具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号“%”,若未特别说明,是指质量百分比;但溶液的百分比,除另有规定外,是指溶液100ml中含有溶质若干克;液体之间的百分比,是指在20℃时容量的比例。
对羟基肉桂酸购自湖北武汉远成科技有限公司。
实施例1
本发明对羟基肉桂酸含量:对羟基肉桂酸25mg/ml。其制备过程如下:
按上述重量份称重,用30%无水乙醇充分溶解后,加入20%吐温-20以及50%水,混合均匀,分装入瓶,得口服液制剂。
实施例2
本发明对羟基肉桂酸含量:对羟基肉桂酸20mg/ml。其制备过程如下:
按上述重量份称重,用30%无水乙醇充分溶解后,加入20%吐温-20以及50%水,混合均匀,分装入瓶,得口服液制剂。
实施例3
本发明对羟基肉桂酸含量:对羟基肉桂酸35mg/ml。其制备过程如下:
按上述重量份称重,用30%无水乙醇充分溶解后,加入20%吐温-20以及50%水,混合均匀,分装入瓶,得口服液制剂。
实施例4
本发明对羟基肉桂酸含量:对羟基肉桂酸40mg/ml。其制备过程如下:
按上述重量份称重,用30%无水乙醇充分溶解后,加入20%吐温-20以及50%水,混合均匀,分装入瓶,得口服液制剂。
实施例5
本发明对羟基肉桂酸含量:对羟基肉桂酸15mg/ml。其制备过程如下:
按上述重量份称重,用30%无水乙醇充分溶解后,加入20%吐温-20以及50%水,混合均匀,分装入瓶,得口服液制剂。
如未有特别说明,下述实验例提到的对羟基肉桂酸为实施例1所得的对羟基肉桂酸制剂。
实验例1对羟基肉桂酸对牛大肠杆菌、禽大肠杆菌体外抑菌作用试验
使用灭菌生理盐水将实施例1所制备的对羟基肉桂酸制剂配制成25mg/ml药液备用。
最小抑菌浓度(MIC)测定:通过试管倍比稀释法确定复方对肉鸡大肠杆菌分离株的最小抑菌浓度(MIC)。取10支灭菌试管,编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、细菌对照和肉汤对照。于10支试管中各加入灭菌肉汤1ml。于1#试管中加入灭菌药液1ml,混匀后,取1ml放至2#试管中,依次倍比稀释,至8#试管,弃去1ml,对照管不加药液。除肉汤对照外,其余各管均加入大肠杆菌1ml。将试管放入37℃恒温摇床上培养24h,第2天观察结果。为消除药物本身的影响,将不能完全确定的试管液体转接于营养琼脂平板培养基上,37℃培养24h。次日观察平皿中有无细菌生长。将该试验重复3次,观察其重现性及稳定性,消除偶然性。
表1对羟基肉桂酸制剂体外杀灭细菌最低有效浓度
牛大肠杆菌是引发细菌性乳腺炎的主要病原菌之一,对羟基肉桂酸制剂对牛大肠杆菌的最小抑菌浓度为15mg/ml,提示对羟基肉桂酸对治疗牛细菌性乳房炎有潜在的应用价值;而对羟基肉桂酸对禽大肠杆菌的最小抑浓度为0.8mg/ml,为研究对羟基肉桂酸抗菌活性,进一步以体内试验验证。
实验例2.对羟基肉桂酸对鸡大肠杆菌病的治疗试验
将21日龄海兰褐鸡随机分为6组,分别为对羟基肉桂酸组高、中、低剂量组、利好(20%复方磺胺间甲氧嘧啶钠可溶性粉,四川拜耳动物保健有限公司生产,批号2008102409)阳性对照组、阴性对照组,空白对照组。腹腔注射大肠杆菌临床分离株(半数致死量为4×108CFU),0.5ml/只,攻毒后12小时给药,按下表2所示口服灌胃。连续给药7天,分上、下午两次给药,停药观察3天后剖检。
表2试验分组及给药情况.
观察指标:
死亡率:凡在试验期间,出现大肠杆菌病症状并死亡,剖检后气囊、肝脏、心脏有典型病变特征,病料能分离出大肠杆菌的,判断为感染死亡,计算死亡率。
相对增重率:根据试验开始及结束时每只鸡的体重,计算增重及每组鸡的平均增重,并以健康对照组增重为100%,各组增重与之相比得到各组相对增重率。
实验结束后剖检存活鸡,观察心包炎、肝周炎等情况,并取肝脏,无菌取材后分离培养细菌,统计肝脏大肠杆菌检出率情况。
实验结果如下:表3。
表3对肉鸡生产性能的影响
注:相对增重率:根据试验开始及结束时每只鸡的体重,计算增重及每组鸡的平均增重,并以空白对照组增重为100%,各组增重与之相比得到各组相对增重率。A-B同一列中字母标识不同为差异显著(P<0.05);A-C同一列中字母标识不同为差异极显著(P<0.01)。
在成活率方面,对羟基肉桂酸高、中、低剂量组分别为70.0%,80.0%和60.0%,而利好对照组达到80%,统计分析发现肉桂酸中剂量组、高剂量和利好对照组差异不显著。
在相对增重率,对羟基肉桂酸高、中和低剂量组分别为88.8%,95.9%,66.7%,相反利好对照组为88.3%,经过显著性分析,中剂量组与利好对照组差异显著(P<0.05)。
实验例3对羟基肉桂酸预防鸡传染性法氏囊病及药物量效关系试验
选择21日龄海蓝褐雏鸡,将实施例3、1、5所得的对羟基肉桂酸组(35毫克/公斤体重)、对羟基肉桂酸组(25毫克/公斤体重)、对羟基肉桂酸组(15毫克/公斤体重)、高免卵黄抗体(购自洛阳普莱柯生物工程有限公司,批号080324)对照组、病毒稀释液组(阳性对照组)、空白对照组(阴性对照组),每组8只,共48只鸡,分组情况如表2所示。以IBDV LX株为攻毒株,100ID50/0.2ml通过点眼、滴鼻途径。除空白对照组外,其它各组均攻毒,每只鸡点眼0.2ml,给药三天后攻毒。用药组连续给药7天,每天分两次给药,高免卵黄抗体对照组:0.5ml/只鸡肌肉注射,连续两天;给完药后观察2天剖检。试验期间观察试验组和对照组的精神状态、采食量、腹泻情况,鸡只的死亡数量等。剖检重点观察法氏囊的病变情况,是否肿大或萎缩、出血、表面是否有胶冻样渗出物。观察胸肌和腿肌病变指数是否出血、出血程度,测定病变指数,结果如下表4-表8所示。
表4预防试验鸡的分组及处理
表5对羟基肉桂酸预防法氏囊感染中体重变化情况
从体重变化来看,对羟基肉桂酸三组相对增重率呈现规律性变化,高、中、低剂量分别为56.651%、56.65%和47.78%,高、中剂量组与低剂量组相比,差异显著,与感染对照组差异及显著。
表6对羟基肉桂酸预防法氏囊试验结果
感染对照组、高免卵黄抗体组的存活率为50.5%、100%。对羟基肉桂酸各个剂量组存活率分别为81.8%,62.5%和42.86%,呈一定的规律性变化。
表7各个脏器病变积分情况
法氏囊病变积分:法氏囊出血、渗出合计总分与该组试验动物数之比;胸腿肌病变积分:胸腿肌肉出血合计总分与该组试验动物数之比;
肾脏病变积分:病变合计总分与该组试验动物数之比;病变合计总分与该组试验动物数之比;病变积分减少率:(感染对照组病变积分-试验组病变积分)/感染对照组病变积分
注:法氏囊病变指数测定如下:严重出血4分;中度3分;轻度1分;胸肌和腿肌病变指数:严重出血3分/侧,中度出血2分/侧,轻度出血1分/侧
从剖检情况看,对羟基肉桂酸中剂量组的病变积分减少率高达90%,高、低剂量组均为70%,三个剂量组的病变减少率均显著性高于高免卵黄抗体组40%,由此可以判定对羟基肉桂酸对于鸡传染性法氏囊病具有较好的预防效果。
表8预防实验的免疫器官指数测定
通过上表比较免疫器官指数可知:对羟基肉桂酸各个剂量组法氏囊指数均低于感染对照组,而脾脏指数均高于高免卵黄抗体组,这表明药物对鸡细胞免疫和体液免疫系统功能的提高具有积极的作用。
综上所述,对羟基肉桂酸对于预防家禽传染性法氏囊病具有提高增重率、减少发病率以及提高机体免疫力的功效。
实验例4对羟基肉桂酸治疗鸡传染性法氏囊病及药物量效关系试验
选择21日龄海蓝褐雏鸡,将实施例3、1、5所得的对羟基肉桂酸组(35毫克/公斤体重)、对羟基肉桂酸组(25毫克/公斤体重)、对羟基肉桂酸组(15毫克/公斤体重)、黄芪多糖(购自河北瑞高动物药业有限公司批号09100701)对照组(250毫克/公斤体重)、病毒稀释液组(阳性对照组)、空白对照组(阴性对照组),每组8只,共48只鸡,分组情况如表9所示。以IBDV LX株攻毒株,100ID50/0.2ml通过点眼、滴鼻途径。除空白对照组外,其它各组均攻毒,每只鸡点眼、滴鼻0.2ml,攻毒后给药。用药组连续给药5天,每天分两次给药,给完药后观察2天剖检。试验期间观察试验组和对照组的精神状态、采食量、腹泻情况,鸡只的死亡数量等。剖检重点观察法氏囊的病变情况,是否肿大或萎缩、出血、表面是否有胶冻样渗出物。观察胸肌和腿肌病变指数是否出血、出血程度,测定病变指数,结果如下表所示。
表9治疗试验鸡的分组及处理
表10对羟基肉桂酸治疗法氏囊感染中体重变化情况
从体重变化来看,对羟基肉桂酸三组增重呈现规律性变化,高剂量组、中、低剂量增重率分别为78.4%,72.0%和71.2%。黄芪多糖对照组为80.6%.80(表10)。
表11对羟基肉桂酸治疗法氏囊试验结果
感染对照组、黄芪多糖组的存活率为40.0%和70.0%。对羟基肉桂酸各个剂量组分别为90.0%,80.0%和60.0%,呈一定的规律性变化,与黄芪多糖对照组相比,高剂量组差异显著(P<0.05),中剂量组和低剂量组差异不显著(表11)。
表12各个脏器病变积分情况
注:法氏囊病变积分:法氏囊出血、渗出合计总分与该组试验动物数之比;胸腿肌病变积分:胸腿肌肉出血合计总分与该组试验动物数之比;
病变积分减少率:(感染对照组病变积分-试验组病变积分)/感染对照组病变积分。
注:法氏囊病变指数测定如下:严重出血4分;中度3分;轻度1分;胸肌和腿肌病变指数:严重出血3分/侧,中度出血2分/侧,轻度出血1分/侧。
从剖检情况看,对羟基肉桂酸高、中剂量组的病变积分减少率高达87.5%,均高于黄芪多糖组50%,且差异显著(P<0.05)。由此可以判定对羟基肉桂酸对于鸡传染性法氏囊病具有较好的保护效果。
表13免疫器官指数
A-B同一列中字母标识不同为差异显著(P<0.05);A-C同一列中字母标识不同为差异极显著(P<0.01)。
通过上表比较免疫器官指数可知:对羟基肉桂酸各个剂量组法氏囊指数均低于感染对照组,而脾脏指数也低于感染对照组和黄芪多糖对照组(表13),这表明药物对鸡细胞免疫和体液免疫系统功能的提高具有积极的作用。
综上所述,对羟基肉桂酸对于治疗家禽传染性法氏囊病具有提高增重率、减少发病率以及提高机体免疫力的功效。
实验例5对羟基肉桂酸治疗鸡毒支原体病试验
1实验方法
1日龄AA肉鸡用于本试验,正常饲养条件下饲养,7日龄时攻毒鸡毒支原体HS株。使用24h能在液体培养基中达到对数生长高峰期(测定培养物含菌浓度约为108CCU/ml)的3代HS株培养物,经点眼、滴鼻和气管注射接种于7日龄健康的AA型肉鸡,0.5ml/只,16d后当鸡群约有半数发病后,开始投药,各组鸡分别按表6所示给药(实施例1所得复方柠檬酸粉剂),分上午、下午两次给药,连续5d,停药后继续观察30d,在实验过程中,随时记录各组鸡的临床表现与发病、死亡情况;对病死鸡进行剖检,观察其病理变化,取鼻、气管分泌物、肺和气囊等组织进行支原体分离培养,同时进行血清平板凝集试验以确定死亡原因;对未死亡鸡采血,分离血清,用平板凝集试验检测抗鸡毒支原体抗体。
2疗效评价指标
(1)感染率:计算用药和未用药出现临床症状数量占实验鸡数量。
(2)平均增重 根据试验初和试验结束时各组鸡的体重,计算每组试验鸡的平均增重。
(3)气囊损伤减少率 试验结束时,各组随机抽取鸡5只,剖检观察气囊、肺、肝、心等主要器官病理变化,并对气囊的损伤程度进行分级评分。
按H.W.Yoder将气囊病理损伤划分5级。
0级:气囊正常,薄而透明,记0分。
1级:气囊仅有稍增厚的灰色区或黄色渗出斑点,记2分。
2级:部分气囊易见到灰色至黄色渗出,有时出现泡沫,气囊增厚,记4分。
3级:大部分气囊增厚,布满大量黄白色干酪样渗出物,记6分。
4级:几乎整个气囊布满黄白色干酪样渗出物,气囊严重增厚,记8分。
鸡气囊平均病理损伤计分=所有鸡气囊损伤度总和/被检鸡数。
根据气囊损伤记分结果计算气囊损伤减少百分率。
气囊损伤减少百分率=(感染对照组每只鸡气囊损伤平均分-试验组每只鸡气囊损伤平均分)/感染对照组每只鸡气囊损伤平均分。
表14治疗试验分组及处理
3试验结果
在发病率方面,对羟基肉桂酸高、中剂量、低剂量组发病率分别为10%、10%、20%,泰乐菌素组发病率为40%。在成活率方面,对羟基肉桂酸三组分别为100%、100%和90%。对羟基肉桂酸高、中、低剂量组给药后感染肉鸡的体重变化见表15。相对增重率分别为84.5%,75.6%和77.8%,其中高剂量组显著性高于泰乐菌素对照组,极显著性高于感染对照组。这显示对羟基肉桂酸可以增加肉鸡的体重,对肉鸡生长有利。
表15对羟基肉桂酸对肉鸡体重的影响
表16对羟基肉桂酸对肉鸡气囊损伤的影响
注:气囊损伤分=(胸气囊损伤分+腹腔气囊损伤分)/剖检鸡只数量;气囊损伤减少率=(感染对照组-试验组气囊损伤积分)/感染对照组气囊损伤积。
A-B同一列中字母标识不同为差异显著(P<0.05);A-C同一列中字母标识不同为差异极显著(P<0.01)。
表16结果显示,对羟基肉桂酸三个剂量组气囊损伤减少率分别为78.27%,88.22%和91.62%,而泰乐菌素对照组为74.35%。对羟基肉桂酸中、高剂量组显著性低于泰乐菌素对照组。
实验例5对羟基肉桂酸治疗禽流感H9亚型病毒感染的疗效观察
一、实验动物及实验分组情况:
1.1实验动物:临床30日龄发病肉鸡,发病时间已经达到12天。主要表现呼噜、流眼泪、咳嗽、精神不振、食欲不佳,有死亡现象发生,经剖检、血清学诊断该鸡群为由禽流感H9亚型感染引起的呼吸道病。
1.2受试药物为实施例4所述对羟基肉桂酸口服液,大群用黄芪多糖(河北安国瑞高药业有限公司生产,批号20080803)为药物对照。试验采用饮水给药,在发病鸡群,连续使用5天,分组及用药方法如下表17所示。
表17实验分组及给药剂量
二、试验方法及观察指标
药物饮水连用5天。每天观察受试动物的精神、采食、饮水、粪便、呼吸情况和死亡情况,并记录。用药完毕后再观察10天,并做如下疗效指标评价:
计算死亡率、相对增重率(根据试验开始及结束时每只鸡的体重,计算增重及每组鸡的平均增重,并以不用药对照组增重为100%,各组增重与之相比得到各组相对增重率)。
三、试验结果
观察试验组鸡群,对羟基肉桂酸鸡群精神较大群好,但依然存在流泪、呼吸困难等症状,试验结束后剖检试验药物组肉鸡发现:与大群对照组病鸡相比,对羟基肉桂酸病鸡气管出血症状减轻,但依然存在较多黄色粘液,肺脏边缘有轻微渗,肾脏轻微肿胀;而大群剖检病鸡发现气管出血严重,存在较多黄色粘液,部分一形成黄色干络样物质堵塞物,肺脏除边缘有轻微渗外,出血严重(约占4/5面积),肾脏肿胀明显。
表18对羟基肉桂酸对成活率、增重的影响
注:A-B同一列中字母标识不同为差异显著(P<0.05);
相对增重率=实验组增重/不用药对照组增重×100%。
试验各组增重及成活率情况如表18所示:对羟基肉桂酸在增重率上表现量效关系,高剂量组相对增重率达到165%,成活率为99.53%;中剂量组增重率和成活率分别为162.5%和99.3%;低剂量组增重率和成活率分别为142.5%和98.66%,显著高于黄芪多糖对照组(135.0%和94.66%)。在成活率方面,高剂量组、中剂量组显著性高于不用药对照组(P<0.05),与黄芪多糖对照组差异不显著。在相对增重方面,高、中剂量组则显著性高于黄芪多糖对照组(P<0.05)。
综上可知,对羟基肉桂酸在治疗家禽临床发生的禽流感H9亚型引起的呼吸道病上能有助于降低死亡率,提高成活率、增加肉鸡生长,表现较好疗效,有良好的应用价值。
实验例6对羟基肉桂酸治疗小鼠禽流感病毒感染的疗效观察
一、实验动物及实验分组情况:
1.1实验动物:18-22克SPF级BALB/C小鼠,雌雄各半,饲养在生物安全3级实验室的负压隔离器中,饲料和饮水经过高压灭菌。
1.2攻毒用毒株:禽流感河北分离株(A/Chicken/Hebei/102/2005),经过小鼠半数致死亡量(LD50)测定为10-4.33/0.1mL。攻毒0.1mL/只,滴鼻。
1.3受试药物:为实施例4所述对羟基肉桂酸口服液,共分三个浓度(100mg/kg体重、50mg/kg体重和25mg/kg体重),对照组药物金刚烷胺,15mg/kg体重(A Hohnson Matthey Company,美国,Lot10118375,分析纯为99%)作为药物对照。攻毒后12小时后,试验小鼠采用灌胃口服给药,在连续使用5天,分组及用药方法如下表19所示。
表19实验分组及给药剂量
二、试验方法及观察指标
攻毒后,灌胃连用5天,每天观察小鼠精神、采食、饮水、粪便、呼吸情况和死亡情况,并记录。用药完毕后再观察5天,并做如下疗效指标评价:
计算死亡率、相对增重率(根据试验开始及结束时每只鼠体重,计算增重及每组平均增重)。
肺脏指数(肺脏重量/体重)和肺脏指数抑制率(感染对照组-试验组肺脏指数/感染对照组肺脏指数x100)。
肺脏出血面积:肺脏出血面积指数=双侧肺脏出血面积投影/肺脏面积x100;肺脏出血抑制率=感染对照组出血面积-试验组肺脏出血面积/感染对照组出血面积x100。
三、试验结果
1相对增重率和成活率的影响:
结果见表20和21。试验组药物口服后相对增重率分别为95.04%,91.18%和77.03%,感染对照组为45.84%,经过统计学分析差异显著。成活率分别为87.5%,87.5%和75%,金刚烷胺组和感染对照组分别为37.5%和37.5%,经过统计分析,测试药物高、中剂量组与金刚烷胺对照组相比差异极显著(P<0.01)。
表20口服药物后对小鼠体重的影响
注:A-B,B-C同一列中字母标识不同为差异显著(P<0.05);A-C同一列中字母标识不同为差异显著(P<0.01)(下同);
相对增重率=实验组增重/健康对照组增重×100%。
表21小鼠死亡率、存活率
2对小鼠相关病变指数的影响:
结果见表22和23。测试药物高、中、低三个剂量组肺脏指数抑制率分别为49.0%、31.52%和10.41%,金刚烷胺对照组为41.39%,统计分析表明高剂量组、中剂量组与金刚烷胺对照组差异不显著,但低剂量组差异显著(P<0.05)。从肺脏出血面积指标来看,测试药物出血抑制率分别为67.38%,53.84%和35.38%,金刚烷胺对照组为62.31%,统计检验结果与肺脏指数抑制率相同。
表22小鼠的肺脏指数变化
表23小鼠的肺脏出血情况
以上结果显示对羟基肉桂酸在治疗禽流感感染小鼠试验中,按100mg/kg体重、50mg/kg体重口服可以显著降低人工感染引起的死亡率,效果优于金刚胺胺对照组;在减少病变上,其效果与金刚烷胺对照组差异不显著,提示测试药物在治疗禽流感引起的感染中有良好的应用价值。