CN101810138A - 一种矮生型狗牙根新品种的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于草坪草育种技术领域，具体涉及一种矮生型狗牙根新品种的培育方法。本发明的特征在于，通过辐射诱变狗牙根种子，进行田间筛选，结合分子标记和同工酶鉴定等辅助选育，获得市场上所需要的矮生型狗牙根新品种。本发明的辐射源为通用的⁶⁰Co-γ射线，其剂量为200Gy-500Gy，剂量率为1.0Gy/min。本发明获得的狗牙根新品种矮生特性明显，持绿性好，培育的矮生型狗牙根新品种建植的草坪在生长期内基本上免修剪。

Description

一种矮生型狗牙根新品种的培育方法

技术领域

本发明属于草坪草育种技术领域，具体涉及一种矮生型狗牙根草坪草新品种的培育方法。

技术背景

狗牙根(Cynodon dactylon(L.)Pers.)别名绊根草、爬根草、百慕大草等。是禾本科狗牙根属多年生暖季型草坪草。原产非洲，广布于热带、亚热带和温暖地区。我国黄河流域以南各地均有野生种。是长江中下游及其以南地区铺设观赏草坪、运动草坪和游息草坪的主要草坪草品种。目前用作建植草坪的狗牙根品种，大部分都存在直立茎生长速度快的特点，在草坪养护中，特别是运动场草坪的养护中，修剪次数频繁，使养护成本居高不下，同时由于频繁修剪而导致剪草机尾气排放，造成了环境污染。

诱发突变是作物改良和基因创新的重要手段。辐射诱发的突变，多是形态变异，如花叶、金边、黄化等，对大多数农作物来说是劣变，但这对观赏植物来说往往是优变(吴楚彬等，绿帝王和花叶芋γ射线辐射诱变试验，广东农业科学，1997(5)：23-24)。国内外利用辐射诱变培育狗牙根新品种的方法已有报道，但主要集中在抗逆品种的培育上，美国育种家用4-8千拉德的⁶⁰Co-γ射线辐射‘Tifway’和‘Tifway II’，诱导出具有精细质地的草坪性状突变体(Hanna W W.Induced mutations in Midiron and Tifway bermudagrasses.Agron Abs，Amer SocAgron，Madison，WI.1990：175)；从狗牙根品种‘Tifgreen’的匍匐茎上获得一个不育的三倍体自然突变体，选育成‘Tifdrawf’品种，之后，用γ射线1181-2132C·kg^-1照射该品种的休眠根茎，产生了158种变异，从中选育了许多新品种，如‘Tifway II’，其表现与‘Tifgreen’相似，但具有较强的抗霜冻性和抗虫性，‘Tifgreen II’也是利用γ射线辐射育成的(Powell J B.Mutation induced in vergetatively propagated turftype bermudagrass by gamma radiation.CropSci.，1974，14：327-330)。国内在草坪草诱变育种方面的工作起步较晚，做了一些初步研究。中国科学院植物研究所通过对不同种源的国产狗牙根匍匐茎进行辐射，认为：从种的水平上，狗牙根匍匐茎γ射线的半致死剂量为9000rads；高剂量处理对狗牙根数量性状能够产生较稳定的理想的变异；在色泽上，低剂量的处理，可使50％的种源叶色变深。(郭爱桂等，辐射技术在国产狗牙根中的初步应用，草业科学，200017(1)：45-47)利用6800rads和9000rads两个剂量对普通狗牙根的10份优良选系进行辐射处理，对其诱变后代进行观测分析，发现9000rads是狗牙根匍匐茎的半致死剂量，并且该处理使得狗牙根的叶片性状和匍匐茎性状能够产生较稳定的理想变异。

利用辐射育种手段从辐射后代中选育新品种是简单而有效的育种方法。现有技术中尚未有利用⁶⁰Co-γ射线辐射狗牙根干种子结合田间筛选和实验室分子标记辅助选择鉴定培育矮生型狗牙根新品种的方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过物理诱变，田间选择和分子标记辅助选择，培育一种适用于草坪用的矮生型狗牙根新品种。

本发明通过以下技术方案实现：

一种矮生型狗牙根新品种的培育方法，包括如下步骤：

1)取狗牙根干种子作为实验材料，用物理方法进行诱变处理，所述的物理方法是采用⁶⁰Co-γ射线辐照狗牙根干种子，辐射剂量为200Gy-500Gy，每处理重复3次，剂量率为1.0Gy/min；

2)将辐射处理过的狗牙根种子播于田间，通过形态特征筛选变异植株；

3)利用过氧化物同工酶和ISSR标记方法对变异植株进行差异性辅助鉴定，筛选获得矮生型狗牙根植株。

其中：

步骤3)所述的ISSR标记方法所用的引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1-10所示。

步骤2)所述播种方法为：将步骤2)的种子播于塑料穴盘中，每穴一粒，穴内的基质为泥炭土和珍珠岩，其体积比为1∶1，重复3次，播种后在种子上方再覆盖基质1cm，将所述的穴盆放进温室内，定时、等量和均匀浇水；分蘖期将植株移至塑料营养钵内，钵内基质为泥炭土∶珍珠岩，其体积比为2∶1，营养钵置室外露地摆放。

步骤2)所述的形态指标包括节间长度、叶片长度、叶片宽度、节间直径和植株高度。

步骤4)所述的过氧化物同工酶鉴定方法为：称取供试材料的嫩叶，在液氮中快速研磨，转入10ml离心管，加入pH7.0磷酸缓冲液1.5ml，于4℃下，6000r/min离心10min，取上清液，置-20℃冰箱备用；采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度为4％，分离胶浓度为12％，pH8.3电极缓冲液为Tris-Gly，点进样量为10μl，以0.05％甘油溴酚兰为前沿指示剂，样品在浓缩胶时电压为100V，进入分离胶后将电压调为200V，将电泳槽置于4℃冰箱中电泳，稳流至电泳完毕，染色至蓝色酶带充分显色，流水冲洗约30min，使酶带变为棕褐色，然后照相，制干胶保存。

步骤3)所述的ISSR标记方法为：先用SDS法提取狗牙根叶片总DNA，以狗牙根(材料编号为HN018狗牙根品种)基因组DNA为模板，反应体系为10×buffer 2μL；10mMdNTP0.4μL；MgCl21.2μL；ISSR引物1μL；Taq酶0.2μL；模板DNA 2μL；ddH2O13.2μL，反应体积为20μL，用序列表SEQ ID NO：1-10所示的引物对对DNA样品进行ISSR-PCR扩增，扩增反应程序为95℃预变性2min；95℃30s，58℃45s，72℃90s，进行复性梯度降温，5个循环后，固定在95℃30S，53℃45S，72℃90S进行35个循环；最后72℃延伸6min，在2.0％琼脂糖凝胶中电泳3h，电泳液为1×TAE，在凝胶中加0.5μg.ml-1的EB。电泳后在紫外灯下观察照相。

本发明所述的矮生型狗牙根新品种培育方法，采用物理方法诱变，人工田间筛选和分子标记辅助选择，有利于筛选和稳定突变体，由于辐射处理的种子数量大，辐射后及时播种，先通过田间实验从辐射后代中筛选出矮生优良形态变异株，再对优良形态变异株进行过氧化物同工酶和分子标记辅助鉴定，因而提高了矮生型狗牙根新品种选育的准确性和选择效率。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1-10是ISSR标记引物对的核苷酸序列；

图1：是通过形态特征筛选的变异植株与其对照图片；

图2：是14个狗牙根材料的POD同工酶谱模式；

图3：是14个狗牙根材料基于遗传相似系数的UPMGA聚类图；

图4：是14个狗牙根材料的ISSR-PCR扩增结果(引物N22)；

图5：是基于ISSR标记所得狗牙根遗传相似系数聚类分析图；

图6：是筛选的矮生型狗牙根建植的草坪。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

利用物理辐射诱变培育矮生型狗牙根新品种

1材料与方法

1.1实验材料

表1 实验材料编号和来源

1.2 种子辐射

将狗牙根干种子(含水量为13-14％)分别装入小塑料袋内，于湖北省农业科学院辐照中心进行⁶⁰Co-γ射线辐照。辐射处理设照射剂量为200Gy、250Gy、300Gy、350Gy、400Gy、450Gy、500Gy，8个处理，每处理重复3次，剂量率为1.0Gy/min，各辐射处理的干种子数为2.5g，保证了足够的实验样本。

1.3 播种及移栽

辐射处理后的狗牙根干种子播于128穴(8×16cm)塑料穴盘中，每穴一粒，穴内基质为泥炭土和珍珠岩，其体积比为1∶1，重复3次，播好后在种子的表面覆盖基质1cm。将所述的塑料穴盘移动至温室内，该温室配有自走式浇水机，可以对各穴盘定时、等量、均匀地浇水。在狗牙根的分蘖期将植株移栽至塑料营养钵内，营养钵规格为12×10cm，营养钵基质为东北泥炭土∶珍珠岩＝2∶1(体积比)，将营养钵置于室外露地摆放，按照常规植物的日常养护管理，管理水平相同。

1.4 辐射后代形态指标观测

对辐照处理后的狗牙根后代形态指标观测主要包括节间长度，叶片长度，叶片宽度，节间直径和植株高度。节间长度为从根颈向上记数的第5个节间的长度；叶片长度和叶片度为第5个节间上的叶片的测量数值；每个指标均选取3个枝条进行测量。植株高度为从植株根颈起，向上生长的最大自然高度。

1.5 室内差异性检测

1.5.1 过氧化物同工酶(POD)分析

采集14个供试材料的幼嫩叶片作为实验材料。分别称取0.5g嫩叶，在液氮中快速研磨，转入10ml离心管，加入1.5ml磷酸缓冲液(1mol/L磷酸二氢钠390ml和1mol/L磷酸氢二钠610ml混合，pH7.0)，4℃下，6000r/min离心10min，取上清液，置-20℃冰箱备用。采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，参考郭尧君的方法(郭尧君，蛋白质电泳实验技术[M].北京：科学出版社，1999)，浓缩胶浓度为4％，分离胶浓度为12％，电极缓冲液为Tris-Gly(pH8.3)，点进样量为10μl，以0.05％甘油溴酚兰为前沿指示剂，样品在浓缩胶时电压为100V，进入分离胶后将电压调至200V。将电泳槽置于4℃冰箱中电泳。稳流至电泳完毕(大约1h)。染色主要参考赵小兰的配方(赵小兰，桂花品种的同工酶研究，[硕士论文].武汉：华中农业大学，1998，中国知网)，染色至蓝色酶带充分显色，流水冲洗约30min，酶带变为棕褐色。然后照相，制干胶保存。

1.5.2 ISSR标记分析

采集供试的狗牙根植株的幼嫩叶片，液氮中浸置后放在-70℃冰箱中备用。狗牙根幼嫩叶片总DNA的提取采用SDS法(王关林等，植物基因工程(第二版)[M]，北京：科学出版社，2002)的基础上稍作改动。以狗牙根(材料编号为HN018，品种为Tifway，购自武汉市洪山区九峰乡草坪基地的商业草皮)的基因组DNA为模板，在20μL反应体系中(10×buffer 2μL；10mMdNTP 0.4μL；MgCl2 1.2μL；ISSR引物1μL；Taq酶0.2μL；模板DNA 2μL；ddH2O13.2μL，反应体积为20μL)从N10等38个ISSR引物(本课题组设计，invitrogen公司合成)中筛选出10条重复性好、扩增性强、多态性高的稳定条带的ISSR引物(见序列表SEQID NO：1-10所示)，用这10个引物对14个狗牙根DNA样品进行ISSR-PCR扩增。

PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃30s，58℃45s，72℃90s，进行复性梯度降温，5个循环后，固定在95℃ 30S，53℃ 45S，72℃ 90S进行35个循环；最后72℃延伸6min，在2.0％琼脂糖凝胶中电泳3h，电泳液为1×TAE，在凝胶中加0.5μg.ml-1的EB。电泳后在紫外灯下观察照相。以上反应所用的药品及酶均为Fermentas公司生产。统计时将扩增条带的有无转换为数据“1”和“0”，用Excel2003计算两两DNA间的相似系数，相似系数S＝(2Nab/Na+Nb)×100％。公式中Na、Nb、Nab分别代表a种，b种和a、b两种共有的酶带数；对相似系数进行聚类分析，构建分子聚类图，聚类方法应用UPMGA法(张俊卫等，利用RAPD标记鉴定和区分梅花42个宫粉型品种，园艺学报，2004，31(4)：487-490)。用公式多态性＝(总带数-共有带数)/总带数×100％，计算各类群间(或类群内)的多态性。

2 结果与分析

2.1 形态指标比较

表2：14个狗牙根辐照材料的形态指标比较

注：表中数据为平均值±标准误，同一列不同英文字母表示数据间存在显著差异(P＝0.05)

由表2可知：14个狗牙根辐照材料中，叶片最宽的是HN014，宽度为0.30cm，叶片最窄的是HN017，宽度为0.13cm。HN010、HN014和HN016与其对照HN009之间的差异呈显著水平，其它形态变异植株与其对照间的叶片宽度差异不显著；叶片长度最长的是HN003，长度为6.27cm，最短的是HN017，长度为1.10cm，各形态变异植株与其对照之间的差异都呈显著水平；从节间直径来看，最大的是HN005，直径为0.26cm，最小的为HN017，直径为0.11cm，除HN016和其对照HN009差异不明显外，其它形态变异植株的节间直径和其对照之间的差异均呈显著水平；在节间长度方面，节间最长的是HN003，长度为3.80cm，最短的是HN017，长度为0.67cm，各形态变异植株和其对照之间的节间长度差异水平显著；植株的自然高度最高的为HN010，高度为42.52cm，最矮的为HN017，高度为11.25cm。

2.2 POD分析

2.1.1 从14个供试材料总体来分析酶谱分布特征

依据POD酶带相对迁移率(Rf值)的大小和酶带集中程度，所有供试材料的酶谱从负极到正极都明显地分为三个区(图2，表3)：Rf值在0.018-0.094范围内的酶带为慢区，视为A区；Rf值在0.163-0.325范围内的酶带为中区，视为B区；Rf值在0.445-0.469范围内的酶带为快区，视为C区。在A区，是14种供试材料酶活性最强、分布最多和最为集中的区域，共出现了41条酶带，其中主酶带为38条，弱带和痕迹带为3条。在B区，共出现了28条酶带，其中包括5条活性强的主酶带P4(HN001、HN003、HN007、HN009、HN010)和23条弱带和痕迹带。在C区，共出现了13条酶带，全部为弱带和痕迹带。P2位点上14个材料均有酶带出现，说明P2位点是狗牙根不同品系共有的位点。

2.1.2 从形态变异植株与其对照的POD谱带来分析

除变异株系HN010和对照HN009，变异株系HN012和变异株系HN013的POD酶带完全相同，变异株系HN015和变异株系HN016的POD酶带在P8位点上的强弱不同外。形态变异植株与其对照之间不仅酶带总数不同，而且在各个区域分布的位点及带级也明显的不同。

表3 18种狗牙根属植物材料POD酶谱的Rf值

注：“--”表示无酶带。

2.1.3 14份狗牙根材料的聚类分析

14个材料间的遗传相似系数变化范围为0.250-1.000，平均为0.825，遗传相似性变化较大。

从聚类树状图(图3)可见，以酶谱相似系数0.83(虚线L1)为阈值时，可以把供试的14个材料聚为4类；第I类包括1个种源：HN011；第II类包括6个种源：HN016，HN015，HN013，HN012，HN018，HN007；第III类包括2个种源：HN017，HN003；第IV类包括5个种源：HN010，HN009，HN014，HN005，HN001。

2.3 ISSR分析

2.3.1 筛选的ISSR引物序列

从38个引物中筛选出10个多态性好的引物，其中2核苷酸重复序列9个，占90％；5核苷酸重复序列1个(N46)。2核苷酸重复序列中(AG)n较多，占60％，产生的多态性条带也最多，说明狗牙根基因组中含有丰富的AG/GA重复序列。所用引物的编号及序列见表4，其中R＝(A，G)，Y＝(C，T)。

表4 ISSR分析所用引物序列和扩增结果

说明：表4中“序列1”即本发明实际所述的“SEQ ID NO：1”，如此类推；限于表4的位置，表4对类似的序列编号进行了缩写。

2.3.2 14个狗牙根材料间扩增结果分析

用筛选出的10个ISSR引物对(见表4和序列表SEQ ID MO：1-10)对14个狗牙根材料的基因组DNA进行PCR扩增，共扩增出98条带，不同引物扩增条带数位7-15条不等，平均每个引物产生9.8条带，其中多态性条带共94条，多态性条带比率平均为95.92％。ISSR反应扩增的DNA片段大小一般在250-2000bp之间。

以图4为例来看，引物N22对14个狗牙根材料扩增的带数为10条，其中条带数最多的为材料HN009、HN016和HN018，各扩增出7条带，条带数最少的是HN001，扩增出4条带。从各变异植株和其对照的扩增条带数以及条带特征来看，均存在差异。

2.3.3 遗传相似系数和聚类分析

14个品种间的遗传相似系数变化范围为0.46-0.82，平均为0.62，遗传相似性变化较大。基于ISSR标记所得遗传相似系数进行聚类分析，获得图5结果。由图5可见，在遗传相似系数(GS)为0.654处作切割线L1时，14份狗牙根材料可分为3个类群。A大类包括5个材料(HN014、HN016、HN015、HN010、HN009)；B大类包括5个材料(HN017、HN018、HN013、HN012、HN011)；C大类包括4个材料(HN005、HN007、HN003、HN001)。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种矮生型狗牙根新品种的培育方法

<130>

<141>2009-12-24

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(18)

<223>

<400>1

agagagagag agagagyc    18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(18)

<223>

<400>2

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<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

<220>

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<222>(1)..(18)

<223>

<400>3

agagagagag agagagy t     18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

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<222>(1)..(18)

<223>

<400>4

agagagagag agagagya    18

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

<220>

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<223>

<400>5

gagagagaga gagagaya    18

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

<220>

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<222>(1)..(18)

<223>

<400>6

gagagagaga gagagayt    18

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

<220>

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<222>(1)..(18)

<223>

<400>7

gtgtgtgtgt gtgtgtya    18

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

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<222>(1)..(18)

<223>

<400>8

gtgtgtgtgt gtgtgtra    18

<210>9

<211>18

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<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

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<222>(1)..(18)

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<400>9

acacacacac acacacya    18

<210>10

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<213>狗牙根(Cynodon dactylon(L)Pers.)

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<222>(1)..(15)

<223>

<400>10

ggggtggggt ggggt    15

Claims (5)

1.一种矮生型狗牙根新品种的培育方法，其特征包括如下步骤：

1)取狗牙根干种子作为实验材料，用物理方法进行诱变处理，所述的物理方法是采用⁶⁰Co-γ射线辐照狗牙根干种子，辐射剂量为200Gy-500Gy，每处理重复3次，剂量率为1.0Gy/min；

2)将辐射处理过的狗牙根种子及时播于田间，通过形态特征筛选变异植株；

3)利用过氧化物同工酶和ISSR标记方法对变异植株进行差异性辅助鉴定，筛选获得矮生型狗牙根植株；

其中：

步骤3)所述的ISSR标记方法所用的引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1-10所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述播种方法为：将步骤2)的种子播于塑料穴盘中，每穴一粒，穴内的基质为泥炭土和珍珠岩，其体积比为1∶1，重复3次，播种后在种子上方再覆盖基质1cm，将所述的穴盆放进温室内，定时、等量和均匀浇水；分蘖期将植株移至塑料营养钵内，钵内基质为泥炭土：珍珠岩，其体积比为2∶1，营养钵置室外露地摆放。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的形态指标包括节间长度、叶片长度、叶片宽度、节间直径和植株高度。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的过氧化物同工酶鉴定方法为：称取供试材料的嫩叶，在液氮中快速研磨，转入10ml离心管，加入pH7.0磷酸缓冲液1.5ml，于4℃下，6000r/min离心10min，取上清液，置-20℃冰箱备用；采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度为4％，分离胶浓度为12％，pH8.3电极缓冲液为Tris-Gly，点进样量为10μl，以0.05％甘油溴酚兰为前沿指示剂，样品在浓缩胶时电压为100V，进入分离胶后将电压调为200V，将电泳槽置于4℃冰箱中电泳，稳流至电泳完毕，染色至蓝色酶带充分显色，流水冲洗约30min，使酶带变为棕褐色，然后照相，制干胶保存。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的ISSR标记方法为：先用SDS法提取狗牙根叶片总DNA，以狗牙根基因组DNA为模板，反应体系为10×buffer 2μL；10mMdNTP 0.4μL；MgCl2 1.2μL；ISSR引物1μL；Taq酶0.2μL；模板DNA 2μL；ddH2O13.2μL，反应体积为20μL，用序列表SEQ ID NO：1-10所示的引物对对DNA样品进行ISSR-PCR扩增，扩增反应程序为95℃预变性2min；95℃30s，58℃45s，72℃90s，进行复性梯度降温，5个循环后，固定在95℃30S，53℃45S，72℃90S进行35个循环；最后72℃延伸6min，在2.0％琼脂糖凝胶中电泳3h，电泳液为1×TAE，在凝胶中加0.5μg.ml-1的EB，电泳后在紫外灯下观察并照相。

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