CN101799421B - 一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法。该方法将体液样品进行膜电泳,电泳结束后,将分离出的蛋白质、DNA或RNA样品连同膜电泳介质一起切下并与冰醋酸接触,孵育,形成透明胶体,加入拉曼光谱增强基质,继续孵育并搅匀,待固相杂质析出后停止孵育并静置分层,取上层混合液进行表面增强光谱检测,建立表面增强拉曼光谱数据库。本发明通过膜电泳技术消除体液中其他复杂成分对蛋白质、DNA和RNA分子SERS检测的干扰,从而充分发挥了SERS方法的高灵敏度特点,可获得高质量的体液表面增强拉曼光谱,从而易于对获得的表面增强拉曼光谱进行分析处理,获得有价值的信息。
Description
技术领域
本发明涉及检测方法领域,特别涉及一种用于检测体液表面增强拉曼光谱(SERS)的检测方法。
背景技术
组织细胞所发生的变化必然伴随着细胞内外生物分子组成和结构的变化,拉曼光谱技术能提供样品成分的分子振动光谱,从而可检测并获得样品在分子水平的组成和结构信息,然而常规拉曼信号太弱,因此需要采取一定技术手段使常规拉曼信号增强后再进行检测,表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman spectroscopy,简称SERS)就是通常采用的一种增强拉曼信号的手段。SERS是指当一些分子被吸附到某些粗糙的金属(如Au、Ag、Cu和Pt等)表面上时,它们的拉曼散射强度会增加104 - 106倍。这就是SERS效应。理论上SERS技术可以实现单分子检测,因此SERS技术检测灵敏度极高,另外,SERS效应多采用近红外激光(785nm)激发,检测功率低于1mW,对生物样品可实现无损检测。
膜电泳是一种特别适合于血液等体液样品分离和分析的电泳技术,目前已经广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋 白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等的分离分析中,和其他电泳技术相比较,如聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳,膜电泳具有的优点如下:
(1)分离分析快速省时。以醋酸纤维素薄膜电泳为例,由于醋酸纤维素薄膜所容纳的电泳缓冲液较少,电渗作用也就小,电流主要由样品传导,因此分离速度快,电泳时间短, 40-60min即可完成电泳。
(2)灵敏度高,样品用量少。 以血液样品为例,仅需0.1-2μl血清即可获得清晰的分离带。
(3)精确性高,以醋酸纤维素薄膜电泳为例,由于醋酸纤维素薄膜对杂质吸附极少,因此无"拖尾"现象,染色后背景能完全脱色,可获得样品清晰的分离带,因而提高了测定的精确性。
膜电泳的原理如下:
(1)电泳以血清蛋白质的分离和分析为例,由于各种血清蛋白质的等电点大都低于pH7.0,在pH8.6巴比妥缓冲液中,上述蛋白均电离出阴离子,在电场作用下,带电荷的血清蛋白会向相反电荷电极泳动,这一现象称为电泳。
(2)膜电泳通常以所采用的薄膜介质命名,如醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为支持物的一种膜电泳方法,由于各种血清蛋白的氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同,在同一pH环境中所带电荷多少及分子大小不同,所以在电场中的泳动速度不同。蛋白质分子量小而带电荷多者,泳动速度快,分子量大而带电荷少者泳动速度慢,因此可以利用其泳速不同将血清蛋白质分开。
组织细胞所发生的病理变化通常反映在蛋白质、DNA和RNA这三种生物分子上,然而体液及分泌液成分较为复杂。以血液为例,除血清蛋白外还含有葡萄糖、脂肪、激素及一些外源物质(如药物、细菌和病毒)等多种成份。传统方法是对体液样品直接进行SERS检测,很难对获得的体液表面增强拉曼图谱中蛋白质、DNA和RNA进行分析,这是因为SERS效应非常灵敏,样品中各个成分的拉曼信号均能得到增强,从而干扰了体液中蛋白质、DNA和RNA的SERS信号。
发明内容
本发明的目的在于提供一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法,具体通过如下步骤:a)处理体液样品为上层水相和下层固相;b)上层水相等分为两份样品,所述两份样品各取适量体积同时进行膜电泳;c)膜电泳结束后,所述两份样品取其中一份进行染色,用于对比识别另一未染色样品在膜电泳介质上的所在确定位置,d)未染色样品在所述确定位置连同膜电泳介质一起切下;e)将所述切下的未染色样品与适当溶剂接触,并在一定温度下进行孵育,形成透明胶体,此时加入拉曼光谱增强基质,继续孵育并搅匀,待固相杂质析出后,停止孵育并静置分层,上层为体液样品与拉曼光谱增强基质混合液,取所述混合液进行表面增强光谱检测;f)不同样品重复以上所述步骤建立表面增强拉曼光谱数据库;g)采用合适的分析方法对所述表面增强拉曼光谱数据库进行聚类分析,建立表面增强拉曼光谱分析模型;
本发明优势在于通过膜电泳技术消除体液中其他复杂成分对蛋白质、DNA和RNA分子SERS检测的干扰,从而充分发挥了SERS方法的高灵敏度特点,可获得高质量的体液表面增强拉曼光谱,从而易于对获得的表面增强拉曼光谱进行分析处理,获得有价值的信息。
为实现本发明的目的采用的技术方案如下:
1. SERS增强基质的制备
采用盐酸羟胺还原、柠檬酸钠还原或硼酸化钠还原方法,制备增强基质金溶胶或银溶胶,溶胶的直径范围在40~70nm之间。
当采用盐酸羟胺还原制备银溶胶时,将氢氧化钠溶液加入到盐酸羟胺溶液中进行混合制成混合物,再将混合物快速添加到硝酸银溶液中,在加入过程中快速搅拌制成乳灰色银溶胶。用离心机将上述乳灰色银溶胶以4000~5000rpm离心10min~15min使银溶胶分层,弃上清液取下层浓缩的银溶胶在室温下避光封存备用。上述制备过程中氢氧化钠︰盐酸羟胺︰硝酸银的摩尔比为1︰0.6︰0.011。
当采用柠檬酸钠还原制备银溶胶时,取10 mg的硝酸银溶于50 ml去离子水中,加热至100℃使之沸腾,然后将1 ml浓度为2%的柠橄酸三钠逐滴加入,并快速搅拌,滴加完后继续保持沸腾6小时得到银溶胶。银溶胶自然冷却后,用离心机离心分层,将上层清液丢弃,取下层浓缩的银溶胶在室温下避光密封存放备用。
当采用柠檬酸钠还原制备金溶胶时,取10 mg的氯金酸溶于100ml去离子水中加热至100℃使之沸腾,然后将2 ml浓度为1%的柠橄酸三钠逐滴加入,并快速搅拌,滴加完后继续保持沸腾15分钟得到金溶胶。待此金溶胶自然冷却后,用离心机离心分层,将上层清液丢弃,取下层浓缩的金溶胶在室温下避光密封存放备用。
2. 膜电泳
a)处理体液样品为上层水相和下层固相。
b)上层水相等分为两份样品,所述两份样品各取适量体积同时进行膜电泳。
c)膜电泳结束后,所述两份样品取其中一份进行蛋白质染色方法或核酸(DNA或RNA)染色,用于对比识别另一未染色样品在膜电泳介质上的所在确定位置。
d)未染色样品在所述确定位置连同膜电泳介质一起切下。
3. 未染色体液样品-SERS增强基质混合液的制备
在适合条件下,使所述未染色样品与150μl~500μl的溶剂接触,如冰醋酸、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液或无RNA酶的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液,25~65 ℃,经10~40分钟孵育形成透明胶体,此时加入拉曼光谱增强基质,继续孵育并搅匀,待固相杂质析出后,停止孵育并静置分层,取上层未染色体液样品与SERS增强基质混合液进行表面增强拉曼光谱检测,弃下层固相杂质。
4. 体液样品-SERS增强基质混合液的拉曼光谱检测
采用400-850nm的激光光源照射所述混合液,拉曼光谱取谱范围为400-4000cm-1,检测由所述体液样品与拉曼光谱增强基质混合液产生的拉曼光谱信号。
5. 建立表面增强拉曼光谱分析模型
按以上所述4个步骤分别获得不同人体液样品的表面增强拉曼光谱,建立表面增强拉曼光谱数据库。采用主成分分析方法(PCA)对所述表面增强拉曼光谱数据库进行聚类分析,建立表面增强拉曼光谱分析模型,获得不同人体液样品对应的散射点分布图。
上述技术方案中所述的拉曼光谱增强基质为银溶胶或金溶胶;
所述的体液指血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊髓液、尿液、唾液、泪液、汗液、细胞提取物、组织匀浆、阴道分泌液或精液;
所述的未染色体液样品为体液样品中的蛋白质分子、DNA分子或RNA分子;
所述的蛋白质染色方法为氨基黑10B染色方法、考马斯亮蓝染色方法或银染色方法;所述的核酸染色方法是溴化乙锭染色方法或银染色方法;
所述的混合液为蛋白质银溶胶混合液、蛋白质金溶胶混合液、DNA银溶胶混合液、DNA金溶胶混合液、RNA银溶胶混合液或RNA金溶胶混合液;
所述的与拉曼光谱增强基质混合液的制备需经过溶剂处理、孵育和静置分层三个步骤;
所述的膜电泳方法使用的介质为醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚偏二氟乙烯膜。
本发明对体液样品-SERS增强基质混合液的制备及表面增强拉曼光谱的检测见图1。
附图说明
图1 是本发明对体液样品-SERS增强基质混合液制备及表面增强拉曼光谱检测示意图:
其中(a) 醋酸纤维素膜电泳分离获得的血清蛋白染色(左)和未染色(右)膜条;(b) 蛋白银纳米粒子混合液制备过程;(c) 检测获得的血清蛋白表面增强拉曼图谱;
图2是本发明对血液样品-银SERS增强基质混合液的表面增强拉曼光谱图;
图3是本发明对对照血液样品-银SERS增强基质混合液的表面增强拉曼光谱图;
图4是本发明对上述两种血液样品的表面增强拉曼光谱PCA分析散点图;
图5是本发明对血液样品-金SERS增强基质混合液的表面增强拉曼光谱图;
图6是本发明对尿液样品进行醋酸纤维素膜电泳后得到的银染图;
图7是本发明对尿液-银SERS增强基质混合液的表面增强拉曼光谱图。
图2、图3和图5中采用的激光波长为785nm,功率为0.1~20mW,纵坐标为谱线的强度,横坐标为各特征谱线的峰位置,以波数(cm-1)表示。
具体实施方式
下面对本发明的方案措施作进一步的说明。
实施例1
血液与银溶胶混合液制备及表面增强拉曼光谱检测
1)银溶胶的制备:盐酸羟胺还原方法制备银溶胶。将12ml 0.1mol的氢氧化钠溶液加入到10ml 0.06mol的盐酸羟胺溶液中,然后将混合物快速添加到180ml 0.0011mol硝酸银溶液中,在加入过程中快速搅拌直至得到均匀的乳灰色溶液。用离心机4500rpm离心12min使银胶分层,将上清液丢弃,取下层浓缩的银溶胶在室温下避光封存备用。
2)醋酸纤维薄膜电泳:将不同人血液样品分成A组与B组,两组血液样品同时进行如下操作:血液样品进行离心,800rpm离心12min,提取上层血清作为样品。通过点样器在两条醋酸纤维薄膜条上点样,经点样的膜条贴在电泳槽两侧支持架上的滤纸上进行电泳,电泳槽电压为180V,电泳时间45min。电泳完毕后将膜条取下, 其中一条直接移至漂洗液中漂洗12min,漂洗后膜条取出置于滤纸上晾干。另一条放在氨基黑10B染色液中染色3min,取出后移置漂洗液中漂洗直至背景蓝色脱净,漂洗后膜条取出置于滤纸上晾干。此时可见染色后的膜条显示5条区带,从阳极到阴极依次为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白。以经过染色的膜条作为对照,将直接漂洗的膜条上电泳时靠近正极的第一条蛋白质谱带即白蛋白剪下并收集于1.5ml试管内。
3)血清白蛋白银纳米粒子混合液制备:往装有血清白蛋白谱带的膜条试管内加入200μl冰醋酸。室温下搅拌直至膜条充分溶解,溶液呈透明胶状。在37℃水浴环境下,往试管中加入已预制备用的银溶胶450μl,充分搅拌直至膜条成絮状析出,停止搅拌,继续37℃水浴45分钟后,静置分层,上层水相为血清白蛋白银纳米粒子混合液。用移液器将所述混合液移至一纯铝载物片上,自然晾干。
4)SERS 检测:利用共焦拉曼光谱仪检测样品获得白蛋白的表面增强拉曼光谱,检测样品时采用的激光波长为785nm,功率为3.75mW,收集波长范围400 cm-1-1800cm-1, A组血液样品中白蛋白表面增强拉曼光谱检测谱线图如图2所示。B组血液样品中白蛋白SERS图谱的获得同以上各步操作,不同之处为样品更换为B组血液样品,B组血液样品中白蛋白表面增强拉曼光谱检测谱线图如图3所示。
5)将获得A组和B组血液样品的白蛋白表面增强拉曼光谱图对应的数据列表输入SPSS软件,数据转置建立样本矩阵,应用SPSS软件分析工具栏中的PCA方法进行计算,具体步骤如下:a)计算出样本的协方差矩阵;b)计算出样本协方差矩阵的本征向量,本征值按大到小排序;c)根据本征值定义主成份,并计算出各个主成份的贡献率;d)根据贡献率选择主成份,要求选出的主成份累计贡献率达到 70% 以上。根据选出的主成份建立相应的分析散点图如图4所示,从而获得表面增强拉曼光谱分析模型 。
实施例2
血液与金溶胶混合液制备及表面增强拉曼光谱检测
1)金溶胶的制备:柠檬酸钠还原方法制备金溶胶,取10 mg的氯金酸溶于100ml去离子水中加热至100℃使之沸腾,然后将2 ml浓度为1%的柠橄酸三钠逐滴加入,并快速搅拌,滴加完后继续保持沸腾15分钟。待此金溶胶自然冷却后,用离心机离心分层,将上层清液丢弃,取下层浓缩的金溶胶在室温下避光密封存放备用。
2)醋酸纤维薄膜电泳:将不同人血液样品分成A组与B组,两组血液样品同时进行如下操作:血液样品进行离心,,1000rpm离心10min,提取上层血清作为样品。通过点样器在两条醋酸纤维薄膜条上点样,经点样的膜条贴在电泳槽两侧支持架上的滤纸上进行电泳,电泳槽电压为15V/cm,电泳时间55min。电泳完毕后将膜条取下, 其中一条直接移置漂洗液中漂洗10min,漂洗后膜条取出置于滤纸上晾干,另一条放在氨基黑10B染色液中染色2min,然后取出后移置漂洗液中漂洗直至背景蓝色脱净,漂洗后膜条取出置于滤纸上晾干。此时可见染色后的膜条显示5条区带,从阳极到阴极依次为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白,以经过染色的膜条作为对照,将直接漂洗的膜条上α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白区带剪下并收集于1.5ml试管内。
3)血清球蛋白金纳米粒子混合液制备:往装有血清白蛋白谱带的膜条试管内加入150μl冰醋酸。室温下搅拌直至膜条充分溶解,溶液呈透明胶状。在50℃水浴环境下,往试管中加入已预制备用的金溶胶200μl,充分搅拌直至膜条成絮状析出,停止搅拌,继续50℃水浴28分钟后,静置分层,上层水相为血清球蛋白金纳米粒子混合液。用移液器将所述混合液移至一纯铝载物片上,自然晾干。
4)SERS 检测:用移液器将混合好的金纳米粒子-血清球蛋白复合物移至一纯铝载物片上,自然晾干,利用共焦拉曼光谱仪检测样品以获得血清球蛋白的表面增强拉曼光谱。检测样品时采用的激光波长为785nm,功率为0.1mW,取谱范围为450 cm-1-1750 cm-1,A组血液样品中血清球蛋白表面增强拉曼光谱如图5所示。B组血液样品中血清球蛋白SERS图谱的获得同以上各步操作,不同之处为样品更换为B组血液样品。
PCA分析同实施例1。
实施例3
尿液的表面增强拉曼光谱检测
1)银溶胶的制备:柠檬酸钠还原方法制备银溶胶,取10 mg的硝酸银溶于50 ml去离子水中,加热至100℃使之沸腾,然后将1 ml浓度为2%的柠橄酸三钠逐滴加入,并快速搅拌,滴加完后继续保持沸腾6小时。待此银溶胶自然冷却后,用离心机离心分层,将上层清液丢弃,取下层浓缩的银溶胶在室温下避光密封存放备用。
2)醋酸纤维薄膜电泳:将不同尿液样品分成A组与B组,两组血液样品同时进行如下操作:尿液样品通过点样器在一条醋酸纤维薄膜膜条上点样,经点样的醋酸纤维薄膜膜条贴在电泳槽两侧支持架上的滤纸上进行电泳,电泳槽电压为21V/cm,电泳时间40 min。电泳完毕后将醋酸纤维薄膜膜条取下, 置银染色液中染色4min,然后取出后移置蒸馏水中漂洗直至背景色脱净,漂洗后膜条取出置于滤纸上晾干。此时可见染色后的醋酸纤维薄膜膜条显示3条蛋白区带,如图6所示。 将3条蛋白区带剪下并收集于1.5ml试管内。
3)尿液蛋白银纳米粒子混合液制备:往装有尿液蛋白区带的醋酸纤维薄膜膜条试管内加入180μl冰醋酸。室温下搅拌直至膜条充分溶解,溶液呈透明胶状。在42℃水浴环境下,往试管中加入已预制备用的银溶胶220μl,充分搅拌直至膜条成絮状析出,停止搅拌,继续42℃水浴30分钟后,静置分层,上层水相为尿液蛋白银纳米粒子混合液。用移液器将所述混合液移至一纯铝载物片上,自然晾干。
4)SERS 检测:用移液器将混合好的银纳米粒子-尿液蛋白混合液移至一纯铝载物片上,自然晾干,利用共焦拉曼光谱仪检测样品以获得尿液蛋白的表面增强拉曼光谱。检测样品时采用的激光波长为785nm,功率为0.13mW,取谱范围为425 cm-1-1780 cm-1,A组尿液样品中尿液蛋白表面增强拉曼光谱如图7所示。B组尿液样品中尿液蛋白SERS图谱的获得同以上各步操作,不同之处为样品更换为对照尿液。
PCA分析同实施例1。
Claims (6)
1.一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法,包括:
a)处理体液样品为上层水相和下层固相;b)上层水相等分为两份样品,所述两份样品同时进行膜电泳;c)膜电泳结束后,所述两份样品分离出的蛋白质、DNA或RNA样品,取其中一份进行染色,用于对比识别另一未染色样品在膜电泳介质上的所在确定位置;d)未染色样品在所述确定位置连同膜电泳介质一起切下;e)将切下的所述未染色样品在室温下与冰醋酸接触,充分搅拌直至形成透明胶体,此时加入拉曼光谱增强基质,并在25~65 ℃进行孵育并搅匀,待固相杂质析出后,停止搅拌继续孵育10~40分钟后静置分层,上层为体液样品与拉曼光谱增强基质混合液,取所述混合液进行表面增强拉曼光谱检测;f)不同人体液样品重复以上步骤a)—e)建立表面增强拉曼光谱数据库;g)采用主成分分析方法对所述表面增强拉曼光谱数据库进行聚类分析,建立表面增强拉曼光谱分析模型,获得不同人体液样品对应的散射点分布图。
2.根据权利要求1的所述的一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法,其特征在于:所述体液为血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊髓液、尿液、唾液、泪液、汗液、细胞提取物、组织匀浆、阴道分泌液或精液。
3.根据权利要求1所述的一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法,其特征在于:所述染色方法为氨基黑10B染色方法、考马斯亮蓝染色方法或银染色方法。
4.根据权利要求1所述的一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法,其特征在于:所述拉曼光谱增强基质为银溶胶或金溶胶,所述混合液为蛋白质银溶胶混合液或蛋白质金溶胶混合液。
5.根据权利要求1 所述的一种体液表面增强拉曼光谱检测方法,其特征在于:所述膜电泳方法使用的介质为醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚偏二氟乙烯膜。
6.根据权利要求1所述的一种体液表面增强拉曼光谱的检测方法,其特征在于:步骤e)所述表面增强拉曼光谱检测采用的激光光源波长范围为400-850nm,所述拉曼光谱的取谱范围为400-4000cm-1。
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