CN101830998A - 一步法提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核糖核酸(RNA)和细胞壁多糖的提取方法，具体是用啤酒酵母制备的单细胞蛋白，包括如下步骤：添加单细胞蛋白干重10～30％的水后充分混合，慢速冷冻，并置于超声波辅助水浴中，反复解冻破壁；再加入重量比为5～18％氯化钠，迅速冷却，离心分离得上清液和细胞壁多糖沉淀物；沉淀物由水洗涤干燥后得细胞壁多糖干品。上述上清液于等电点PI4.2沉淀蛋白质后，再于等电点PI2.5沉淀RNA，并经乙醇洗涤后干燥得到RNA干品。由于采用反复冻融破壁单细胞蛋白、用调节等电点的方法分离氨基酸的混合物，具有分离提取率高、纯度高、方法简便的特点。

Description

一步法提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖的方法
技术领域
本发明涉及一种提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖的方法。
背景技术
单细胞蛋白也叫微生物蛋白，它是人工培养的微生物菌体。单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。其营养丰富，特别是利用啤酒酵母发酵生产的单细胞蛋白，其核糖核酸，细胞壁多糖等含量较高，且此种方法中使用的啤酒酵母是一种公认的无毒无害广泛被利用于医学、工业和食品领域的生物安全性较高的菌种。以往的提取工艺，大多仅限于提取一种产物，大量的具有高附加值的其他物质被废弃，特别是以往的提取工艺复杂，能耗高，普遍添加多种能造成二次污染的化学制剂，造成产品的品质的低下和环境的污染。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种一步法提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖的方法。本发明系统的解决了以啤酒酵母为培养物的单细胞蛋白的以低能耗，不添加能造成二次污染的化学制剂，一步法提取多种高附加值产物的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种一步法提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖的方法，有如下步骤：
1)冻融破壁：用啤酒酵母制备的单细胞蛋白，添加其干重10～30％的水，充分混合后缓慢冷冻至-3～0℃；再置于超声波功率100W～600W、频率为30～58KHz的50～100℃超声波辅助水浴中解冻10～80min；反复上述冻融破壁过程1～5次；得破壁后溶液；
2)细胞壁多糖提取：再将上述溶液升温至75～100℃，加入占溶液重量比为5～18％的氯化钠，保温60～140min后冷却至0～4℃，离心分离得到上清液和细胞壁多糖沉淀物；沉淀物由水洗涤干燥后得细胞壁多糖干品；
3)核糖核酸提取：取步骤2)上清液控制等电点，于等电点PI4.2沉淀得蛋白质；离心分离的蛋白质废弃，得到的上清液继续控制等电点，于等电点PI2.5静置2-10h后RNA盐就析出，乙醇洗涤杂质，干燥后获得RNA干品。
优选的，所述的步骤1)中添加的水占单细胞蛋白干重的15～20％。所述的步骤1)冷冻温度为-2～-1℃。所述的超声波辅助水浴的超声波功率为140～200W、频率为40～50KHz。所述的超声波辅助水浴的温度为75～85℃；水浴中解冻时间为20-40min。
优选的，冻融破壁为3次。所述的步骤2)氯化钠的添加量为10～12％，所述的溶液于90～95℃保温120～140min。RNA盐析出静置时间为7.5～8.5h。控制等电点PI所用的是盐酸。
本发明的原理是，各种氨基酸在其等电点时，溶解度最小，因而用调节等电点的方法，可以分离氨基酸的混合物。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明的最大特点在于冻融加超声波破壁，因为水浴加热过程中利用超声波可以加大其破壁率。而利用酶降解，成本高。用化学方法造成二次污染。冻融破壁原理是使细胞内冰晶撑破细胞壁，缓慢冷冻的原因就是使冰晶在细胞壁内逐渐增大，使细胞撑破。水浴解冻时候利用超声波在进行辅助破壁，如时间太长，蛋白质就破碎了，如果太短，达不到辅助破壁的效果，也不会使其解冻。
此外，氯化钠的添加把RNA变成了RNA盐，在75℃以上的情况下保温，RNA盐几乎全部溶解在水里，加入盐酸，调节PH值。原来PH在7左右，因为蛋白质的等电点比较高(PI4.2)，所以第一开始出现沉淀的就是多种蛋白质，把那些蛋白质离心后废弃。继续用盐酸把PH下降，到2.5这个时候RNA盐就析出了。析出来的盐肯定有杂质，这些杂质是溶于乙醇的，故用乙醇洗一下，使之更纯，然后干燥，成为干品。
由于采用反复冻融破壁单细胞蛋白、用调节等电点的方法分离氨基酸的混合物，具有分离提取率高、纯度高、方法简便的特点。
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。
具体实施方式
实施例1  提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖
用啤酒酵母制备的单细胞蛋白10克，添加其干重20％的水，充分混合后慢速冷冻至-2℃。置于功率140W、频率为42KHz的80℃超声波辅助水浴中解冻35℃，反复冻结、溶解过程3次破壁。再升温至95℃，加入12％的氯化钠，保温120min，迅速冷却至4℃，离心分离得到上清液和细胞壁多糖沉淀物；将沉淀物用水清洗2遍，干燥，称重，共获得2.037克细胞壁多糖。
上述上清液用盐酸控制等电点，于等电点PH4.2沉淀蛋白质，离心分离的蛋白质废弃。得到的上清液继续控制等电点，于等电点PH2.5静置8.5h，乙醇洗涤，干燥后获得RNA干品。利用血球计数板计算得出其破壁率为83％，核糖核酸经紫外分光光度计于A260纳米吸收峰确定。共得到0.5109克核糖核酸。
实施例2  提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖
用啤酒酵母制备的单细胞蛋白10克添加其干重10％的水，充分混合后慢速冷冻至0℃。置于功率100W、频率为30KHz的50℃超声波辅助水浴中解冻10min，冻结、溶解过程1次破壁。升温至75℃，加入5％的氯化钠，保温60min，冷却至0℃，离心分离得到上清液和细胞壁多糖沉淀物；沉淀物用水清洗2遍，干燥，称重，共获得1.087克细胞壁多糖。
上述上清液于等电点PH4.2沉淀蛋白质，离心分离的蛋白质废弃，得到的上清液继续控制等电点，于等电点PH2.5静置2h沉淀RNA，乙醇洗涤，干燥后获得RNA干品。利用血球计数板计算得出其破壁率为52％，核糖核酸经紫外分光光度计于A260纳米吸收峰确定。共得到0.1890克核糖核酸；
实施例3  提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖
用啤酒酵母制备的单细胞蛋白10克添加其干重30％的水，充分混合后慢速冷冻至-3℃。置于功率600W、频率为58KHz的100℃超声波辅助水浴中解冻80min，反复冻结、溶解过程5次。升温至100℃，加入18％的氯化钠，保温140min，冷却至4℃，离心分离得到上清液和细胞壁多糖沉淀物；沉淀物用水清洗2遍，干燥，称重，共获得1.687克细胞壁多糖。
上述上清液于等电点PH4.2沉淀蛋白质，离心分离的蛋白质废弃，得到的上清液继续控制等电点，于等电点PH2.5静置2h，乙醇洗涤，干燥后获得RNA干品。利用血球计数板计算得出其破壁率为78％，核糖核酸经紫外分光光度计于A260纳米吸收峰确定。共得到0.4630克核糖核酸。
实施例4  提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖
用啤酒酵母制备的单细胞蛋白10克添加其干重20％的水，充分混合后慢速冷冻至-2℃，置于功率140W，频率为42KHz的90℃超声波辅助水浴中解冻50min，反复冻结、溶解过程2次。升温至90℃，加入12％的氯化钠，保温100min，冷却至4℃，离心分离得到上清液和细胞壁多糖沉淀物；沉淀物用水清洗2遍，干燥，称重，共获得1.837克细胞壁多糖。
上述上清液于等电点PH4.2沉淀蛋白质，离心分离的蛋白质废弃，得到的上清液继续控制等电点，于等电点PH2.5静置2h，乙醇洗涤，干燥后获得RNA干品。利用血球计数板计算得出其破壁率为80％，核糖核酸经紫外分光光度计于A260纳米吸收峰确定。共得到0.5020克核糖核酸。
实施例5  提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖
用啤酒酵母制备的单细胞蛋白10克添加其干重10％的水，冻至-3℃，置于功率600W，频率为58KHz的95℃超声波辅助水浴中解冻10min，反复冻结、溶解过程3次。升温至95℃，加入18％的氯化钠，保温100min，冷却至4℃，离心分离得到上清液和细胞壁多糖沉淀物；沉淀物用水清洗2遍，干燥，称重，共获得1.137克细胞壁多糖。
上述上清液于等电点PH4.2沉淀蛋白质，离心分离的蛋白质废弃，得到的上清液继续控制等电点，于等电点PH2.5静置2h，乙醇洗涤，干燥后获得RNA干品。利用血球计数板计算得出其破壁率为80％，核糖核酸经紫外分光光度计于A260纳米吸收峰确定。共得到0.5103克核糖核酸。

Claims (9)

1.一种一步法提取单细胞蛋白中的核糖核酸和细胞壁多糖的方法，有如下步骤：
1)冻融破壁：用啤酒酵母制备的单细胞蛋白，添加其干重10～30％的水，充分混合后冷冻至-3～0℃；再置于超声波功率100W～600W、频率为30～58KHz的50～100℃超声波辅助水浴中解冻10～80min；反复上述冻融破壁过程1～5次；得破壁后溶液；
2)细胞壁多糖提取：再将上述溶液升温至75～100℃，加入占溶液重量比为5～18％的氯化钠，保温60～140min后冷却至0～4℃，离心分离得到上清液和细胞壁多糖沉淀物；沉淀物由水洗涤干燥后得细胞壁多糖干品；
3)核糖核酸提取：取步骤2)上清液控制等电点，于等电点PI4.2沉淀得蛋白质；离心分离的蛋白质废弃，得到的上清液继续控制等电点，于等电点PI2.5静置2-10h后RNA盐就析出，乙醇洗涤杂质，干燥后获得RNA干品。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤1)中添加的水占单细胞蛋白干重的15～20％。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的步骤1)冷冻温度为-2～-1℃。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的超声波辅助水浴的超声波功率为140～200W、频率为40～50KHz。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的超声波辅助水浴的温度为75～85℃；水浴中解冻时间为20-40min。
6.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的步骤1)冻融破壁为3次。
7.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的步骤2)氯化钠的添加量为10～12％，所述的溶液于90～95℃保温120～140min。
8.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的步骤3)RNA盐析出静置时间为7.5～8.5h。
9.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的控制等电点PI所用的是盐酸。
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