CN101815530A - 治疗性抗体的纯化方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

制备抗-b淀粉状蛋白免疫球蛋白的一种方法涉及在碱性条件下，如在pH 10.25至11.75下使用二乙胺HCl来处理人血浆抗-b淀粉状蛋白免疫球蛋白，以便由此从其中解离出b淀粉状蛋白。典型地，这种抗-b淀粉状蛋白免疫球蛋白存在于获自血浆或血清的人免疫球蛋白制品之中。通过该方法所制备的抗-b淀粉状蛋白免疫球蛋白是基本上不含b淀粉状蛋白的，并且在用于治疗与b淀粉样蛋白斑相关联的一个疾病或病况，如阿耳茨海默病的多种组合物和/或方法中具有治疗活性。

Description

治疗性抗体的纯化方法和使用方法
技术领域
本发明涉及免疫球蛋白的制备。更具体地，本发明涉及一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的制备，该免疫球蛋白可适宜于阿耳茨海默病的免疫治疗。
背景
阿耳茨海默病是一种神经变性疾病，其最常见的形式发现于超过65岁的人中。全世界大概有1500万人患有阿耳茨海默病。
阿耳茨海默病的临床迹象的特征为进行性的认知退化、连同与日常生活相关联的活动减少、以及神经精神病学症状或行为的变化。
阿耳茨海默病其特征为由β淀粉状蛋白肽所组成的斑块在脑组织中的积聚。将抗-β淀粉状蛋白抗体给予一种阿耳茨海默病的小鼠模型似乎减少了小鼠大脑中β淀粉状蛋白的沉积，并且恢复或提高了认知功能或者至少认知衰退的速度。
对抗β淀粉状蛋白肽的自然发生的抗体存在于人血清中。将从人血清中获得的人免疫球蛋白制品给予人体内与在脑脊液中β淀粉状蛋白-肽水平的下降相关联。[US2002/0009445.]最近的临床试验资料显示了在用静脉内的免疫球蛋白(“IVIg”)所治疗的阿耳茨海默病患者中行为和认知方面的有益结果(http://www.news-medical.net/？id＝40383)。
然而，此类IVIg制品包含显著量的神经毒性的β淀粉状蛋白肽，并且在抗体亲合性和滴度方面表现出显著的变化。
概述
在碱性条件下提供了抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的制品，在该条件下β淀粉状蛋白是微溶的，并且因此与抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白重新结合的能力较弱。
一方面，制备一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的一种方法涉及在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
适宜地，根据该方法所制备的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白是基本上不含结合的β淀粉状蛋白的。
另一方面，制备一种组合物的方法涉及在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下通过处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白来制备一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白；并且将该抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白与一种可接受的载体、稀释剂或赋形剂相结合。
在又一个方面，提供了一种分离的或纯化的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白，该免疫球蛋白在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下通过处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白而得以制备。
在仍又一个方面，一种组合物包括一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白，该免疫球蛋白在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下通过处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白而得以制备；以及一种可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个实施方案中，该组合物适宜于治疗与β淀粉样蛋白斑相关联的一种疾病或病况，如阿耳茨海默病。
在另又一个方面，在一种哺乳动物体内治疗与β淀粉样蛋白斑相关联的一种疾病或病况的方法涉及给予所述哺乳动物一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白，该免疫球蛋白在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下通过处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白而得以制备。
在一个实施方案中，与β淀粉样蛋白斑相关联的疾病或病况是阿耳茨海默病。
其他目的、特征、以及优点从以下详细说明中将会变得明显。给出了详细说明以及具体的实例仅用于解说，因为对于本领域的普通技术人员而言，在本发明的精神和范围之内的不同的变化和变更从这一详细说明中将会变得明显。此外，这些实例显示了本发明的原理，并且不能预期这些实例确切地说明了本发明对于那些对现有技术领域内的普通技术人员而言它是显而易见地有用的所有实例的应用，。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括”、“包括了”、以及“已包括”应当被理解为是指包含了一个提到的整数或多个整数的组，但不是排除任何其它的整数或多个整数的组。
附图简要说明
图1：在(A)甘氨酸缓冲液(甘氨酸HCl pH 2.5；甘氨酸NaOH pH10.25；甘氨酸NaOH pH 10.75；甘氨酸NaOH pH 11.25；以及甘氨酸NaOHpH 11.75)的存在下ELISA比较抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白制品。
图2：在二乙胺HCl缓冲液(pH 10.25；pH 10.75；pH 11.25；以及pH11.75，)的存在下ELISA抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白制品与一种甘氨酸HCl pH 2.5对照物的比较。
详细说明
特异性结合的β淀粉状蛋白可以在碱性条件下从抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的制品中被去除。在酸性条件下(例如大约pH 2)纯化IVIg抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白产生了可溶解的β淀粉状蛋白，它可以与抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白重新结合，特别是当回复中和(back-neutralisation)开始时。
碱性处理抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白，即使在低至大约pH 10.5的pH下，也使到β淀粉状蛋白从抗-β淀粉状蛋白中解离出，在这些条件下β淀粉状蛋白基本上保持不溶解并且不能被抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白重新结合。该方法特别适合从人IVIg来大规模和/或工业性制备抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
在工业规模上在碱性条件下处理之后抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的改进的效率提供了一个商业上更为可行的过程用于生产抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
一方面，制备抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的方法涉及在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
另一方面，在此提供了通过如以上说明的方法所制备的分离的或纯化的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
用“分离的”一词是指存在于从一种自然状态中离开的一种环境之中或以另外方式受到人为操作。分离的材料可以是基本上或实质上不含在其自然状态中正常伴随它的组分、或者可被操作以便与在其自然状态中正常伴随它的组分一起处于一种人工状态。
用“纯化的”一词是指富集的、浓缩的、或者以另外方式具有大于处于一种起始状态或形式的一种特异的活性、量值或浓度。
分离的或纯化的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白可以是基本上不含β淀粉状蛋白的。
用“基本上不含”一词是指至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95-99％的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白分子不结合至β淀粉状蛋白或其片段上、或者被β淀粉状蛋白或其片段结合。
如在此所使用的一种“蛋白”是一种氨基酸聚合物，它可以是一种肽或一种多肽。通常，如在此所使用的术语“肽”是具有不超过六十个(60)邻近的氨基酸的一种蛋白质。
术语“β淀粉状蛋白”在其范围内包括淀粉状蛋白前体蛋白(APP)及其片段，包括但不局限于例如在美国公开文件2006/0099211中说明的肽片段。
应当理解，如在此所使用术语“免疫球蛋白”包括这种人免疫球蛋白基因复合体的任何一种抗原-结合蛋白产物，包括人免疫球蛋白同种型IgA、IgD、IgM、IgG、以及IgE和它们的抗原结合片段。抗原结合片段的实例包括但不局限于：Fab、F(ab)2、Fv、scFv、等等。
优选地，如以上说明所制备的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白是、或包括IgG。
起始的或初始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的一个优选的来源是人血清或血浆。从这种来源中获得的免疫球蛋白制品典型地是通过不同的路径进行给药，包括肌内、静脉内以及皮下的，并且由此经常被称为“IMIg”、“IVIg”、“SCIg”、或者类似物。用于在该方法中使用的一个来源的一个特别的非限制性实例是血浆、或由孔恩分级分离法所获得的一个血浆部分，如Cohn上清液I(纤维蛋白原耗尽的血浆)或者溶解了的和澄清的部分II+III。
这种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白(如处于IVIg形式)可以通过在本领域中充分理解的方法进行脱脂和/或耗尽优球蛋白，如在以下实例中所说明。
这种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白在碱性处理之前可以经受至少一个阴离子交换层析步骤。在某些实施方案中，可以使用第一以及第二顺序的阴离子交换层析步骤。在其它实施方案中，可以使用阴离子和阳离子交换层析步骤的一个组合。
为了达到用于将β淀粉状蛋白从抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离的一个碱性pH，可以使用典型地处于一个缓冲溶液形式的任何适宜的碱类。此类碱性缓冲液在本领域中是熟知的，并且可以容易地由本领域内的普通技术人员进行选择。
仅作为举例，碱性缓冲液可以包括碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三-磷酸氢二钠缓冲液(tri-sodium hydrogen phosphate buffer)、二乙胺HCl、三乙胺HCl、甘氨酸NaOH、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁烷磺酸(TABS)、3-[(1，1-二甲基-2-羟乙基)氨基]-羟基丙磺酸(AMPSO)、2-(N-环己基氨基)乙烷磺酸(CHES)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、3-环己基氨基-1-丙磺酸(CAPS)以及4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸(CABS)。
一种优选的碱性缓冲液是二乙胺HCl。
优选的碱性条件包括在8.5至11.75范围内的一个pH。
更优选地，该pH是在10.75至11.75的范围之内。
有利的是，该pH是在11.25至11.75的范围之内。
在碱性pH下(例如，大约pH 11或以上)进行洗脱产生了β淀粉状蛋白的不溶性聚集体，这些聚集体不能重新结合抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。然后，该pH可以被中和至没有形成可溶解的β淀粉状蛋白的一个较低的pH(例如，大约pH 9)。在那种pH下，在进一步中和至一个适当的配制品pH(典型地在pH 4.0至7.4范围内)之前，不溶解的β淀粉状蛋白可以被除去。对于IVIg制品，一个非限制性的实例是大约pH 4.8。应当理解，较低的pH条件(如pH 4.8)典型地用于IVIg制品，因为较低的pH有助于使二聚物/聚集体的形成作用最小化。然而，值得注意的是IMIg配制品(其中可以耐受较高的二聚物/聚集体水平)可处于一个更接近中性的pH(例如，大约pH 6.5)。
然后，β淀粉状蛋白的去除可通过本领域内任何一种已知的方法来进行。此类方法的非限制性实例包括过滤(如纳米过滤)以及层析(如疏水性相互作用层析法)。可替代地，β淀粉状蛋白聚集体可通过离心作用(如连续流动离心作用)而被去除。还应当理解的是，β淀粉状蛋白的可溶解形式也可以(例如)通过使用一种适宜分子量的截取膜(截取大约10至30kDa)的透析过滤而被去除。
在一个非限制性的实施方案中，制备一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的方法包括：
(i)在10.75至11.75范围内的一个pH下用一种二乙胺HCl缓冲液处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白，以便由此基本上将结合的β淀粉状蛋白从所述抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离；
(ii)部分地将(i)中的pH中和至大约pH 9；
(iii)去除β淀粉状蛋白；
(iv)将(ii)中的pH中和至大约pH 4.0至7.4范围内的一个pH值；并且
(v)收集抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
在另一个实施方案中，这种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白制品经受了病毒灭活作用。优选地，病毒灭活作用去除了有包膜病毒和无包膜病毒。在一个非限制性的实施方案中，尺寸排阻可用来去除小到大概20纳米的病毒。
在一些实施方案中，这种β淀粉状蛋白沉淀在能够去除病毒和这种β淀粉状蛋白质或其片段的条件下经受了病毒过滤步骤。
如以上所说明而制备的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白在用于治疗与β淀粉样蛋白斑相关联的阿耳茨海默病以及其他疾病或病况的多种组合物和/或方法中可能是特别有效的。
因此，在一个方面，在一种哺乳动物体内治疗与β淀粉样蛋白斑相关联的一种疾病或病况的方法涉及给予所述的哺乳动物一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白，该免疫球蛋白通过在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白而得以制备。
在另一个方面，制备一种组合物的方法涉及在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下通过处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白来制备一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白；并且将这种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白与一种可接受的载体、稀释剂、或者赋形剂相结合。
在又另一方面，一种组合物包括一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白，该免疫球蛋白在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下通过处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白而得以制备；以及一种可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
载体、稀释剂和赋形剂可以是药学上、兽医学上和/或免疫学上可接受的，如在本领域中所熟知的。
在一般性术语中，提及“载体、稀释剂或赋形剂”是指可以一个固体或液体填充剂、粘合剂、稀释剂、包封物质、包衣或润滑剂，可将其安全地给予一只动物、优选一个人。依据给药的特定途径，可以使用本领域内熟知的不同的可接受的载体、稀释剂或赋形剂，例如在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)中所说明的。
仅作为举例，这些可选自一个组，该组包括：糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、胶质、滑石、硫酸钙、植物油类、合成油类、低级醇类、多元醇类、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、润湿剂、润滑剂(如硬脂酸钠或硬脂酸镁)、等渗盐水以及无热原的水。
当给予患有阿耳茨海默病的患者时，这种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白制品具有增强的疗效和/或降低的β淀粉状蛋白毒性的风险。
在一个非限制性的实施方案中，本发明的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白可以静脉内或皮下给予患者以防止或治疗阿耳茨海默病。
这种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白制品可以按一个单一剂量或在某一时期内以一个剂量重复一次或若干次进行给药。这种适当的剂量根据不同的参数发生变化。此类参数包括所治疗的个体的生理状态、免疫球蛋白制品、给药的方式和频数、等等。
抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白制品的剂量可依据患者的年龄、体重和生理状态而发生变化。仅作为举例，根据本发明所制备的免疫球蛋白(immunologlobulin)可以按照以下频率进行给药：一周一次、或者每两周一次、或者每四、五、六或更多周一次。所给予的免疫球蛋白的量可发生变化，并且可以取决于该免疫球蛋白制品的纯度、亲合性和亲合力。
仅作为举例，该量值可以是每剂量给予一位患者、每kg体重大约0.001g至大约10g；每kg体重大约0.01g至大约5g；每kg体重大约0.1g至大约3g；每kg体重大约0.5g至大约2g或者每kg体重大约0.8g至大约1.5g的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
一个临床上有效的人给药方案的一个非限制性实例是大约每两周一次0.2g/kg、或者每四周一次0.8g/kg。
在人体内包括阿耳茨海默病在内，这些免疫球蛋白制品还可用于与非人类的哺乳动物(如家畜、家庭宠物、表演动物等等)的免疫治疗相关的多种兽医学应用。
实例
经处理以除去结合的β淀粉状蛋白的IVIg的大规模制品
根据以下所说明的过程来制造抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白制品。
用于本发明的方法的特别优选的起始材料是血浆、或通过孔恩分级分离法所获得的多个血浆部分，如Cohn上清液I(纤维蛋白原耗尽的血浆)或者溶解了的和澄清的部分II+III。
冷冻的血浆(典型地是1,250kg至10,000kg血浆/血浆等效物(6,250至50,000全血捐赠物))在12至24小时期间内被解冻之前在-5℃的温度下软化。这种解冻的血浆形成了一种冷冻沉淀物以及一种包含免疫球蛋白的冷冻上清液。这种冷冻上清液典型地是通过连续流动离心作用而与该冷冻沉淀物分离的，其中流出物温度不超过5℃。
然后，这种冷冻上清液溶液可以被稀释至4-6％重量/体积，并且在中性pH下加入足够的冷乙醇(95％体积/体积)以便在-2℃进行孵育之前达到8％体积/体积的乙醇浓度，以便使纤维蛋白原发生沉淀(部分I)。部分I可以通过离心作用和/或过滤作用从包含免疫球蛋白的上清液(上清液I)中被去除。
在可替代的实施方案中，上清液I可以被暴露至较高浓度的乙醇中，以便使这种免疫球蛋白组分作为部分II+III发生沉淀。然后，部分IH+III可以通过过滤作用被再次溶解并澄清，以便制备一种起始材料。
其中这种起始材料是血浆或其它包含免疫球蛋白的材料(包含脂蛋白)，如上清液I，这些脂蛋白优选地在适当的条件下通过吸附作用或沉淀作用从这种起始材料中被除去以避免免疫球蛋白的损失或使该损失最小化。根据本发明的一个特别优选的吸附材料是一种精细分开的二氧化硅(硅石)吸附剂，如Aerosil，例如具有从5至50nm范围内的颗粒大小。
上清液I在Aerosil加入之前在2至8℃下与一种助滤剂(如Diacel 150)进行混合。搅拌该混合物，直到在使用一种压滤机装置过滤之前将Diacel和Aerosil进行分散。压滤机装置中的保留体积可以通过使用0.5M NaCl进行冲洗而得以恢复。
降低这种脱脂的上清液I的导电率以便制备用于阴离子交换层析的溶液。这可以使用具有一种额定的不小于10,000道尔顿截取值的一种超滤膜来实现。在这之后，将该pH调整至pH 5.2以便使优球蛋白样蛋白发生沉淀。在使用一种滤压机装置过滤之前，通过将一种助滤剂(如Diacel)加至该混合物中来去除这种包含优球蛋白的沉淀。在压滤机装置中的保留体积可以通过使用0.5M NaCl进行冲洗而得以恢复。
如以上说明所制备的脱脂的、并且优球蛋白耗尽的材料是通过阴离子交换层析以产生一种第一包含免疫球蛋白的部分而分成部分的；并且通过一种第二阴离子交换层析的步骤来纯化该第一包含免疫球蛋白的部分提供了一种纯化的包含免疫球蛋白的溶液。
优选地，这种脱脂材料在使得在这一步骤中所获得的免疫球蛋白(粗制的IgG)的纯度最大化的负载、pH和离子强度荷载条件下使用DEAE-Sepharose FF、通过阴离子交换层析分成部分之前进行渗滤、pH调节、并且使优球蛋白耗尽。优选地，这种脱脂的、优球蛋白耗尽的材料的分馏在pH 5.2并且在0.5至1.0mS/cm的导电率下，在一种DEAE-Sepharose FF柱子上起效。特别是，这些条件确保了转铁蛋白从免疫球蛋白中最大的分离，即使转铁蛋白的理化性质近似于免疫球蛋白的理化性质。在这一步骤中产生一种相对纯的免疫球蛋白制品有利于一种第二阴离子交换步骤的随后的使用，以便在确保该树脂的负载量足够用于一种实际的商业性过程并且亚类的恢复是适当的pH条件下产生纯的最终产品。
该第二阴离子交换层析步骤包括在产生一种高度纯化产品的负载、离子强度、以及pH条件下使用大的、多孔性的阴离子交换树脂将这种包含免疫球蛋白的部分纯化，该高度纯化产品具有完整的亚类分布、低IgA和IgM浓度，以及在已接受的药典(pharmacopoeidial)限制之内的抗-A以及抗-B水平。确切地，具有大于100nm孔径大小的大的、多孔性的树脂的使用(如Macro-Prep HQ、MacroPrep Q、Poros HQ、Q Hyper DM)能够在6.0至6.6的pH下以及0.7至1.5mS/cm的导电率下进行使用，以便提供足够的吸附能力来除去污染的蛋白来提供一种纯的包含免疫球蛋白G(纯IgG)的制品。
在其它实施方案中，其中该起始材料是脂蛋白已经耗尽并且部分地纯化的重新溶解的部分II+III或其它包含免疫球蛋白的材料，该材料穿过如以上所说明的大的、多孔性的阴离子交换树脂的柱子仅仅经受了最终的纯化作用。
然后，这种纯的IgG溶液通过超滤作用被浓缩至大约2％重量/体积，并且加入了一种适当的缓冲剂(如甘氨酸-NaOH、乙醇胺-HCl、或者磷酸氢二钠)。在2至8℃下在连续混合的存在下在大约2小时期间，使用0.2M二乙胺HCl通过将pH调整至11.75使得这种β淀粉状蛋白从包含在纯的IgG溶液之内的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出。在pH 11.75下将这种pH调整的纯IgG孵育伴随混合至少30分钟。然后，该pH可以被中和至没有形成可溶解的β淀粉状蛋白的一个较低的pH(例如，大约pH 9)。
通过将该溶液以小于每升树脂40g蛋白的量负载至一根疏水作用层析(HIC)柱上(如Toyopearl 650C、Sepharose Fast Flow HIC、Source HIC或MacroPrep HIC)，将这种包含β淀粉状蛋白的不溶性沉淀物从纯的IgG中去除。在大约9.0的pH下、在1.5M NaCl的存在下，将柱子在一种适当的缓冲液(如磷酸盐缓冲液)中预先平衡。随后使用从1.5M至0M NaCl的一种60分钟线性梯度以60至200cm/hr的流速将该IgG从HIC柱中洗脱。然后，使用0.1M盐酸或0.1M氢氧化钠将洗脱的蛋白pH调节至4.8，并且在进一步处理之前储存在2至8℃下。
在一个可替代的实施方案中，通过将该溶液以小于每升树脂20g蛋白的量负载至一种疏水性电荷诱导层析(HCIC)柱(如MEP Hypercel)上，将这种包含β淀粉状蛋白的不溶性沉淀物从纯的IgG中去除。在一种中性或碱性的pH下，将柱子在一种适当的缓冲液(如磷酸盐或Tris缓冲液)中预先平衡。随后在pH 4.8下使用20mM乙酸钠缓冲液将该IgG洗脱。在进一步处理之前可以将这种包含洗脱的IgG的制品储存在2至8℃下。
在一个可替代的实施方案中，通过加入一种助滤剂(如Diacel)以及任选的2M NaCl和HIC树脂(如Toyopearl 650C、Sepharose Fast Flow HIC、Source HIC、或MacroPrep HIC)将这种包含β淀粉状蛋白的不溶性沉淀物从纯的IgG中去除。以小于每升树脂40mg蛋白的量加入这种HIC树脂。在通过离心作用和/或过滤作用澄清之前，在2至8℃下将该混合物搅拌至少30分钟。然后，使用0.1M盐酸或0.1M氢氧化钠将这种澄清的溶液pH调整至4.8，并且在进一步处理之前储存在2至8℃下。
在又一个实施方案中，通过将这种溶液负载至一种尺寸排阻柱(包含一种树脂，如Sephacryl S400HR)上将这种包含β淀粉状蛋白的不溶性沉淀物从纯的IgG中去除。使用一种缓冲液(如50mM乙酸钠)、pH 4.8、在10-50cm/hr下将这种免疫球蛋白部分从该柱上洗脱。然后，使用0.1M盐酸或0.1M氢氧化钠将洗脱的蛋白的pH调整至4.8，并且在进一步处理之前储存在2至8℃下。
在另一个实施方案中，通过连续流动离心作用将这种包含β淀粉状蛋白的不溶性沉淀物包从纯的IgG中去除。
优选地，这种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白制品经受了病毒灭活作用，例如通过以下两个专用的病毒去除步骤：在37℃、pH 4下孵育10小时以灭活有包膜病毒，以及病毒过滤作用以便通过尺寸排阻来去除小到大概20纳米的有包膜病毒以及无包膜病毒。
在一些实施方案中，纯的包含IgG的β淀粉状蛋白沉淀在能够去除病毒和这种β淀粉状蛋白的条件下经受了这个病毒过滤步骤。
然后，使用0.1M氢氧化钠和0.1M盐酸将这种病毒灭活的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白制品pH调整至pH 4.8，并且通过使用至少30,000道尔顿的额定截取值的一种膜的超滤作用使其浓缩至大约12％重量/体积。这种溶液渗滤对抗至少6体积的水，同时通过加入0.1M盐酸或0.1M氢氧化钠将pH维持在4.8。通过加入大概250mmol/L的左旋脯氨酸作为一种稳定剂并且进行稀释以便在最终产品中产生10％重量/体积的浓度来达到最终的配制品。跟随穿过澄清过滤器，这种配制的大量的免疫球蛋白穿过具有0.22μm或更小的孔径大小的一种预先高压灭菌的灭菌膜药筒进入一个容器中，其中在分配之前它可储存在2至8℃下。将产品无菌地分配入无菌的1mL、5mL、10mL以及50mL的小瓶中。
IVIg pH处理的ELISA分析
在4℃下用处于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1μg/ml的淀粉状蛋白β蛋白片段1-40酰胺(SIGMA，MO)(在此称为Aβl-40)，每孔50μl，将96-孔Nunc MaxiSorb板(Thermo Fisher Scientific，NY)包被过夜。通过用350μl 0.05％Tween-20(Sigma，MO)、PBS  (TPBS)洗涤这些孔将未结合的抗原去除。在室温下将抗原包被的以及空白的未包被的板用2％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，MO)、PBS、每孔50μl封闭2小时。通过用350μl TPBS洗涤这些孔将未结合的BSA去除。
将IntragamP(CSL Limited，Parkville，Australia)(在此称为IVIg)在PBS中稀释至20mg/ml，并接着在pH 2.5、10.25、10.75、11.25、以及11.75下在0.2M甘氨酸(Sigma，MO)中按1/5稀释；或者在pH 10.25、10.75、11.25以及11.75下在0.2M二乙胺(Sigma，MO)中按1/5稀释。在室温下孵育20分钟之后，pH处理过的IVIg用等体积的2.0M Tris-HCl、pH 8.0(Sigma，MO)进行中和，并接着按1/2稀释到1％BSA、TPBS中。IVIg在一个96-孔Nunc V型底的板(Thermo Fisher Scientific，NY)中在1％BSA、TPBS中进行3倍系列稀释，并且将100μl转移至这些BSA封闭的板上。在通过用350μl TPBS洗涤孔这些两次来除去未结合的IVIg之前，将这些板在室温下孵育1小时。
在绵羊体内培养的、在1％BSA、TPBS中按1/2000稀释的第二抗体抗-人IgG(γ链)亲合分离的HRP偶联物(Millipore，MA)每孔转移50μl，并且在室温下孵育20分钟。通过用350μl TPBS洗涤这些孔将未结合的第二抗体去除。用TMB/E溶液(Millipore，MA)对测定物显色、每孔50μl，在室温下孵育10分钟来显出颜色，并且用2.0M磷酸、每1孔25μl停止。在一台Wallac Victor 2(Perkin Elmer，MA)板读器上、在450nm的吸光度下将已显色的板扫描0.1秒。结果显示在图1和图2中。
提及图1和图2，甘氨酸NaOH和二乙胺HCl碱性缓冲液均使得抗-β淀粉状蛋白IgG从起始的IVIg样品中解离。二乙胺HCl优于甘氨酸NaOH，特别是pH高于11.25时。这些数据还证明了pH高于11.25(特别是在pH
11.75)的二乙胺HCl碱性缓冲液在将抗-β淀粉状蛋白IgG从起始的IVIg样品中解离这一方面优于甘氨酸HCl pH 2.5缓冲液。
因此，有人提出碱性缓冲液适宜于将抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白从β淀粉状蛋白中解离出。
特别值得注意的是，处于11.25至11.75范围内的一个pH的二乙胺HCl碱性缓冲液完成情况好于在这些实验中所测试的甘氨酸HCl pH 2.5酸性缓冲液。
应当理解的是根据以上所说明的范围(例如，pH、剂量等等)，适当时在此说明的范围内的任何给定值可用作一个较低的或较高的值来建立另一个范围。
贯穿本说明书，目标是说明本发明的优选方案，而未将本发明限于任何一个实施方案或具体的特征集合。可以对所说明并解说的实施方案进行不同的变化和变更而不偏离本发明。
在本说明书中所提及的每一项专利和科学文献、计算机程序和算法的披露其全文均通过引用结合在此。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.制备抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的一种方法，包括在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其中该起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白存在于人血浆中。
3.如权利要求1所述的方法，其中这些碱性条件包括10.25至11.75的pH。
4.如权利要求3所述的方法，其中这些碱性条件包括11.25至11.75的pH。
5.如以上权利要求中任一项所述的方法，进一步包括至少部分地中和至没有形成可溶解的β淀粉状蛋白的一个较低的pH的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，进一步包括去除不溶解的β淀粉状蛋白的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其中不溶解的β淀粉状蛋白的去除是通过过滤、层析法或离心作用来进行的。
8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，进一步包括中和至大约pH4.8的步骤。
9.制备一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的一种方法，该方法包括：
(i)在10.75至11.75范围内的一个pH下用一种二乙胺HCl缓冲液处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白，以便由此基本上将结合的β淀粉状蛋白从所述抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出；
(ii)部分地将(i)中的pH中和至大约pH 9；
(iii)去除β淀粉状蛋白；
(vii)将(ii)中的pH中和至大约pH 4.0至7.4范围内的一个pH；并且
(v)收集抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中通过该方法所制备的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白是基本上不含β淀粉状蛋白的。

Claims (24)

1.制备抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的一种方法，包括在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其中该起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白存在于人血浆中。
3.如权利要求1所述的方法，其中这些碱性条件包括10.25至11.75的pH。
4.如权利要求3所述的方法，其中这些碱性条件包括11.25至11.75的pH。
5.如以上权利要求中任一项所述的方法，进一步包括至少部分地中和至没有形成可溶解的β淀粉状蛋白的一个较低的pH的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，进一步包括去除不溶解的β淀粉状蛋白的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其中不溶解的β淀粉状蛋白的去除是通过过滤、层析法或离心作用来进行的。
8.如权利要求6或7所述的方法，进一步包括中和至大约pH 4.8的步骤。
9.制备一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白的一种方法，该方法包括：
(i)在10.75至11.75范围内的一个pH下用一种二乙胺HCl缓冲液处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白，以便由此基本上将结合的β淀粉状蛋白从所述抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出；
(v)部分地将(i)中的pH中和至大约pH 9；
(vi)去除β淀粉状蛋白；
(vii)将(ii)中的pH中和至大约pH 4.0至7.4范围内的一个pH值；并且
(v)收集抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中通过该方法所制备的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白是基本上不含β淀粉状蛋白的。
11.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白对与β淀粉样蛋白斑相关联的一种疾病或病况具有治疗活性。
12.如以上权利要求中任一项所述的方法，进一步包括一个病毒灭活步骤。
13.制备一种抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白组合物的一种方法，所述方法包括在足以从所述起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白中解离出β淀粉状蛋白、或它的一个片段的碱性条件下处理一种起始的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白；并且将该抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白与一种可接受的载体、稀释剂或赋形剂相结合。
14.如权利要求13所述的方法，其中该组合物适宜于在一种哺乳动物体中治疗与β淀粉样蛋白斑相关联的一种疾病或病况。
15.如权利要求14所述的方法，其中该哺乳动物是一个人。
16.如权利要求15所述的方法，其中该疾病或病况是阿耳茨海默病。
17.分离出基本上不含通过权利要求1至12中任一项所述的方法所制备的β淀粉状蛋白的抗β淀粉状蛋白免疫球蛋白。
18.一种组合物，包括如权利要求17所述的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白以及一种可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
19.如权利要求18所述的组合物，适宜于在一种哺乳动物体内治疗与β淀粉样蛋白斑相关联的一种疾病或病况。
20.如权利要求19所述的组合物，其中该哺乳动物是一个人。
21.如权利要求19或20所述的组合物，其中该疾病或病况是阿耳茨海默病。
22.在一种哺乳动物体内治疗与β淀粉样蛋白斑相关联的一种疾病或病况的一种方法，该方法包括给予所述哺乳动物以下物质：根据权利要求1至12中任一项所生产的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白、或根据权利要求13至16中任一项所述的方法所生产的一种组合物、如权利要求17所述的分离的抗-β淀粉状蛋白免疫球蛋白、或者如权利要求18至21中任一项所述的组合物，以便由此在所述哺乳动物体内治疗所述疾病或病况。
23.如权利要求22所述的方法，其中该哺乳动物是一个人。
24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中该疾病或病况是阿耳茨海默病。
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