CN101804185A - 美白祛斑中药复方提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

美白祛斑中药复方提取物及其制备方法，它涉及一种美白祛斑的药物。本发明解决目前中药治疗黄褐斑存在疗效缓慢、治愈率不高、长期服用中药不方便的问题。本发明产品由柴胡、当归、白芍、山茱萸、白术、茯苓、川芎、桃仁、白僵蚕、煨姜、薄荷和炙甘草制成；采用二氧化碳超临界萃取技术制备产品。本发明方法简单，便于操作，可使有效成分高度富集，从而提高了生物利用度，明显增强药理活性，获得产品的体积小，不含不可乳化的固体杂质。本发明产品有效地抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成，消除或改善黄褐斑，1个月左右见效，治愈率达到99.98%。本发明产品可作为有效成分直接用于制备美白祛斑的外用药物制剂及化妆品，容易携带，使用方便。

Description

美白祛斑中药复方提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种美白祛斑的药物。具体地说是以中草药为原料采用二氧化碳超临界萃取技术制得的产品。

背景技术

爱美之心，人皆有之。随着生活水平的提高，人们对生活质量的要求越来越高，越来越重视皮肤的自然美白，而颜面部显得尤为重要。黄褐斑是一种获得性色素沉着皮肤病，是由多种原因所致的局限性、不规则性皮肤色素改变，临床表现为对称性色素沉着，呈蝶翅状，轻者为淡黄或浅褐色，点片状散布于面颊两侧，以眼部下外侧多发；重者呈深褐或浅黑色分布于面部。本病多发于中青年女性，一般无任何自觉症状，病程顽固，严重影响患者美观，给患者精神和生活方面带来诸多烦恼和痛苦。

黄褐斑发病机理复杂，黑素过多是其核心病理表现。其确切的发病机制迄今未明，一般认为与黑素代谢异常、内分泌失调、妊娠、口服避孕药、遗传因素、氧自由基、紫外线照射、酪氨酸酶功能障碍等诸多因素有关，其中内分泌失调、遗传、紫外线照射等造成的皮肤黑素代谢异常是其发病的主要原因。

现代医学治疗黄褐斑主要包括使用避光剂（如氧化锌、二氧化钛等），系统使用维生素类、止血环酸、褪黑素等；但基本以局部外用化学脱色为主，如氢酮、壬二酸、曲酸、谷胱甘肽、消炎痛、维甲酸、酚类化合物、皮质内固醇等；还有化学剥脱角质层或化学皮肤沙磨去除黑素及用染料激光破坏黑素颗粒等。可是，大多数方法因引起不均匀色素脱失、毛细血管扩张、接触性皮炎等毒副作用或本身不稳定、疗效缓慢易复发，并有造成永久脱色和药源性褐黄斑之弊，而未能推广应用。

中医学将黄褐斑称作“黧黑斑”、“面尘”、“肝斑”等，《医宗金鉴》云:“黯如尘久怠暗，原于忧思抑郁而成”。对本病的症状又云:“初起色如尘垢，日久黑似煤形，枯暗不泽，大小不一。小者如粟粒赤豆，大者似莲子、或长、或斜、或圆。与皮肤相平，妇女多有之”。认为肝、肾、脾功能失调，气血运行失常，使脉络空虚不能上华于面，或瘀浊阻络，蕴结肌肤是黄褐斑发病的主要原因。

中医药治疗黄褐斑讲求内脏气血阴阳平衡，注重调整脏腑功能，治以疏肝解郁，滋补肝肾，健脾养血，活血化瘀。或内治为主、或外治为主，或内外治并用。中药治疗黄褐斑历史悠久，早在《神农本草经》、《名医别录》、《太平圣惠方》、《千金方》等古典医籍中就明确记载了能够“祛面黑，好颜色”的方药。大量临床实践证明，中医药治疗黄褐斑显示出一定的优势，具有突出整体调节、疗效稳定、副作用小、患者易于接受等优点，疗效比单纯用西药治疗要好。但是，目前中药治疗黄褐斑主要以口服为主，仍存在疗效缓慢、治愈率不高、长期服用中药不方便等缺点，影响了治疗的依从性。

发明内容

本发明的目的是为了提供美白祛斑中药复方提取物及其制备方法，以解决目前中药治疗黄褐斑存在疗效缓慢、治愈率不高、长期服用中药不方便的问题。本发明的产品有效地抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成，消除或改善黄褐斑，具有良好的美白祛斑作用，1个月左右见效，治愈率达到99.98%，本发明产品可作为有效成分直接用于制备美白祛斑的外用药物制剂及化妆品，容易携带，使用方便。

本发明中美白祛斑中药复方提取物的中药制剂按重量百分比由8~12份柴胡、8~12份当归、8~12份白芍、8~12份山茱萸、8~12份白术、8~12份茯苓、8~12份川芎、8~12份桃仁、8~12份白僵蚕、1~3份煨姜、2~5份薄荷和5~10份炙甘草制成；其制备方法是按下述步骤进行的：按上述配方分别称取各组分后混合，然后粉碎，过筛得到药粉；再将药粉装入二氧化碳超临界萃取装置中，用体积浓度为95%以上的乙醇作夹带剂进行萃取，然后在分离釜I和Ⅱ内进行分离，其中夹带剂的用量与药粉的比为0.1ml~1ml：1g，萃取温度为30~60℃，萃取压力为20~60MPa，CO₂流量控制在25L·h^-1，萃取时间1~5h，分离釜I内的压力为10MPa，分离釜I内的温度为40℃，分离釜Ⅱ内的压力为4MPa、分离釜Ⅱ内的温度为25℃；合并分离釜I和Ⅱ内液体；然后用旋转蒸发仪回收乙醇后得到棕黄色粘稠油状物，即得到了美白祛斑中药复方提取物。

本发明的组方科学合理，方中柴胡疏肝解郁，当归补血活血，白芍养血敛阴柔肝，三药配合，既补肝体又和肝用；白术、茯苓调中补脾，健脾渗湿，使运化有权，气血有源，煨姜温胃和中，三者合用能健脾以化气血，强脾以防肝乘；山茱萸滋肾益肝，与方柴胡、白术共用，能够兼补益肝、脾、肾；川芎通上下而行血之气，桃仁活血祛瘀，白僵蚕通络散结，与方中当归、白芍配合，能够补血活血祛瘀，通行血脉；少佐薄荷助柴胡疏散条达；甘草益气补中，又可调和诸药。同时，方中白芍、白术、茯苓、桃仁均具有“治面，令人肌滑”的作用，白僵蚕在『神农本草经』载有“灭黑斑，令人面色好”的功效，此5个药味均为白色或近白色，符合现代中医“以色治色”的新理论，既以药材的色白来“中和”、“冲淡”皮损的色黑。全方兼顾肝、肾、脾三脏，使肝血充足，以疏肝解郁为主，辅以滋肾健脾，补血活血祛瘀，调和气血，使气血运行通畅，推陈致新，使肌肤得养，浅色药味以色治色，诸药共奏除“面尘”之功。

本发明中当归、白僵蚕、川芎、白芍、桃仁、茯苓、白术、山茱萸、甘草等产品均可不同程度地抑制酪氨酸酶活性。当归有抗促性腺激素作用，其主要成分阿魏酸可抑制垂体分泌黄体生成素和催乳素，拮抗促性腺激素释放，抑制酪氨酸酶活性，防止酪氨酸氧化形成色素。柴胡、当归、白芍等具有增强SOD活性，清除自由基，抗脂质过氧化，降低血浆纤维蛋白原浓度，促进细胞降聚，降低血液粘度，扩张血管，改善血流状况等作用。豚鼠UVB照射诱导皮肤色素沉着动物实验表明，茯苓、白术可使多巴阳性MC数、含黑素颗粒细胞数及黑素含量指数较UVB对照组明显减少。melan-a与SP-1共培养体系实验表明，川芎在细胞培养水平对黑素生成有显著抑制作用。白僵蚕含有氨基酸和活性丝光素，有营养皮肤和美容作用，所含蛋白质有刺激上皮脂腺，调节性激素分泌的作用，所含维生素E9.89％，能清除自由基，抗脂质氧化，所含的活性丝光素能促使皮肤细胞新生，调节皮脂，改善皮肤微循环。煨姜和薄荷具有清除体内自由基、抗氧化的作用，以及抗炎杀菌和促进透皮吸收的作用。可见，方中诸药，能协同增进皮肤微循环，抑制酪氨酸酶活性，消除色素沉着，调节性激素分泌失调，保持皮肤弹性。最终达到消除或改善黄褐斑的目的。

本发明通过二氧化碳超临界萃取技术提取组方中的有效成分，方法简单，便于操作，使有效成分高度富集，生物利用度高，药理活性明显增强，体积小，不含不可乳化的固体杂质，可作为有效成分直接用于美白祛斑的外用药物制剂及化妆品的制备。本发明产品具有优异的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用，有效抑制色素沉着，消除或改善黄褐斑，1个月左右见效，治愈率达到99.98%。本发明产品可作为有效成分直接用于制备美白祛斑的外用药物制剂及化妆品，容易携带，使用方便。当将本发明产品可作为有效成分制作具有美白袪斑作用的化妆品及外用药物制剂时，优选其混合量在外用剂总量中为0.1~50mg/ml，特别优选1~10mg/ml。当将本发明产品作为有效成分制作具有美白袪斑作用的化妆品及外用药物制剂时，在不防碍本发明效果的范围内，可以根据需要适当加入通常的化妆品、医药品等皮肤外用剂的其他成分，例如：油分、润湿剂、紫外线吸收剂、抗氧化剂、表面活性剂、防腐剂、保温剂、香料、水、醇、增稠剂等。本发明的产品可用于化妆品及外用药物制剂，特别适合广泛用于化妆品中。其剂型只要是用于皮肤的剂型即可，可适用于溶液体系、乳化体系、软膏、凝胶等任意剂型。另外，其使用形态也是任意的，例如：化妆水、乳液、霜、面膜等。

本发明中药材柴胡——功能主治：和解表里，疏肝，升阳。治寒热往来，胸满肋痛，口苦耳聋，头痛目眩，疟疾，下利脱肛，月经不调，子宫下垂。

当归——功能主治：补血和血，调经止痛，润燥滑肠。治月经不调，经闭腹痛，癥瘕结聚，崩漏；血虚头痛，眩晕，痿痹；肠燥便难，赤痢后重；痈疽疮疡，跌扑损伤。

白芍（又名白芍药）——功能主治：养血柔肝，缓中止痛，敛阴收汗。治胸腹胁肋疼痛，泻痢腹痛，自汗盗汗，阴虚发热，月经不调，崩漏，带下。

山茱萸——功能主治：补肝肾，瑟精气，固虚脱。治腰膝酸痛，眩晕，耳鸣，阳痿，遗精，小便频数，肝虚寒热，虚汗不止，心摇脉散。

白朮——功能主治：补脾，益胃，燥湿，和中。治脾胃气弱，不思饮食，倦怠少气，虚胀，泄泻，痰饮，水肿，黄疸，湿痹，小便不利，头晕，自汗，胎气不安。

茯苓——功能主治：渗湿利水，益脾和胃，宁心安神。治小便不利，水肿胀满，痰饮咳逆，呕哕，泄泻，遗精，淋浊，惊悸，健忘。

川芎——功能主治：行气开郁，祛风燥湿，活血止痛。治风冷头痛旋晕，胁痛腹疼，寒痹筋挛，经闭，难产，产后瘀阻块痛，痈疽疮疡。

桃仁——功能主治：破血行瘀，润燥滑肠。治闭经，癥瘕，热病蓄血，风痹，疟疾，铁打损伤，淤血肿痛，血燥便秘。

白僵蚕——功能主治：祛风解痉，化痰散结。治中风失音，惊痫，头风，喉风，喉痹，瘰疬结核，风疮瘾疹，丹毒，乳腺炎。

煨姜——功能主治：和中止呕。适用于脾胃不和、恶心呕吐等症。

薄荷——功能主治：疏风，散热，辟秽，解毒。治外感风热，头痛，目赤，咽喉肿痛，食滞气胀，口疮，牙痛，疮疥，瘾疹。

炙甘草——功能主治：补脾和胃，益气复脉。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心动悸，脉结代，可解附子毒。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式美白祛斑中药复方提取物按重量百分比由8~12份柴胡、8~12份当归、8~12份白芍、8~12份山茱萸、8~12份白术、8~12份茯苓、8~12份川芎、8~12份桃仁、8~12份白僵蚕、1~3份煨姜、2~5份薄荷和5~10份炙甘草制成。

本实施方式的美白祛斑中药复方提取物具有优异的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用，消除或改善黄褐斑，1个月左右见效，治愈率达到99.98%。本实施方式的美白祛斑中药复方提取物在浓度为1mg/ml及以上时，对黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的平均抑制率在45%以上，对黑素瘤细胞黑素合成的平均抑制率在40%以上，对UVB诱导豚鼠皮肤色素沉着具有显著的抑制作用。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：美白祛斑中药复方提取物按重量百分比由10份柴胡、10份当归、10份白芍、10份山茱萸、10份白术、10份茯苓、10份川芎、10份桃仁、10份白僵蚕、2份煨姜、3份薄荷和8份炙甘草制成。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：美白祛斑中药复方提取物按重量百分比由8份柴胡、9份当归、11份白芍、10.5份山茱萸、9.5份白术、11份茯苓、11.5份川芎、12份桃仁、8份白僵蚕、1份煨姜、5份薄荷和5份炙甘草制成。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：美白祛斑中药复方提取物按重量百分比由12份柴胡、8份当归、12份白芍、8.5份山茱萸、10.5份白术、12份茯苓、12份川芎、9份桃仁、12份白僵蚕、3份煨姜、2份薄荷和10份炙甘草制成。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：美白祛斑中药复方提取物按重量百分比由8.5份柴胡、11份当归、9份白芍、11份山茱萸、8份白术、9份茯苓、8份川芎、8份桃仁、9份白僵蚕、2.5份煨姜、4份薄荷和9份炙甘草制成。

具体实施方式六：本实施方式美白祛斑中药复方提取物的制备方法是按下述步骤进行的：按重量百分比分别称取8~12份柴胡、8~12份当归、8~12份白芍、8~12份山茱萸、8~12份白术、8~12份茯苓、8~12份川芎、8~12份桃仁、8~12份白僵蚕、1~3份煨姜、2~5份薄荷和5~10份炙甘草，然后混合后粉碎，过筛得到药粉；再将药粉装入二氧化碳超临界萃取装置中，用体积浓度为95%以上的乙醇作夹带剂进行萃取，然后在分离釜I和Ⅱ内进行分离，其中夹带剂的用量与药粉的比为0.1ml~1ml：1g，萃取温度为30~60℃，萃取压力为20~60MPa，CO₂流量控制在25L·h^-1，萃取时间1~5h，分离釜I内的压力为10MPa，分离釜I内的温度为40℃，分离釜Ⅱ内的压力为4MPa、分离釜Ⅱ内的温度为25℃；合并I和Ⅱ内液体；然后用旋转蒸发仪回收乙醇后得到棕黄色粘稠油状物，即得到了美白祛斑中药复方提取物。

本实施方式制备的美白祛斑中药复方提取物具有优异的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用，消除或改善黄褐斑，1个月左右见效，治愈率达到99.98%。本实施方式制备的美白祛斑中药复方提取物在浓度1mg/ml及以上时，对黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的平均抑制率在45%以上，对黑素瘤细胞黑素合成的平均抑制率在40%以上，对UVB诱导豚鼠皮肤色素沉着具有显著的抑制作用。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述夹带剂的用量与药粉的比为0.2ml~0.8ml：1g。其它步骤和参数与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述夹带剂的用量与药粉的比为0.4ml~0.6ml：1g。其它步骤和参数与具体实施方式六相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述夹带剂的用量与药粉的比为0.5ml：1g。其它步骤和参数与具体实施方式六相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：所述萃取温度为35~55℃。其它步骤和参数与具体实施方式六至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：所述萃取温度为40~50℃。其它步骤和参数与具体实施方式六至九之一相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：所述萃取温度为55℃。其它步骤和参数与具体实施方式六至九之一相同。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式六至十二之一不同的是：所述萃取压力为25~55Mpa。其它步骤和参数与具体实施方式六至十二之一相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式六至十二之一不同的是：所述萃取压力为30~50Mpa。其它步骤和参数与具体实施方式六至十二之一相同。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式六至十二之一不同的是：所述萃取压力为35~45Mpa。其它步骤和参数与具体实施方式六至十二之一相同。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式六至十二之一不同的是：所述萃取压力为40Mpa。其它步骤和参数与具体实施方式六至十二之一相同。

具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式六至十六之一不同的是：所述萃取时间2~4h。其它步骤和参数与具体实施方式六至十六之一相同。

具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式六至十六之一不同的是：所述萃取时间3h。其它步骤和参数与具体实施方式六至十六之一相同。

具体实施方式十九：本实施方式美白祛斑中药复方提取物的制备方法是按下述步骤进行的：按重量百分比分别称取8~12份柴胡、8~12份当归、8~12份白芍、8~12份山茱萸、8~12份白术、8~12份茯苓、8~12份川芎、8~12份桃仁、8~12份白僵蚕、1~3份煨姜、2~5份薄荷和5~10份炙甘草，总重量为5000g，然后混合后粉碎，过24目筛（药典2号筛）得到药粉；再将药粉装入二氧化碳超临界萃取装置中，用无水乙醇作夹带剂进行萃取，然后在分离釜I和Ⅱ内进行分离，其中夹带剂的用量为2500ml，萃取温度为45℃，萃取压力为40MPa，CO₂流量控制在25L·h^-1，萃取时间2h，分离釜I内的压力为10MPa，分离釜I内的温度为40℃，分离釜Ⅱ内的压力为4MPa、分离釜Ⅱ内的温度为25℃；合并两个分离釜内液体（约2000ml）；然后用旋转蒸发仪在45℃条件下减压浓缩回收乙醇后得到棕黄色粘稠油状物（116~128g），即得到了美白祛斑中药复方提取物（得率为2.32%~2.56%）。

具体实施方式二十：本实施方式美白祛斑中药复方提取物的制备方法是按下述步骤进行的：按重量百分比分别称取10份柴胡、10份当归、10份白芍、10份山茱萸、10份白术、10份茯苓、10份川芎、10份桃仁、10份白僵蚕、2份煨姜、3份薄荷和8份炙甘草，总重量为5000g，然后混合后粉碎，过24目筛（药典2号筛）得到药粉；再将药粉装入二氧化碳超临界萃取装置中，用无水乙醇作夹带剂进行萃取，然后在分离釜I和Ⅱ内进行分离，其中夹带剂的用量为2500ml，萃取温度为45℃，萃取压力为40MPa，CO₂流量控制在25L·h^-1，萃取时间2h，分离釜I内的压力为10MPa，分离釜I内的温度为40℃，分离釜Ⅱ内的压力为4MPa、分离釜Ⅱ内的温度为25℃；合并两个分离釜内液体（约2000ml）；然后用旋转蒸发仪在45℃条件下减压浓缩回收乙醇后得到棕黄色粘稠油状物（123g），即得到了美白祛斑中药复方提取物（得率为2.46%）。

本实施方式采用二氧化碳超临界萃取装置的型号为HA221-50-06型，由南通市华安超临界萃取有限公司生产。

下面以本实施方式所述的复方提取物为例对本实施的产品的酪氨酸酶活性抑制作用、黑色素生成抑制作用，以及添加本发明产品的皮肤外用剂的美白作用的实验方法及结果进行说明：

一、酪氨酸酶活性抑制和黑色素生成抑制实验研究

1实验材料

小鼠B16黑素瘤细胞（购于中科院上海细胞所）；熊果苷（购于Sigma公司）；DMEM培养基（购于Gibco公司）；胎牛血清（购于Billab公司）；胰蛋白酶（购于Billab公司）；磷酸缓冲盐（购于北京中杉金桥有限公司）；双抗（购于Billab公司）；多巴（购于Sigma公司）；TritonX-100（购于Sigma公司）；MTT（购于Billab公司）；DMSO（购于Sigma公司）；酶标仪（热电上海仪器有限公司）。

2试剂配制

取熊果苷临用时以DMEM培养基稀释成实验所需浓度。

取本实施方式制备的美白祛斑中药复方提取物，用少量无水乙醇溶解，再用DMEM培养基溶解配成1mg/ml，其中乙醇浓度为0.8%，调节PH值为7.0，过滤除菌，4℃保存，备用。

3细胞培养及受试药物暴露

取小鼠B16黑素瘤细胞，待细胞生长至近融合状态，经0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%小牛血清的DMEM培养液传代，置于CO₂培养箱37℃、5%CO₂饱和湿度环境中进行培养。每一次实验取自同一传代细胞。

3.1细胞增殖抑制率测定

选择生长至近融合状态的细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞浓度，以每孔5×10³个接种于96孔板，每孔液体量150μL，置于37℃，体积分数为5%CO2条件下培养24h后，用添加受试药物的新鲜培养液换液1次，熊果苷、本发明产品浓度均分别设10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，每个浓度设6个复孔。对照组直接加培养液，空白组只加培养液不加细胞，同样置于37℃，体积分数为5%CO₂条件下培养72h，于结束前4h加入MTT20μL/孔，37℃孵育4h后弃去上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔，振荡10min左右。用酶标仪测OD值，波长为490nm。

细胞增殖抑制率%=[1－（试验组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－空白组OD值）]×100%

3.2酪氨酸酶活性抑制率测定

选择生长至近融合状态的细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞浓度，以每孔5×10³个接种于96孔板，每孔液体量150μL，置于37℃，体积分数为5%CO2条件下培养24h后，用添加受试药物的新鲜培养液换液1次，熊果苷、本实施方式制备的美白祛斑中药复方提取物均分别设10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，每个浓度设6个复孔。对照组直接加培养液，空白组只加培养液不加细胞，同样置于37℃，体积分数为5%CO₂条件下培养72h，倾去培养液，用PBS洗两次，加TritonX-10090μL/孔，震荡30min，加入0.2%L-dopa溶液60μL/孔，37℃孵育20min，用酶标仪测OD值，波长为490nm。

酪氨酸酶活性抑制率%=[1－（试验组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－空白组OD值）]×100%

3.3黑素含量抑制率测定

选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞浓度接种于培养瓶中，置于37℃，体积分数为5%CO₂条件下培养24h后，用添加受试药物的新鲜培养液换液1次，熊果苷、本发明产品浓度均分别设10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，对照组直接加培养液，空白组只加培养液不加细胞，同样置于37℃，体积分数为5%CO₂条件下培养72h，用0.25%胰酶收获细胞，离心（1500r/min，5min）后弃去上清液，加PBS缓冲液调节细胞密度至10⁵/ml左右，各吸取1ml细胞悬液分别置于3个平行具塞管中，离心（1500r/min，5min）后弃去上清液，先加入200μl蒸馏水使细胞重新悬浮，然后加入1ml乙醇∶乙醚液（体积比为1∶1）以溶解非黑素的不透明颗粒，在室温下放置15min，离心（3000r/min，5min）并弃去上清液，加入1ml质量分数为10%的二甲基亚砜、1mol/LNaOH溶液，置于80℃水浴30min，使细胞团块完全溶解。用酶标仪测OD值，波长为490nm。

黑素含量抑制率%=[1－（试验组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－空白组OD值）]×100%

4结果分析

4.1本实施方式所述复方提取物对B-16细胞生长的影响

由表1可见，本实施方式所述复方提取物对细胞生长的抑制作用与空白组和熊果苷组相比，差异均无统计学意义（P<0.05），说明该提取物无细胞毒作用。

4.2本实施方式所述复方提取物对B-16细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响

由表2、3可见，本实施方式所述复方提取物三个浓度均有显著的抑制酪氨酸酶活性和黑素合成的作用，并且作用均强于熊果苷，说明在抑制酪氨酸酶活性和黑素合成方面，本实施方式所述复方提取物比传统美白剂熊果苷具有更明显的作用。

表1 对小鼠B16黑素瘤细胞增殖的抑制率（

±s，%）

表2 对小鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的抑制率（

±s，%）

与空白对照相比，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；与同浓度熊果苷相比，^△P<0.05，^△△P<0.01

表3 对小鼠B16黑素瘤细胞黑素合成的抑制率（±s，%）

与空白对照相比，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；与同浓度熊果苷相比，^△P<0.05，^△△P<0.01

二、对UVB诱导豚鼠皮肤色素沉着的抑制作用实验研究

1实验仪器、试药与实验动物

UVB紫外光疗仪（Sigma公司）；0.1%8-甲氧补骨脂素（8-MOP）酊（Sigma公司）；普通级健康纯白豚鼠80只，雌性，体重250-320g；以普通基质配制含不同浓度日霜，配方和制备方法见表4（但并不作为本发明的限制，本领域常规日霜的辅料均适合于本发明的技术方案）。

表4加入本实施方式美白祛斑中药复方提取物制备的日霜：

2UVB诱导的色素沉着模型复制及给药

每只豚鼠背部取3个相离区域（2×2cm²），用弯剪剪除豚鼠背部中央处长毛，电动剃须刀剃净短毛，使用SS-04B型紫外线光疗仪照射，紫外线灯配置UVB光源，灯管的光谱峰值为310～315nm；照射前应用UVB紫外辐照计测定辐照光强，照射该区域20min，每日照射量200mJ/cm²，连续2周，累积照射量2800mJ/cm²。每次照射后2小时给药，照射结束后继续给药2周，取皮肤组织做病理检查。

3分组

第1组以不照射紫外的正常豚鼠背部皮肤作空白对照；第2组，造模，外涂配制外用药物所使用的基质，作为自身对照；3-7组，造模，外涂含本实施方式所述提取物的药物，浓度分别为：0.5、1、5、10、30mg/ml；第8组，造模，外涂0.1%8-甲氧补骨脂素（8-MOP）酊，作为阳性对照。

4染色方法

4.1HE染色：从豚鼠背部取皮肤标本（2cm×2cm），常规石蜡切片HE染色。

4.2Schmorl法染色

（1）切片移至水洗。（2）用新鲜配置的0.037mol/L(1%)氯化铁30ml,新鲜配置的0.03mol/L(1%)铁氰化钾4mL和蒸馏水6mL的混合液处理10min。(3)流水清洗。结果：黑素染色为黄褐、黑色颗粒。

4.3Imokawa法染色

（1）从豚鼠背部取皮肤标本（2cm×2cm）,用0.1mol/LPBS液（pH6.8）冲洗，1mol/L溴化钠37℃孵育5h。（2）分离表皮、真皮。（3）表皮用3.33mol/L（10%）冷中性福尔马林固定30min，用0.1mol/LPBS液（pH6.8）冲洗2遍。（4）用0.1%多巴（0.1mol/LPBS液）（pH6.8）染色5h。结果：黑素细胞染成黑褐色。

5光镜观察

5.1含黑素颗粒细胞计数：Schmorl法染色，高倍镜下用网形目镜测微尺单盲法计数每份标本每平方毫米表皮基底层含黑素颗粒细胞数。

5.2多巴阳性细胞计数：Imokawa法染色，高倍镜下用网形目镜测微尺单盲法计数每份标本每平方毫米表皮基底层含多巴阳性黑素细胞数。

6结果分析

由表5可见，与空白组相比，UVB模型组豚鼠皮肤含黑素颗粒细胞、多巴阳性细胞数均明显增高，有显著性差异（P<0.01），这说明UVB诱导的类似于黄褐斑的色素沉着皮肤模型成功。与模型组相比，含本实施方式所述提取物的药物能明显减少豚鼠皮肤含黑素颗粒细胞、多巴阳性细胞数；并且高浓度组的作用强于阳性对照药8-MOP。说明实施方式所述提取物具有良好的美白祛斑作用。

表5产品对豚鼠皮肤黑素细胞和黑素形成的影响（

±s）

与空白组相比﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；与UVB模型组比较^△P<0.05，^△△P<0.01

具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式二十不同的是：所述的萃取温度为30~60℃。其它步骤和参数与具体实施方式二十相同。

本实施方式美白祛斑中药复方提取物的得率为2.40~2.50%。

具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式二十不同的是：所述的萃取压力为20~60MPa。其它步骤和参数与具体实施方式二十相同。

本实施方式美白祛斑中药复方提取物的得率为2.32~2.48%。

具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式二十不同的是：所述的萃取时间为1~5h。其它步骤和参数与具体实施方式二十相同。

本实施方式美白祛斑中药复方提取物的得率为2.35~2.52%。

具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式二十不同的是：所述的夹带剂的用量为500~5000ml。其它步骤和参数与具体实施方式二十相同。

本实施方式美白祛斑中药复方提取物的得率为2.26~2.54%。

具体实施方式二十五：本实施方式利用具体实施方式一所述美白祛斑中药复方提取物制备眼霜，配方和制备方法见表6（但并不作为本发明的限制，本领域常规眼霜的辅料均适合于本发明的技术方案）：

表6：眼霜的配方和制备方法

具体实施方式二十六：本实施方式利用具体实施方式一所述美白祛斑中药复方提取物制备润肤乳液，配方和制备方法见表7（但并不作为本发明的限制，本领域常规润肤乳液的辅料均适合于本发明的技术方案）。

表7：润肤乳液的配方和制备方法

 

Claims (7)

1.美白祛斑中药复方提取物，其特征在于美白祛斑中药复方提取物按重量百分比由8~12份柴胡、8~12份当归、8~12份白芍、8~12份山茱萸、8~12份白术、8~12份茯苓、8~12份川芎、8~12份桃仁、8~12份白僵蚕、1~3份煨姜、2~5份薄荷和5~10份炙甘草制成。

2.根据权利要求1所述的美白祛斑中药复方提取物，其特征在于美白祛斑中药复方提取物按重量百分比由10份柴胡、10份当归、10份白芍、10份山茱萸、10份白术、10份茯苓、10份川芎、10份桃仁、10份白僵蚕、2份煨姜、3份薄荷和8份炙甘草制成。

3.如权利要求1所述美白祛斑中药复方提取物的制备方法，其特征在于治疗美白祛斑中药复方提取物的制备方法是按下述步骤进行的：按重量百分比分别称取8~12份柴胡、8~12份当归、8~12份白芍、8~12份山茱萸、8~12份白术、8~12份茯苓、8~12份川芎、8~12份桃仁、8~12份白僵蚕、1~3份煨姜、2~5份薄荷和5~10份炙甘草，然后混合后粉碎，过筛得到药粉；再将药粉装入二氧化碳超临界萃取装置中，用体积浓度为95%以上的乙醇作夹带剂进行萃取，然后在分离釜I和Ⅱ内进行分离，其中夹带剂的用量与药粉的比为0.1ml~1ml：1g，萃取温度为30~60℃，萃取压力为20~60MPa，CO₂流量控制在25L·h^-1，萃取时间1~5h，分离釜I内的压力为10MPa，分离釜I内的温度为40℃，分离釜Ⅱ内的压力为4MPa、分离釜Ⅱ内的温度为25℃；合并分离釜I和Ⅱ内液体；然后用旋转蒸发仪回收乙醇后得到棕黄色粘稠油状物，即得到了美白祛斑中药复方提取物。

4.根据权利要求3所述的美白祛斑中药复方提取物的制备方法，其特征在于所述萃取温度为45℃。

5.根据权利要求3或4所述的美白祛斑中药复方提取物的制备方法，其特征在于萃取压力为40MPa。

6.根据权利要求5所述的美白祛斑中药复方提取物的制备方法，其特征在于萃取时间2h。

7.根据权利要求3、4或5所述的美白祛斑中药复方提取物的制备方法，其特征在于用无水乙醇作夹带剂。