CN101808629A - 激活调节性t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过诱导调节性T细胞(Treg细胞)的抑制性效能，激活人或动物机体的调节性T细胞(Treg细胞)的方法，其包含将合适的液体培养基中的调节性T细胞(Treg细胞)与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN)抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂接触的步骤。

Description

激活调节性T细胞的方法
本发明涉及激活调节性T细胞(Treg细胞；CD4+CD25+-细胞)的方法。尤其是，本发明涉及使用丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN；CD13；EC 3.4.11.2)的抑制剂或使用具有类似酶学效应的酶的抑制剂异位(ex-situ)激活调节性T细胞的方法。本发明还涉及丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或具有类似的酶学效应的酶的抑制剂在激活调节性T细胞中的用途。
已知具有自身免疫性发病机理的疾病如I型糖尿病或多发性硬化症，例如，是以自体反应性免疫细胞(即针对身体自身抗原的免疫细胞)，尤其是来自自体反应性T淋巴细胞的激活和增殖为基础的，或这些免疫细胞的激活和增殖对于这种疾病过程是标志性的。
相似的机制在器官移植后的排斥现象的形成过程中是显著的，除了一点不同：主要不是“自身抗原”而是供体器官的“外源抗原”是形成致命性免疫反应的原因。
在两种情况下，即在自身免疫性疾病和在排斥反应中，对身体自身抗原或来自移植物的抗原发生免疫系统“耐受性”的非预期性中断。在过敏症的情况下，过渡的免疫反应也同样适用。
近年来的经验表明，积极地在健康器官中保持该“耐受性”是通过积极地抑制自体反应性T淋巴细胞的功能和生长。这通过特定的抑制性T细胞群，所谓的天然调节性T细胞(Treg，CD4+CD25+细胞)而实现。Treg在胸腺中发育(Kawahata K.等人，J.Immunol.168：4399-4405，2002)并构成外周血中T细胞比例的5至10％。它们通过直接的细胞接触对具有相同抗原特异性的CD4+T细胞具有抑制性效应。该抑制性效应通过Treg内/上强烈表达TGF-β1而实现。因此，TGF-β1出现在Treg的表面并与自身反应性T细胞上的TGF-β1受体结合，这构成了该强免疫抑制性细胞因子作用的全新机制(Nakamura等人，J.Exp.Med.194：629-644，2001)。
Treg细胞抑制自身免疫反应比抑制对于“外源”抗原的免疫反应更有效(Romagnoli，P.等人，J.Immunol.168：1644-1648)。因此，Treg细胞功能的限制或丧失在自身免疫性疾病的形成过程中尤其具有发病机理的重要性。对于I型糖尿病(Boudalay，S.等人，Eur.CytokineNetw.13：29-37，2002；Gregori，S.等人，Diabetes 51：1367-1374，2002)，自身免疫性脑脊髓炎(多发性硬化症的动物模型)(Furtado，G.C.等人，Immunol.Rev.182：122-134，2001；Muhallab，S.等人，Scand.J.Immunol.55：264-273，2002；Hamilton，N.H.等人，Scand.J.Immunol.55：171-177，2002)，自身免疫性卵巢疾病(AOD)(Tung，K.S.等人，Immunol.Rev.182：135-148，2001)，还有克隆氏病(Neurath，M.F.等人，J.Exp.Med.195：1129-1143，2002)，已经鉴定出在Treg细胞的数目/功能和自身免疫性疾病的表现之间的直接关联。
此外，Treg细胞还是抑制肠道或肺部炎症的成因(Singh，B等人，Immunol.Rev.182：190-200，2001；Hori，S.等人，Eur.J.Immunol.32：1282-1291，2002)。还已经明确证实Treg细胞在异体(外源)器官移植后抑制排斥现象中的作用([Kingsley，Cl等人，J.Immunol.168：1080-1086，2002；Taylor，P.A.等人，Blood 99：3493-3499，2002；Chiffoleau，E等人，J.Immunol.169：5058-5069，2002)。Treg细胞的所有这些免疫抑制功能的共同之处是与它们由高抗原特异性而区分，即在正常生理条件下每个Treg细胞克隆针对特定抗原，并抑制具有相同抗原特异性的自身反应性T细胞。自身免疫性疾病情况下，Treg细胞的这个功能丧失，而且在I型糖尿病情况下针对胰腺β细胞蛋白的自身反应性T细胞克隆导致自身免疫性疾病的发生。
然而，该抗原特异性还能通过这些细胞在体内或体外的“抗原特异性”激活而增加或再造Treg细胞(或被这些细胞激活的树突细胞)的数目/功能而治疗性地使用。口腔应用该“抗原”也适合于该目的(Zhang等人，J.Immunol.167：4245-4253，2001)。然而，这种抗原的生产是技术上极其花费时间并是极其昂贵的，并限于抗原特异性T细胞克隆。
两篇以上最近的出版物强调了TGF-β1在调节免疫高反应性中的特殊作用，其表明通过遗传操作使CD4+细胞过量产生TGF-β1能抑制病理过程。因为在哮喘情况下，Th2-细胞是发病中的决定性因素，因此致病性Th2-细胞克隆的功能能被转基因性过量产生TGF-β1所抑制(Hansen，G.等人，J.Clin.Invest.105：61-70，2000；Thorbecke，G.J.等人，Cytokine Growth Factor Rev.11：89-96，2000)。这些诱导CD4+或Treg细胞产生TGF-β1的方法的缺点是它们必须经遗传操作，一方面，这些方法是非常昂贵的，另一方面不适合人或动物的药理学应用。
出版物DE-A 102 30 381涉及丙氨酰基-氨基肽酶的一种或多种抑制剂和/或具有相同底物特异性的酶的一种或多种抑制剂在诱导Treg细胞内和/或Treg细胞上TGF-β1的产生和TGF-β1的表达中的用途，以及在预防和/或治疗自身免疫性疾病、过敏症、动脉硬化和在抑制移植排斥中的用途。
现在令人惊奇地发现，促进Treg细胞的抑制性活性和促进这些Treg细胞表达TGF-β1可归因于一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或Treg细胞上具有相同底物特异性的肽酶的一种或多种抑制剂的激活效应。尤其是，令人惊奇地发现，有可能通过一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶的抑制剂和/或通过具有相同底物特异性的肽酶的一种或多种抑制剂在人或动物体外(体外)激活Treg细胞，并通过激活Treg细胞产生针对人或动物体内的异体抗原和自身抗原的耐受性或甚至是克服体内过度的免疫应答。
因此，本发明涉及通过诱导调节性T细胞(Treg细胞)的抑制性效应，激活人或动物体的调节性T细胞(Treg细胞)的方法，其包括将合适的液体培养基中的调节性T细胞(Treg细胞)与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂(氨基肽酶N；APN)和/或具有相同底物特异性的肽酶的一种或多种抑制剂接触的步骤。
尤其是，本发明涉及体外激活人或动物体的调节性T细胞(Treg细胞)的方法，其含有步骤：
(a)回收来自至少一个人体或动物体的含有Treg细胞的至少一种体液；
(b)从如此获得的人或动物体液中分离调节性T细胞(Treg细胞)；
(c)将如此而分离并纯化的合适的液体或半液体培养基中的调节性T细胞与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN)抑制剂和/或具有相同底物特异性的肽酶的一种或多种抑制剂接触足以激活的时间；并
(d)将如此处理的合适的培养基中的调节性T细胞(Treg细胞)回输至至少一种人或动物体内。
该方法的优选具体实施方式将在从属权利要求3至16中声明。
本发明还涉及使用下文详细描述的方法获得的激活的调节性T细胞(Treg细胞)。
本发明此外涉及含有激活的调节性T细胞(Treg细胞)的制品，如含有使用本发明所述的方法制备的调节性T细胞的制品，该制品可能含有通常的支持物，辅助物质或佐药(adjuvant)。
本发明此外涉及根据下列详细说明的激活的调节性T细胞(Treg细胞)的用途和/或含有这种调节性T细胞(Treg细胞)的制品在预防、缓解或治疗移植排斥反应、自身免疫性疾病、过敏症、支气管哮喘和COPD，慢性炎症发生的疾病，包括动脉硬化、神经元性疾病和脑损伤，皮肤病，优选银屑病、痤疮或瘢痕瘤和其它过度增殖的情况，纤维化、肿瘤性疾病和败血症中的用途。
优选的用途在从属权利要求27至38中声明。
参考图将进一步详细解释本发明，其中：
图1是定量证明在放线酰胺素作为氨基肽酶N抑制剂存在条件下人调节性T细胞的激活的示意图；
图2是定量证明在PAQ22作为胞浆氨基肽酶(cAAP)抑制剂存在条件下人调节性T细胞的激活的示意图；
图3是定量证明在IP10.C8作为丙氨酰基-氨基肽酶(APN)和二肽基肽酶IV(DPIV)的双重抑制剂存在条件下人调节性T细胞的激活的示意图；
图4是定量证明在菲宾斯汀(phebestin)作为丙氨酰基-氨基肽酶(APN)抑制剂存在条件下鼠调节性T细胞的激活的示意图；和
图5是定量证明在小鼠大肠炎模型中以APN抑制剂(菲宾斯汀)异位激活的调节性T细胞(Treg细胞)效应的示意图。
现在参考优选具体实施方式和实施例进一步详细解释本发明，其中描述了优选具体实施方式的实践性应用。然而，应理解本发明不限于优选具体实施方式，其仅用于示例性解释。
本发明涉及激活调节性T细胞(Treg细胞，CD4+CD25+细胞)的方法。在本说明书和本专利的权利要求中，“调节性T细胞”应理解为是那些具有控制致病性T细胞应答能力的T淋巴细胞。Treg细胞在胸腺中分化然后转运至身体的外周。人或动物组织中的Treg细胞的主要任务是阻断自身反应性成熟T细胞的效应器功能(Sakaguchi，S.等人，J.Immunol.155：1151-1164(1995)；Roncarolo，M.G.等人，J.Exp.Med.193：F5-F9)。
根据本发明所述的方法激活Treg细胞。在本说明书和在专利权利要求中，“激活”应理解为诱导出Treg细胞的抑制性效应，这表现在转化生长因子β1(TGF-β1)和转录因子FoxP3的强烈表达。根据本发明，术语“激活”还包括Treg细胞的重激活。这既能在体内发生也能在体外发生，例如，在在炎症条件下Treg细胞失活(例如是炎症性细胞因子长期作用的结果)后发生。
在本说明书和本专利权利要求中，术语“抑制剂”应理解为是指那些天然来源的、合成来源的或经合成修饰的天然来源的化合物，其具有调节效应，尤其是抑制一种酶或一组酶的效应。该调节性效应能基于广泛多种效应，而不局限于术语“抑制剂”的前述广义定义。根据本发明优选的抑制剂是对酶有抑制效应的抑制剂，进一步优选对特定的酶的群组具有抑制效应的抑制剂，例如对于丙氨酰基-氨基肽酶N(APN)和对于与丙氨酰基-氨基肽酶N的底物特异性相同的肽酶具有抑制效应的抑制剂或对于二肽基肽酶IV(DP IV)和对于与二肽基肽酶IV的底物特异性相同的肽酶具有抑制效应的抑制剂。
能在使调节性T细胞(Treg细胞)与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶和/或与一种或多种有相同底物特异性的肽酶的抑制剂接触的步骤中使用单一抑制剂。或者，能使用多种抑制剂。根据本发明尤其优选使用一种抑制剂。本发明所述的方法中使用的抑制剂可以是一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶的抑制剂。或者，本发明所述的方法中使用的抑制剂可以是一种或多种具有与丙氨酰基-氨基肽酶相同的底物特异性的肽酶抑制剂。或者进一步，使用的抑制剂可以是一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶和具有相同底物特异性的肽酶的抑制剂。本发明所述方法的进一步的另外的具体实施方式中，能使用多种抑制剂，其中一种或多种抑制剂来自丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂，并且一种或多种进一步抑制剂来自与丙氨酰基-氨基肽酶底物特异性相同的肽酶抑制剂。
所用的一种抑制剂或所用的多种抑制剂(如果使用多种抑制剂)可以是丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN；CD13；EC 3.4.11.2)的抑制剂(下文在优选具体实施方式中将更详细说明)，或该抑制剂可以是具有与丙氨酰基-氨基肽酶相同的底物特异性的肽酶的抑制剂。
术语“丙氨酰基-氨基肽酶(APN)的抑制剂”，正如在本说明书和本专利权利要求中所用，涉及那些能特异性抑制APN和其它底物特异性相同的肽酶的酶活性的物质。已知，这些抑制剂可以属于不同的结构类别。APN抑制剂的共同特征是其与APN和具有相同底物特异性的肽酶的活性位点的亲和力。以Zn2+离子、具有序列为HEXXH-(X18)-E的锌结合基序和肽链端解酶基序GXMEN为特征。负责在APN活性位点结合所有已知APN抑制剂的必要的氨基酸残基包括E355、H388、E389、H392、E411和Y477。
不考虑抑制剂的特定结构，就源自确定的抑制剂结果的APN和具有相同底物特异性的酶的抑制剂的效应和生物学作用而言，APN抑制剂与丙氨酰基-氨基肽酶和具有相同底物特异性的肽酶之间的特异性相互作用的这些分子基础用于解释一般的适用性(Xu，W.等人，Curr.Med.Chem.-Anti-Cancer Agents 5：285-301(2005)；Bouvois，B.等人，Med.Res.Reviews 26：88-130(2006))。
本说明书和本专利权利要求中所用的术语“(与丙氨酰基-氨基肽酶)具有相同底物特异性的肽酶抑制剂”，在关于抑制剂的在先陈述的意义上，涉及那些其效应能以含有高度保守性锌结合基序和肽链端解酶基序而定义的肽酶。这种肽酶的例子有胞浆氨基肽酶(cAAP；EC3.4.11.14)，氨基肽酶A(APA；EC 3.4.11.7)，促甲状腺激素释放激素-降解性胞外酶TRH-DE；EC 3.4.19.6)，脂肪细胞源性的亮氨酸氨基肽酶(A-LAP；EC 3.4.11.x)，胰岛素调节的氨基肽酶(IRAP；EC3.4.11.3)，氨基肽酶B(APB；EC 3.4.11.6)，白细胞三烯A4水解酶(LTA4H；EC 3.3.2.6)和白细胞源性的精氨酸氨基肽酶(LRAP；EC3.4.11.x)，不限于上述例子(Albiston，A.L.等人，Protein and PeptideLetters，vol.XI，No.5，491-500(2004))。
根据本发明尤其优选使用丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN；CD13；EC 3.4.11.2)抑制剂。
在基于非预期的激活结果之上的本发明所述的尤其优选的激活调节性T细胞(Treg细胞)的方法中，激活的步骤在体外发生。在本说明书和本专利权利要求的框架内，应理解本发明所述的优选的方法并非在(活体)人或动物有机体上进行的方法。而是以从活体人或动物体内取出的物质在体外进行激活步骤，然后将以本发明所述的方法处理的该物质再以合适的形式回输至人或动物体内。正如下文解释的从基于特定优选具体实施方式的实施例中所看到的，这导致Treg细胞的激活结果，对于本领域技术人员是非预期的。
在本发明所述的激活人或动物体的调节性T细胞(Treg细胞)的优选的体外方法的第一步中，至少一种能用于回收Treg细胞的体液，即那些含有Treg细胞的体液，从至少一个人或动物体，优选从正好的一个人或动物体回收。含有Treg细胞的体液能从人或动物体内回收，或多数含有Treg细胞的体液能从一个人或动物体内回收。这可以以技术人员已知的方式在活体人或动物体上或在活体人或动物体内进行，并且回收方法取决于所要考虑的体液。回收一种或多种体液的合适的途径可以是通过人或动物体(例如是渗出液的情况)的体液分泌或通过由专家操作取出体液(例如是血液的情况)。
在该方法的尤其优选的具体实施方式中(然而不限定本发明)，一种或多种选自血液、血液组分，淋巴，渗出液或局部腔室中的体液从人或动物体内回收。在实践基础上，回收选自上述体液的单一体液。如果血液自人或动物体内分离，那么优选选择外周血，甚至进一步优选静脉血。例如胸膜或腹膜能优选作为局部腔室而分离。尤其优选的是如果外周血，尤其有利地是静脉血，从人或动物体回收。Treg细胞天然存在于静脉或外周血中，其浓度促进以实际方式在下列步骤中的分离。
在下列方法步骤中，将调节性T细胞(Treg细胞)从本发明所述的方法的第一步中回收的体液中分离出来，即，优选从一种上述体液中分离，尤其是从一种上述从人或动物体回收的体液中分离，进一步优选从血液和尤其优选从外周血，例如从静脉血中分离。使用任何对于技术人员来说是已知的分离Treg细胞的可能步骤进行，不使本发明在这方面受到任何限制。尤其是，分离Treg细胞的分离试剂盒是商业上可获得的，其能使Treg细胞从一种上述体液中分离出来。
从体液或从第一方法步骤中回收的特定体液，例如从外周血或从静脉血开始，使用合适的分离方法分离也含有调节性T细胞(Treg细胞)的细胞组分。例如，以已知的方式，单核细胞本身和其中含有Treg细胞的浓缩T细胞能从外周供体血中使用一般对于本领域技术人员而言已知的不同过程通过密度梯度离心而获得。从这样获得的细胞组分中，调节性T细胞(Treg细胞)能使用考虑到Treg细胞的特性的分离过程而获得，例如(不限于此)使用与磁性颗粒结合的细胞特异性抗体。根据本发明，证明两步磁性分离是有利的。根据本发明，在其第一过程步骤中，可以从在先过程步骤中获得的细胞群中耗竭CD4-细胞而保留CD4+细胞。例如这能使用市场上可购得的分离试剂盒，例如用CD4-分离试剂盒(从Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，Germany购得)而实现。这使得能获得纯度是＞95％的CD4+T细胞。在第二磁柱分离步骤中，然后以抗-CD24微珠(Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，Germany)处理剩余的细胞群，并使用CD25标记，通过磁柱分离获得CD4+CD25+T细胞(调节性T细胞；Treg细胞)。高度纯化的调节性T细胞(Treg细胞)能以这种方式分离。换句话说，分离Treg细胞的步骤伴随Treg细胞的纯化，即去除可能阻碍或干扰或甚至是阻止后续Treg细胞激活的其它细胞、细胞成分或其它物质。然而，本发明不限于该分离和纯化Treg细胞的方法，其仅以实施例的方式给出。
在下一步方法步骤中，将因此获得的和在合适的液体培养基中的纯化的调节性T细胞与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN)抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂接触一段足以激活的时间。这能以任何对于本领域技术人员是已知的和熟悉的所期望的方式进行，在这方面本发明不受任何限制。
在本发明所述方法的优选具体实施方式中，在合适的液体培养基中进行Treg细胞与一种或多种抑制剂的接触，与下列涉及抑制剂的特定说明书一致。
在本说明书和专利权利要求中，“液体培养基”应理解成主要是指液体细胞培养基，如商售的各种形式的含或不含白蛋白和血清成分的液体细胞培养基。然而，这不构成对本发明的限制，而仅是在实际中基本上可能的浓度。天然地，水培养基优选那些具有它们应该是生理上可接受的共同特点，即不仅因为能使Treg细胞后续再输注回人或动物体内的实际理由，还因为考虑到要使得激活步骤的天然过程在尽可能接近于体内存在条件的条件下进行。因此，尤其优选使用的培养基选自生理上可接受的溶液，细胞培养基和营养培养基。甚至更优选的是如果这些培养基选自生理上可接受的水溶液，水制细胞培养基或水制营养培养基。在本发明所述方法的尤其优选的具体实施方式中，选择无血清AIMV培养基作为激活过程的培养基。上述培养基能单独选择或者两种或多种组合选择。尤其优选使用主要含有水或实质上由水组成的培养基。
此外，根据本发明优选向用于激活过程的液体培养基中加入添加剂，这些添加剂在细胞培养和/或细胞治疗中常见，并且对于技术人员在其专业知识的基础上是已知的。这些添加剂的例子有抗生素、氨基酸补充剂、维生素补充剂和微量元素补充剂，在用于激活过程的培养基中或预备的(provided)培养基中单独或与两种或多种特定物质组组合起来使用。
使上述分离(和纯化)的调节性T细胞(Treg细胞)与一种或多种抑制剂(如上文详细描述的那些抑制剂)接触一段足以激活的时间。在适当时，在培养基中加入白细胞介素-2(优选20至100U/ml)是有利的，和/或使用丝裂原(如PHA或PWM)和/或使用抗CD3抗体刺激是有利的。技术人员在所限定实验的范围内对于特定系统能容易地确定孵育时间。从经验得知，这位于24至48小时的范围内，但不限于该范围。
根据本发明，使上述分离的调节性T细胞与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN)抑制剂接触和/或与底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂接触。根据本发明所述的方法能使用一种抑制剂以激活Treg细胞或能使用多种抑制剂。单一抑制剂可以是丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂，或者单一抑制剂可以是底物特异性相同的肽酶抑制剂。当使用多种抑制剂时，两种或甚至多种抑制剂能组合使用。这些两种或多种抑制剂可以全部是丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂或可以全部是底物特异性相同的肽酶抑制剂，或者这两种或多种抑制剂可以是部分来自丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂，部分来自底物特异性相同的肽酶抑制剂，或者这些抑制剂是丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂，同时也是与丙氨酰基-氨基肽酶底物特异性相同的肽酶的(一种或多种)抑制剂。尤其优选的是如果使用上述两组之一的单一抑制剂，并且最优选使用丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂。
在本发明所述方法的优选具体实施方式中，多种已知抑制剂之一来自放线酰胺素、雷黑斯汀(leuhistin)、菲宾斯汀(phebestin)、抑氨肽酶素、苯丁抑制素(bestatin)、普博斯汀(probestin)、阿芙曼宁(arphamenin)A、阿芙曼宁B、MR 387A、MR 387B、β-氨基硫醇(β-aminothiols)、α-氨基磷酸及其酯类和盐类、α-氨基碳磷酸盐化合物、α-氨基硼酸、α-氨基醛、α-氨基酸氧肟酸盐、N-苯基酞酰亚胺、N-苯基同酞酰亚胺(N-phenylhomophthalimides)、α-酮酰胺、沙利度胺及其衍生物，用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或用作至少一种底物特异性相同的肽酶抑制剂。上述名称一般代表技术人员所熟悉的能在本发明所述的激活方法中用作抑制剂的抑制剂或物质组的常用名称。
名称“MR 387A”已知代表物质：
Figure G2008800256699D00101
其系统名称是C(2S，3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁醇-基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酸，名称“MR 387B”已知代表物质
Figure G2008800256699D00111
其系统名称是C(2S，3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁醇-基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-(R)-羟基-L-脯氨酸。
假定单纯通过实施例的方式并不旨在将本发明限于此，下列化合物，其能单独使用或多种组合使用以激活Treg细胞，可以是合适的丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂。
Figure G2008800256699D00112
雷黑斯汀(10)
Figure G2008800256699D00121
菲宾斯汀(4)
Figure G2008800256699D00122
抑氨肽酶素(5)
Figure G2008800256699D00123
苯丁抑制素(1)
Figure G2008800256699D00124
阿芙曼宁A＝5-氨基-8-{[氨基-(亚胺基-)甲基-]氨基-}2-苯甲基-4-氧-辛酸
Figure G2008800256699D00131
阿芙曼宁B＝5-氨基-8-{[氨基-(亚胺基-)甲基-]氨基-}2-(4-羟基-苯甲基)-4-氧辛酸
Figure G2008800256699D00132
β-氨基硫醇：
Figure G2008800256699D00141
Figure G2008800256699D00161
Figure G2008800256699D00171
α-氨基硼酸：
Figure G2008800256699D00181
α-氨基醛：
Figure G2008800256699D00191
Figure G2008800256699D00201
α-酮酰胺：
这些化合物详见出版物“Xu，W.等人；Curr.Med.Chem.Anti-Cancer Agents 5：281 to 301(2005)”，并就其对丙氨酰基-氨基肽酶的抑制性效应进行了描述。该出版物的内容在此并入本申请的公开以供参考。
在本发明所述的方法中，为激活调节性T细胞(Treg细胞)更优选使用来自α-酮酰胺，α-氨基磷酸，N-苯基同酞酰亚胺和α-氨基碳磷酸盐的多种已知抑制剂中的一种作为至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或作为底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。如果使用α-酮酰胺，优选使用一种来自3-氨基-2-氧-4-苯丁酸酰胺的化合物。如果使用α-氨基磷酸，尤其优选使用D-Phe-y[PO(OH)-CH2]-Phe-Phe。如果使用N-苯基同酞酰亚胺，尤其优选使用PAQ-22。如果使用α-氨基碳磷酸，尤其优选使用RB3014和/或菲宾斯汀。在特定优选化合物中，最尤其优选使用PAQ-22，RB3014和/或菲宾斯汀作为至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或作为底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。PAQ-22或多种已知含有PAQ-22(即其中之一是PAQ-22)的抑制剂可以优选用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或作为底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂，这些抑制剂具有特定优势同时保留了对于需要激活的Treg细胞的特别好的激活效果。在这种情况下，缩写名称RB3014代表该物质
其系统名称为2-{3[(1-氨乙基-)羟基膦基]-2-苯甲基-丙酰基氨基-}3-苯丙酸。PAQ-22代表物质：
Figure G2008800256699D00231
其系统名称是3-(2，6-二乙基苯基-)喹唑啉-2，4(1H3H)-二酮。
在本发明所述的同样优选的进一步具体实施方式中，可将来自丙氨酰基-氨基肽酶或底物特异性相同的肽酶，和来自通式(1)和(2)的化合物的二肽基肽酶(IV)或底物特异性相同的肽酶的双重抑制剂的一种或多种已知抑制剂用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或用作底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。
A-B-D-B′-A′  (1)和
A-B-D-E        (2)，
其中
-A和A′可以相同或不同并代表基团
-其中X代表S、O、CH2、CH2CH2、CH2O或CH2NH，并且Y代表H或CN，并且*代表优选在S-或L-构型中的手性碳原子；
-B和B′可以相同或不同并代表未被取代或取代的，非分支或分支的亚烷基基团、环亚烷基基团、芳香亚烷基基团、杂环亚烷基基团、杂芳香亚烷基基团、芳香基-氨基亚烷基基团、杂芳香氨基亚烷基基团，其含或不含O、N或S，带有一个或多个五-、六-、或七元环的未被取代的或单或多取代的亚芳基基团或杂亚芳基基团，其；
-D代表-S-S-或-Se-Se-；和
-E代表基团-CH2-CH(NH2)-R9或-CH2-*CH(NH2)-R9，其中R9代表未被取代的或取代的，非分支的或分支的烷基基团、环烷基基团、芳香烷基基团、杂环烷基基团、杂芳香烷基基团、芳香氨基烷基基团、杂芳香氨基烷基基团，其含有或不含O，N或S，带有一或多个五-，六-或七元环的未被取代的或单-或多取代的芳香基团或杂芳香基基团，并且*优选在S-或L-构型中代表手性碳原子。
-或其带有机酸和/或无机酸的酸加成盐。
在本说明书和本专利权利要求中，术语“双重抑制剂”应理解为是指丙氨酰基-氨基肽酶的抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶抑制剂(如上所限定)以及二肽基肽酶IV(DP IV；CD26；EC 3.4.14.5)抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶抑制剂。
在本说明书和本专利权利要求中，术语“二肽基肽酶IV(DP IV)抑制剂”理解为是指那些能特异性抑制DP IV和其它底物特异性相同的肽酶的酶活性的物质。在这种情况下，这些DP IV抑制剂可以属于不同结构类型。这些抑制剂的共同特征是它们对DP IV和底物特异性相同的肽酶的活性位点的亲和力。DP IV和其它底物特异性相同的肽酶的分子区域的特征是氨基酸残基S630、D708、H740(“催化三联体”)，E205、E206和Y547。此外，残基Y666、F357和R358属于抑制剂-结合氨基酸残基。
不管该抑制剂的特定结构，就源自结合已确立的抑制剂的结果的这些抑制剂的效应和生物学作用而言，DP IV抑制剂与相同底物特异性的肽酶的抑制剂之间的特异性相互作用的这些分子基础用于解释一般的适用性(参照Sedo，A.等人，Biochimica et Biophysi ca Acta 1550：107-116(2001))。
上述出版物还证实具有与二肽基肽酶IV的底物特异性相同的肽酶的许多例子(与上文已限定的作为与APN的底物特异性相同的肽酶具有相似的意义)。这些例子包括例如(不限制)成纤维细胞-激活蛋白α，二肽基肽酶IV β，二肽基-氨基肽酶样蛋白(DPPX)、NAALADase(N-乙酰化α-连接的酸性二肽酶)、QPP(静止细胞脯氨酸二肽酶)、二肽基肽酶II(DP II)、吸引素(桃花心木蛋白)、二肽基肽酶8(DP 8)、二肽基肽酶9(DP 9)。
是上述定义意义中的双重抑制剂的上述通式(1)和(2)的化合物中，A和A′，可以相同或不同，代表基团
Figure G2008800256699D00251
其中X代表S、O、CH2、CH2CH2、CH2O或CH2NH，并且Y代表H或CN，并且*代表手性碳原子。具有通式(1)的化合物，其中A和A′相同，以及具有通式(1)和(2)的化合物，其中在A代表的上述基团中，X代表S、CH2或CH2CH2和/或Y代表H或CN，根据本发明是尤其优选的。
在本发明的进一步优选的具体实施方式中，这些具有通式(1)和(2)的化合物代表尤其在Treg细胞的激活中具有活性的抑制剂的药物前体，其中*所指的手性碳原子具有S-或L-构型。
在说明书和专利权利要求中，术语“药物前体”理解成涉及天然存在的或合成的或天然存在但经合成修饰的化合物，在一定条件下能用化学方法从药物前体派生或衍生出来其它化合物，所述条件优选为在生理或病理条件下或在所期望的化学反应条件下(如在Treg细胞激活条件下)，其中这些其它化合物产生从质上和/或量上不同于起始物质(“药物前体”)的化学或药理功效。因此，抑制剂药物前体理解为是天然或合成来源的化合物，或是天然的但经合成修饰的化合物，所述合成修饰优选在生理或病理条件下或在所期望的化学反应条件下进行，能有目的地反应形成具有抑制效能的新物质。这不排除这些药物前体在转化成具有特定药理效能(例如抑制性)的药物之前就已经产生药理效能(例如，抑制两种上述酶之一)的能力。药物前体转化成为哺乳动物或特定的人的药物的条件可以是如那些在哺乳动物例如人的生理环境中或在哺乳动物例如人体内常规存在的条件。另外，这些生理条件可以仅在特定条件下存在，例如特定生理状态下，如确定临床图像的条件，例如在哺乳动物如人中，或者例如它们能通过外界作用诱导或发生适应性改变，例如(不限于)通过药物作用，作用于哺乳动物的组织如人的组织，或通过创造出特定化学反应条件。
在上述通式(1)和(2)的化合物中，B和B′可以相同或不同，并代表未被取代或取代的，非分支或分支的亚烷基基团、环亚烷基基团、芳香亚烷基基团、杂环亚烷基基团、杂环芳香亚烷基基团、芳香氨基亚烷基基团、杂芳香氨基亚烷基基团，其含有或不含O、N或S，带有一个或多个五，六或七元环的未被取代或单或多取代的亚芳基基团或杂亚芳基基团。
在本说明书和专利权利要求中，术语“烷基基团”理解为涉及单价直链(非分支)或分支的基团，该基团含有彼此以单键结合的碳原子，其中氢原子结合至碳原子上。因此，在本发明的意义上，烷基基团是饱和的单价烃残基。通式(1)和(2)的化合物中的烷基基团优选含有1至18个碳原子并因此选自基团甲基、乙基、n-丙基、i-丙基和基团丁基，戊基，己基，庚基，辛烷基，壬烷基，癸烷基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基、十五烷基，十六烷基，十七烷基和十八烷基的许多不同直链和分支的异构体。尤其优选含1至12个碳原子的直链和分支的烷基基团，并且还进一步优选含有1至6个碳原子的直链和分支的烷基基团。最优选基团甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、n-丁基、i-丁基、仲丁基和叔丁基。
因此，在本说明书和专利权利要求中，术语“链烯基基团”和“链炔基基团”理解为涉及单价直链(非分支)或分支的基团，该基团含有以单键彼此结合的碳原子和结合至分子中任何所期望的但却是限定的位置上的至少一个双键或三键，所述分子中氢原子结合至碳原子的其余键上，所述碳原子是至少2个碳原子和多达18个碳原子。乙烯基基团或丙烯基基团是优选的这类基团的例子。然而，具有多个碳-碳键的基团并不限于两个上述基团。
在说明书和专利权利要求中，术语“亚烷基基团”理解为涉及二价直链(非分支)或分支的基团，其含有彼此以单键结合的碳原子，其中氢原子结合至碳原子上。因此，在本发明的意义上，亚烷基基团是饱和二价烃基。通式(1)和(2)的化合物中的亚烷基基团优选含有1至18个碳原子，并且因此选自基团亚甲基，亚乙基，n-亚丙基(propylene)，2，2-亚丙基，1，2-亚丙基和亚丁基，亚戊基，亚己基(hexylene)，亚庚基(heptylene)，亚辛基(octylene)，亚壬基(nonylene)，亚癸基(decylene)，亚十一基(undecylene)，亚十二基(dodecylene)，亚十三基(tridecylene)，亚十四基(tetradecylene)、亚十五基(pentadecylene)，亚十六基(hexadecylene)，亚十七基(heptadecylene)和亚十八基(octadecylene)的许多不同的直链和分支的异构体。尤其优选含有1至12个碳原子的直链和分支的亚烷基基团，并且还进一步优选含有1至6个碳原子的直链和分支的亚烷基基团。最优选基团亚甲基，亚乙基，n-亚丙基，2，2-亚丙基，1，2-亚丙基和许多不同的亚丁位异构体。
在烷基和/或亚烷基基团中，其是部分本发明所述的通式(1)和(2)的化合物，含有碳原子的链可以被-O-原子、-N-原子或-S-原子打断。因此，并非一个或多个-CH2-基团，一个或多个来自-O-，-NH-和-S-的基团可以位于链中，其中基团-O-，-NM-和/或-S-中的两个基团通常在链中不彼此相邻。在这种情况下可以将多个基团-O-，-NM-或-S-之一插入分子中任何所期望的位置。当这样杂基团(hetero group)存在时，这样的基团优选包含在分子中。
根据本发明，在进一步具体实施方式中，通式(1)和(2)的化合物中的直链和分支的烷基或亚烷基基团可以以一个或多个取代基取代，优选以一个取代基取代。取代基可以位于碳原子形成的骨架上任何所期望的位置上，并且(本发明不限于此)可以优选选自：卤素原子，如氟、氯、溴和碘，尤其优选氯和溴；具有1至6个碳原子的烷基基团，尤其优选具有1至4个碳原子的烷基基团，烷基基团内具有1至5个碳原子的烷氧基，优选烷基基团内具有1至3个碳原子；氨基基团，羰基基团和羧基基团(其是未被取代的或分别以一个或两个含有1至6个碳原子优选1至3个碳原子的彼此独立的烷基基团取代)。后者也可以以烷基基团中含有1至6个碳原子的醇的盐或酯的形式存在。因此，术语“羧基基团”包括含有基本结构-COO-M+(其中M＝单价金属原子，如碱金属原子或多价金属原子的相应等价物，如二价金属原子如碱土金属原子的半等价物)，或基本结构-COORx(其中Rx＝含有1至6个碳原子的烷基基团)的基团。被取代的烷基基团选自上述详细限定的烷基基团，并且最优选的是这些烷基基团是甲基基团，乙基基团，n-丙基基团，i-丙基基团，n-丁基基团，i-丁基基团，仲丁基基团或叔丁基基团。烷氧基基团是上述限定的意义上的烷基基团，其通过桥-O-原子结合至碳原子形成的骨架上。它们优选选自基团甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、i-丙氧基、n-丁氧基、i-丁氧基、二丁氧基或叔丁氧基。氨基基团是含有基本结构-NRxRy的基团，其中基团Rx和Ry，彼此独立，可以代表氢或具有1至6个碳原子(尤其优选1至3个碳原子)的烷基基团(与上述限定一致)，其中基团Rx和Ry可以相同或彼此不同。作为取代基的尤其优选的氨基基团是基团-NH2，-NH(CH3)，-N(CH3)2，-NH(C2H5)和-N(C2H5)2。术语“氨基基团”还包括具有上述限定的结构的基团，其以季铵(quaternised ammonium)离子存在，或者以与有机酸或无机酸形成的盐(即具有RxRyRzN+Q-结构的基团，其中Rx，Ry和Rz能相同或不同，优选相同，并可以具有上述对Rx和Ry限定的含义，并且至少这些基团之一是来自与有机酸或无机酸季铵化作用的氢，并且Q代表有机或无机酸的酸性残基)存在或与本领域技术人员已知的合适的四元化试剂(例如卤代烷，但不限于此)形成的盐存在。
在本说明书和专利权利要求中，术语“环烷基”代表未被取代的或取代的含有-CH2-基团的连接起来形成闭合环的单价基团。根据本发明，这些基团能优选在环上含有三至八个原子，并可以完全由碳原子构成或含有一个或多个选自-O-，-S-和-NRx-的杂原子，其中Rx代表氢或具有1至6个碳原子的烷基基团(如上限定)。在杂原子结合至环上的情况下，在多数杂原子存在的地方，这些杂原子可以相同或不同。在存在杂原子的情况下，环上优选结合一个杂原子。在完全的碳环中尤其优选的基团是环戊基，环戊烯基，环戊二烯基，环己基，环己烯基，环己二烯基，环庚基，环庚烯基，环庚二烯基，和环庚三烯基。在本发明的进一步具体实施方式中，含有杂原子的环烷基基团的例子，也被称为杂环烷基基团，是四氢呋喃基，吡咯烷基，吡唑烷基，咪唑烷基，哌啶基，哌嗪基和吗啉基。
在这些碳环或杂环环烷基基团上可能的取代基能优选选自上述线性烷基基团的取代基(本发明并不限于此)。环烷基基团的尤其优选取代基是取代基-Cl，-Br，甲基，乙基，n-丙基，i-丙基，n-丁基，i-丁基，二丁基或叔丁基，甲氧基，乙氧基，n-丙氧基，i-丙氧基；n-丁氧基，i-丁氧基，二丁氧基和叔丁氧基，-NH2，-NH(CH3)，-N(CH3)2，-NH(C2H5)和-N(C2H5)2，羰基和羧基。
在本说明书和专利权利要求中，术语“环亚烷基”代表未被取代的或取代的含有-CH2-基团的连接起来形成闭合环的二价基团。根据本发明，环上的这些基团可以优选含有三至八个原子并且可以完全由碳原子构成或含有一个或多个选自-O-，-S-和-NRx-的杂原子，其中Rx代表氢或具有1至6个碳原子的烷基基团(如上限定)。完全是碳环的基团尤其优选是环亚戊基，环戊烯基，环戊二烯基(cyclopentadienylene)，环己烯基，环亚己烯基(cyclohexenylene)，环亚己二烯基(cyclohexadienylene)，环庚烯基，环亚庚烯基，环庚二烯基，环庚四烯基。在环烷基基团的情况下上述限定的杂环基团也可以与“B”基团一样以二价基团存在于通式(1)和(2)的化合物中，并且尤其优选的是那些其中-O-或-NRx-基团结合至环上的环状二价基团。在这种情况下，在环上两种化合价可位于任何所期望的C原子上。优选一个杂原子或两个杂原子结合在环上，在尤其优选的具体实施方式中，这些基团是衍生自四氢呋喃、吡咯烷、吡唑烷、咪唑烷、哌啶、哌嗪和吗啉的二价基团。
这些碳环或杂环环亚烷基基团上可能的取代基可以优选选自上述线性烷基基团取代基(本发明并不限于此)。环亚烷基基团的尤其优选的取代基是取代基-Cl，-Br，甲基，乙基，n-丙基，i-丙基，n-丁基，i-丁基，二丁基或叔丁基，甲氧基，乙氧基，n-丙氧基，i-丙氧基；n-丁氧基，i-丁氧基，二丁氧基和叔丁氧基，-NH2，-NH(CH3)，-N(CH3)2，-NH(C2H5)和-N(C2H5)2，羰基和羧基。
在本说明书和专利权利要求的框架内，“芳香基”理解为是指单价烃残基，其可以是未被取代的或是取代的，衍生自具有芳香族特征的环状分子(在环轨道上4n+2π-电子移位)。这种芳香基团的环状结构可以是具有一个环的五，六或七元环结构，或彼此结合在一起的两个或多个环形成的环或结构(稠合的)，其中稠合环可以有相同或不同数目的环成员，尤其是C原子。在由多数彼此稠合的环构成的系统的情况下，优选苯并稠环，即至少有一个环是仅由C原子构成的芳香族六元环(苯环)的环系。典型地，但并非是芳香基基团的限制性的例子是环戊二烯基基团(C5H5-)(作为五元环)，苯基基团(作为六元环)，环庚三烯基基团(C7H7 +)(作为七元环)，萘基(作为含有两个稠合六元环的环系)，还有衍生自蒽和菲(三个稠合的六元环)的单价基团。根据本发明，最优选的芳香基基团是苯基和萘基基团。
这些碳环芳香基基团上的可能的取代基可以优选选自上述线性烷基基团，而本发明并不限于这些取代基。尤其优选的芳香基基团的取代基是取代基-Cl，-Br，甲基，乙基，n-丙基，i-丙基，n-丁基，i-丁基，二丁基或叔丁基，甲氧基，乙氧基，n-丙氧基，i-丙氧基；n-丁氧基，i-丁氧基，二丁氧基，叔丁氧基，-NH2，-NH(CH3)，-N(CH3)2，-NH(C2H5)和-N(C2H5)2，羰基和羧基。根据本发明，一个或多个可以相同或不同的这样的取代基可以结合至芳香基基团上。可以如所期望的选择芳香环(系)上的取代位置。
在本说明书和专利权利要求的框架内，对于芳香基基团的情况的比较性限定适用于术语“亚芳香基基团”。这理解为涉及二价基团，其基本结构和选择和取代基与上述对于“芳香基基团”的详细限定有可比性，除了这是可以结合至环上任意两个碳原子上的二价基团。
在本说明书和专利权利要求的框架内，“杂芳香基基团”理解为涉及环状结构中含有优选选自O、N或S基团的杂原子或多个杂原子而不因此丧失分子的芳香化特征的芳香基基团(在上述限定的意义上)。根据本发明，杂芳香基基团可以是未被取代的或取代的。这种杂芳香基基团的环状结构可以是具有一个环的五元，六元或七元环结构，或彼此结合的(稠合的)两个或多个环形成的结构，其中稠合环可以有相同或不同数目的环成员。杂原子能单独存在于环系的一个环中或者还可以存在于环系的几个环中。杂芳香基基团优选含有一个或两个环。在系统由多个彼此稠合的环构成的情况下，尤其优选苯并稠环，即尤其优选其中至少一个环是芳香碳环(即仅由碳原子构成的环)六元环的环系。尤其优选的杂芳香基基团选自呋喃基、硫代苯基、吡啶基、吲哚基、苯并呋喃基(cumaronyl)、硫茚基(thionaphthenyl)、喹啉基(苯并吡啶基)、喹唑啉基(苯并嘧啶基)或喹喔啉基(苯并吡嗪基)。
这些杂芳香基基团上可能的取代基可以优选选自上述线性烷基取代基而本发明不限于这些取代基。杂芳香基基团的尤其优选的取代基是取代基-Cl，-Br，甲基，乙基，n-丙基，i-丙基，n-丁基，i-丁基，二丁基或叔丁基，甲氧基，乙氧基，n-丙氧基，i-丙氧基；n-丁氧基，i-丁氧基，二丁氧基，叔丁氧基，-NH2，-NH(CH3)，-N(CH3)2，-NH(C2H5)和-N(C2H5)2，羰基和羧基。根据本发明，可以相同或不同的一个或多个这样的取代基可以结合至杂芳香基基团上。可以如期望的选择杂芳香环(系)上的取代位置。
在本说明书和专利权利要求的框架内，对于杂芳香基基团的情况的比较性限定适用于术语“杂亚芳香基基团”。这理解为涉及二价基团，其基本结构和选择和取代基与上述对于“杂芳香基基团”的详细限定有可比性，除了这是可以结合至环或环系上任意两个碳原子或可以结合氮原子的二价基团。
在本说明书和专利权利要求的框架内，使用的下列术语：“芳烷基基团”“杂芳烷基基团”“杂环烷基基团”“芳香氨基烷基基团”和“杂芳香氨基烷基基团”是指上述一般和特定的限定意义上的烷基基团(或更加准确地是亚烷基基团)，其在其中一个键上以芳香基基团(与上述一般和特定的限定一致)、杂芳香基基团(与上述一般和特定的限定一致)、杂环烷基基团(与上述以杂原子取代的环烷基基团的一般和特定的限定一致)、芳香氨基基团(与上述一般和特定的限定一致)或杂芳香氨基基团(与上述一般和特定的限定一致)取代。这些基团可以是未被取代或被取代的。
在本发明优选的具体实施方式中，芳烷基基团是其中芳香基基团是苯基基团、取代苯基基团、萘基基团或取代萘基基团的基团，并且(亚)烷基基团是直链或分支的并且具有1至6个碳原子。尤其有利地使用基团苯甲基、苯乙基、萘甲基和萘乙基作为芳烷基基团，且其中尤其最优选苯甲基基团。
芳烷基基团的芳香基基团上可能的取代基可以优选选自上述线性烷基取代基而本发明不限于这些取代基。芳烷基基团的芳香基基团尤其优选的取代基是取代基-Cl，-Br，甲基，乙基，n-丙基，i-丙基，n-丁基，i-丁基，二丁基或叔丁基，甲氧基，乙氧基，n-丙氧基，i-丙氧基；n-丁氧基，i-丁氧基，二丁氧基，叔丁氧基，-NH2，-NH(CH3)，-N(CH3)2，-NH(C2H5)和-N(C2H5)2，羰基和羧基。根据本发明，可以相同或不同的一个或多个这样的取代基可以结合至芳烷基基团的芳香基上。可以如期望的选择芳香环(系)上的取代位置。
在本发明优选的具体实施方式中，杂芳香烷基基团其中根据本发明杂芳烷基的杂芳香基基团被取代，并且亚烷基基团是直链或分支的并具有1至6个碳原子的基团。这种杂芳香基基团的环状结构可以是具有一个环的五元、六元或七元环状结构，或两个或多个环彼此结合(稠合)形成的结构，其中稠合环可以具有相同或不同数目的环成员。在环系中杂原子能单独存在于一个环中或者存在于数个环中。杂芳香烷基基团中的杂芳香基基团优选含有一个或两个环。在杂芳香烷基系统由多个彼此稠合的环构成的情况下，尤其优选苯并稠环，即尤其优选其中至少一个环是芳香碳环六元环的环系。尤其优选的杂芳香烷基基团选自呋喃甲基和呋喃乙基、硫代苯甲基和硫代苯乙基、吡啶甲基和吡啶乙基、吲哚甲基和吲哚乙基、苯并呋喃甲基和苯并呋喃乙基、硫代萘亚甲基甲基和硫代萘亚甲基乙基、喹啉基(苯并吡啶基)甲基和喹啉基(苯并吡啶基)乙基、喹唑啉基(苯并嘧啶基)甲基和喹唑啉基(苯并嘧啶基)乙基或喹喔啉基(苯并吡嗪基)甲基和喹喔啉基(苯并吡嗪基)乙基。
杂芳烷基基团的杂芳香基基团上可能的取代基可以优选选自上述线性烷基基团的取代基而本发明并不限于这些取代基。杂芳香基基团的尤其优选的取代基是取代基-Cl，-Br，甲基，乙基，n-丙基，i-丙基，n-丁基，i-丁基，二丁基或叔丁基，甲氧基，乙氧基，n-丙氧基，i-丙氧基；n-丁氧基，i-丁氧基，二丁氧基，叔丁氧基，-NH2，-NH(CH3)，-N(CH3)2，-NH(C2H5)和-N(C2H5)2，羰基和羧基。根据本发明，可以相同或不同的一个或多个这样的取代基可以结合至杂芳烷基基团上。可以如期望的选择杂芳香环(系)上的取代位置。
在本发明优选的具体实施方式中，杂环烷基基团是与上述一般和特定的限定一致的环烷基基团，其含有一个或多个选自-O-，-S-和-NRx-的杂原子，其中Rx代表氢或具有1至6个碳原子的烷基基团(如上述限定)，并且杂环烷基基团上的(亚)烷基基团是直链或分支的且具有1至6个碳原子。在数个杂原子结合至环上的情况下，这些杂原子可以相同或不同。优选一个杂原子结合至环上。在本发明的进一步具体实施方式中，含有杂原子的环烷基基团(也指杂环烷基基团)的优选的例子是基团四氢呋喃基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基。
这些杂环烷基基团上可能的取代基可以优选选自上述线性烷基基团的取代基而本发明不限于这些取代基。尤其优选的杂芳香基基团取代基是取代基-Cl，-Br，甲基，乙基，n-丙基，i-丙基，n-丁基，i-丁基，二丁基或叔丁基，甲氧基，乙氧基，n-丙氧基，i-丙氧基；n-丁氧基，i-丁氧基，二丁氧基，叔丁氧基，-NH2，-NH(CH3)，-N(CH3)2，-NH(C2H5)和-N(C2H5)2，羰基和羧基。根据本发明，可以相同或不同的一个或多个这样的取代基可以结合至杂环烷基基团上。可以如期望的选择杂环烷基环(系)上的取代位置。
在本说明书和专利权利要求中，术语“芳香氨基烷基基团”和“杂芳香氨基烷基基团”是指上述一般和特定的限定意义上的烷基基团(或者更准确地说是亚烷基基团)，其在其与芳香氨基基团或杂芳香氨基基团结合的一个键上被取代，所述芳香氨基基团或杂芳香氨基基团具有通式Ar-NRx-C(＝O)-或通式Ar-C(＝O)-NRx-，其中Rx代表氢或具有1至6个碳原子的烷基基团，且Ar代表与上述一般或特定的限定一致的任何所期望的芳香基基团或杂芳香基基团。这些芳香基或杂芳香基基团可以是未取代或取代的。芳香氨基烷基基团的优选实施例(本发明不限于这方面)是2-，3-或4-苯甲酰氨基-n-丁基基团或2-硝基-3-，-4-，-5-或-6-苯甲酰氨基-n-丁基基团；杂芳香氨基烷基基团的优选但非限制性的例子是2-，4-，5-或6-吡啶-3-羧酸-氨基-n-丁基基团。
这些芳香氨基烷基基团和杂芳香氨基烷基基团上可能的取代基可以优选选自上述线性烷基基团的取代基而本发明不限于这些取代基。芳香氨基烷基基团和杂芳香氨基烷基基团的尤其优选的芳香基基团或杂芳香基基团的取代基是取代基-Cl，-Br，甲基，乙基，n-丙基，i-丙基，n-丁基，i-丁基，二丁基或叔丁基，甲氧基，乙氧基，n-丙氧基，i-丙氧基；n-丁氧基，i-丁氧基，二丁氧基，叔丁氧基，-NH2，-NH(CH3)，-N(CH3)2，-NH(C2H5)和-N(C2H5)2，羰基和羧基。根据本发明，可以相同或不同的一个或多个这样的取代基可以结合至芳香氨基烷基基团或杂芳香氨基烷基基团的芳香基或杂芳香基基团上。可以如期望的选择芳香环(系)上的取代位置。
就术语“芳香亚烷基基团”、“杂环芳香亚烷基基团”、“杂环亚烷基基团”、“芳香氨基亚烷基基团”和“杂芳香氨基亚烷基基团”的限定而言，对芳香烷基基团、杂芳香烷基基团、杂环烷基基团、芳香氨基烷基基团和杂芳香氨基烷基基团的比较性限定适用于本说明书和专利权利要求的框架内。这些术语分别理解为涉及二价基团，其基本结构和选择和取代基与上述对于“芳香烷基基团”、“杂芳香烷基基团”、“杂环烷基基团”、“芳香氨基烷基基团”和“杂芳香氨基烷基基团”的详细限定有可比性，除了在每种情况下这是可以结合至环或环系或亚烷基基团的任何两个碳原子上二价基团或结合至杂芳香基或杂环烷基环系的氮原子上的二价基团。
在通式(1)和(2)中，基团D代表-S-S-或-Se-Se-。这两个S或Se原子形成通式(1)和(2)的化合物分子的两部分之间的键，这两部分能在天然条件下尤其是在还原条件下分裂。在这种情况下，两个分子部分能释放出来，其产生关于二肽基肽酶IV(DP IV)和具有相似的酶学效能的肽酶，还有关于丙氨酰基-氨基肽酶N(APN)和具有相似的酶学效能的肽酶的抑制性效能。
在上述通式(2)中，E代表基团-CH2-C*H(NH2)-R9，其中R9代表未被取代的或被取代的，非分支的或分支的烷基基团、环烷基基团、芳香烷基基团、杂环烷基基团、杂芳香烷基基团、芳香氨基烷基基团、杂芳香氨基烷基基团，其含有或不含有O，N或S，带有一或多个五元、六元或七元环的未被取代的或单或多取代的芳香基基团或杂芳香基基团。根据本发明，关于烷基基团、环烷基基团、芳香烷基基团、杂环烷基基团、杂芳香烷基基团、芳香氨基烷基基团、杂芳香氨基烷基基团，带有一或多个五元、六元或七元环的未被取代或单或多取代的芳香基基团或杂芳香基基团的优选的或可用的例子，以及这些基团可能的优选取代基，可以参考上述相应基团的限定和其优选的具体实施方式。这些限定也同样适用于E代表的通式(2)的基团。
在上述E代表的通式中，*代表以氨基基团取代的碳原子上的手性碳原子。在本发明进一步优选的具体实施方式中，这种通式(2)的化合物代表特别有效的抑制剂的药物前体，其中*标明的手性碳原子具有S-或L-构型。
根据本发明，尤其优选的是如果E代表被取代的2-氨基亚烷基基团，例如2-氨基-3-苯基丙基，或代表未被取代的或被如-S-，-S(＝O)-，-N-或-O-的杂原子取代的2-氨基亚烷基基团，如2-氨基-4-甲基戊基基团、2-氨基-4-甲硫丁基基团或2-氨基-4-甲基-硫代氧丁基(sulphoxybutyl)基团。
在本发明的进一步优选的具体实施方式中，通式(1)和(2)中的基团B和/或B′代表基团R1，其代表具有1至6个碳原子的直链或分支的亚烷基基团。尤其优选的通式(1)和(2)的化合物含有一个或多个选自-CH2-(亚甲基)，-CH2-CH2-(亚乙基)或(H3C)2-C＜(2，2-亚丙基)形式的B和/或B′基团。
此外，在同样进一步优选的具体实施方式中，B和/或B′代表基团-(CH2)n-R2-R3-R4-，其中n代表从1至5的整数；当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-，或其中当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；R4代表未被取代的或取代的，非分支的或分支的亚烷基基团、环亚烷基基团，芳香亚烷基基团，杂环亚烷基基团杂环芳香亚烷基基团，其含有或不含有O，N或S，未被取代的或单或多取代的具有一个或多个五元、六元或七元环的亚芳基基团或杂亚芳基基团。进一步优选的是如果n代表1至5，以致上述基团的优选的例子含有亚甲基基团，亚乙基基团，亚丙基基团，亚丁基基团和亚戊基基团；R2和R3优选一起形成氨基基团-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝O)-。这些通式(1)和(2)的化合物进一步优选具有B和/或B′基团，其中B代表上述化学式，且R4代表氨基取代的亚烷基基团，例如氨基亚乙基基团或未被取代的或被取代的(例如被硝基取代)次苯基基团或未被取代或被取代的吡啶-2，5-亚基团。
此外，在同样进一步优选的具体实施方式中，B和/或B′代表化学式-R7-R8-的基团，其中R7代表单或多取代的苯亚甲基基团，且R8代表单键或未被取代或被取代的，非分支和或分支的亚烷基基团，环亚烷基基团，芳香亚烷基基团，杂环亚烷基基团或杂芳香亚烷基基团，其含有或不含O，N或S，其优选可以具有一个或多个氨基基团，羰基基团或羧基基团作为功能基团，或具有一个或多个五元、六元或七元环的未被取代的或单或多取代的亚芳基基团或杂亚芳基基团。各个基团或取代基的在先一般或特定的限定可以指上述基团和其根据本发明的可能的取代基的限定。
根据本发明进一步优选的是通式(1)和(2)的化合物，其中B和B′可以相同或不同并代表基团-(CH2)n-R2-R3-R4-，其中当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-，或其中当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；并且R4代表
--CH(COOH)-R1，其中当R2代表O＝C＜且R3代表-NH-时，R1具有上述指定的含义；或
Figure G2008800256699D00361
其中当R2代表O＝C＜且R3代表-NH-时，R1具有上述指定的含义；或
--CH(NHR5)-R1-当R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-和R3代表O＝C＜时，其中R5代表H或酰基基团，优选代表苯甲氧羰基基团，芴-9-基-甲氧羰基基团、叔丁氧羰基基团或苯甲酰基基团；或
Figure G2008800256699D00362
NH-C(＝NH)-NH-；或其中当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；或
Figure G2008800256699D00363
其中R5代表H或酰基基团，优选代表苯甲氧羰基基团，芴-9-基甲氧羰基基团或苯甲酰基基团，并且当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-；或其中当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；或
Figure G2008800256699D00364
其中亚烷基代表非分支或分支的有1至6个碳原子的亚烷基基团，并且当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-，或其中当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；或
Figure G2008800256699D00371
其中亚烷基代表非分支或分支的具有1至6个碳原子的亚烷基，并且当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-，或者当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；或
Figure G2008800256699D00372
其中当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-，或者其中当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；或
Figure G2008800256699D00373
其中R6代表H，NO2，CN，卤素或酰基基团，并且当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-，或者其中当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；或
Figure G2008800256699D00374
其中当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R6代表H，NO2，CN、卤素或酰基基团并且R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-，或其中当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；或
Figure G2008800256699D00375
其中当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R6代表H，NO2，CN，卤素或酰基基团并且R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-，或其中当R3代表-NH-时，R2代表O＝C＜；或
Figure G2008800256699D00381
其中当R3代表O＝C＜或-SO2-时，R2代表-NH-或-NH-C(＝NH)-NH-，或当R3代表-NH-时R2代表O＝C＜。
此外，根据本发明，进一步优选的通式(1)和(2)的化合物是那些其中B和B′可以相同或不同的并代表基团-R7-R8-的化合物，其中R7和R8组合代表基团
Figure G2008800256699D00382
(其中R7代表上述无R8的基团，并且R6位置取决于R8位置)，其中R8和R6具有上述指定的含义，即其中R6代表H，NO2，CN，卤素或酰基基团且其中R8代表单键或代表未被取代的或被取代的，非分支或分支的亚烷基基团、环亚烷基基团，芳香亚烷基基团、杂环亚烷基基团或杂芳香亚烷基基团，其含有或不含O，N或S，其可以优选具有一个或多个氨基基团、羰基基团或羧基基团作为功能基团，或代表具有一个或多个五元、六元或七元环的未被取代的或单或多取代的亚芳基基团或杂亚芳基基团。
甚至更优选的通式(1)和(2)的化合物是那些其中B和B′相同或不同并彼此独立地代表R7-R8-基团的化合物，其中R7代表上述化学式(无R8)的单或多取代的苯亚甲基基团，并且R8代表NH-或C1-至C6-亚烷基-NH-与下列的组合：
--C(＝O)-C1-至C6-亚烷基-或
--C(＝O)-亚芳基-或
--SO2-C1-至C6-亚烷基-或
--SO2-亚芳基-或
--C(＝O)-CH(NHR5)-R1，其中R1和R5具有上述指定含义；或
-O＝C＜与下列组合：
--NH-C1-至C6-亚烷基-或
--NH-亚芳基-或
--NH-CH(COOH)-R1-，其中R1具有上述指定含义；或
--O-C1-至C6-亚烷基-或
--O-亚芳基-或
--O-C1-至C6-亚烷基-NH-C(＝O)-CH(NH2)-R1-，其中R1具有上述指定含义；或
--O-C1-至C6-亚烷基-C(＝O)-NH-CH(COOH)-R1-，其中R1具有上述指定含义。
根据本发明，通式(1)和/或(2)的化合物以中性分子的形式存在，并因此具有本发明所述的激活Treg细胞的用途。或者，通式(1)和/或(2)的化合物还可以以其与无机酸和/或有机酸的酸加成盐的形式存在。这种酸加成盐的形成是因为在分子中碱性位点的存在(绝大部分是碱性氮原子的存在)，通过结合一个或多个H-酸化合物分子(布朗斯泰德酸)，优选H-酸化合物分子，并且例如确保该分子在极性介质中，如水中有增加的可溶性。最后提及的特性对于那些产生药理效能的化合物尤其重要。
在本发明的优选具体实施方式中，酸加成盐是药学上可接受酸的并优选(但不限制本发明)选自通式(1)和(2)的化合物的盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐。
尤其优选和方便可用的通式(1)的化合物具有通式(1a)的特征
Figure G2008800256699D00401
其中X，Y和B具有上述指定的含义。通式(1a)的化合物的酸加成盐，优选其与药学上可接受的无机和/或有机酸形成的酸加成盐，尤其是与来自上述基团的酸形成的酸加成盐，最尤其优选通式(1a)的化合物的盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐，在本发明所述的方法中尤其方便可用。
最尤其优选的通式(1a)的化合物见下表1，本发明不限于这些化合物。
表1
通式A-B-D-B′-A′(1)的化合物的例子
和其酸加成盐，尤其其与药学上可接受的无机和/或有机酸，优选与来自上述基团的药学上可接受的酸形成的酸加成盐，最尤其优选通式(1a)的化合物的盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐。
尤其优选和方便可用的通式(2)的化合物具有通式(2a)的特征
Figure G2008800256699D00412
其中X，Y，R9和B具有上述指定的含义，和其酸加成盐，优选其与药学上可接受的无机和/或有机酸，尤其是与选自上述基团的药学上可接受的酸形成的酸加成盐，尤其优选通式(2a)的化合物的盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐。
最尤其优选的通式(2a)的化合物见下表2，而本发明不限于这些化合物。
表2
通式A-B-D-E(2)的化合物的例子
和其酸加成盐，尤其是其与药学上可接受的无机和/或有机酸形成的酸加成盐，尤其优选通式(2a)的化合物的盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐。
使用的抑制剂的浓度相当于IC50抑制值或在其以上。抑制剂浓度在纳摩尔分子至微摩尔分子范围内，且本领域技术人员可以在一些容易操作的标准实验中毫无困难地测定该浓度。根据上述详细说明，Treg细胞与一个或多个抑制剂的培养优选在37℃进行，例如更优选是在CO2含量是5％的饱和蒸汽的空气中进行。Treg细胞的浓度适应于总体积并尤其优选为每毫升1至5百万细胞。
在本发明所述的方法的进一步的同样优选的具体实施方式中，除了一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN)的抑制剂和/或除了底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂外，还使用致病性自身抗原的肽片段或合成类似物和/或致病性微生物的特定抗原成分。可以使用一类肽片段或可以使用几类肽片段。此外，可能使用致病性微生物的一种类型的特定抗原成分，或使用致病性微生物的多种类型的特定抗原成分。根据本发明，还能使用所述成分的一种或多种组合。令人惊奇的是，可以用这种抑制剂和进一步成分的组合实现尤其有利的调节性T细胞(Treg细胞)的激活。
在本发明所述的方法的进一步优选的具体实施方式中，使用MBP(髓磷脂碱性蛋白)，MOG(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)，MAG(髓磷脂相关糖蛋白)和/或PLP(蛋白脂蛋白)。根据该方法的另一个同样进一步的优选具体实施方式，将衣壳蛋白或膜糖脂复合物用作致病性微生物的特定抗原成分。还可以使用这些特定成分的组合。
根据本发明，将调节性T细胞(Treg细胞)以本技术领域技术人员所知的方式与上文详细描述的培养基或介质接触。假如纯粹通过举例的方式(并不限制本发明)，声明的是将调节性T细胞(Treg)与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN)抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂接触或孵育的步骤以常规方式进行，优选在静止或水平移动或垂直移动或旋转移动的细胞培养器皿中。更优选的是，这些器皿可以是培养皿、培养板、细胞培养反应器，细胞培养瓶，细胞培养袋，适合培养细胞的双或多室的系统或中空的纤维反应器或一般用于培养细胞的技术人员已知的任何其它器皿。尤其优选的是培养在细胞培养器皿中进行，该细胞培养器皿的部分或全部的朝向培养物的表面上具有可能的促进反应的表面涂层和/或基质替代物。细胞培养优选在37℃ 5％ CO2饱和蒸汽存在下进行。
在本发明所述的方法中的最后一步中，以上述方式激活的调节性T细胞(Treg细胞)在合适的培养基中回送至至少一个人或动物体内。常规将Treg细胞输送至需要这些激活的Treg细胞来调节免疫问题的人或动物体内。在任何情况下，培养基是对于受体是药学上可接受的培养基并在本发明的进一步优选的具体实施方式中可以选自优选液体培养基，进一步优选的液体培养基选自生理上可接受的溶液，尤其优选水溶液，如果必要的话，可以含有进一步有用的或者甚至对于计划目的用途是有用的成分。
尤其优选的是如果激活的Treg细胞输送至分离Treg细胞的生物(人或动物)供体的体液组织中，可以以对于完成所期望目的的技术人员是可能的任何方式回输，即将激活的Treg细胞再输送至受体生物(不管是人还是动物)。回输的尤其优选的方式是选自静脉内应用、动脉内应用、腔内应用，膜内应用或皮内应用的形式。如果目的是要将激活Treg细胞的再注入受体，则静脉应用是优选使用的，具有特别的优势，这是由于其可以将Treg细胞直接插入外周系统，并因此进入血液循环，在此Treg细胞还可以天然地发挥作用。
T细胞(Treg细胞)的注入量很大程度上地取决于其在用作回输注入培养基中的浓度，受体(人或动物)的体质，临床图片或免疫状态和技术人员已知的或容易确定的其他因素。
本发明还涉及激活的调节性T细胞(Treg细胞)，如那些使用上述详细描述的方法以一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或以底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂而获得的激活的调节性T细胞。这种激活的Treg细胞直至今天才被人知道，其与以常规方式激活的T细胞相比，具有令人惊奇的高度抑制性效能。尤其是，使用本发明所述的方法激活的调节性T细胞(Treg细胞)可以用于在人和动物体内产生针对自身抗原(在生物体内产生的抗原)的耐受性和异体抗原(通过外部因素导入的抗原)，并用以克服人和动物体内过度的免疫应答，因为其将机体的免疫应答抑制到令人惊奇高的程度。
本发明还涉及任何类型的包含或含有活化的调节性T细胞(Treg细胞)的制品，所述调节性T细胞可以使用上文详细描述的方法以一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或以底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂被激活。除了含有激活的调节性T细胞和支持培养基或合适给药的溶剂以外，这种制品可能另外含有一种或多种支持物，辅助性物质和/或佐药。如技术人员已知，这些物质可以包括一种或多种技术人员已知的单独使用或组合使用的用作支持物，辅助性物质和/或佐药的成分。
本发明还涉及激活的调节性T细胞(Treg细胞)的用途，或还涉及用于预防、缓解或治疗涉及或与人或动物机体免疫反应失衡相关的多种疾病和情况的含有激活的调节性T细胞(Treg细胞)的制品的用途。根据本发明所述的用途，使用哪个抑制剂或哪些抑制剂激活Treg细胞是不重要的。
已经证明激活的调节性T细胞(Treg细胞)以及含有这些细胞的制品在预防、缓解或治疗移植排斥方面尤其有益。
本发明还涉及激活的调节性T细胞(Treg细胞)的用途或者还涉及含有激活的调节性T细胞(Treg细胞)的制品在预防、缓解或治疗具有过度的免疫应答和包括动脉硬化、神经元疾病、脑损伤、皮肤疾病(如银屑病、痤疮、瘢痕瘤)和其它过度增殖的情况以及败血症和II型糖尿病的炎性发生的疾病的用途。
本发明还涉及激活的调节性T细胞(Treg细胞)的用途或者还涉及含有激活的调节性T细胞(Treg细胞)的制品在制备预防、缓解或治疗具有过度的免疫应答和包括动脉硬化、神经元疾病、脑损伤、皮肤疾病(如银屑病、痤疮、瘢痕瘤)和其它过度增殖的情况、纤维化、肿瘤性疾病和病毒相关性疾病以及败血症和II型糖尿病的炎性发生的疾病的药物或化妆品中的用途。
在本发明的优选的具体实施方式中，激活的调节性T细胞(Treg细胞)或含有这些细胞的制品用于预防和治疗下列疾病：如多发性硬化、克隆氏病、溃疡性大肠炎和其他自身免疫性疾病以及炎症性疾病、支气管哮喘和其他过敏性疾病，皮肤和粘膜疾病，如银屑病、痤疮以及过度增殖性皮肤疾病和成纤维细胞的分化状态发生改变的病状，良性纤维形成和硬化性皮肤病和恶性成纤维细胞过度增殖的情况，急性神经元性疾病如缺血性或出血性中风后的缺血相关脑损伤情况，颅脑创伤，心搏停止，心肌梗塞或心脏手术后果、慢性神经元性疾病如阿尔采默氏病，匹克氏病，进行性核上性麻痹，皮质基底变性、额颞叶痴呆，帕金森症，尤其是与染色体17连锁的帕金森症，亨廷顿氏病，朊病毒相关性疾病情况和肌萎缩性侧索硬化症，动脉粥样硬化，动脉炎，支架再狭窄，慢性阻塞性肺病(COPD)，肿瘤，转移瘤的形成，前列腺癌，严重急性呼吸综合症(SARS)和败血症及败血症样情况，以及II型糖尿病。
在本发明进一步优选的具体实施方式中，激活的调节性T细胞(Treg细胞)或含有这些细胞的制品用于预防和治疗移植组织和细胞的排斥反应。这种应用的例子可以是调节性T细胞(Treg细胞)的用途或含有Treg细胞的制品在同种或异种移植的器官、组织和细胞例如在肾脏、心脏、肝脏、胰腺、皮肤中或干细胞移植以及移植物抗宿主反应中的用途。
在本发明进一步优选的具体实施方式中，激活的调节性T细胞(Treg细胞)或含有这些细胞的制品用于预防和治疗生物体中植入的医疗设备上的或造成的排斥或炎症反。例如，这些医疗设备可以是支架、关节植入物(膝关节植入物，髋关节植入物)、骨植入物、起搏器或其它植入物。
在本发明进一步优选的具体实施方式中，使用激活的调节性T细胞(Treg细胞)或含有这些细胞的制品，以致将Treg细胞或含有这些细胞的组合物应用于涂层或浸渍层形式的一个设备或多个设备，或至少调节性T细胞(Treg细胞)或含有这些细胞的组合物与该一个设备或多个设备的材料完全地混合。当然，还可能在这种情况下局部或全身给予用本发明所述的方法已经制备的激活的Treg细胞，或含有这些细胞的组合物-可能在时间上间断给药或平行给药。
以上述同样的方式-且为了比较的目的或为了预防和治疗上述特定的疾病或情况，以例子方式，但非决定性地-一般意义上的调节性T细胞(Treg细胞)和含有这些细胞的药物和化妆品组合物可以单独使用或几个组合使用，以制备治疗上述疾病或情况的药物。这些可以包括以下列实施列的方式给出的量的激活的调节性T细胞(Treg细胞)，可能与本身已知的支持物，辅助性物质和/或添加剂在一起。
下面通过应用实施列的方式更加详细解释本发明。
然而，就上述详细的公开而言应理解的是本发明不限于下列实施列。下列实施列代表当前优选的最佳具体实施方式。
实施例
实施例1
在氨基肽酶N抑制剂放线酰胺素存在条件下，人调节性T细胞的激活
通过密度梯度离心从健康供体的外周血中获得单核细胞。通过两步磁性分离的方式分离存在的调节性T细胞：
在第一步中，通过去除所有CD4-阴性细胞后回收CD4+T细胞(CD4分离试剂盒，Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，Germany)。常规获得的纯度的量为＞95％ CD4+ T细胞。
在第二步中，使用CD25标记(抗CD25微珠，Miltenyi Biotech)通过磁性柱分离将CD4+CD25+调节性T细胞从该群中依次分离出来。
CD4+CD25-组分作为效应细胞对照。
在特定的共培养中测试调节性T细胞的功能能力。为此，总共将20 000效应细胞(CD4+CD25-)和调节性T细胞(CD4+CD25+)分别以彼此不同的数量比例在微量测试板中培养120小时的时间。将固相结合抗CD3抗体(UCHT1，0.25μg/孔)用作T细胞刺激的激活剂。
在DNA合成速率的基础上通过在24小时内掺入氚胸腺嘧啶脱氧核苷(n＝5)的方式分析培养细胞的增殖程度。
图(图1)表明在存在或不存在APN抑制剂放线酰胺素的条件下，在定量关系是50％(实验相关)，20％(实验相关)和10％(生理相关)的Treg成分的条件下，诱导的调节性T细胞(Treg细胞)的抑制性表型。
当效应细胞与Treg细胞是1∶1的比例时，由于Treg细胞的强抑制能力，抑制剂的可靠效应不明显，尤其是在10∶1的生理相关的数量范围(p＜0.05)内，Treg细胞的抑制能力的显著增强变得明显。
实施例2
在胞浆氨基肽酶(cAAP)抑制剂PAQ22存在条件下，人调节性T细胞的激活
通过密度梯度离心从健康供体的外周血中获得单核细胞。通过两步磁性分离的方式分离存在的调节性T细胞：
在第一步中，通过去除所有CD4-阴性细胞(CD4分离试剂盒，Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，Germany)回收CD4+T细胞。常规获得的纯度的量为＞95％CD4+T细胞。
在第二步中，使用CD25标记(抗CD25微珠，Miltenyi Biotech)通过磁性柱分离从该群中依次分离出CD4+CD25+调节性T细胞。
CD4+CD25-组分作为效应细胞对照。
在特定的共培养中测试调节性T细胞的功能能力。为此，总共将20 000效应细胞(CD4+CD25-)和调节性T细胞(CD4+CD25+)分别以彼此不同的数量比例在微量测试板中培养120小时的时间。将固相结合抗CD3抗体(UCHT1，0.25μg/孔)用作T细胞刺激的激活剂。
通过氚胸腺嘧啶脱氧核苷在24小时内掺入(n＝3)的方式在DNA合成率的基础上分析培养细胞的增殖程度
图(图2)表明在存在或不存在胞浆氨基肽酶(cAAP)的选择性抑制剂PAQ22的条件下，在生理相关定量关系是10％和5％的Treg细胞成分的条件下，诱导的调节性T细胞(Treg细胞)的抑制性表型。
共培养5天后，根据浓度PAQ22诱导调节性T细胞的抑制能力。
实施例3
在丙氨酰基氨基肽酶(APN)和二肽基肽酶IV(DPIV)的双重抑制剂IP10.C8存在条件下，人调节性T细胞的激活
通过密度梯度离心方式自健康供体的外周血中获得单核细胞。接着使用尼龙衬垫粘附方法分离T细胞。
通过两步磁性分离的方式分离存在的调节性T细胞。
在第一步中，通过去除所有CD4-阴性细胞回收CD4+T细胞(CD4分离试剂盒，Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，Germany)。常规获得的纯度的量为＞95％ CD4+T细胞。
在第二步中，使用CD25标记(抗CD25微珠，Miltenyi Biotech)通过磁性柱分离从该群中依次分离出CD4+CD25+调节性T细胞。
CD4+CD25-组分作为效应细胞对照。
在特定的共培养中测试调节性T细胞的功能能力。为此，总共将20 000效应细胞(CD4+CD25-)和调节性T细胞(CD4+CD25+)分别以彼此不同的数量比例在微量测试板中培养120小时的时间。将固相结合抗CD3抗体(UCHT1，0.25μg/孔)用作T细胞刺激的激活剂。
通过氚胸腺嘧啶脱氧核苷在24小时内掺入(n＝10)的方式在DNA合成率的基础上分析培养细胞的增殖程度。
图(图3)表明在存在或不存在氨基肽酶N和二肽基肽酶IV的双重抑制剂IP10.C8的条件下，在定量关系是50％(实验相关)，20％(实验相关)和10％(生理相关)的Treg细胞成分的条件下，诱导的调节性T细胞(Treg细胞)的抑制性表型。
当效应细胞与Treg细胞是1∶1的比例时，因为Treg细胞的强抑制能力，抑制剂的可靠效应不明显，尤其是在10∶1的生理相关的数量范围(p＜0.01)内，Treg细胞的抑制能力的显著增强变得明显。
实施例4
在丙氨酰基-氨基肽酶(APN)抑制剂菲宾斯汀存在条件下，鼠调节性T细胞的激活
通过密度梯度离心从健康小鼠的外周血中获得单核细胞(MNC)。使用CD25标记(抗CD25微珠，Miltenyi Biotech)分离存在的调节性T细胞。CD25-MNC组分作为效应细胞对照。
在特定的共培养中测试调节性T细胞的功能能力。为此，总共将20 000效应细胞(MNC-CD25-)和调节性T细胞(CD4+CD25+)分别以彼此不同的数量比例在微量测试板中培养120小时的时间。通过加入抗CD3/抗CD28(1μg/ml)刺激T细胞。
通过氚胸腺嘧啶脱氧核苷在24小时内掺入(n＝4)的方式在DNA合成的基础上分析培养细胞的增殖程度。
图(图4)表明在存在或不存在APN抑制剂菲宾斯汀的条件下，诱导的调节性T细胞(Treg细胞)的抑制性表型。
共培养5天后，菲宾斯汀(1.0μM)诱导调节性T细胞的抑制性能力达到显著的程度(*p＜0.01，#p＜0.05)。
实施例5
鼠大肠炎模型中APN抑制剂(菲宾斯汀)异位激活的调节性T细胞(Treg细胞)的效应
口服3％硫酸右旋糖苷钠溶液(DSS)造成Balb-c小鼠大肠炎。疾病的严重程度建立在疾病活性指数(DAI)的基础上。所述指数由每日体重下降记录、大便粘度、直肠出血、食物和水摄入组成，并由出版物限定(Bank，U.，Heimburg，A.，Helmuth，M.，Stefin，S.，Lendeckel，U.，Reinhold，D.，Faust，J.，Fuchs，P.，Sens，B.，Neubert，K.，
Figure G2008800256699D00501
M.，Ansorge，S.；Triggering endogenous immunosuppressive mechanisms bycombined targeting of dipeptidyl peptidase IV(DPIV/CD26)andaminopeptidase N(APN/CD13)-A novel approach for the treatment ofinflammatory bowel disease；International Immunopharmacology 6：1925-1934(2006))。
外周静脉血的调节性T细胞通过密度梯度离心和使用CD25微珠磁性分离平行回收。
于第3天，氨基肽酶N抑制剂菲宾斯汀(0.5mg/kgKG)，或未处理的CD4+CD25+Treg细胞(1百万细胞/动物)或激活的CD4+CD25+Treg细胞(1百万细胞/动物)通过静脉内给予一次。
使用本发明所述的方法通过将Treg细胞在菲宾斯汀(500μg/ml)存在条件下孵育45分钟，Treg细胞出现异位激活。
单次静脉使用未处理的调节性T细胞或菲宾斯汀对疾病活性(使用疾病活性指数测定)无影响，单次给予以丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂激活而活化的Treg细胞在使用后直到48小时使得疾病的临床症状明显减轻(p＜0.05)。

Claims (38)

1.通过诱导调节性T细胞(Treg细胞)的抑制性效能，激活人或动物机体的调节性T细胞(Treg细胞)的方法，其包括将合适的液体培养基中的调节T细胞(Treg细胞)与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN)抑制剂和/或与底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂接触的步骤。
2.体外激活人或动物机体的调节性T细胞(Treg细胞)的方法，其包含步骤：
(a)回收至少一种含有来自至少一个人或动物机体的Treg细胞的体液；
(b)从因此获得的人或动物的体液中分离调节性T细胞(Treg细胞)；
(c)将因此分离和纯化的于合适的液体培养基中的调节性T细胞与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN)抑制剂和/或与底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂接触足够激活的时间；并且
(d)将因此处理的于合适的液体培养基中的调节性T细胞(Treg细胞)回输给至少一个人或动物体内。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中将一种或多种已知抑制剂选自放线酰胺素、雷黑斯汀，菲宾斯汀、抑氨肽酶素、苯丁抑制素、普博斯汀、阿芙曼宁arphamenin A、阿芙曼宁B、MR 387A、MR 387B、β-氨基硫醇、α-氨基磷酸及其酯类和盐类、α-氨基碳磷酸盐化合物、α-氨基硼酸、α-氨基醛、α-氨基酸氧肟酸盐、N-苯基酞酰亚胺、N-苯基同酞酰亚胺、α-酮酰胺、沙利度胺及其衍生物，用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将选自α-酮酰胺，优选3-氨基-2-氧-4-苯丁酸酰胺，α-氨基磷酸，优选D-Phe-y[PO(OH)-CH2]-Phe-Phe，N-苯基同酞酰亚胺，优选PAQ-22，α-氨基碳磷酸盐，优选RB3014和/或菲宾斯汀，尤其优选PAQ-22，RB3014和/或菲宾斯汀的多种已知抑制剂之一用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂，最优选地，其中使用PAQ-22或使用多个含有PAQ-22的已知抑制剂作为至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将一种或多种选自丙氨酰基-氨基肽酶或底物特异性相同的肽酶和二肽基肽酶(IV)或来自通式(1)和(2)的化合物的底物特异性相同的肽酶的双重抑制剂的已知抑制剂用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。
A-B-D-B′-A′             (1)和
A-B-D-E                   (2)，
其中
-A和A′可以相同或不同并代表基团
其中X代表S，O，CH2，CH2CH2，CH2O或CH2NH，且Y代表H或CN且*代表优选在S-或L-构型中的手性碳原子；
-B和B′可以相同或不同并代表未被取代的或被取代的非分支或分支的亚烷基基团、环亚烷基基团、芳香亚烷基基团、杂环亚烷基基团、杂环芳香亚烷基基团、芳香氨基亚烷基基团、杂芳香氨基亚烷基基团，其含有或不含O，N或S，具有一个或多个五、六或七元环的未被取代的或单或多取代的亚芳基基团或杂亚芳基基团；
-D代表-S-S-或-Se-Se-；且
-E代表基团-CH2-CH(NH2)-R9或-CH2-*CH(NH2)-R9，其中R9代表未被取代的或被取代的非分支或分支的烷基基团、环烷基基团、芳香氨基基团、杂环烷基基团、杂芳香烷基基团、芳香氨基烷基基团、杂芳香氨基烷基基团，其含有或不含O，N或S，具有一个或多个五、六或七元环的未被取代的或单或多取代的芳香基团或杂芳香基团，且*代表优选在S-或L-构型中的手性碳原子；
-或其与有机和/或无机酸形成的酸加成盐。
6.根据权利要求5所述的方法，其中将通式(1)或(2)的化合物的一种或多种酸加成盐用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂，其中所述酸加成盐来自药学上可接受的酸的酸加成盐，其中优选将盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐用作酸加成盐。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中将通式(1a)的多种化合物之一
Figure F2008800256699C00031
其中X，Y和B具有上述指定的含义，和/或其酸加成盐，优选其与药学上可接受的无机和/或有机酸的酸加成盐，更优选其盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐，用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中将一种或多种通式(1a)的化合物，其中X，Y和B具有下列含义：
Figure F2008800256699C00041
和/或其酸加成盐，优选其与药学上可接受的无机和/或有机酸的酸加成盐，更优选其盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐，用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。
9.根据权利要求5或6所述的方法，其中将一种或多种通式(2a)的化合物
Figure F2008800256699C00042
其中X，Y，R9和B具有上述指定的含义，和/或其酸加成盐，优选其与药学上可接受的无机和/或有机酸的酸加成盐，更优选其盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐，用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将一种或多种通式(1a)的化合物，其中X，Y，R9和B具有下列含义：
Figure F2008800256699C00051
和/或其酸加成盐，优选其与药学上可接受的无机和/或有机酸的酸加成盐，更优选其盐酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐和/或柠檬酸盐，用作至少一种丙氨酰基-氨基肽酶抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中另外使用致病性自身抗原的肽片段或合成类似物和/或致病性微生物的特定抗原成分。
12.根据权利要求11所述的方法，其中MBP(髓磷脂碱性蛋白)、MOG(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)、MAG(髓磷脂相关糖蛋白)和/或PLP(蛋白脂蛋白)用作致病性自身抗原的肽片段，和/或其中衣壳蛋白或膜糖脂复合物用作致病性微生物的特定抗原成分。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中将调节性T细胞(Treg细胞)从一种或多种选自血液，优选外周血，更优选静脉血及其组分，淋巴、渗出液或局部腔室，优选胸膜或腹膜的体液中分离出来。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中将分离的调节性T细胞与至少一种丙氨酰基氨基肽酶抑制剂和/或与底物特异性相同的肽酶的至少一种抑制剂在来自生理上可接受的溶液、细胞培养基和营养培养基的液体中接触，优选在生理上可接受的水溶液、水制细胞培养基和水制营养培养基的液体中接触，更优选地，还在细胞培养和细胞治疗中常见的抗生素、氨基酸补充剂、维生素补充剂、微量元素补充剂的存在下。
15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中将调节性T细胞(Treg细胞)通过选自静脉内应用、动脉内应用、腔内应用、膜内应用或皮内应用，优选通过静脉内应用的应用方式回输给至少一个人或动物的体内，优选回输给先前从中分离调节性T细胞(Treg细胞)的体液的供体体内。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中将孵育的调节性T细胞(Treg细胞)与一种或多种丙氨酰基-氨基肽酶(氨基肽酶N；APN)抑制剂和/或底物特异性相同的肽酶的一种或多种抑制剂接触的步骤以常规方式进行，所述常规方式为优选在静止或水平移动或垂直移动或旋转移动的细胞培养器皿中，优选在培养皿中，在培养板上，在细胞培养反应器中，在细胞培养瓶中，在细胞培养袋中，在适合细胞培养的双或多室的系统中，在中空的纤维反应器中，尤其优选在细胞培养器皿中，其在这些直接面向培养物的部分或整个表面上具有可能促进反应的表面涂层和/或基质替代物。
17.通过根据权利要求1至16任一项所述的方法获得的激活的调节性T细胞(Treg细胞)。
18.含有根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)的制品，可能还含有常规溶剂、支持物、辅助性物质和/或佐药。
19.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗移植排斥反应的用途。
20.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗自身免疫性疾病的用途。
21.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗过敏症、支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)的用途。
22.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗慢性炎症发生性疾病的用途，优选用于预防、缓解或治疗动脉硬化的用途。
23.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗神经元性疾病和脑损伤的用途。
24.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗皮肤病的用途，优选用于银屑病、痤疮或瘢痕瘤和其他过度增殖情况的用途。
25.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗纤维化的用途。
26.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗肿瘤性疾病和败血症的用途。
27.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗多发性硬化、克隆氏病、溃疡性大肠炎和其他自身免疫性疾病的用途。
28.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗炎症性疾病的用途。
29.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗支气管哮喘和其他过敏性疾病的用途。
30.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗皮肤和粘膜疾病，优选银屑病、痤疮以及过度增殖性皮肤疾病和成纤维细胞的分化状态发生改变的情况、良性纤维形成和硬化性皮肤病和恶性成纤维细胞过度增殖情况的用途。
31.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗急性神经元疾病，如缺血或出血性中风后缺血相关脑损伤情况、颅脑创伤、心搏停止，心肌梗塞或心脏手术后果的用途。
32.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗慢性神经元性疾病，优选阿尔采默氏病，匹克氏病，进行性核上性麻痹，皮质基底变性、额颞叶痴呆，帕金森症，更优选与染色体17连锁的帕金森症，亨廷顿氏病的用途。
33.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗朊病毒相关疾病情况和肌萎缩性侧索硬化症的用途。
34.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗动脉粥样硬化、动脉炎、支架再狭窄的用途。
35.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗肿瘤、转移瘤的形成、前列腺癌的用途。
36.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗严重急性呼吸综合征(SARS)的用途。
37.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗败血症和败血症样情况的用途。
38.根据权利要求17所述的激活的调节性T细胞(Treg细胞)和/或根据权利要求18所述的制品用于预防、缓解或治疗II型糖尿病的用途。
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