CN101818055B - 一种含三苯胺基团的快速荧光增强剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于荧光增强试剂领域、荧光显微成像检测领域，具体公开了一种含三苯胺基团的快速荧光增强剂：4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺(TBA-SCM)。本发明所述荧光增强剂具有快速荧光增强特性，在室温下可快速与任一含氨基的检测物作用获得荧光增强信号，可对食品中氨基甲酸酯类农药样品实现实时检测；由于所述荧光增强剂的分子量小，具有很好的细胞穿透力，还可快速与细胞内氨基酸分子键合，获得荧光增强信号从而完成分子识别，有望在医疗临床分析获得应用；同时，该荧光增强剂制备化工工艺简单，产率较高，易于产业化。

Description

一种含三苯胺基团的快速荧光增强剂

技术领域

本发明属于荧光增强试剂领域、荧光显微成像检测领域，具体涉及一种含三苯胺的发光小分子，所述发光小分子可与含氨基的化合物快速键合，使含氨基的化合物立刻发出明亮的蓝光，具有快速荧光增强效应。

背景技术

20世纪80年代以来，由于一系列食品原料的化学污染导致的食源性疾病呈上升趋势，食品安全问题为全世界所关注。如氨基甲酸酯类农药为乙胆碱酯酶的抑制剂，后者在神经传导中起着重要的作用，缓解神经的高度兴奋，以确保神经脉冲的有效传送。当氨基甲酸酯类农药在农业生产中的大量使用，不可避免导致瓜果、蔬菜残留氨基甲酸酯类农药，对人类健康将造成较大危害。

目前，氨基甲酸酯类农药残留检测多采用薄层色谱法、气相色谱法、搞笑液相色谱法等，例如，色谱分析法：气象色谱、高效液相色谱、气-质联用或液-质联用；生物检测法：乙酰胆碱酯酶抑制法、植物水解酶与植物酶抑制技术测定；生物传感器法：电流乙酰胆碱酯酶生物传感器法；免疫分析法：酶联免疫测定法；化学计量学分析法(李志伟.梁丹.张建夫.华中农业大学学报.2008(27)，691～695)。这些方法的检测限低、灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考，但由于需要昂贵的设备、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能满足快速简便的现场检测要求，现场的食品快速检测方法要求：①实验准备简化，使用的试剂较少，配制好的试剂保存期长；②样品前处理简单，对操作人员要求低；③分析方法简单、准确和快速。

王忠东等人发表的文章公开了一种用于检测氨基甲酸酯类农药残留的荧光系统，该系统由激发荧光和传输荧光的光学系统与探测荧光和处理荧光信号的电子系统组成；采用单光源、双光路结构，能够对测量信号和参考信号同时进行处理；采用所设计的筒式光纤探头激发并探测荧光，设计了相应的信号处理电路，实现了计算机管理(参见：王忠东.王玉田.李艳春.光学技术.2005(31))。该方案主要对检测系统进行了设计，从而使氨基甲酸酯类农药的检测准确。

若在激光激发下的“双光子荧光”发生的区域可限制在λ³(λ为入射光波长)量级的空间体积内，将使得发色团的激发更具有高度的空间选择性，将进一步提高检测的灵敏度和选择性，但目前未见氨基甲基酯类化合物的双光子荧光实时监测的报道。

技术方案

本发明的目的是提供一种含三苯胺基团的快速荧光增强剂。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种含三苯胺基团的快速荧光增强剂，4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺(TBA-SCM)，呈“D-π-A”结构特征，其中三苯胺基为电子给体“D”，琥珀酰胺基为电子受体“A”，羧基为“π-桥”，其化学式为：

上述荧光增强剂的制备方法包括以下步骤：

(1)合成4-N，N-二苯基氨基苯甲酸：使用高锰酸钾氧化4-N，N-二苯基氨基苯甲醛，然后使用盐酸调节体系pH至酸性，冷却静置析出晶体，抽滤洗涤干燥得到4-N，N-二苯基氨基苯甲酸；

(2)取等摩尔的4-N，N-二苯基氨基苯甲酸和二环己基碳二亚胺溶于二氯甲烷中，再加入N-羟基琥珀酰胺，室温反应至少18h，过滤，将滤液进行柱层析分离，浓缩得到淡黄色粉末，即4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺(TBA-SCM)。

上述技术方案中，所述荧光增强剂是以三苯胺基团为“电子给体”、琥珀酰胺为“电子受体”、羧基为“桥”的不对称分子；可与含氨基的有机分子(发光或不发光)瞬时通过酰胺键键合，使结合后产生的产物在硅胶版上呈现明亮的蓝光，因此，可以应用于含有氨基的化合物的荧光检测中，例如，实时检测氨基甲基酯类化合物。

因此，本发明同时要求保护所述荧光增强剂在实时监测含有氨基的化合物中的应用，以及在检测氨基甲基酯类化合物的应用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明所述4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺(TBA-SCM)，具有快速荧光增强效应特性，可快速与检测物中的氨基反应形成酰胺键，从而完成识别分子荧光信号的检测，可对食品中氨基甲酸酯类农药样品实现实时检测；

2.本发明所述4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺(TBA-SCM)分子量小(386)，具有很好的细胞穿透力，可快速与检测物中的氨基反应形成酰胺键，从而完成识别分子荧光信号的检测，有望在医疗临床分析获得应用；

3.本发明所述4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺(TBA-SCM)，制备化工工艺简单，产率较高，易于产业化。

附图说明

附图1、实施例二中TBA-SCM与检测物(分别记为p0、p1、p2和p3)结合前后荧光变化；

附图2、实施例二在不同时间下TBA-SCM对检测物p3的快速荧光增强谱图；

附图3、实施例二中加入20μL的TBA-SCM溶液于p0(a)和p3(b)溶液中，10秒中后观测到p0-TBA和p3-TBA的荧光寿命变化；

附图4、实施例三中p0-TBA和p3-TBA的双光子荧光增强光谱图(对照实验曲线见x-TBA-SCM曲线，x为摩尔配比的倍数)；

附图5、实施例四中TBA-SCM与不同浓度的氨基甲酸甲酯结合前后荧光变化；

附图6、实施例一中4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺(TBA-SCM)结构式；

附图7、实施例二中TBA-SCM与p0化学键合过程。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

4-N，N-二苯基氨基苯甲酸合成：在三口烧瓶中加入2.0g4-N，N-二苯基氨基苯甲醛，加入四氢呋喃使其溶解，加入预先配制好的KMnO₄溶液，反应24h后，抽滤，在滤液中加入适量HCl溶液后，与冰箱内放置过夜。取出后抽滤，将滤渣烘干即得到白色三苯胺酸粉末，产率为80％，纯度为98％以上。Mp：199-201℃.IR(KBr)：v，cm^-1 1316(C-N)，1670(C＝O)，2647，2528(COOH).¹H NMR(CDCl₃；400MHz；Me₄Si)：δ，ppm 6.981，7.002(d，2H，J＝8.4Hz)，7.156-7.173(m，5H)，7.311-7.349(m，5H)，7.915，7.895(d，2H，J＝8.0Hz)。

4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺(TBA-SCM)合成：在单口烧瓶中依次加入等摩尔的4-N，N-二苯基氨基苯甲酸和二环己基碳二亚胺于10mLCH₂Cl₂中，使其溶解，再加入1.0g N-羟基琥珀酰胺，室温反应24h后，过滤，将滤液进行柱层析分离，弄缩得到淡黄色粉末，产率约为70％。IR(KBr)：v，cm^-1 1263(C-N)，1349(N-O)，1609(C＝O)，2924(CH₂)，3453(COON)。¹H NMR(CDCl₃，300MHz，Me₄Si)：δ，ppm 7.931、7.901(d，J＝9Hz，2H，ArH)，7.371、7.345、7.319(t，J＝7.8Hz，4H，ArH)，7.178-7.151(m，6H)，6.989、6.959(d，J＝9Hz，2H，ArH)，2.866(s，4H，CH₂)。

证明制备得到4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺(TBA-SCM)，结构式如附图6。

实施例二

将20μL的TBA-SCM溶液(THF，2×10^-2mol/L)分别加入到代数为0～3的PAMAM(分别记为p0、p1、p2和p3)甲醇溶液中(2mL，2×10^-4mol/L)，10秒钟后测试其荧光增强，选择的检测物为氨基酰胺类系列化合物，分别为p0、p1、p2和p3，其中，

p1、P2和p3的通式为：

其中，p1中R＝NH₂；

其中，TBA-SCM与p0化学键合过程参见图7。

检测TBA-SCM与检测物(分别记为p0、p1、p2和p3)结合前后荧光变化，结果参见图1；

在不同时间下TBA-SCM对化合物p3的快速荧光增强谱图，在p3的甲醇溶液(2×10^-4mol/L)中加入20μL的TBA-SCM溶液(THF，2×10^-2mol/L)，结果参见图2检测到在不同时间下荧光增强的变化；从10秒至100秒，荧光强度一直持续上升，100秒后荧光强度，光强增幅四倍，发光峰位稳定在～500nm。

加入20μL的TBA-SCM溶液于p0(a)和p3(b)溶液中，10秒中后观测到p0-TBA和p3-TBA的荧光寿命变化，结果参见图3：TBA-SCM的荧光寿命为0.9ns，p0和p3的荧光寿命分别为4.21和3.66ns；当20μL的TBA-SCM溶液(2×10^-2mol/L)加入到p0和p3溶液(浓度均为2 10^-4mol/L)十秒钟后，测得p0-TBA和p3-TBA的荧光寿命均出现双寿命现象(见图3a和3b)，前者为3.73和1.83ns；后者为4.15和2.04ns。

实施例三：

分别抽取20μL、40μL、60μL、80μL的TBA-SCM溶液(THF，2×10^-2mol/L)，注入到p0甲醇溶液中(2mL，2×10^-4mol/L)，配制(p0与TBA-SCM)摩尔浓度配比分别为1∶1、2∶1、3∶1和4∶1的p0-TBA溶液；同样地，分别配制(p3与TBA-SCM)摩尔浓度配比为1∶1、2∶1和3∶1的p3-TBA溶液；10秒钟后测其双光子荧光，结果参见图4：当TBA-SCM与p0或p3瞬时结合后，随着TBA-SCM摩尔浓度配比从1(p0和p3的摩尔配比恒定为1)增加到4时，与对照实验比较(见图4)可知，p3-TBA和p0-TBA的双光子荧光强度明显增加，当增大到4∶1时，p0-TBA双光子荧光强度趋于平缓，但明显高于对照实验x-TBA曲线，p3-TBA的双光子荧光强度则急剧增加，这种快速反应从而引起单、双子荧光增强的效应，可在(双光子)荧光显微成像、荧光检测、传感等方面获得应用。

实施例四

检测TBA-SCM与不同浓度的氨基甲酸甲酯结合前后荧光变化，结果参见图5：将1.5mLTBA-SCM溶液(1×10^-3mol dm^-3，THF)分别加入到浓度为1×10^-3、1×10^-6和1×10^-8mol·dm^-3的氨基甲酸甲酯溶液(1.5mL，THF)，此时荧光信号明显增强，与对照实验相比(见曲线a)，当氨基甲酸甲酯的检测浓度为1×10^-3mol·dm^-3时荧光强度为对照样的1.7倍(见曲线b)；当氨基甲酸甲酯的检测浓度为1×10^-6mol·dm^-3时荧光强度达到最大，为对照样的2.5倍(见曲线c)，当氨基甲酸甲酯的检测浓度为1×10^-8mol dm^-3时，此时荧光强度略有下降，为对照样的1.5倍(见曲线d)。

Claims (3)

1.一种含三苯胺基团的快速荧光增强剂，其特征在于，所述含三苯胺基团的快速荧光增强剂为4-N，N-二苯基氨基苯甲酸琥珀酰亚胺，呈“D-π-A”结构特征，其中三苯胺基为电子给体“D”，琥珀酰胺基为电子受体“A”，羧基为“π-桥”，其化学式为：

2.权利要求1所述荧光增强剂在实时监测含有氨基的化合物中的应用。

3.权利要求1所述荧光增强剂在检测氨基甲基酯类化合物的应用。

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