Development of ThymicStroma.Science.2005，308：248-251)。病毒的用量为300iu/个细胞，感染率可达75％。作成人工胸腺后，移植入裸鼠的肾脏荚膜下，8周后，这些小鼠的肺出现炎性细胞浸润(如图4所示)，与TRAF6缺损小鼠的症状相似(见Dependence ofSelf-tolerance on TRAF6-directed Development of Thymic Stroma.Science.2005，308：248-251)，而相同处理的CS-RfA-EG质粒却没有。体内研究表明CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA抑制TRAF6的表达。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA及其应用

<130>1

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>shRNA

<400>1

gaatcacttg gcacgacact t    21

<210>2

<211>51

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>含有抑制小鼠TRAF6基因的shRNA的DNA序列

<400>2

gagtcacttg gtacgatact tgtcgaagag aagtgtcgtg ccaagtgatt c    51

<210>3

<211>55

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>正义DNA链

<400>3

caccgagtca cttggtacga tacttgtcga agagaagtgt cgtgccaagt gattc    55

<210>4

<211>55

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>反义DNA链

<400>4

aaaagaatca cttggcacga cacttctctt  cgacaagtat  cgtaccaagt  gactc    55

Claims (9)

1.一种抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA，其特征在于：所述shRNA的脱氧核糖核酸序列如下所示：GAATCACTTGGCACGACACTT。

2.权利要求1所述抑制小鼠TRAF6基因表达的shRNA的应用，其特征在于：所述shRNA应用于抑制小鼠TRAF6基因的表达。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：先将所述shRNA构建于慢病毒载体上，再将由所述shRNA和慢病毒载体组成的重组质粒应用于抑制小鼠TRAF6基因表达。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的慢病毒载体为CS-RfA-EG慢病毒载体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将所述的shRNA构建于CS-RfA-EG慢病毒载体上，包括以下步骤：

(1)设计含有抑制小鼠TRAF6基因的shRNA的DNA序列，如下所示：

GAGTCACTTGGTACGATACTT GTCGAAGAGAAGTGTCGTGCCAAGTGATTC；

为了将其克隆至pENTR/U6载体上，合成以下DNA序列：

FP：5’-CACCGAGTCACTTGGTACGATACTT GTCGAAGAGAAGTGTCGTGCCAAGTGATTC-3’

RP：5’-AAAAGAATCACTTGGCACGACACTT CTCTTCGACAAGTATCGTACCAAGTGACTC-3’；

(2)将DNA序列FP和RP退火，然后置于冰上放置至少5min；接着将退火后的FP和RP按等摩尔量进行混合，孵育，沉淀，得到双链DNA片段；

(3)将pENTR/U6载体与步骤(2)得到的双链DNA片段进行连接，得到重组载体pENTR/U6-TRAF6-shRNA；

(4)通过Gateway技术将位于重组载体pENTR/U6-TRAF6-shRNA上的双链DNA片段转移至慢病毒载体CS-RfA-EG上，得到CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重组质粒。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述退火的条件为于95℃退火5min。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述孵育的条件为37℃孵育2h。

8.一种重组质粒，含有CS-RfA-EG慢病毒载体和权利要求1所述含有抑制小鼠TRAF6基因的shRNA。

9.根据权利要求8所述的重组质粒，其特征在于：所述的重组质粒由CS-RfA-EG慢病毒载体和如下所示的含有抑制小鼠TRAF6基因的shRNA的DNA序列组成：GAGTCACTTGGTACGATACTT GTCGAAGAGAAG TGTCGTGCCAAGTGATTC；所述的GTCGAAGAG为loop序列。

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