CN101798573B - 全基因合成犬α干扰素基因及蛋白表达 - Google Patents
全基因合成犬α干扰素基因及蛋白表达 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及利用全基因合成技术获得犬α干扰素基因及进行干扰素蛋白的原核表达，属于生物制药领域。包括对犬α干扰素基因序列进行密码子的改造并全基因合成此序列，含犬α干扰素基因的原核表达载体的构建，用所述含犬α干扰素基因的原核表达载体转化大肠杆菌及诱导表达，蛋白提取及变性复性，及抗病毒活性的研究。试验所得干扰素能抵抗水疱性口炎病毒的攻击，比活性达到1.67×107U/mg。该方法生产干扰素工艺简单，表达量高，生物活性高。
Description
一技术领域
本发明属于基因工程生物制药领域，涉及利用全基因合成技术获得犬α干扰素基因及其干扰素蛋白的原核表达。
二背景技术
近年来，养犬业在我国发展迅速，犬的种类和数量也越来越多，不论是作为伴侣动物还是凶猛灵敏的警用犬，都对现代社会起着不可或缺的作用，而病毒病如犬细小病毒病、犬瘟热、犬冠状病毒病等都严重危害着犬的健康和生存，病毒病的预防和治疗显得尤为重要。干扰素系统是机体对抗病毒感染的重要防御系统，当干扰素系统被激活后，血清干扰素可以在几分钟之内扩散到身体各器官，而细胞接触干扰素只需几分钟就可产生抗病毒状态，而且，动物可以在一到三周内对其他病毒的重复感染有抵抗作用。根据干扰素的氨基酸序列、抗原性和细胞来源的不同可将其分为2个型：I型干扰素的主要成员为α干扰素和β干扰素，II型干扰素为γ干扰素。而其中α干扰素(IFN-α)以其突出的抗病毒作用而备受人们重视。
由诱生剂诱导产生的天然犬IFN-α，因来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多原因而价格昂贵，极大的限制了临床和科研的应用，而利用基因工程技术选择一个合适的系统，使其得到高效表达，生产具有廉价、广谱抗病毒活性、无毒害、无残留等优点的干扰素已经无疑是促使干扰素在兽医临床上推广应用的有效途径。
三发明内容
本发明的目的之一在于对犬α干扰素基因序列进行密码子改造后，通过全基因合成技术合成此序列并构建高效表达载体，实现干扰素在大肠杆菌的高表达，获得具有抗病毒活性的犬α干扰素蛋白。
本发明的另一目的是提供一种通过全基因合成技术合成的经过改造的核酸，其特征在于：所述核酸包含编码犬α干扰素的阅读框，并且在该阅读框内全部采用大肠杆菌偏爱的密码子。
优选的，上述阅读框的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一目的是提供一种含有上述核酸的重组载体。
本发明的另一目的是提供一种含有上述重组载体的大肠杆菌。
本发明还提供一种在原核表达系统中提高犬α干扰素表达量的方法，其包含如下步骤：(1)在不改变犬α干扰素氨基酸序列的基础上设计其编码核酸序列，使阅读框内的每个密码子都采用大肠杆菌偏爱的密码子；(2)人工合成步骤(1)中设计的编码核酸；(3)将步骤(2)合成的核酸插入适当的表达载体，构建重组表达载体；(4)将步骤(3)构建的重组表达载体转化适当的大肠杆菌进行诱导表达。
本发明的技术方案如下：
(一)犬α干扰素基因的合成
(1)登录GeneBank，查找编码犬α干扰素成熟蛋白的基因序列；
(2)利用SignalP 3.0Server软件预测此基因序列有无信号肽及其位置；
(3)利用TargetP 1.1Server软件检测此信号肽的功能；
(4)将犬α干扰素的编码密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，将犬α干扰素密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子；
(5)将替换后的序列5′、3′端分别加上EcoRI、XhoI酶切位点，送生物公司进行全基因合成；
(二)犬α干扰素的原核表达
(1)重组质粒pET32a-CaIFN-α转化大肠杆菌BL21(DE3)；
(2)阳性重组菌诱导表达，最佳诱导时间的确定及表达蛋白可溶性鉴定；
(3)重组阳性菌稳定性检测；
(三)重组犬α干扰素的提取
(1)菌体破碎；
(2)包涵体洗涤；
(3)包涵体变性；
(4)目的蛋白透析复性及蛋白浓度测定；
(四)重组犬α干扰素抗病毒活性测定
利用微量病变抑制法测定干扰素活性
(1)培养MDCK细胞；
(2)接种96孔细胞板；
(3)滤泡性口炎病毒(VSV)对MDCK半数致死量的测定；
(4)干扰素抗VSV活性测定，将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位。
四附图说明
图1是重组犬α干扰素蛋白表达SDS-PAGE电泳图
泳道1：诱导表达前；
泳道2-7：诱导表达1，2，3，4，5，6小时；
泳道7：蛋白质分子量标准(Marker)。
重组菌经诱导表达后在分子量32kD处有增加的蛋白表达条带，与预期的蛋白分子量一致(干扰素分子量18.0kD，加上载体本身的融合标签14.3kD)，且在6小时时表达量最高，所以选用的最佳诱导时间为6小时。
图2是重组犬α干扰素蛋白可溶性鉴定图
泳道1：蛋白质分子量标准(Marker)；
泳道2：菌体破碎后上清；
泳道3：菌体破碎后沉淀。
电泳结果显示目的蛋白为包涵体形式表达。
图3是目的蛋白纯化效果SDS-PAGE电泳图
泳道1：蛋白质分子量标准(Marker)；
泳道2：纯化后的目的蛋白。
五具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明进行进一步的描述。
实施例1犬α干扰素基因的合成
登录GeneBank，查找编码犬α干扰素成熟蛋白的基因序列(序列号为M28625)，利用SignalP 3.0Server软件预测此基因可能含有一段信号肽序列，为其氨基酸序列的前30个氨基酸，利用TargetP 1.1Server软件检测此序列功能，发现其为帮助蛋白分泌的信号肽而非蛋白结构所必需，由于犬α干扰素为真核生物干扰素，但后续研究需要在原核生物中进行表达，真核生物的信号肽在原核生物细胞环境中由于缺少相应的受体而不能发挥作用，所以我们去掉信号肽序列，剩下编码成熟犬α干扰素的基因序列，其核苷酸长度为495bp；将犬α干扰素的编码密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列顺序的基础上，对已知的编码犬α干扰素的基因序列进行改造，替换为大肠杆菌喜好的密码子，旨在提高基因在大肠杆菌的表达水平；
然后将替换后的序列5′、3′端分别加上EcoRI、XhoI酶切位点，送上海英骏生物公司进行全基因合成，并连入原核表达质粒pET32a中，得到重组原核表达质粒pET32a-CaIFN-α；
实施例2犬α干扰素蛋白的原核表达
1将测序正确的重组质粒pET32a-CaIFN-α转入BL21(DE3)，挑取单菌落进行双酶切鉴定；
2阳性重组菌的诱导表达
挑取含有重组阳性质粒的单菌落，接种到含有浓度为100mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。按1％的比例将过夜培养的菌液接种于Amp+/LB液体培养基中，培养3h至菌液光密度值达0.4-0.6，立即加入IPTG至工作浓度达1mM，继续培养5h，每1h取1ml菌液，进行SDS-PAGE电泳，以确定最佳诱导时间；
3大肠杆菌表达的犬α干扰素的可溶性鉴定
取经IPTG诱导的菌液，4℃，12000rpm，离心10min后收集菌体，弃上清，沉淀经PBS洗涤三次后超声波破碎，超声条件为功率400w，工作5秒，间隔10秒反复80次。离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，以鉴定目的蛋白的可溶性；
4重组阳性菌稳定性检测
挑取含有重组阳性质粒的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养，每12小时以1％转接一次，传代过程中均不添加氨苄青霉素，连续传代25次，然后取每一代培养的菌液进行IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳观察表达情况；
实施例3重组犬α干扰素的提取
1菌体破碎
离心收集诱导后的菌体，PBS洗涤三次，超声破碎细胞，涂片镜检，观察破碎效果，弃上清，得到粗制的包涵体；
2包涵体的洗涤
用含2M脲的包涵体洗涤液充分洗涤包涵体，4℃，12000rpm，离心15min，弃上清；
3包涵体的变性
用含8M脲的包涵体溶解液重悬沉淀，并30℃水浴使包涵体充分溶解变性，离心取上清，即得变性蛋白液；
4目的蛋白透析复性
将变性蛋白液加入到透析袋中，分别放入含4M、2M、1M、0.75M、0M脲的PBS溶液中进行透析，每个浓度4℃搅拌透析4h，所得蛋白液离心，上清用直径0.22μm滤膜过滤除菌及杂质，即得到本发明重组犬α干扰素基因的表达蛋白，进行SDS-PAGE电泳检验纯化结果，用Broadford法测定蛋白浓度；
实施例4重组犬α干扰素抗病毒活性测定
采用微量细胞病变抑制法
MDCK接种96孔板，待长成单层后弃去生长液，加入10倍倍比稀释的重组犬α干扰素，每个稀释度做8个重复，培养24小时后弃上清，用10TCID50的水疱性口炎病毒(VSV)进行攻毒，同时设立阴性对照(只加10倍稀释的干扰素，不加病毒)，阳性对照(只加病毒，不加干扰素)，空白对照(不加干扰素，不加病毒)，倒置显微镜下逐日观察细胞病变，待阳性对照孔出现75％病变时判定结果。
实验结果表明：(1)阴性对照孔中的细胞未产生任何病变，说明本发明得到的干扰素本身对细胞没有毒害作用；(2)经104倍稀释的干扰素能100％抑制细胞病变，而107倍稀释的干扰素有4个孔出现细胞病变，由上述结果得出犬α干扰素抗VSV活性为1.06×107U/mL，比活性为1.67×107U/mg。
序列表
<110>南京农业大学
<120>全基因合成犬α干扰素基因及蛋白表达
<160>1
<210>1
<211>495
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>重组犬α干扰素成熟蛋白的基因序列
<222>(1)…(495)
<223>
<400>1
tgccacctgc cggacaccca cggcctgcgc aactggcgtg tcctgacgct gctgggtcag 60
atgcgtcgtc tgtccgccgg ctcttgtgac cactacacca atgactttgc cttcccgaag 120
gagctgtttg atggccagcg tctgcaggag gcgcaggccc tgtctgtggt ccacgtgatg 180
acccagaagg tcttccacct gttctgcccg gacacgtcct ctgctccttg gaacatgact 240
ctgctggagg aactgtgctc tggtctgtct gagcagctgg atgacctgga ggcctgtccg 300
ctgcaggagg cgggtctggc cgagaccccg ctgatgcatg aggactccac cctgcgtacc 360
tacttccaac gtatctccct gtacctgcaa gaccgtaacc acagcccgtg tgcctgggag 420
atggtccgtg cagaaatcgg tcgttccttc ttctcctcta ccatcctgca agaacgtatc 480
cgtcgtcgta aatga 495
Claims (3)
1.一种通过全基因合成技术合成的经过改造的核酸，其特征在于：所述核酸为编码犬α干扰素的阅读框，并且在该阅读框内全部采用大肠杆菌偏爱的密码子，所述阅读框的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有如权利要求1所述核酸的重组载体。
3.一种含有如权利要求2所述重组载体的大肠杆菌。
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