CN101812465B - 一种固氮基因和多肽及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固氮基因和多肽及应用。所述固氮基因具有如SEQ ID NO 1所示DNA序列；所述多肽具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列。本发明采用乙炔还原乙烯的方法、纳什试剂比色法和¹⁵N₂同位素标记方法进行检验和确定，证实所述多肽具有固氮酶活性，能够将空气中的N₂固定，还原为NH₄ ⁺，可作为生物固氮的新技术应用于工、农业生产。

Description

一种固氮基因和多肽及应用

技术领域

本发明属于生物固氮技术领域，具体涉及一种肠杆菌科的基因，以及具有所述基因序列的多肽，所述基因与多肽在生物固氮方面的应用。

背景技术

化学氮肥的制造是一个高耗能的过程，而生物固氮可以在常温常压下利用固氮酶将空气中的氮气固定成氨，作为生命体系的氮素来源，既节省能源，又对环境友好。生物固氮体系本身就是一座小化肥厂，原料来自空气，取之不尽。在当前能源日益紧张和环境日益恶化的情况下，随着生物技术的发展和研究方法的进步，克隆生物固氮的相关的酶和它编码的基因，进行遗传工程操作，使固氮酶基因在原核生物和植物组织内表达，为节约能源、改善环境和促进农业生产应用。

生物固氮所涉及的固氮菌有三种类型，第一类是自生固氮菌，如蓝细菌；第二类是联合固氮菌，如植物体内的内生固氮菌，巴西在甘蔗生产中使用联合固氮体系，可为甘蔗提供60％的氮素来源；第三类是共生固氮菌，它效率非常高，但绝大多数是豆科植物与根瘤菌进行共生固氮。

共生固氮现象从1887年发现至今已经有120多年，世界各国的科学家花费了大量的时间和精力对它进行研究，目前取得了不少进展，加深了我们对生物固氮的认识和理解。共生固氮菌的固氮效率高，但仅局限于豆科等少数植物。且共生固氮菌的共生基因、结瘤基因、固氮基因和植物-根瘤菌的信号识别基因调控关系复杂。

肠杆菌科的联合固氮菌的固氮效率仅次于共生固氮菌，它与植物的信号识别比较简单，它的宿主范围较广。联合固氮菌可以在植物根际或植物体内进行固氮，有些菌可为植物生长(如甘蔗)提供高达60％的氮素。

研究肠杆菌科的联合固氮相关技术具有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种肠杆菌科的基因。

本发明的另一个目的是提供具有所述编码基因的新的具固氮功能的多肽。

本发明还有一个目的是提供所述基因和多肽的应用。所述新的固氮多肽及其编码的基因来源于原核生物肠杆菌属，不同于传统的固氮酶基因家族有多个基因相互作用共同完成固氮过程，单个基因编码的多肽能够独立进行固氮。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

提供一种固氮基因，具有SEQ ID NO 1所示序列，具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。

同时提供了所述固氮基因的克隆方法，通过设计正向引物和反向引物，扩增新固氮功能的基因阅读框架得到。所述扩增以肠杆菌属中的菌株DNA为模版，但不局限于肠杆菌属的菌株DNA，也可以以其它细菌科属的菌株DNA为模版采用常规技术扩增得到。

所述设计正向引物和反向引物分别为：

正向引物：OrfF1，5′-ATCG AAT TC ATG CTC TCC TCG GTC GATCGC-3′(含EcoR I酶切位点)；

反向引物OrfR1，5′-GCCA A GCT TCA AGC TAG CTT TGC TTCGAT G-3′(含Hind III酶切位点)。

本发明以水稻肠杆菌(Enterobacter oryzae LMG 24251＝CGMCC1.7012)DNA为模版，所述水稻肠杆菌资料见：

http://ijsb.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/ijs.0.005967-0v1。

总DNA的提取采用常规的苯酚一氯仿抽提方法，乙醇沉淀和洗涤，所用试剂为常规的分子生物学试剂，用正向引物和反向引物扩增水稻肠杆菌基因阅读框架，经测序分析获得序列SEQ ID NO 1，生物信息学分析后，获得了该基因的氨基酸序列SEQ ID NO 2。

将所述基因SEQ ID NO 1克隆到原核表达载体pET-32a(+)中，获得转化子编号4-4，采用异丙基-□-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得了所述新型固氮基因表达的多肽，具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。采用乙炔还原乙烯的方法、纳什试剂比色法和¹⁵N₂同位素标记方法进行检验和确定，证实该新型固氮多肽具有固氮酶活性。

本发明提供了所述基因和多肽在生物固氮方面的应用。

本发明的有益效果是：

本发明成功提供一种新的具固氮功能的多肽及其编码的基因，所述基因具有生物固氮功能。其不同于传统的固氮酶基因家族-由多个基因相互作用共同完成固氮过程，所述新的固氮多肽及其编码的基因来源于根瘤菌科细菌，单个基因编码的多肽能够独立进行固氮，并可以在常温常压下利用固氮酶将空气中的氮气固定成氨，作为生命体系的氮素来源，既节省能源，又对环境友好。

附图说明

图1本发明固氮多肽电泳图

图2对照样将乙炔还原为乙烯的气相色谱仪测定结果

图3样品4-4将乙炔还原为乙烯的气相色谱仪测定结果

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

菌株与质粒：pET32a(+)载体(Novagen)和宿主菌BL21由华南农业大学兽医学院的牛学峰博士馈赠，引物合成由上海英俊生物工程有限公司合成。

1、基因的扩增：

(1)以水稻肠杆菌(Enterobacter oryzae LMG 24251＝CGMCC1.7012)DNA为模版；

(2)PCR引物为OrfF1和OrfR1；

(3)PCR反应体系：

10×PCR Buffer         2.5μL

dNTPmix(2.5mmol.L^-1)   0.5μL

OrfF1(25μM)           0.5μL

OrfR1(25μM)           0.5μL

DNA模板                0.5μL

Taq酶(4U/μL)          0.5μL

dd H₂O                 20μL

反应总体积             25μL

PCR反应条件(32个循环)：

94℃预变性    4min

94℃变性      1min

60℃复性      45s

72℃延伸      1min30s

72℃延伸      10min

2.基因片段的亚克隆

(1)上述PCR产物用DNA纯化试剂盒(QIAquick PCR PurificationKit，QIAGEN GmbH，Germany)纯化，纯化产物用于连接反应；

(2)提取pET32a(+)质粒DNA：采用QIAprep Spin Miniprep Kit提取，试剂盒为QIAGEN GmbH，Germany生产，按试剂盒说明书操作；

(3)将质粒pET32a(+)和PCR产物分别用EcoRI和HindIII双酶切：

DNA纯化产物10ul/pET32a 7μL     ×μL

10×H Buffer                    2μL

EcoRI                           1μL

10％BSA                         0.2μL

ddH₂O                           to 20μL

37℃保温2h后加入：

10×M Buffer    3μL

HindIII         1μL

ddH₂O           to 30μL

载体pET32a(+)37℃保温2h，PCR产物保温4h后，取5μL电泳检测确定酶切是否完全，在酶切体系中加入3μL的乙酸钠(pH＝5.2)及100μL的无水乙醇沉淀，12000rpm，离心10min，用70％乙醇漂洗，真空干燥，复溶于10μL无菌水中待连接。

(4)连接体系：

10×连接缓冲液    2.5μL

T4DNA连接酶       1μL

DNA               0.06pmol-0.3pmol

载体              0.03pmol

ddH₂O             to 20μL

(5)14℃连接过夜(大概14h左右)，连接产物可以直接用于转化或保存于-20℃；

(6)从-70℃冰箱中取200μL感受态细胞悬液(DH5α)，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上，加入10μL连接液，轻轻摇匀，冰上放置30min后42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3～5min，向管中加入500μL LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L，用NaOH调节pH值7.5，高压灭菌；不含氨苄青霉素(Amp))。混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)，将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的LB平板上。

(7)待转化子长出后鉴定阳性转化子

A快速鉴定：挑取单菌落，涂圈于平板，培养8h，刮取菌落少许于50μL 2×Cracking gel Buffer(0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖)，振荡，室温5min，加入4μL 1mol L^-1KCl，溴酚蓝(0.25％)(3∶1)混合液，冰上5min，离心5min，电泳检测。

B菌落PCR快速鉴定：刮取菌落少许进行PCR扩增，反应体系中引物为载体的通用引物M13，反应循环数减少，其余同目的基因扩增；PCR完毕后用2％的琼脂糖电泳鉴定。

C酶切鉴定：提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和PstI双酶切。酶切产物用2％的琼脂糖电泳鉴定。

(8)选取鉴定好的转化子编号4-4，应用Sanger双脱氧终止法进行双链DNA的核苷酸序列测定，测序工作有上海Invitrogen公司完成。

(9)NCBI BLAST序列分析即获得序列SEQ ID NO 1。

(10)通过生物信息软件序列处理在线工具包(The SequenceManipulation Suite)中的核苷酸序列与氨基酸序列转换，将之前得到的核苷酸序列转换为氨基酸序列，序列分析后即得到该基因的氨基酸序列SEQID NO 2。

(11)基因片段的克隆：

A.各挑取鉴定好的编号4-4的转化子及BL21(pET32a(+))单菌落，在含有100μg.mL^-1的氨苄青霉素的5mL的LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养过夜；

B.取上述过夜菌液1mL转至100mL LB(含100μg mL^-1M1Amp)培养液中，37℃，200rpm继续培养2～3h至OD600值为0.6左右；

(3)加入IPTG至终浓度为0.4mM，继续诱导培养3h；

(4)收集细胞菌体；

(5)用PBS缓冲液洗菌体两次，4倍上样缓冲液裂解细胞，使其终浓度为150mg.mL^-1，放入95℃下加热10min，并以4000rpm离心2min。可直接上样进SDS-PAGE检测表达情况。蛋白电泳图见附图1。

本发明实施例虽然采用水稻肠杆菌(Enterobacter oryzae LMG 24251＝CGMCC1.7012)DNA基因进行PCR扩增获得所述基因，但实际应用中的基因序列的获得与菌株没有关系，可采用现有的基因合成仪器人工合成所述基因。本领域的技术人员也可以从其它类似的菌株里克隆到所述基因。实施例2新型多肽样品的纯化

(1)各挑取4-4的转化子及BL21(pET32a(+))单菌落，在含有100ugmL^-1的氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，200 rpm min^-1振荡培养过夜；

(2)将过夜培养的菌液按照1∶100接种到新的LB(含100ug mL^-1Amp)培养液中，37℃，180rpm培养至OD600＝04～0.8，加入IPTG至终浓度为0.4mmol.L^-1，25℃继续培养3h；

(3)收集菌体，用灭菌的超纯水洗菌体两遍，弃尽上清，按照10mL.g^-1菌体的比例加入磷酸缓冲液(50mm的磷酸缓冲液，PH＝7.4即：81mL0.2mmol.L^-1的Na₂HPO₄，19mL 0.2mol.L^-1的NaH₂PO₄用超纯水定容到400mL)；

(4)充分悬浮细胞，用JG-IA高压细胞破碎机破碎细胞；

(5)收集破碎液，4℃，13000rpmmin^-1离心30min，转移上清，用0.22um的滤膜过滤；BL21(pET32a(+))表达后的过滤滤液记为对照，以备后用，编号4-4的转化子表达的滤液将进行纯化。

(6)取编号4-4的转化子表达后过滤液加2M咪唑溶液，使终浓度为20mM，纯化前用5～10mL平衡缓冲液平衡预装柱His SpinTrap Kit(GEHealthCare)，然后取滤液以0.5mL·min^-1上样，分管收集；

用15mL平衡缓冲液(同上50mm的磷酸缓冲液含有20mM咪唑)洗去未吸附的样品，流速1～2mL·min^-1，分管收集；

用15mL洗涤缓冲液洗(同上50mm的磷酸缓冲液含有40mM咪唑)去未吸附的样品，流速1～2mL·min^-1，分管收集；

用5mL洗脱缓冲液洗(同上50mm的磷酸缓冲液含有500mM咪唑)洗脱样品，流速1～2mL·min^-1，分管收集；此次收集样品即为纯化的多肽样品4-4。

用5mL平衡缓冲液平衡柱子，灌满20％乙醇，封闭，以备下次使用。

实施例3对照与转化子4-4的固氮酶活性实验

以大肠杆菌BL21为对照样，分别取对照样和和转化子4-4，用乙炔还原乙烯的方法测定固氮酶活性。将对照和转化子样品各3mL接入胶塞试管中，向试管中注入1/10体积的乙炔气体，37℃恒温箱培养24h后用气相色谱测定各反应液中的乙烯的生成，对照样和样品4-4的还原结果分别见附图2和附图3，其中，附图2为对照样的还原结果，附图3为样品4-4的还原结果，附图2和附图3中，曲线1代表甲烷，曲线2代表乙烯，曲线3代表乙炔。由附图2和附图3可知，编号4-4的转化子样品可成功有效地将乙炔还原为乙烯，另外还伴随了甲烷的生成。

实施例4应用实验

分别取上述对照和转化子4-4样品各3mL，接入胶塞试管中，用胶塞封口，37℃恒温箱培养24h后取样用流动注射分析仪采用纳什试剂比色法直接进样测定NH₄ ⁺浓度，结果见下表1：

表1 对照与样品中的NH₄ ⁺浓度

注：表中数值为平均值±标准差；同一行中标有小写英文字母表示Duncan多重比较差异显著(P＜0.05)；以下表中出现的字母具有相同含义。

由表1中可见，转化子4-4样品中NH₄ ⁺浓度显著增加，说明转化子4-4能将空气中的N₂，转化为NH₄ ⁺。

实施例5应用实验

锥形瓶灭菌(可以用胶塞分口)，注满灭菌的超纯水，倒过来，注入2/3体积的H₂，再注入1/3体积的¹⁵N₂气体，然后取上述纯化多肽样品30mL，胶塞密封，以加热使多肽失活作为对照样品，分装5瓶，37℃恒温箱倒置培养24h后，在上述培养液中加入酶终止液(30％的三氯乙酸，1mL/20mL)，在50℃干燥箱中浓缩培养液，使NH₄ ⁺-N的浓度达到3mgmL^-1～5mg mL^-1，即为铵盐。样品分析由上海化工研究院稳定性同位素测试中心完成，结果见下表2：

表2 各样品中的¹⁵N丰度

由表2中可见，新型多肽液中，¹⁵N 1丰度atm％比对照明显增加，说明所述多肽能将空气中的¹⁵N₂，转化为¹⁵NH₄ ⁺。

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>一种固氮基因和多肽及应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>585

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgctctcct cggtcgatcg cccaagtacc gcgctcgctc cggaaaagaa gatcgtctcc     60

tatgccggtc cacgccgaac catcgtcgtt gtcgatgaca atgaggatca ccgtgacctg    120

atgatggagg tgctgtcgcc gctcgatttc gtcgtgctga cggcacaaag cgggccagac    180

tgcctggcgc tgatcgaggc gatgcagccg gacgccttcc tcatcgatat ctccatgcca    240

ggaatgagcg gctggcaatt ggtggacagg ctgcgcgacg cagggcaaac ggcgcccatc    300

ctcatgctct cggccaatat cggcgatacg gccatcatcg gcgctggtac ggatggccat    360

aatgacacgc tggcaaagcc cgtggacatc cgcaagctct gcgaccggct ggccgttcat    420

ctcggcctgc aatgggttta tgataccgac cagcccccgg tctcattgcc ccaaagtcag    480

gcaaagcccg gcgctataca ggcaccggca ccggctcatt tgcaggatct gattgcactt    540

ggcgaaatag gctatattcg tggcatcgaa gcaaagctag cttga                    585

<210>2

<211>194

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Met Leu Ser Ser Val Asp Arg Pro Ser Thr Ala Leu Ala Pro Glu Lys

1               5                   10                  15

Lys Ile Val Ser Tyr Ala Gly Pro Arg Arg Thr Ile Val Val Val Asp

            20                  25                  30

Asp Asn Glu Asp His Arg Asp Leu Met Met Glu Val Leu Ser Pro Leu

        35                  40                  45

Asp Phe Val Val Leu Thr Ala Gln Ser Gly Pro Asp Cys Leu Ala Leu

    50                  55                  60

Ile Glu Ala Met Gln Pro Asp Ala Phe Leu Ile Asp Ile Ser Met Pro

65                  70                  75                  80

Gly Met Ser Gly Trp Gln Leu Val Asp Arg Leu Arg Asp Ala Gly Gln

                85                  90                  95

Thr Ala Pro Ile Leu Met Leu Ser Ala Asn Ile Gly Asp Thr Ala Ile

            100                 105                 110

Ile Gly Ala Gly Thr Asp Gly His Asn Asp Thr Leu Ala Lys Pro Val

        115                 120                 125

Asp Ile Arg Lys Leu Cys Asp Arg Leu Ala Val His Leu Gly Leu Gln

    130                 135                 140

Trp Val Tyr Asp Thr Asp Gln Pro Pro Val Ser Leu Pro Gln Ser Gln

145                 150                 155                 160

Ala Lys Pro Gly Ala Ile Gln Ala Pro Ala Pro Ala His Leu Gln Asp

                165                 170                 175

Leu Ile Ala Leu Gly Glu Ile Gly Tyr Ile Arg Gly Ile Glu Ala Lys

            180                 185                 190

Leu Ala

Claims (5)

1.一种固氮基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.一种多肽，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

3.一种权利要求2所述多肽的克隆方法，其特征在于是将权利要求1所述基因克隆到原核表达载体中，获得转化子，采用IPTG诱导和纯化得到。

4.一种权利要求2所述多肽的应用，其特征在于应用于工、农业生产中的生物固氮。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述多肽是将空气中的N₂固定还原为NH₄ ⁺应用于工、农业生产。

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