CN101817833B - Dpp-iv抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种式I所示的杂化并嘧啶酮类DPP-IV抑制剂或其盐、其制备方法、组合物及其在预防或治疗受益于DPP-IV抑制的疾病中的用途。本发明化合物制备工艺简单，原料易得，适合工业化大规模生产，经体外和体内实验验证，其对DPP-IV具有非常好的选择性抑制作用，在有效抑制DPP-IV活性的同时，对DPP-VIII和DPP-IX的活性几乎没有影响，开发成药后其毒性会比较低，而且较同机理药物Alogliptin的作用效果更强，作用时间更长，显示了优秀的降糖和增加胰岛素敏感性的作用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地涉及一种以杂环并嘧啶酮为母核的化合物或其盐、其制备方法、组合物以及这类化合物作为二肽基肽酶(DPP-IV)抑制剂在预防或治疗受益于DPP-IV抑制的疾病中的用途。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种多病因的代谢性疾病，是由于胰岛素的绝对或相对不足造成血糖升高而引起机体代谢紊乱。它可以分为胰岛素依赖型糖尿病(insulindependent diabetes mellitus，IDDM，即I型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(noninsulindependent diabetes mellitus，NIDDM，即II型糖尿病)，其中II型糖尿病最为常见，占糖尿病病人的90％以上。目前糖尿病治疗药物的研究多是针对II型糖尿病展开的。传统的降糖药物种类繁多，主要有三大类：胰岛素增敏剂，包括双胍类(如二甲双胍)和噻唑烷二酮类(如吡格列酮)；胰岛素促分泌剂，包括磺酰脲类(如格列吡嗪)；以及α-葡萄糖苷酶抑制剂(如阿卡波糖)等。
上述传统降糖药一般都伴有体重增加、低血糖等副作用以及药效逐渐降低等问题，因此迫切需要开发新型的药物。二肽基肽酶(Dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV)抑制剂是最新一代的抗糖尿病药物，是基于胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的治疗药物，能够有效控制血糖而不增加体重，不引起低血糖等副作用，为糖尿病的治疗带来了希望。
DPP-IV是一种广泛分布于体内的糖蛋白，其功能类似于丝氨酸蛋白酶，通过对多肽的剪切使其失活，从而达到调节生理功能的作用。GLP-1(Glucagon-like peptide)是一种内源性的激素，随着餐后血糖升高，小肠中的L-细胞就分泌产生GLP-1，进而刺激胰岛素分泌，以此降低血糖。基于GLP-1的治疗方案可以有效地控制血糖，但是GLP-1作为DPP-IV的底物，半衰期很短，分泌后1-2分钟之内就会被DPP-IV迅速剪切，失活。因此基于GLP-1的作用机制可以采用两种新药开发的策略：开发DPP-IV耐受的GLP-1类似物和开发DPP-IV抑制剂。本发明人就是基于后一开发思路，发现杂环并嘧啶酮类化合物是一种有效的DPP-IV抑制剂，能够有效降低血糖，同时不引起体重增加和低血糖等风险，并基于此完成本发明。
发明内容
本发明一方面提供一种新型杂环并嘧啶酮类衍生物或其盐，其结构如下式I所示：
其中，R6、R7、R8、R9相同或不同，各自独立地选自氢、氰基、氨基、卤素、羟基、低级烷基、低级烷氧基；
X、Y相同或不同，各自独立地选自C、N、S、O，条件是X、Y中至少有一个是N、S或O；
当X、Y为C或N时，R3、R5相同或不同，各自独立地选自氢、低级烷基、低级烷氧基、芳基、杂芳基；
R4选自氢、低级烷基、低级烷氧基、芳基、杂芳基。
本发明所述的低级烷基是指由1-4个碳原子组成的直链或支链的饱和烷基，具体的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等。
本发明所述的低级烷氧基是指具有低级烷基取代的含氧部分，即-O-低级烷基基团，具体的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。
本发明所述的芳基是指含有5-12个碳原子的全碳单环或稠合多环(即，多个环共有相邻的碳原子对)基团，具有完全共轭的π电子体系，芳基的非限制性实例如苯基、萘基等。芳基可以是取代的或未取代的，取代基选自低级烷基、低级烷氧基、芳基、卤素、氨基、羟基等。
本发明所述的杂芳基是指有3-7个原子的单环芳基，至少含有1个选自N、O或S的杂原子，其余的原子是C，此外，还有完全共轭的π电子体系。杂芳基可以是取代的或未取代的，取代基选自低级烷基、低级烷氧基、芳基、羟基、氨基等。未取代的杂芳基的非限制性实例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、吡唑、吡啶、嘧啶等。
本发明所述的化合物或其盐，优选下列式II-式VI所示的化合物或其盐：
式IV，
其中，R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9同上述式I化合物中的定义相同。
本发明所述的化合物或其盐，更优选下列式III的化合物或其盐：
其中，R6、R7、R8、R9同上述式I化合物中定义相同，R4、R5选自氢、低级烷基、低级烷氧基。
本发明所提供的具体化合物举例如下：
本发明再一方面提供上述杂环并嘧啶酮类衍生物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)式A的化合物与式B的化合物反应生成式C的化合物；
式A 式C
(2)式C的化合物与式D的化合物反应生成式I的化合物；
其中，R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、X、Y同上述式I化合物中定义相同，Hal为氯或溴，Hal’为氯、溴或碘。
本发明再一方面提供一种式A的化合物：
其中，R3、R4、R5、X、Y同上述式I化合物中定义相同；Hal选自氯或溴。式A优选下列结构的化合物：
本发明再一方面提供式A化合物在制备本发明所述的上述杂环并嘧啶酮类化合物中的用途。
本发明另一方面提供上述式A化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(a)式F的化合物与卤化试剂发生卤代反应生成式G的化合物；
(b)式G的化合物在有机溶剂和碱水溶液中或在碱水溶液中水解生成式A的化合物；
其中X、Y、R3、R4、R5同上述式I化合物中定义相同，Hal为氯或溴；步骤(a)中所述的卤化试剂选自三氯氧磷、三溴氧磷、五氯化磷或二氯亚砜；步骤(b)中所述的有机溶剂选自四氢呋喃、乙腈、醇类溶剂、二甲基甲酰胺、1，4-二氧六环；碱水溶液选自氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液等。所述的醇类溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、丁醇、叔丁醇等本领域常用的醇类溶剂。
具体地说，本发明的合成路线如下，详细的制备方法会因原料、合成条件、合成前体的不同而变化，但基本都经过以下反应完成：
其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、X、Y同上述式I中所述的定义相同，Hal为氯或溴，Hal’为氯、溴或碘；当式A中的X-R3或Y-R5为N-H基团时，应当先用常规的保护基团对其中的N进行保护，然后再使带有保护基的式A化合物与式B化合物进行反应，随后用常规的方法脱去保护基，得到式C的化合物。
具体反应方法举例如下：
1)将式F的化合物加入到卤化试剂中，加热反应6-10小时，反应液冷却，减压蒸发除去大部分卤化试剂，将残留液加入到碎冰中，剧烈搅拌，将析出的固体过滤、干燥得式G的化合物；
2)将式G的化合物溶于有机溶剂，加入碱水溶液，或者直接悬浮于碱水溶液中，加热反应4-24小时，减压蒸去有机溶剂，用冰醋酸调pH至4-6，随后进行抽滤或萃取等简单处理，得到式A的化合物；
3)将式A的化合物溶于干燥的乙二醇二甲醚和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂(4∶1-0∶1)，加入60％的氢化钠，然后加入无水溴化锂，再加入式B化合物，混合物加热反应10-18小时，冷却，加入反应液体积的5-8倍的水，即有固体析出，抽滤、干燥得式C的化合物；
4)将1当量的式C的化合物，1.05-5当量式D的化合物，3-5当量碳酸氢钠和5-10倍体积量的无水乙醇混合，加热至150℃回流6-15小时，冷却，过滤，滤液减压浓缩，纯化后得到式I的化合物。
其中，步骤(1)中所述的卤化试剂为三氯氧磷、三溴氧磷、五氯化磷或二氯亚砜；步骤(2)中所述的有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、醇类溶剂、二甲基甲酰胺、1，4-二氧六环等。
当式A中的X-R3或Y-R5为N-H基团时，上述步骤(2)结束后制得的式A化合物先用常规的保护基团如(BOC)2O等对其中的N进行保护，然后再进行步骤(3)的反应，使带有保护基的式A化合物与式B化合物进行反应，在本发明步骤(3)的条件下，随着反应的进行，保护基团BOC会自然脱去，得到式C的化合物。
上述方法中，式F的化合物可以按照本领域已知的方法合成得到或者从市场上买到，比如，当式F中的X、Y为C或S时，可以采用下列方法合成式F化合物：
使式E的化合物与尿素或者氯磺酰异氰酸酯发生缩合反应生成式F的化合物，其中，式E的化合物可以从市场上买到或通过本领域常用的方法合成得到；
其中，X、Y为C或S，R3、R4、R5同上述式I中所述的定义相同，R10为低级烷基。
本发明提供的上述杂环并嘧啶酮类化合物可以以其盐、水合物的形式存在，它们在体内转化为本发明化合物，例如，在本发明的范围内，按照本领域熟知的工艺，将本发明化合物转化为药学上可接受的盐的形式，并且以盐形式使用它们。
当本发明化合物具备游离碱的形式时，使化合物的游离碱形式与药学上可接受的无机或有机酸反应，可以制备本发明化合物的酸加成盐，这些盐包括但不限于：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙磺酸盐、甲苯磺酸盐和苯磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐和水杨酸盐、丙二酸盐、己二酸盐、己酸盐、精氨酸盐、富马酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐、草酸盐等。
当本发明化合物具备游离酸的形式时，使其游离酸形式与药学上可接受的无机或有机碱反应可以制备本发明化合物的碱加成盐，这类盐包括但不限于：锂、钠、钾、钡、钙、镁、铝、铁、亚铁、铜、锌盐，或与吗啉、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三甲胺、赖氨酸或组胺酸组成的盐。
上述每一通式所代表的化合物，包含单一的立体异构体和立体异构体混合物的形式。
本发明再一方面提供所述的杂环并嘧啶酮类化合物在制备治疗或预防受益于DPP-IV抑制的疾病的药物中的用途。所述的受益于DPP-IV抑制的疾病选自II型糖尿病、糖尿病性脂血异常、葡萄糖耐量减低(IGT)症、禁食血浆葡萄糖减低(IFG)症、代谢性酸中毒、酮症、食欲调节、肥胖症、各种癌症、神经系统病症、免疫系统病症等，优选地包括II型糖尿病和肥胖症。
本发明再一方面提供一种药物组合物，包括本发明所述的杂环并嘧啶酮类DPP-IV抑制剂和一种或几种药学上可接受的辅料。本发明所述的组合物可以是液体、半液体或固体形式，按照适合于所用的给药途径的方式配制。本发明所述的组合物可以按照下列给药方式给药：口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、透皮、舌下、肌内、直肠、口腔、鼻内、脂质体等方式。
口服组合物可以是固体、凝胶或液体。固体制剂的实例包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂和散装粉剂。这些制剂可以选择地含有粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、甜味剂和矫味剂等。粘合剂的实例包括但不限于微晶纤维素、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶溶液、蔗糖和淀粉糊；润滑剂的实例包括但不限于滑石、淀粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸；稀释剂的实例包括但不限于乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、磷酸二钙；助流剂的实例包括但不限于二氧化硅；崩解剂的实例包括但不限于交联羧甲基纤维素钠、淀粉羟乙酸钠、藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素。
以肠胃外给予本发明组合物，一般以注射为主，包括皮下、肌内或静脉内注射。注射剂可以被制成任何常规形式，如液体溶液或悬液、适合于在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式或者乳剂。可用于本发明注射剂的药学上可接收的载体的实例包括但不限于水性载体、非水性载体、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧剂、悬浮与分散剂、乳化剂、螯合剂和其它药学上可接受的物质。水性载体的实例包括氯化钠注射液、林格式注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖与乳酸化林格氏注射液；非水性载体的实例包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油；抗微生物剂的实例包括间甲酚、苄醇、氯丁醇、苯扎氯铵等；等渗剂的实例包括氯化钠和葡萄糖；缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。
本发明组合物还可以制备成无菌的冻干粉针剂，将化合物溶于磷酸钠缓冲溶液，其中含有葡萄糖或其他适合的赋形剂，随后在本领域技术人员已知的标准条件下将溶液无菌过滤，继之以冷冻干燥，得到所需的制剂。
本发明提供的上述杂环并嘧啶酮类化合物制备工艺简单，原料易得，适合工业化大规模生产，并且经体外和体内实验验证，本发明化合物对DPP-IV具有非常好的选择性抑制作用，在有效抑制DPP-IV活性的同时，对DPP-VIII和DPP-IX的活性几乎没有影响，可以预见本发明化合物开发成药后毒性将远低于对照药，具有突出的优势，并且本发明化合物较同机理药物Alogliptin的作用效果更强，作用时间更长，显示了优秀的降糖和增加胰岛素敏感性的作用。
附图说明
附图1本发明化合物的小鼠葡萄糖耐量实验结果
具体实施方式
本发明提供的化合物可以通过多种制备方法来合成，实施例中仅提供了合成这些化合物的代表性方法。这里要说明的是，不管以何种方式开发的本发明化合物的游离酸和/或碱形式，还是盐的形式，均属于本发明的范围。具体实施例的目的是进一步说明本发明内容但不意味着对本发明进行限制。
本发明具体实施例中使用的初始原料、反应试剂等均为市售产品。
实施例1.化合物1的合成
合成路线：
合成化合物1-2
将尿素(1mol，60g)加入到250ml干燥的单口圆底烧瓶中，油浴下加热到160℃至熔融，加入(0.13mol，20g)3-氨基噻吩-2-甲酸甲酯，混合物在190-200℃加热反应3小时，冷却，加入500ml 10％的氢氧化钠水溶液，搅拌均匀，抽滤，5-10％氢氧化钠水溶液洗涤，滤液于冰浴下用2N HCl溶液调pH至6.5，有白色固体析出，抽滤，冰水洗，干燥得白色固体12.5g，收率59％。
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ6.9(1H，d，J＝5.2Hz)，8.10(1H，d，J＝5.2Hz)，11.60-11.1(2H，br，s)；MS：169.1[M+H+]。
合成化合物1-3
将上步骤中得到的化合物1-2(74.3mmol，12.5g)与200ml三氯氧磷混合，加热回流8小时，冷至室温，减压蒸去大部分三氯氧磷，残留液缓慢倒入到碎冰中，剧烈搅拌，有白色固体析出，抽滤，冷水洗，干燥得白色絮状固体10.2g，收率67％。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.55(1H，d，J＝5.5Hz)，8.13(1H，d，J＝5.5Hz)；MS：206.9[M+H+]。
合成化合物1-4
将上步骤中得到的化合物1-3(49.7mmol，10.2g)溶于120ml四氢呋喃中，冰浴下加入1N氢氧化钠水溶液120ml，氮气保护下室温反应8小时，低温减压蒸去四氢呋喃，冰醋酸调pH至5.5，有固体析出，抽滤，冷水洗，干燥得淡黄色固体8.4g，收率90.5％。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ7.55(1H，d，J＝5.5Hz)，8.2(1H，d，J＝5.5Hz)，13.47(1H，br，s)；MS：187.0[M+H+]。
合成化合物1-5
将上步骤中得到的化合物1-4(44.9mmol，8.4g)用干燥的120ml DME和30ml DMF的混合溶剂溶解，冰浴下加入60％的氢化钠(2.1g，51.6mmol)，搅拌20分钟，再加入无水溴化锂(7.9g，89.7mmol)，升至室温，搅拌30分钟，加入邻氰基苄溴(10.15g，51.6mmol)，加热至65℃反应14小时，反应液用冰浴冷却，缓慢加入反应液体积8倍量的水，有固体析出，抽滤，冷水洗，干燥得13.1g化合物1-5，收率96.8％。
1H-NMR(400MHz，DMSO)：δ5.77(2H，br，s)，7.16(1H，d，J＝8Hz)，7.32(1H，d，J＝5.2Hz)，7.43(1H，t，J＝7.6Hz)，7.55(1H，t，J＝7.6Hz)，7.73(1H，d，J＝7.6Hz)，7.88(1H，d，J＝5.2Hz)；MS：302.0[M+H+]。
合成化合物1
将上步骤中得到的化合物1-5(13.1g，43.41mmol)，3-(R)-氨基哌啶二盐酸盐(11.5g，66mmol)，碳酸氢钠(17.4g，173.6mmol)，300ml无水乙醇和4g分子筛4A先后加入500ml单口圆底烧瓶中，混合物加热至150℃，回流反应12小时，冷至室温，过滤，滤液减压浓缩，所得油状物经柱层析分离纯化(先乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1，然后二氯甲烷∶甲醇＝15∶1洗涤)得浅黄色固体化合物1。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.25(1H，m)，1.67(1H，m)，1.76(1H，m)，1.96(1H，m)，2.67(1H，m)，2.88(2H，m)，3.21(1H，m)，3.39(1H，m)，5.56(2H，s)，7.12(1H，d，J＝8Hz)，7.25(1H，d，J＝4.8Hz)，7.42(1H，t，J＝7.6Hz)，7.57(1H，t，J＝7.6Hz)，7.73(1H，d，J＝8Hz)，7.98(1H，dd，J＝2Hz，2Hz)；MS：366.1[M+H+]。
实施例2.化合物2的合成
用化合物2-1代替实施例1中的化合物1-1，合成方法参考实施例1，制备得到浅黄色固体化合物2，收率45％。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.25(1H，m)，1.75(1H，m)，1.77(1H，m)，1.96(1H，m)，2.03(1H，m)，2.33(3H，s)，2.71(1H，m)，2.81(1H，s)，2.89(1H，m)，3.21(1H，m)，3.42(2H，m)，5.55(2H，ABq)，7.08(1H，d，J＝8Hz)，7.39(1H，t，J＝7.6Hz)，7.56(1H，t，J＝7.8Hz)，7.59(1H，s)，7.69(1H，d，J＝7.6Hz)；MS：380.1[M+H+]，402.1[M+Na+]。
实施例3.化合物3的合成
合成路线
合成化合物3-2
于250ml圆底烧瓶中加入化合物3-1(77.5g，0.5mol)，氰乙酸甲酯(99.1g，1mol)和50ml甲醇，冰浴下分别滴入1mlDMF和5ml三乙胺，加热至70℃反应3小时，减压蒸除溶剂，剩余物用1L冷水处理、搅拌，得到灰褐色沉淀，抽滤，冷水洗，干燥得到113g灰色固体化合物3-2，收率79.6％。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ6.98(1H，d，J＝5.2Hz)，6.30(1H，d，J＝5.2Hz)，4.0(2H，s)，3.80(3H，s)；MS：158.0[M+H+]。
合成化合物3-3
将上步骤中得到的化合物3-2(9.5g，6mmol)溶于300ml干燥的二氯甲烷，冷至-60℃，氮气保护下滴加9g氯磺酰异氰酸酯，滴加完毕，升至室温反应20分钟，TLC显示反应完全。减压除去溶剂，加入200ml水，75℃搅拌1小时以除去过量的氯磺酰异氰酸酯，再冷至室温，加入200ml 10N的NaOH溶液，升温至85℃搅拌30分钟，冰浴下用浓HCl调pH至1，产生沉淀，抽滤，水洗，干燥得8g灰白色固体化合物3-3，收率78.4％。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(1H，s)，11.20(1H，s)，7.12(1H，d，J＝5.6Hz)，7.08(1H，d，J＝5.6Hz)；MS：169.0[M+H+]。
合成化合物3-4
于冰水浴中，将化合物3-3(8g，47.6mmol)与4.2g N，N-二甲基苯胺，40ml乙腈和200ml POCl3混合，搅拌30分钟，然后加热回流12小时，TLC显示反应完全。冷至室温，缓慢倾入500ml碎冰中，剧烈搅拌，有沉淀析出，抽滤，冷水洗，干燥得8.8g淡黄色固体化合物3-4，收率90.2％。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.15(1H，d，J＝6.4Hz)，7.55(1H，d，J＝6.4Hz)；MS：206.9[M+H+]。
合成化合物3
采用化合物1的合成方法，制备得到化合物3，为浅黄色固体，收率50.5％。1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ＝7.73(1H，d，J＝7.6Hz)，7.58(1H，t，J＝7.6Hz)，7.42(1H，t，J＝7.6Hz)，7.28(2H，dd，J＝6.8Hz，6Hz)，7.19(1H，d，J＝8Hz)，5.53(2H，s)，3.49(1H，dd)，3.32(1H，d)，3.25(1H，d)，3.07(1H，s)，2.86(2H，m)，1.80(1H，d，J＝5Hz)，1.71(2H，m)，1.36(2H，m)；MS：366.0[M+H+]。
实施例4.化合物4的合成
以2-氨基-4-甲基噻吩-3-甲酸乙酯为原料，代替化合物3的合成路线中的原料3-2，其余步骤参考化合物3的合成方法，制备得到化合物4，浅黄色固体，收率50.5％。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.71(1H，d，J＝7.6Hz)，7.6(2H，m)，7.44(1H，dd，J＝6.8Hz，6Hz)，6.42(1H，d，J＝4Hz)，5.71(2H，s)，4.54(1H，dd)，4.42(1H，dd)，3.06(1H，m)，2.84(2H，m)，2.46(3H，s)，1.98(1H，m)，1.76(1H，m)，1.54(2H，m)，1.34(2H，m)；MS：380.1[M+H+]，402.1[M+Na+]。
实施例5.化合物5的合成
合成路线：
合成化合物5-2
将39.4g溴乙缩醛二乙醇用250mlDMF溶解，然后加入2.4g NaI，39.6g氰基乙酸甲酯和55.0g无水碳酸钾，加热至70℃反应过夜，TLC显示反应完全。反应液降至室温，用500ml水处理，300ml乙醚萃取3次，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析分离，得到24.9g浅黄绿色液体化合物5-2，收率57.8％。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ4.69(1H，t，J＝5.6Hz)，3.82(3H，s)，3.73(3H，m)，3.54(2H，m)，2.25(2H，m)，1.21(6H，m)；MS：214.1[M-H+]。
合成化合物5-3
将2g化合物5-2和0.67g尿素加入到由0.44g钠与50ml无水乙醇制备的乙醇钠溶液中，室温搅拌30分钟，然后加热回流7小时，蒸除乙醇，剩余物用30ml水处理，乙醚洗涤并弃之，所得水相用冰醋酸调pH至6.5，得到白色沉淀，抽滤，水洗，干燥得到640mg白色固体化合物5-3，收率28.3％。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.24(1H，s)，9.95(1H，s)，5.84(2H，s)，4.45(1H，s)，3.58(2H，q)，2.39(2H，d，J＝5.2Hz)，1.07(6H，t，J＝6.8Hz)；MS：266.0[M+Na+]。
合成化合物5-4
将630mg化合物5-3悬浮于50ml 0.2N的HCl溶液中，室温搅拌5小时，有大量白色固体析出，抽滤，水洗，干燥得350mg灰白色固体化合物5-4，收率81％。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.44(1H，s)，11.09(1H，s)，10.47(1H，s)，6.56(1H，t，J＝2.4Hz)，6.22(1H，t，J＝2.4Hz)；MS：152.1[M+H+]。
合成化合物5-5
将3.6g化合物5-4溶于10ml甲苯中，加入7ml三氯氧磷，加热至70℃滴加DIPEA 8.2ml，滴毕，100℃反应过夜，TLC显示反应完全。降至室温，倾入到150ml冰水混合物中，剧烈搅拌，有沉淀析出。抽滤，冷水洗，干燥得3.42g深黄色固体，收率77.2％。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.77(1H，s)，7.72(1H，t，J＝2.8Hz)，6.65(1H，dd，J＝2.0Hz，1.6Hz)；MS：190.0[M+H+]。
合成化合物5-6
将400mg化合物5-5悬浮于12ml 2N的KOH水溶液中，100℃下反应4小时，然后冷至室温。倾入50ml冷水中，冰浴下滴加冰醋酸调pH＝6.5，再用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗，干燥，过滤，浓缩得到240mg黄色固体，收率：80.6％。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.75(1H，br，s)，12.02(1H，s)，7.06(1H，t，J＝2.8Hz)，6.45(1H，t，J＝2.8Hz)；MS：168.0[M+H+]。
合成化合物5-7
将240mg化合物5-6溶于30mlTHF中，然后分别加入143mg三乙胺，320mg(BOC)2O和9mg DMAP，室温搅拌2小时，TLC显示反应完全。反应混合物减压浓缩，剩余物经柱层析分离得到340mg白色固体，收率89％。
1H-NMR(400MHz，CD3Cl3)：δ12.76(1H，br，s)，7.37(1H，d，J＝4.0Hz)，6.73(1H，d，J＝3.6Hz)，1.68(9H，t，J＝7.6Hz)；MS：292.0[M+Na+]。
合成化合物5-8
采用制备化合物1-5相同的合成方法，由310mg化合物5-7制备得到144mg白色固体形式的化合物5-8，收率：44.1％。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.20(1H，s)，7.90(1H，d，J＝7.6Hz)，7.65(1H，t)，7.50(1H，t)，7.15(2H，m)，6.54(1H，t)，5.58(2H，s)；MS：285.0[M+H+]，307.0[M+Na+]。
合成化合物5
参考合成化合物1的方法，制备得到浅黄色固体形式的化合物5，收率63％。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ10.90(1H，br，s)，7.59(1H，d，J＝7.6Hz)，7.36(1H，t，J＝7.6Hz)，7.25(1H，t，J＝7.6Hz)，6.97(1H，d，J＝7.6Hz)，6.76(1H，d，J＝7.6Hz)，6.59(1H，d，J＝7.6Hz)，5.53(2H，d，J＝5.2Hz)，3.13(1H，t，J＝2.4Hz)，2.96(2H，m)，2.71(2H，t)，1.86(2H，m)，1.69(1H，m)，1.56(1H，m)；MS：349.1[M+H+]，371.1[M+Na+]。
实施例6.体外活性实验
本发明提供的化合物对DPP-IV的抑制率可以用DPP-IV-GloTM蛋白水解酶的均相发光检测系统(DPP-IV-GloTM Protease Assay，Promega cat#G8350)测得。该系统含有DPP-IV底物Gly-Pro-氨基萤光素和萤光素酶活性检测的缓冲液系统，DPPIV-GloTM被DPP-IV切割后会激活萤光素酶反应，产生“glow-type”型发光信号，再用Turner VeritasTM微孔板发光光度计检测发光信号即可表征DPP-IV的活性。
1、实验目的
测定本发明化合物对DPP-IV酶的抑制活性以及选择性抑制作用。
2、实验材料
DPP-IV酶、DPP-VIII酶、DPP-IX酶、GP-AMC(BioMol)、黑色96孔板、超级酶标仪；
DPP-IV和DPP-VIII的分析缓冲液：100mmol/l Tris/HCl buffer，pH 8.0，0.1mg/ml BSA；
DPP-IX的分析缓冲液：100mmol/l Tris/HCl buffer，pH 7.4，0.1mg/ml BSA。
3、实验方法
a、酶活性的确定：
将GP-AMC稀释于各自的缓冲液中，浓度为100umol/L，每孔25ul；酶梯度稀释，起始浓度分别为DPP-VIII、DPP-IX：0.01ug/ul，DPP-IV：0.01mU/ul，按5倍稀释，每孔25ul，混匀；37℃，360/460nm测定荧光值的动态变化，测定30分钟；以吸光度呈直线上升、S/N≥5的酶浓度为使用浓度。
b、抑制剂活性测定：
所有酶、抑制剂、GP-AMC均用分析缓冲液配制，设置无化合物对照、无酶液对照。
按酶的使用浓度配制酶液，每孔25ul；梯度稀释抑制剂(10倍或5倍稀释)，每孔25ul，混匀；加入稀释好的GP-AMC溶液50ul，混匀；37℃反应20分钟，360/460nm测定荧光值。
c、数据分析：用GraphPad-Prism软件分析。
4、实验结果
本发明化合物1-5对三种酶的抑制活性数据如下表一所示。
表一体外活性与选择性数据
实验结果说明：与对照药相比，本发明化合物对DPP-IV具有非常好的选择性抑制作用，化合物1，2，3，5对DPP-IV的抑制率均高于对照药，化合物4与对照药相当。表中数据还显示，在有效抑制DPP-IV活性的同时，本发明化合物对DPP-VIII和DPP-IX的活性几乎没有影响，可以预见本发明化合物开发成药后毒性将远低于对照药，具有突出的优势。
实施例7.体内活性试验
1、实验目的
利用小鼠葡萄糖耐量模型(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)比较各化合物的降糖作用。
2、实验材料
6-8周龄雄性C57BL/6小鼠；
Alogliptin(20mg/kg)、化合物1(20mg/kg)、化合物3(20mg/kg)、化合物4(20mg/kg)；
强生稳豪血糖仪与血糖试纸；
3、实验方法
动物按体重随机分成6组，每组8只：正常对照组、Alogliptin组(20mg/kg)、化合物1组(20mg/kg)、化合物3组(20mg/kg)、化合物4组(20mg/kg)。其中阳性对照药物为Alogliptin(20mg/kg)。
各组连续灌胃给药4天，实验前小鼠禁食17h后分别灌胃给予蒸馏水及各药物，测量各组动物的基础血糖，30min后灌胃给予葡萄糖(2.5g/kg)并开始计时，在0min、30、60、120min各时间点从小鼠尾部取血并用血糖仪测定血糖。
3、实验结果
本发明化合物的小鼠葡萄糖耐量实验数据见表二和附图1。
表二本发明化合物对小鼠葡萄糖耐量的影响(n＝8，X±SD)
| 组别 | 动物数(只) | 基础血糖Mmol/l | 0min血糖Mmol/l | 30min血糖Mmol/l | 60min血糖Mmol/l | 120min血糖Mmol/l |
| 正常对照组 | 8 | 4.6±1.19 | 4.6±0.89 | 15.4±3.32 | 9.2±2.51 | 6.2±1.67 |
| Alogl iptin(20mg/kg) | 8 | 3.6±0.58 | 4.2±0.69 | 11.8±2.02* | 8.6±1.52 | 4.9±0.55 |
| 化合物1(20mg/kg) | 8 | 5.1±1.16 | 4.8±1.10 | 8.2±1.47*** | 5.8±1.50** | 4.4±1.34* |
| 化合物3(20mg/kg) | 8 | 3.6±0.55 | 4.5±0.92 | 11.6±1.75* | 8.4±1.57 | 5.4±1.04 |
| 化合物4(20mg/kg) | 8 | 3.5±0.68 | 4.1±0.63 | 10.3±2.55*** | 7.8±1.12 | 4.8±0.52* |
*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001各组与正常组比较。
实验结果表明：本发明化合物在小鼠糖耐量试验中能显著降低小鼠灌服葡萄糖后血糖峰浓度，增加小鼠糖耐量能力，并且较同机理阳性药Alogliptin作用效果更强，作用时间更长，显示了优秀的降糖和增加胰岛素敏感性的作用。
Claims (7)
1.选自下列式II、III或V所示的化合物或其盐：
其中，R6、R7、R8、R9相同或不同，各自独立地选自氢、氰基、氨基、卤素、羟基、低级烷基、低级烷氧基；
R3、R5相同或不同，各自独立地选自氢、低级烷基、低级烷氧基、芳基、杂芳基；
R4选自氢、低级烷基、低级烷氧基、芳基、杂芳基；
芳基选自苯基、萘基；
杂芳基选自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、吡啶、嘧啶；
低级烷氧基为-O-低级烷基基团；
低级烷基为由1-4个碳原子组成的直链或支链的饱和烷基。
2.根据权利要求1的化合物或其盐，选自下列式III所示的化合物或其盐：
其中，R6、R7、R8、R9同权利要求1中定义相同，R4、R5选自氢、低级烷基、低级烷氧基，低级烷基、低级烷氧基同权利要求1中定义相同。
3.根据权利要求1的化合物或其盐，其中化合物选自下列结构的化合物：
4.一种权利要求1所述的化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)式A的化合物与式B的化合物反应生成式C的化合物；
(2)式C的化合物与式D的化合物反应生成式I的化合物；
其中，R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9同权利要求1中定义相同，Hal为氯或溴，Hal’为氯、溴或碘，X为C时，Y为S或N，X为S时，Y为C。
5.权利要求3的化合物1的制备方法，包括如下步骤：
6.权利要求1、2或3所述的化合物在制备治疗或预防受益于DPP-IV抑制的疾病的药物中的用途，所述的受益于DPP-IV抑制的疾病选自糖尿病、糖尿病性脂血异常、葡萄糖耐量减低(IGT)症、禁食血浆葡萄糖减低(IFG)症、代谢性酸中毒、酮症、食欲调节、肥胖症、各种癌症、神经系统病症、免疫系统疾病。
7.一种药物组合物，其包括权利要求1、2或3所述的化合物或其盐，和一种或几种药学上可接受的辅料。
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