CN101778947B

CN101778947B - 营养组合物

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Publication number: CN101778947B
Application number: CN200880103192.1A
Authority: CN
Inventors: 里特瓦·尼玛拉; 朱哈尼·沙里宁; 贾里·何琳; 加尼卡·瓦基宁
Original assignee: Suomen Rehu Oy; Glykos Finland Ltd
Current assignee: Suomen Rehu Oy; Glykos Finland Ltd
Priority date: 2007-06-13
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2028-06-13
Also published as: US20100184150A1; MY149912A; EA200901616A1; EP2167674A4; DK2167674T3; IL202656A0; BRPI0811686A2; CA2692251C; BRPI0811686B1; BRPI0811686B8; JP2010529980A; WO2008152207A1; EP2167674B1; EP2167674A1; CA2692251A1; TR201807799T4; PL2167674T3; CN101778947A; EA024620B1; MX2009013489A

Abstract

本发明涉及分离自酵母培养物的新的糖类组合物。本发明还涉及具有增强的水溶性的基于酵母细胞的糖类组合物。本发明中公开的糖类组合物可用作营养添加剂或药物添加剂或作为营养组合物或药物组合物的一部分，以便促进施用所述组合物的动物或人类受治疗者的健康。本发明还涉及产生所述糖类组合物的方法。

Description

营养组合物

发明背景

Progut^TM是基于全酵母的动物饲料成分，用于保持动物良好的肠道健康、改善其生长和在大多数胃肠问题中替代抗生素(参见US20020061345)。Progut^TM产生于全啤酒酵母(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，因此其含有酵母细胞壁颗粒(主要是甘露糖蛋白和β-葡聚糖)和内部的细胞核苷酸。所有这些组分显示对Progut^TM的活性是重要的。

本发明揭示了特别是用优化的强酸水解或酶促水解条件或令人惊讶地有效的其组合产生的新的progut型产物，以便获得新的具有生物活性和高度可溶的产物。据观察，需要令人惊讶地强酸处理条件(包括非常高的酸浓度，包括约0.5M至约1M酸)和/或范围在75-100℃的高反应温度来获得增强的溶解作用和获得高生物活性的低分子量多糖和寡糖。条件是剧烈的，并揭示了酵母材料对水解的高抗性，然而存在条件的优化，以便高温下增加酸至2M造成细胞壁材料更低效的溶解作用和/或由接近完全水解的水解造成的增加量的游离单糖。

包括高甘露糖寡糖和低淀粉寡糖含量及高Glcβ-糖含量的独特化学特性与新的糖类级分的高生物活性相关。这些明显不同于之前的产物和竞争产物。产生大量有效的甘露糖寡糖和Glcβ-糖类至相同制品的优化水解条件是新颖而有创意的，特别当糖类产生至相同制品并来自包括未经主要水解或提取化学处理(诸如衍生自发酵的酵母，诸如酿酒过程衍生的酵母)的天然酵母的酵母原材料。

应理解，背景中酵母材料的酸处理主要是在适度pH范围用低酸浓度的温和处理，并且反应温度一般与碱处理一起使用来获得主要不可溶的细胞壁制品(称为葡聚糖)。不存在葡聚糖制品酸衍生的β6的证据。

本发明中分析了一套旧的和新的Progut^TM样品以及来自选择的相关产物的样品。主要通过凝胶渗透色谱进行分析，但是该过程使用此处通过凝胶渗透色谱分离的可溶性组分的NMR分析。

本研究的另一个目的是产生具有增强的可溶性而不丧失其活性的新的Progut^TM。这可通过酶促地、机械地或通过酸水解来降解甘露糖蛋白和/或β-葡聚糖而实现。

附图简述

图1.Progut型产物(PG)和相关样品中可溶性组分的量。

PG1-PG9，Progut型产物样品；相关样品：C1，Agrimos；C2，Ascogen；C3，Alphamune Alpharma；C4，Bio-Mos。

图2.来自0.2％的溶液的PG1和PG2的比较。来自0.2％溶液的A.PG1和B.PG2水溶性组分的凝胶渗透色谱图(等量的样品制品)；在Superdex肽柱上(测量A₂₁₄)。

图3.来自1％的溶液的PG1和PG2的比较。来自1％溶液的A.PG1和B.PG2水溶性组分的凝胶渗透色谱图(等量的样品制品)；在Superdex肽柱上(测量A₂₁₄)。

图4.9种PG样品和相关样品的比较。来自1％溶液的A.PG1、B.PG2、C.PG3、D.PG4、E.PG5、F.PG6、G.PG7、H.PG8、I.PG9、J.C1、K.C2、L.C3、M.C4水溶性组分的凝胶渗透色谱图(等量的样品制品)；在Superdex肽柱上(测量A₂₃₀)。对于PG9，分析大约50％更少的材料。然而这通过相应地调整比例尺以便能够同等地比较结果而被补偿。

图5.5种PG样品的比较。来自1％溶液的A.PG10、B.PG11、C.PG12、D.PG13、E.PG14水溶性组分的凝胶渗透色谱图(等量的样品制品)；在Superdex肽柱上(测量A₂₃₀)。

图6.产生自啤酒酵母溶液及其均化形式的PG样品的比较。来自1％溶液的酸水解的A.啤酒酵母和B.均化的啤酒酵母水溶性组分的凝胶渗透色谱图(等量的样品制品)；在Superdex肽柱上(测量A₂₁₄)。

图7.通过用于细菌黏着测试的酶促或化学降解产生的样品的比较。来自1％溶液的A.啤酒酵母(BY)+glucanex(G)、B.均化的BY(HBY)+G、C.BY G+赛威蛋白酶(savinase)(S)、D.HBY G+S、E.BY 1M H₃PO₄、F.HBY 1M H₃PO₄、G.BY G+果胶酶(PE)、H.HBY G+PE、I.PG1PE、J.PG1+PR水溶性组分的凝胶渗透色谱图(等量的样品制品)；在Superdex肽柱上。A、B和I是制备色谱图，其中测量A₂₃₀(彼此可比较)；其他是分析色谱图，其中测量A₂₁₄(彼此可比较)。

图8.PG1、水溶性PG(PG WS)、具有乳化剂的水溶性PG(PG WS+E)和过度水解的PG的比较。来自1％溶液的A.PG1、B.PG WS、C.PG WS+E和D.PG 15h水溶性组分的凝胶渗透色谱图(等量的样品制品)；在Superdex肽柱上(测量A₂₁₄)。

图9.链霉蛋白酶对Progut-型产物样品的影响。没有(灰色柱)和具有(深灰色柱)链霉蛋白酶消化的Progut-型产物样品1和2(PG1和PG2)。

图10.链霉蛋白酶对Progut-型产物和啤酒酵母溶液的影响。没有(灰色柱)和具有(深灰色柱)链霉蛋白酶消化的Progut-型产物样品1和2(PG1和PG2)(第二次实验)。啤酒酵母(BY)首先用链霉蛋白酶然后用酸水解处理(BY1)，或者首先用酸水解然后用链霉蛋白酶处理(BY2)，深灰色柱。作为对照，BY与工艺过程一起酸水解(灰色柱)。

图11.赛威蛋白酶对Progut-型产物和啤酒酵母溶液的影响。没有(灰色柱)和具有(深灰色柱)赛威蛋白酶消化的Progut-型产物样品1和2(PG1和PG2)。啤酒酵母(BY)首先用赛威蛋白酶然后用酸水解处理(BY1)，或者首先用酸水解然后用赛威蛋白酶处理(BY2)，深灰色柱。作为对照，BY1和BY2与工艺过程一起酸水解(灰色柱)。

图12.果胶酶对Progut-型产物和啤酒酵母溶液的影响。没有(灰色柱)和具有(深灰色柱)果胶酶消化的Progut-型产物样品1和2(PG1和PG2)。啤酒酵母(BY)首先用果胶酶然后用酸水解处理(BY1)，或者首先用酸水解然后用果胶酶处理(BY2)，深灰色柱。作为对照，BY1和BY2与工艺过程一起酸水解(灰色柱)。

图13.glucanex对啤酒酵母溶液的影响。第一个实验，啤酒酵母在30℃用5mg、20mg、100mg glucanex处理(分别为G5 30C、G20 30C、G10030C)，之后进行工艺酸处理，深灰色柱。第二个实验，啤酒酵母在37℃或50℃用20mg glucanex处理(分别为G20 37C、G20 50C)，之后进行工艺酸处理，深灰色柱。作为对照，在两个实验中，啤酒酵母仅用工艺酸处理来处理，灰色柱。

图14.glucanex和赛威蛋白酶对啤酒酵母溶液的组合影响。A.啤酒酵母溶液首先于30℃下用5mg、20mg、100mg glucanex处理，然后于37℃下用4μl赛威蛋白酶处理(分别为G 5+S、G 20+S、G 100+S)，之后用工艺酸处理，深灰色柱。B.啤酒酵母溶液首先于37℃下用20mg glucanex处理，然后于37℃下用4μl或20μl赛威蛋白酶处理(分别为G 37+S4、G37+S20)，深灰色柱，或者于50℃下用20mg glucanex处理，然后于37℃下用4μl或20μl赛威蛋白酶处理(分别为G 50+S4、G 50+S20)，之后用工艺酸处理，深灰色柱。作为A.和B.的对照，啤酒酵母溶液在没有酶时孵育，并仅用工艺酸处理进行处理，灰柱。

图15.glucanex和内切葡聚糖酶和/或赛威蛋白酶对啤酒酵母溶液的组合影响。啤酒酵母溶液于37℃或50℃下用20mg glucanex和200μg内切葡聚糖酶处理(分别为G 37+EG、G 50+EG)，或者首先于37℃或50℃下用20mg glucanex、200μg内切葡聚糖酶处理，然后于37℃下用4μl赛威蛋白酶处理(分别为G 37+EG+S、G 50+EG+S)，然后用工艺酸处理，深灰色柱。作为对照，啤酒酵母溶液在没有酶时孵育，并仅用工艺酸处理进行处理，灰柱。

图16.与赛威蛋白酶处理组合的更高浓度H₃PO₄对啤酒酵母溶液的影响。用不同H₃PO₄浓度(0.3M、0.5M、1M)于100℃下对啤酒酵母溶液进行酸水解(分别为0.3M、0.5M、1M)，深灰色柱。啤酒酵母溶液与赛威蛋白酶(4μl)一起孵育，然后用不同H₃PO₄浓度(0.3M、0.5M、1M、2M)于80℃下进行酸水解(分别为0.3M+S、0.5M+S、1M+S)，深灰色柱。作为对照，啤酒酵母溶液用工艺酸处理进行处理，灰柱。

图17.HCl对啤酒酵母溶液的影响。用不同HCl浓度(0.3M、0.5M、1M、2M)于80℃下对啤酒酵母溶液进行酸水解(分别为0.3M、0.5M、1M、2M)，深灰色柱。作为对照，啤酒酵母溶液用工艺酸处理进行处理，灰柱。

图18.H₂SO₄对啤酒酵母溶液的影响。用不同H₂SO₄浓度(0.3M、0.5M、1M、2M)于80℃下对啤酒酵母溶液进行酸水解(分别为0.3M、0.5M、1M、2M)，深灰色柱。作为对照，啤酒酵母溶液用工艺酸处理进行处理，灰柱。

图19.均化的影响。啤酒酵母溶液用工艺酸水解或1M H₃PO₄处理，而均化的啤酒酵母溶液于80℃下用1M H₃PO₄处理(分别为BY、BY 1M、HBY 1M)。

图20.用glucanex、赛威蛋白酶和果胶酶均化的影响。用glucanex、glucanex和赛威蛋白酶、及glucanex和果胶酶处理(分别为BY G、BY G+S、BY G+P)，然后进行工艺酸水解的啤酒酵母溶液(灰色)及其均化的形式(深灰色)。

图21.PG1、PG2、PGWS和PGWS+E的可溶性之间的比较。

图22.通过凝胶渗透色谱比较PG1、PG-WS、Agrimos、Ascogen、Alphamune Alpharma和Bio-Mos。来自1％溶液的样品在Superdex肽柱中运行(测量A₂₃₀)。

图23.从1％溶液中测量的酵母产物在水中的可溶性。PG Av，Progut^TM平均值(n＝9)；PG S，Progut型可溶性产物；Ag，Agrimos；Al，Alphamune^TM；BM，Bio-Mos

图24显示5种Progut型样品的分析性GPC分析。该分析显示可溶性材料的GPC分布基本没有变化，因此生产工艺被很好地标准化。

图25.PG，Progut^TM；PG S，Progut型可溶性产物；和PG WS，Progut型水溶性产物(总体(水)溶性产物，从Progut S进一步加工)的分析性GPC分析。

图26.可溶性多糖和寡糖以及肽的量的比较。测量材料的相对量，表示为214nm下以6-14ml洗脱体积的凝胶渗透色谱图的面积。PG_Av指5个不同PG批次的平均面积，并设定为1。

图27.PG；PG S；Agrimos；Alphamune^TM；和Bio-Mos

的GPC分析。

图28.Progut型材料和3种竞争剂产物中多糖和寡糖以及肽的量的比较。PG Av，平均值(指5个不同PG批次的平均面积，并设定为1)；PG S；PG WS；Ag，Agrimos；Al，Alphamune^TM；BM，Bio-Mos

。结果显示为230nm下来自6-14ml的从凝胶渗透色谱图测量的相对量。

图29.5个Progut型产物批次的可溶性中等大小材料的量与细菌黏着分析结果的相关性。图A.通过GPC测量的可溶性多糖和寡糖大小材料的相对量(来自400mg 1％PG溶液的部分纯化(即基本上不含氨基酸/肽)的可溶性组分的制备GPC分析的数据，230nm来自6-14ml测量。此处来自5个PG样品的平均面积是27800mAu，其给定值为1)。图B.大肠杆菌细菌黏着分析结果。

图30.Progut型产物和竞争剂样品的可溶性材料的量与细菌黏着分析结果的相关性。图A.可溶性多糖和寡糖大小材料的相对量。(来自400mg1％PG溶液的部分纯化(即基本上不含氨基酸/肽)的可溶性组分的分析性1％样品的GPC分析的数据，230nm来自6-14ml测量。此处来自5个PG样品的平均面积是205mAu，其给定值为1)。图B.大肠杆菌细菌黏着分析结果。

图31.可溶性多糖和寡糖大小材料的甘露糖含量(即，来自1％PG或相关溶液的通过GPC、Superdex肽10/30柱于6-16ml分离的可溶性组分)。PG Av，平均值(n＝5)；PG WS；Ag，Agrimos；Al，Alphamune^TM；BM，Bio-Mos

。

图32.5个Progut型产物批次的甘露糖含量与细菌黏着分析结果的比较。图A.可溶性多糖和寡糖大小材料的甘露糖含量(即来自1％PG溶液的通过GPC、Superdex肽10/30柱于6-16ml分离的可溶性组分)。图B.大肠杆菌细菌黏着分析结果。

图33.来自Progut型产物的可溶性多糖和寡糖的¹H NMR。甘露-寡糖类的一些结构特性由NMR谱指示。

图34.PG和竞争剂的¹H NMR的比较。

发明详述

新的可溶性啤酒酵母衍生的产物的产生

本发明揭示了用于从酵母(优选啤酒酵母型材料)产生可溶性治疗性或营养保健产物(食品或饲料产物或其添加剂)的新方法。本发明揭示了用于产生材料的几种方法，包括特异性水解和/或降解方法

1)特异性的糖苷酶，特别是内切糖苷酶

2)蛋白切割酶，诸如蛋白酶链霉蛋白酶和赛威蛋白酶，

3)改善的化学水解，特别是强酸水解，和

4)原材料的物理均化。

本发明进一步涉及具有增强溶解作用活性的方法的组合。

用于产生新的可溶性产物的优选原材料

本发明优选地涉及适当的酵母材料特别是来自发酵过程的酵母的应用，最优选地当酵母衍生自酿造工艺时啤酒酵母作为原材料的应用。应意识到，此类酵母材料将包括植物衍生的非可溶性材料，特别是包含诸如半纤维素糖类(如由果胶酶的切割所示)的植物多糖的植物衍生的非可溶性材料和诸如谷物β葡聚糖的植物衍生的β-葡聚糖材料，该谷物优选地是用于酿造工艺的谷物，最优选地是大麦。应意识到，新的酶促反应用于产生其他量的谷物型可溶性糖类至新的产物。

应意识到，通过特异性酶促反应或可选地通过化学方法产生的新的糖类具有其他有益的保健作用。

应进一步意识到优选的可溶性组合可通过组合以下原材料来产生

1)不用于酿酒的酵母和

2)植物衍生的多糖，优选诸如半纤维素多糖的植物多糖；和/或植物

葡聚糖(特别是谷物)，且最优选大麦衍生的多糖或谷物葡聚糖，最优选大麦葡聚糖。

优选工艺

优选的优化工艺包括至少以下步骤：

1.提供啤酒酵母原材料

2.通过酶和/或通过优化的酸水解的水解

本发明进一步涉及包含以下步骤的工艺：

1.提供啤酒酵母原材料

2.材料的物理均化

3.通过酶和/或酸的水解，在优选的实施方案中通过酸的水解

本发明进一步涉及包含以下步骤的工艺：

1.提供啤酒酵母原材料

2.材料的物理均化

3.通过酶和酸的水解

新的寡糖和低分子量多糖组合物

新的降解性产生工艺得到具有增强的可溶性或更少不可溶材料的产物。除了增强的可溶性，这些材料对引起腹泻的感染具有增强的生物活性，并且具有增加动物生长的活性。

从新的产物中对可溶性组分的分离

本发明特别涉及产生自啤酒酵母材料的新的可溶性级分的分离。

产物中优选的寡糖组合物

本发明者根据Superdex肽色谱图(于水中的1％溶液)的分布分析了新的可溶性产物的生物活性。吸光度指示可溶的不同大小组分的相对量。在生物模型和相关材料中Progut型产物的相对有效性可通过计算洗脱面积而以数目来显示(例如，表1)。本发明揭示了称为“可溶性”和“水溶性”材料、用于抑制有害细菌活性(诸如引起腹泻的大肠杆菌活性)的新的可溶性糖类制品。应意识到，此类制品用于人类和动物的生长和健康。

优选的产物类型

应意识到，新的水解工艺产生可用作诸如衍生自酵母的非分级组合物的新的可溶性糖类。在优选实施方案中，优选地通过诸如氢氧化钠的强碱来中和或部分中和该制品。在优选实施方案中，例如通过喷雾干燥、转鼓式干燥或其他已知的干燥方法来干燥产物。

本发明进一步涉及包括部分分级和纯化的糖类产物的分级产物。优选的部分纯化方法包括主要非糖类组分的一部分的去除，诸如1)脱盐，在优选实施方案中通过诸如钙或其他离子的磷酸盐沉淀的盐沉淀，2)通过特异性的吸附剂(诸如疏水或离子交换基质)对离子分子或疏水分子的去除和/或3)对不可溶材料或其一部分的去除。应意识到，部分纯化一般增加了制品中新糖类含量10-30％或甚至50％。在强磷酸水解之后脱盐将增加制品中糖类的量甚至30-60％，因此增加了优选的Manα3Man-甘露糖糖类的优选量从约15g/kg、更优选20g/kg至约20g/ke和更优选30g/kg。

优选的纯化方法包括糖类级分或其一部分的分离。纯化级分中糖类的含量优选地为至少10％，更优选地至少25％，甚至更优选地至少约50％。NMR中测量的凝胶过滤级分估计包括至少60％的、甚至更优选地至少70％的糖类纯度。应意识到，通过其他标准的纯化和分级方法能获得相似的纯度。

糖类材料的优选大小

本发明揭示了可溶性产物的两种优选的主要大小范围：从Superdex肽柱从6至12分钟洗脱的大的大小的产物和从约12分钟至约16分钟洗脱的中等大小的产物。

本发明特别涉及描述的糖类级分，其含有新的有用的糖类，并且与产物改善的增强的生物活性相关。

优选的可溶性多糖大小和级分

产物包含对应于大小从凝胶过滤大小的约20个至约30个己糖(Hex)单位的糖类和可能更大的可溶性多糖的空体积峰。更优选地，从约7.7分钟的空体积对应于约25个己糖单位和更大的糖类的可溶性多糖。本发明涉及新产物，该新产物包含大量可溶性多糖材料，这是该新产物的特征。优选的多糖级分包括对应于约20个己糖单位的糖类的从6-9分钟洗脱的级分和从Superdex肽柱和6-12分钟洗脱的更大的级分。

应意识到，12分钟处的洗脱位置大约在寡糖(DP10)和包含超过10个单糖残基的多糖的边界。

因此，本发明涉及以下多糖级分：

a)从10-mer至30-mer或从10-Hex单位至至少约30-Hex单位的凝胶过滤大小和更大的可溶性多糖，

b)通过根据本发明的工艺产生的从20-mer至30-mer或从20-Hex单位至至少约30-Hex单位的凝胶过滤大小。

优选的中等大小产物

本发明进一步涉及从约12分钟至约16分钟洗脱的优选的中等大小产物。该范围对应从约二糖/三糖至约十糖的寡糖或者具有从3-Hex单位至至少约10-Hex单位的凝胶过滤大小的糖类。

优选的更大的寡糖和多糖级分

本发明进一步涉及从约6分钟至14分钟洗脱的更大寡糖和多糖的组合级分。该优选级分含有从约4-6-mer的，更优选地从约5-6-mer的寡糖至至少约20-30mer的多糖，或至从5-Hex单位至至少约30-Hex单位的凝胶过滤大小和更大的可溶性多糖。

凝胶过滤中，2个己糖(诸如葡萄糖、甘露糖或半乳糖)单位一般对应于寡糖或多糖中的一个HexNAc(例如GlcNAc或GalNAc)，并且糖类的预期洗脱大小一般可由Hex单位的量来计算。

原材料的均化和与水解的组合

已揭示在工艺酸水解之前使用啤酒酵母原材料和甚至更多的酸，啤酒酵母溶液的均化增加了Progut-型产物型产物的可溶性15％。在优选实施方案的酸水解中，本发明特别涉及包括水解前均化的工艺。

酶促处理增加酸水解产物(PG)的可溶性

本发明揭示了通过酸水解的产物可进一步通过用蛋白酶或多糖切割酶的酶促处理而溶解。优选的酶促处理包括链霉蛋白酶、赛威蛋白酶、果胶酶、Glucanex和与赛威蛋白酶组合的Glucanex或者对相同蛋白或多糖类型具有特异性的酶。

酸水解之前的酶促处理

本发明揭示了如果在酸水解之前用蛋白酶或多糖切割酶进行酶促处理，那么通过酸水解的产物更可溶。优选的酶促处理包括链霉蛋白酶、赛威蛋白酶、果胶酶、Glucanex和与赛威蛋白酶组合的Glucanex，以及任选地与赛威蛋白酶组合的内切葡聚糖酶，或者对相同蛋白或多糖类型具有特异性的酶。

优化的酸水解条件

本发明涉及用于产生新的可溶性产物的优化的酸水解条件。

本发明揭示了用增加量的酸的酸处理增加啤酒酵母的可溶性。

本发明特别涉及优化的水解工艺，其中作为干重计算的原始酵母材料的量介于反应总体积的5-35重量/体积(w/v)％之间，更优选地介于10-30％(w/v)，甚至更优选15-25％(w/v)，并且最优选约反应总体积的20％(w/v)。

本发明涉及根据时间、温度、酸浓度(/每样品量的酸量)和酸类型优化的水解条件。优选的酸包括无机酸磷酸(H₃PO₄)、盐酸和硫酸。最优选的酸是磷酸(H₃PO₄)。

本发明揭示了特别是用优化的强酸水解或酶促水解条件或令人惊讶地其有效组合产生的新的progut型产物，来获得新的生物活性的和可溶的产物。据观察，令人惊讶地需要强酸处理条件(包括非常高的酸浓度，包括约0.5M至约1M酸)和/或在75-100℃范围的高反应温度以便获得增加的溶解作用和获得高生物活性的低分子量多糖和寡糖。条件是剧烈的，并且揭示了酵母材料对水解的高抗性，然而存在对条件的优化以便高温下增加酸至2M引起细胞壁材料的更低效的溶解和/或由接近完全水解的水解造成的增加的量的自由单糖。

经由H₃PO₄的优化的水解

本发明优选地涉及浓度高于0.5M、更优选地高于约0.75M、甚至更优选地高于1M或者最优选约1M的磷酸(H₃PO₄)的应用。

用2M磷酸降低了对溶解作用的影响，甚至低于0.5M磷酸的影响，极端的酸浓度令人惊讶的没有增加水解但引起材料的沉淀。这表明用于有效溶解作用的优化的酸浓度是从约0.5M至约1M。

在优选实施方案中，当反应在约80℃的温度(优选地介于70-100℃之间，甚至更优选地介于70℃和95℃之间，甚至更优选地介于75℃和85℃之间)下进行时，使用约1M H₃PO₄作为最佳浓度，优选范围从约0.75M至约1.25M，甚至更优选地从约0.8M至约1.2M，并且最优选地约0.9M至约1.1M。优选的反应时间是约4小时，优选地从2至8小时，更优选地3至5小时，最优选地从3.5至4.5小时。

本发明特别涉及强水解条件或强酸水解条件和酶促水解的组合来获得根据本发明的增加量的高度可溶的和高生物活性的糖类，在优选实施方案中，使用等同于本发明的水解条件。

在优选实施方案中，条件等于在约75℃至90℃下持续约4小时、约1M H₃PO₄持续4小时。应意识到，如果升高温度，可降低酸量和/或反应时间，并且反之亦然。在另一个优选实施方案中，温度从约90℃升高至约100℃，并且酸量从约0.5M增加至约1M，那么反应时间是约4小时。图16显示100℃下使用0.5M和1M酸的高溶解作用。

应进一步意识到，可通过使用根据本发明的酶或与酸水解组合的酶(诸如图16所示的赛威蛋白酶)来获得高度可溶的和高生物活性的产物。酶的应用增强了溶解过程，以致需要更低的酸浓度、更低的反应温度或更短的反应时间。在优选实施方案中，本发明涉及与0.3-1M酸组合的根据本发明的酶的应用。

经由盐酸HCl的优化的水解

本发明优选地涉及浓度高于0.5M、更优选地高于约0.75M和甚至更优选地高于1M或约1M的HCl的应用。2M酸产生更高的溶解作用，但是也增加了单糖的量，因为使用非常强的无机酸的酸水解条件接近完全水解条件。

在优选实施方案中，当反应在约80℃的温度下(优选地介于70-90℃之间，甚至更优选地介于75℃和85℃之间)进行时，使用大约最佳浓度的HCl，优选范围从约0.75M至约1.25M，甚至更优选地从约0.8M至约1.2M，且最优选地约0.9M至约1.1M。优选的反应时间为约4小时，优选地2至8小时，更优选地3至5小时，最优选地3.5至4.5小时。

本发明进一步涉及以高于0.5M的增加浓度的H₂SO₄和以如上文所述的约1M的其他酸处理的应用。数据显示2M酸不产生增加的溶解作用，进一步可能指示增加的沉淀。

溶解方法的组合

本发明进一步揭示了如实验部分所述的方法的多种有用的组合。优选的组合包括均化与酶促水解或化学水解。

在优选实施方案中，本发明涉及诸如均化和改善的化学水解的方法的组合。该方法是优选的，因为产物溶解的高效以及方法和试剂的低成本。

本发明进一步涉及均化与糖苷酶和/蛋白切割酶的酶促水解的组合。

本发明进一步揭示了蛋白的酶促切割和产生高产量材料的糖苷酶切割的优选组合。该方法优选地与均化组合。

本发明进一步揭示了化学切割方法与蛋白的酶促切割和/或产生高产量材料的糖苷酶切割的优选组合。该方法优选地与均化组合。

产生的可溶性碳水化合物的改善的活性

本发明揭示了优选的溶解方法产生具有有用生物活性的增加量的可溶的分子材料。本发明特别涉及针对病原微生物的增加的活性，所述病原微生物诸如引起腹泻的微生物，特别是包括大肠杆菌的细菌。

优选的酶促处理

优选的内切糖苷酶

葡萄糖多糖的切割

本发明揭示了葡萄糖多糖切割酶用于产生新的可溶性产物。

在优选实施方案中，包含纤维素酶活性的β-连接的葡萄糖多糖切割内切-β-葡糖苷酶(诸如内切-葡糖苷酶和glucanex)在新的生产工艺中在减少不溶性材料中具有有用的活性。本发明特别涉及切割纤维素型和β-葡聚糖的多糖。优选的有待切割的β-葡聚糖是包含Glcβ4Glc-结构的β-葡聚糖，诸如纤维素、谷物b-葡聚糖，包括葡萄糖残基之间的β4和β3-键合。优选的内切-β-葡糖苷酶是内切-葡糖苷酶和纤维素酶。

本发明特别涉及残基不可溶β-葡聚糖，诸如酵母细胞壁葡聚糖、谷物葡聚糖和/或在优选实施方案中啤酒酵母材料中的纤维素材料的切割，以便产生更高的可溶性和/或以便产生可溶的生物活性的葡聚糖寡糖。

本发明特别涉及包含根据式[Glcβ4]_nGlc-结构的结构的纤维素和/或谷物β-葡聚糖寡糖的产生，其中n是从2-20的整数，更优选2-10。

本发明更优选地涉及产生谷物型葡聚糖寡糖至产物。产物优选地包含根据式[Glcβ4]_n1[Glcβ3]_n2[Glcβ4]_n3Glcβ3[Glcβ4]_n4Glc-结构的葡萄糖残基之间的β4和β3-键合，其中n1、n3和n4是独立地从0至约5的，优选1至4的，甚至更优选1至3的整数，并且n2是0或1。

本发明特别涉及内切-β-葡糖苷酶催化的葡聚糖寡糖的产生。

本发明揭示了在根据本发明的优选级分中α-连接的葡萄糖材料的存在。本发明进一步涉及在生产新的可溶性产物中内切-α-葡糖苷酶的应用。α-葡萄糖多糖切割酶是新的产物组合物特别优选的调整和优化，并且优选作为具有内切α-葡糖苷酶活性的，特别是内切-α4-葡糖苷酶活性的其他酶，优选淀粉或直链淀粉切割酶。

果胶和相关半纤维素材料的切割

本发明进一步涉及通过果胶酶制品对啤酒酵母材料的处理。应意识到，已报道果胶酶包含多种活性。本发明涉及通过包含果胶酶的制品对果胶和/或其他半纤维素型材料如包含果胶的半纤维素材料的切割。

在优选实施方案中，本发明涉及产生果胶和或半纤维素衍生的寡糖或低分子量可溶性多糖至产物。

优选的蛋白酶处理

本发明涉及应用蛋白酶切割来自原材料或酸水解材料的蛋白材料。优选的蛋白酶是赛威蛋白酶或链霉蛋白酶。

具有改善的可溶性的新的包含聚糖的材料，可溶性Progut型产物和水溶性 Progut型产物

本发明揭示了可能通过根据本发明的优化方法来产生具有增强的水溶性的酸水解的酵母制品。应意识到，高可溶性材料用于饲料和食品的更有效的制品。可溶性级分特别优选用于液体饲料和液体食品或食品添加剂，特别是饮品和饮料。应意识到，由于实践原因(诸如生产中装瓶和转移液体材料)，具有远小于50％可溶性材料的材料不用于液体食品或饮料，而实践材料应优选地具有远高于50％的可溶性材料。应意识到，一些应用将部分耐受不可溶材料，并且在优选实施方案中不可溶材料的小部分用于食品组合物中作为纤维来支持营养和健康。Progut型产物及其可溶性形式与用于动物饲料的一些参考产物的总体可溶性的比较示于图23。

新的可溶性产物包含具有改善的生物活性的甚至更大量的可溶性糖类材料(寡糖和多糖)。可溶性多糖和寡糖材料的量(从Superdex肽柱在6-14分钟之间洗脱，如图25所示)示于图26和图28。可溶性Progut型产物和水溶性Progut型产物中寡糖的量与较小优化的Progut型产物相比分别为约2-倍更高，甚至超过3-倍更高。

新的可溶性材料的优选可溶性范围

本发明特别涉及新的可溶性Progut型产物，其中作为1％水溶液的总体可溶性为超过55％，更优选地超过60％，甚至更优选地超过65％，甚至更优选地超过63％，甚至更优选地超过66％，甚至更优选地超过67％，且最优选地超过68％。在优选实施方案中，水溶性为约70％，优选地在55％至85％的范围，更优选地在60％至80％的范围，更优选地在63％至77％的范围，更优选地在65％至75％的范围，甚至更优选地在66％至74％的范围，甚至更优选地在67％至73％的范围。

本发明进一步涉及实际上完全水溶性的包含糖类的产物，其中水溶性产物在室温(优选20-25℃)下作为1％(重量/体积)水溶液具有实际上完全的水溶性。优选的水溶性级分分离自Progut型产物，优选可溶性Progut型产物。优选的完全水溶性为至少90％或超过90％，更优选地超过93％，甚至更优选地超过95％，甚至更优选地超过96％，甚至更优选地超过97％，且最优选地超过98％。

本发明进一步涉及半水溶性Progut型产物，其中部分去除了不可溶材料。应意识到，部分的低去除提供了与可溶性产物相似的材料，而高去除提供了与水溶性产物相似的材料。在优选实施方案中，不溶性组分可以从约10％至约80％，更优选地从约20％至约75％，更优选地从约25％至约66％，甚至更优选地从约33％至约66％的可变程度被去除以便获得半水溶性产物。半水溶性产物的总体可溶性优选地在从约73％至约94％，更优选地从约76％至约92.5％，甚至更优选地从约80％至约90％，甚至更优选地从约81％至约89％的范围内。在优选实施方案中，可溶性接近约80％，优选地在从约75％至约85％的范围内，或接近约90％，在从约85％至约95％的范围内。半水溶性级分的总体可溶性优选地调整为覆盖介于可溶性和水溶性级分/材料之间的可溶性。

在优选实施方案中，字‘约’指示优选地在值的2％单位内，更优选地在1％单位内，或者更优选地在从精确值的0.5％单位内，或者在单独实施方案中精确的值。

生物活性的碳水化合物组分

本发明进一步揭示了具有改善的可溶性的新材料具有针对造成腹泻的细菌的改善的生物活性。这显示于图29，且与相关材料的比较显示于图30的图B。生物活性与UV吸收材料的存在相关。材料被去除蛋白，并去除疏水杂质，在可通过NMR观察的寡糖范围内不含有主要杂质。因此，吸光度看起来对应于碳水化合物材料、包括水溶性寡糖和多糖的糖类，部分是由于还原性末端醛的吸光度和工艺中形成的还原性末端衍生化和少量与糖类相连的GlcNAc残基。可能包括少量肽材料，如图说明所示，但基于NMR，这些材料的定量重要性是有限的。

活性碳水化合物组分

甘露糖糖类

示于图31的分析揭示了新的高活性的可溶性Progut型产物包括增加量的甘露糖寡糖。图32显示级分的生物活性与甘露糖含量部分相关。本发明者能通过NMR分析定义Progut型产物中新的高活性的甘露糖寡糖和多糖。这类寡糖的增加特别用于新的营养保健分子。新的可溶性产物中的甘露糖含量增加了约50％。

优选的末端Manα3-结构

本发明进一步揭示了除了甘露糖含量，甘露糖寡糖的特定结构解释了Progut型产物更高的活性(例如，如图30所示)。本发明特别涉及包含增加量的末端Manα3-结构的寡糖序列，如图33-34所示。本发明进一步揭示了非还原端末端的和3-取代的Manα2-表位及在线性Manα2-结构中的中链Manα2-表位的特定量，其为衍生自酵母的甘露糖糖类的关键部分。

本发明优选地涉及由根据本发明的工艺产生的和在优选实施方案中从啤酒酵母产生的包含增加的末端Manα3-结构，更优选的非还原端末端Manα3Manα2的寡糖。在优选实施方案中，末端Manα3-结构的量产生NMR信号，其高于非还原端末端的和3-取代的Manα2-表位的NMR信号，或者高于线性Manα2-结构中的中链Manα2-表位的NMR信号，如图33-34所示。在优选实施方案中，Manα3信号高于质子NMR光谱中图33标记的Manα2-表位信号的任一种，如图33和34所示。本发明特别涉及Manα3-聚糖，其中Manα3位置的质子NMR信号至少5％高于、更优选地至少7％高于，甚至更优选地9％高于，且最优选地至少10％高于图33所示的比较的Manα2-信号。

应理解，末端非还原端Manα3Manα2结构是针对用于抑制病原体(特别是产生腹泻的细菌，诸如大肠杆菌)的新的活性组分。还原端Manα2-结构产生聚糖新构象。基于诸如Manα3Manβ4GlcNAc结构的其他聚糖或还原性二糖表位，该聚糖的活性未知。

本发明进一步涉及富集末端Manα3的糖类级分，其包含至少约10克/kg，甚至更优选地至少15克/kg，甚至更优选地至少16克/kg，甚至更优选地至少17克/kg，甚至更优选地至少18克/kg，甚至更优选地至少19克/kg，甚至更优选地至少20克/kg，甚至更优选地至少21克/kg，甚至更优选地至少22克/kg，最优选地至少23克/kg或24克/kg的优选甘露糖寡糖。优选的甘露糖寡糖包括包含甘露糖的、优选地主要包含甘露糖的寡糖，但其可进一步包含其他单糖残基，优选地，Glc、或GlcNAc或GlcN优选地作为次要组分。

其他活性碳水化合物组分，特殊的β-葡糖信号

本发明者观察到在质子NMR-光谱约4.51-4.53ppm区特殊的β-葡萄糖寡糖信号。这些信号是相关的新的异常低分子量的葡萄糖寡糖和多糖信号。本发明特别涉及富含在区域(Glcβ6的龙胆二糖H1位于约4.51ppm，中链Glcβ6残基的信号位于约4,519；4,529；和4.523ppm；Lo V.M.等Carbohydr Res.(1993)245，333-345)具有特征信号的β6-连接的葡萄糖的寡糖。

本发明进一步涉及当材料进一步包含少量GlcN/GlcNAc时的根据本发明的糖类材料，材料优选地是衍生自酵母的Glcβ-材料，更优选地包含Glcβ6残基。

在单独的实施方案中，本发明进一步涉及当酵母原材料培养于含有(谷物)β3/4葡聚糖或纤维素的材料中时的β4-连接的葡萄糖寡糖，优选的β(3/)4葡萄糖信号位于优选区域(例如β3/4葡聚糖寡糖在约4.53ppm处具有β4-连接的Glc H1信号)。

基于单糖分析，葡萄糖材料的量与样品中的甘露糖材料是可比较的，Glc材料的一部分包括Glcα-材料，而α和β信号都对应于大量的糖类。

根据本发明的优选的富集的寡糖

本发明涉及根据本发明的优选糖类，其中由于Progut型产物NMR-信号的锐度，该信号特别地来自寡糖。根据本发明的寡糖具有介于2-10程度的寡聚化。应意识到，大多数背景涉及诸如葡聚糖的多糖材料和不可溶的大多糖。

总糖类含量和更大糖类的含量

通过UV吸光度定量更大的寡糖和多糖

本发明涉及具有特定更大寡糖和多糖含量的新的Progut型产物。

0.4克干Progut型产物或相关产物的样品在水中稀释为1％的溶液(重量/体积)。离心样品，并干燥水溶性部分，进行进一步的分析。通过与1.4ml Dowex H+-树脂和bond elut柱一起孵育而去除蛋白和肽以及亲脂杂质来进一步纯化寡糖和多糖级分(分析，实验部分)。纯化的样品在真空离心机中干燥，并溶于1000微升水中。1000微升的15微升样品在Superdex肽柱中运行，并在214nm处收集从6至14分钟的吸光度面积。标准化的Progut型产物在从柱上介于6-14分钟之间洗脱的更大糖类范围内(含有更大的寡糖和多糖)产生680mAU(吸光度单位)。

本发明特别涉及新的Progut型产物，特别是可溶性和水溶性产物，当以1.0ml/min的流速运行于Superdex肽柱(Amersham Pharmacia，分析实施例)时，当糖类级分基本上从来自糖类级分的污染的肽和蛋白中纯化时，其产生每6mg原始干样品介于6-14分钟之间高于680mAU(Ab单位，吸光度单位)的吸光度积分。本发明还涉及具有凝胶过滤中相应材料大小范围的对等的寡糖级分和通过根据本发明的工艺产生的材料。吸光度积分的优选值是680mAU的1.3倍、更优选地1.5倍、甚至更优选地1.7倍、甚至更优选地1.8倍、甚至更优选地2.0倍、甚至更优选地2.3倍、甚至更优选地2.5倍、甚至更优选地2.7倍、甚至更优选地2.8倍、最优选地2.9倍、3.0倍或3.2倍。

通过甘露糖质量对寡糖和多糖的定量

本发明涉及具有特定总体寡糖和多糖含量的新的Progut型产物。这是通过分析从Superdex肽柱上在6至16分钟之间洗脱的寡糖和/或多糖级分中的总体甘露糖含量而实现的。

对可溶性糖类材料的纯化或分离

本发明特别涉及包含根据本发明的一种或几种优选糖类类型的纯化的或富集的级分。应意识到，富集的或纯化的级分具有作为营养保健功能性食品或饲料或营养保健(食品或饲料)添加剂的特别高的特异活性。

优选的纯化方法包括以下及其组合：

a)色谱方法，诸如：

i.用于吸收带电的和或亲脂的(疏水杂质)的色谱

ii.大小排阻色谱，特别是凝胶过滤以便去除低分子量杂质

iii.具有与糖类或其一部分结合的基质的亲和色谱，优选活性炭上的色谱

和/或

b)相分离溶液方法，诸如用溶剂提取和/或杂质或糖类的沉淀。在优选实施方案中，有机溶剂用于沉淀，优选醇或酮，诸如甲醇或乙醇，更优选乙醇；或者丙酮用于沉淀优选大小的糖类。

和/或

c)溶液和沉淀剂的离心和分离

和/或

d)化学或酶促方法来降解不需要的组分，优选温和碱水解来降解碱不稳定的杂质和/或包含Glcα的糖原/淀粉型糖类的酶促水解。

本发明进一步特别涉及用于去除杂质的离子交换和/或疏水色谱和/或用于纯化新的糖类级分的大小排阻色谱。应意识到，在优选实施方案中离子交换的阳离子交换树脂材料还吸收亲脂化合物，或者两种基质可包括于相同的柱中。

可溶性实验

图9-21显示酸和/或酶处理之后的产物级分的可溶性。测量0.2％水溶液中剩余的不可溶材料。显示的量对应于50ml中100mg原始干产物。因此，mg量表示对应于不可溶材料的百分比。图23中，可溶性材料的量表示为百分比。

实验部分

缩写

BY 啤酒酵母

HBY 均化的啤酒酵母

G Glucanex

PG Progut型产物

PG S 可溶性Progut型产物

PG WS 水溶性Progut型产物

PG WS+E 具有乳化剂的水溶性Progut型产物

PE 果胶酶

PR 链霉蛋白酶

S 赛威蛋白酶

实施例1

材料和方法

材料

来自Suomen Rehu的Progut ^TM (PG)样品

来自不同生产批次的14种Progut^TM型产物样品：PG1-PG14。来自不同生产工艺的3种Progut型产物样品：PG 15h，水解15h；PG WS，PG水溶性；PG WS E+，具有乳化剂的PG水溶性。

已显示PG1作用很好，而PG2如在细菌黏着测定上所示不是有效的。当使用山羊测试时，PG4在田间产生良好的结果。

来自其他生产商的商业化样品

Agrimos(C1)、和Ascogen(C2)、Alphamune alpharma(C3)、和Bio-Mos(C4)。

全啤酒酵母样品

啤酒酵母BY和均化的啤酒酵母HBY。

分析步骤

样品的制备

从Progut型产物和相关样品制备0.2％的水溶液或1％的水溶液。这些溶液于室温在温和搅拌下孵育2-5小时。然后将混合物离心(4000rpm，20分钟)，冻干上清液，并测量干重。

可溶性组分的分析

在凝胶渗透色谱之前通过两个纯化步骤来纯化样品的可溶性组分：首先，干材料稀释为H⁺-珠(AG 50W-X8树脂，Bio-Rad，1.4ml用于0.4g样品)的浆态溶液，并在温和搅拌下于室温(RT)孵育2小时。第二，来自H⁺-珠溶液的上清液通过BondElut C-18-柱洗脱(500mg/6ml，Varian)。浓缩后，样品在Superdex肽10/300GL柱(Amersham Biosciences)内以1ml/min的流速使用50mM碳酸氢铵运行凝胶渗透色谱，在

Purifier 10(泵P-903，UV-900，Amersham Biosciences)中测量214nm或230nm处的吸光度。Superdex肽柱：空体积，6.7ml；总洗脱体积，18.0ml；和多糖/寡糖/单糖的洗脱：空体积处30个Hex单位；7.7ml处25个Hex单位；14.4ml处5个Hex单位；16.7ml处2个Hex单位，和17.3ml处1个Hex单位。

核磁共振光谱(NMR)

对NMR分析，如以下从Superdex肽色谱收集样品：大的大小组分(从6至12ml洗脱)，中等大小组分(从12至16ml洗脱)。在一维¹H NMR实验之前，首先冻干样品，然后溶解于D₂O(99.9％)中。通过Varian Unity 500光谱仪(Varian Inc.)于23℃下记录NMR谱。

啤酒酵母的酸水解

全啤酒酵母溶液用H₃PO₄的酸水解相似于Progut型产物制造工艺中使用的水解：用H₃PO₄(浓缩的，87％)将pH调整为2.4，并于80℃下孵育4小时。该酸水解在下文文本中称为“工艺酸水解”。

结果

可溶性组分的量的比较

制备9种Progut型产物样品和4种相关样品的1％溶液，并测量水溶性组分的干重(图1)。从图1显示的结果，可得出结论，大约50％的Progut型产物材料是水溶性的，尽管取决于批次可溶性有变化。Alphamunealpharma(C3)、Bio-Mos(C4)和Agrimos(C1)具有比Progut型产物更少的可溶性组分。在另一方面，Ascogen(C2)看来具有良好的可溶性。

然而，应注意到，在这些冻干样品中可留有可变量的水。因此，干重的误差可能高于平均值。

通过凝胶渗透色谱对可溶性材料比较

来自0.2％溶液的色谱图

PG1和PG2的比较

如材料和方法中所述制备PG1和PG2的0.2％溶液，且可溶性材料的色谱图示于图2。比较PG1和PG2的可溶性材料可以发现，PG1具有比PG2相对更中等大小的材料(在12-16ml之间洗脱)，相反PG2具有比PG1更大的大小的材料(在6-12ml之间洗脱)。PG1中可溶性材料的总量看来高于PG2，如PG1中更高的吸收性所示。从图1也可发现相同的现象。可溶性和色谱行为的这些差异暗示PG1和PG2的有效性：PG1和PG2已通过细菌黏着测试进行测试，并且PG1显示有效而PG2无效。

来自1％溶液的色谱图

PG1和PG2的比较

可溶性组分的NMR分析需要大量的材料。因此，从半制备凝胶渗透色谱图中产生1％的溶液。作为与来自图3的0.2％溶液的色谱图的比较，显示了来自PG1和PG2的1％溶液的可溶性材料的色谱图。尽管检测器有些过载，可能甚至更清楚地发现PG2中存在的中等大小的可溶性组分少于PG1。

9种Progut型产物和4种相关样品的比较

同时制备9种Progut型产物(PG1-9)和4种相关样品(C1-4)，并进行相同的分析。因此，它们的凝胶渗透色谱图是可比较的。此处，在A₂₃₀处检测样品，为了正确的比较，重新分析PG1和PG2。吸光度轴的比例尺调整为在所有色谱图中相等，以便有利于样品的比较。

PG1、PG3、PG4和PG6的色谱图的形状和材料的量看起来都相当相似(图4，A、C、D、F)。PG1(细菌黏着测定中)和PG4(使用山羊的田间实验中)都显示是有效的。另一方面，PG2、PG5、PG7和PG8具有比其他PG样品更少的材料(图4，B、E、G、H)。从这些结果发现已知PG2在细菌黏着测定中是无效的。这些数据表明在优选实施方案中，可通过色谱图的形状特别是通过中等大小可溶性材料的量来预测有效的Progut-型产物。中等大小材料(于12-16ml处洗脱)的相对量可计算为色谱图的面积(mAb单位乘以ml)，比较这些值(表1)证明了Progut型产物样品之间差异的估计。收集大的大小(于6-12ml处洗脱)和中等大小(于12-16ml处洗脱)材料用于NMR分析。

在相关样品中，中等大小和甚至大的材料的量远低于Progut型产物样品(图4，J、K、L、M)。Alphamune alpharma(C3)和Bio-Mos(C4)中可溶性材料的总量(分别为图4，L、M)当与Progut型产物样品相比时看起来很少，这也可在图1中观察到。在Agrimos(C1)和特别在Ascogen(C2)中，可溶性材料的总量与Progut型产物是可比较的，但是其中大多数是低分子量大小的材料(图4，J、K)。低分子量大小的材料在抑制细菌黏着方面并不好，尽管其可能具有一些其他有益的特性。

表1.来自图4中色谱图的组分的相对量。面积计算为mAb单位乘以ml(此处，面积是来自3个半制备色谱图的合并)。

5种Progut型产物样品的比较

与图4的样品相似地制备Progut型产物样品PG10-14用于凝胶渗透色谱。因此，图4和图5的色谱图是可比较的。尽管没有获得PG10-14的生物活性的信息，但这些色谱图暗示这些(PG10-14)Progut型产物批次应很好地起作用，因为在所有样品中，存在大量的主要由中等至高分子量化合物组成的可溶性材料。收集大的大小(在6-12ml处洗脱)和中等大小(在12-16ml处洗脱)的材料用于NMR分析。

酸水解的啤酒酵母及其均化形式

啤酒酵母溶液通过工业压力匀浆器被均化，并且两种啤酒酵母溶液的样品及其均化形式由如材料和方法中所述的Progut型产物工艺酸水解水解。为了分离样品用于半制备凝胶渗透色谱的NMR，检测器被过载，并且不能获得与图4和图5可比较的色谱图。然而，运行分析凝胶渗透色谱图(图6)，并且色谱图的分布模拟PG1的分布(图2A)。比较图6A和图6B的色谱图面积表明均化增加了可溶性15％。

制备用于细菌黏着测试的样品

需要Progut型产物更高的可溶性用于将其混于液体饲料中最优选地于饮用水中服用。选择针对新的水溶性Progut型产物的10种样品候选物。制备足够量的这些样品用于细菌黏着测试，其凝胶渗透色谱图示于图7(实验工艺示于实施例2的材料和方法中)。样品是：

1.用glucanex和工艺酸水解处理的啤酒酵母，BY G(图7A)

2.用glucanex和工艺酸水解处理的均化的啤酒酵母，HBY G(图7B)

3.用glucanex和赛威蛋白酶处理的，然后通过工艺酸水解的啤酒酵母，BY G+S(图7C)

4.用glucanex和赛威蛋白酶处理的，然后通过工艺酸水解的均化的啤酒酵母，HBY G+S(图7D)

5.用1M H₃PO₄处理的啤酒酵母，BY 1M(图7E)

6.用1M H₃PO₄处理的均化的啤酒酵母，HBY 1M(图7F)

7.用glucanex和果胶酶处理的，然后通过工艺酸水解的啤酒酵母，BY G+PE(图7G)

8.用glucanex和果胶酶处理的，然后通过工艺酸水解的均化的啤酒酵母，HBY G+PE(图7H)

9.用果胶酶处理的PG1，PG1PE(图7I)

10.用链霉蛋白酶处理的PG1，PG1PR(图7J)

最后选择新的水溶性Progut型产物的5种候选物(样品1、2、5、6和9)用于细菌黏着测试。用glucanex和用1M H₃PO₄对啤酒酵母的处理在与以前的Progut型产物测试工艺相似进行的细菌黏着测定中产生具有最好活性的材料。

有趣地，酶促处理之后啤酒酵母及其均化形式的色谱图相当相似。相反，与未均化的样品相比，用1M H₃PO₄处理的均化的啤酒酵母中发现更可溶的中等大小的材料(图7，F相比于E)。

水溶性Progut型产物

为了测试1M H₃PO₄处理的啤酒酵母的田间有效性，以工业规模产生产物，并且产物命名为水溶性Progut型产物(PG WS)。还通过引入乳化剂产生另一种形式的PG WS，并将其命名为PG WS+E。通过凝胶渗透色谱分析其可溶性，为了容易比较，在相同组的实验中分析PG1(图8)。当比较PG(图8A)和PG WS(图8B)的色谱图，并且由此计算材料的相对量时(表2)，可以得出结论，PG WS中存在超过30％更多的可溶性材料。具体地，非常大的大小的材料(于6-9ml洗脱)的相对量增加了大体上60％。然而，中等大小材料(12-16ml)的相对量大约是相等的。因此，PG WS生产中更高浓度的H₃PO₄看起来破坏了不可溶部分正好足以使其可溶于水。尽管产物不完全可溶，但是改变足够高以允许PG WS作为饮用水中的液体饲料被递送。

在其他正常的生产工艺中，通过更长(15小时)的水解制备另一种样品(PG 15h)。PG 15h的凝胶渗透色谱图(图8D)暗示产物与PG1相似。NMR分析将揭示是否存在组分结构的改变。

表2.来自图8A和图8B的色谱图的材料的相对量。材料的量指定为作为计算的mAb单位乘以ml的色谱图的面积。

Progut型产物样品中中等大小组分的NMR分析

中等大小级分NMR分析中最显著的信号可指定至α-糖苷碳水化合物链的H-1。考虑到分析材料的生物起源，α-葡聚糖链和α-甘露糖苷链是信号的预期来源。

谱图还显示了起源自β-糖苷单位的H-1的信号。这些信号预期起源自各种β-葡萄糖残基。含有此类单位的碳水化合物寡聚体预期从例如酵母和大麦的β-葡聚糖在本发明的工艺中产生。

结论

分析Progut型产物样品和来自主要生产者的相关样品的可溶性，并产生其凝胶渗透色谱分布。从这些结果，看起来同样工艺化样品的可溶性材料的相对量暗示讨论的Progut型产物作为动物饲料的有效性。大和中等大小材料两者的量看来特别重要。在所有相关样品中，大和中等大小材料的量明显低于Progut型产物样品中的量。在一些相关样品中，大多数可溶性材料是低分子量大小，其不可能有效抑制细菌黏着。

本发明涉及显示于这些凝胶渗透色谱图中的可溶性组分的分离和材料的任选的进一步分级以及例如通过NMR对分离的和/分级的材料的更详细的化学分析。本发明特别涉及中等大小的材料及其作为活性重要组分的相对量。本发明进一步涉及大的大小的材料及其作为活性重要组分的相对量。

实施例2

材料和方法

材料

来自Suomen Rehu的Progut ^TM (PG)-型产物样品

PG1；PG2；PG15h，PG水解15h；PG WS，水溶性PG；PG WS E+，具有乳化剂的水溶性PG。

已显示PG1很好地起作用，而PG2在细菌黏着测定上不这么有效。

全啤酒酵母样品

用于本实验的啤酒酵母样品具有平均20％的干物质。

用酸水解

磷酸

用H₃PO₄对全啤酒酵母溶液的主要酸水解与用于Progut型产物制造工艺的水解相似：用H₃PO₄(浓缩的，87％)调整pH至2.4，并于80℃下孵育4小时。这一酸水解在下文文本中称为‘工艺酸水解’。

用更高浓度H₃PO₄的酸水解使用0.3M、0.5M、1M和2M H₃PO₄在80℃或100℃下进行4小时。

盐酸

用HCl的酸水解用0.3M、0.5M、1M和2M HCl于80℃下进行4小时。

硫酸

用H₂SO₄的酸水解用0.3M、0.5M、1M和2M H₂SO₄于80℃下进行4小时。

可溶性实验

从Progut型产物样品或啤酒酵母溶液制备0.2％水溶液(即含有100mg干重材料的500μl反应混合物用H₂O稀释至50ml)。将该水溶液在温和搅拌下于室温孵育2-5小时。显示孵育持续时间与可溶性不相关。将混合物离心(4000rpm，20分钟)，并在冻干后测量沉淀物的重量。

酶促处理

链霉蛋白酶

20mg链霉蛋白酶(灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，48U/mg，Sigma)与5ml啤酒酵母溶液/20％Progut型产物溶液、5mM CaCl₂于37℃下一起孵育5小时。在酶促处理之前或之后进行工艺酸水解。通过可溶性实验分析链霉蛋白酶的影响。

赛威蛋白酶

5ml啤酒酵母溶液/20％Progut型产物溶液(用NaOH调整pH至10)、4或20μl赛威蛋白酶(来自芽孢杆菌属(Bacillus sp)的蛋白酶，16mU/μl，Sigma)于37℃下一起孵育5小时。在酶促处理之前或之后进行工艺酸水解。通过可溶性实验显示赛威蛋白酶的影响。

Glucanex

通过改变glucanex的量或反应温度来研究glucanex(来自哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的裂解酶，1.18U/g，Sigma)对啤酒酵母溶液可溶性的影响。对5ml啤酒酵母溶液，加入5-100mg glucanex，并于30℃、37℃或50℃下孵育5小时。在酶促处理之后进行工艺酸水解。通过可溶性实验显示glucanex的影响。

果胶酶

对5ml啤酒酵母溶液或20％Progut型产物溶液加入20mg果胶酶(黑曲霉(Aspergillus niger)，1U/mg，Calbiochem)，并于37℃下孵育5小时。在酶促处理之前或之后进行工艺酸水解。通过可溶性实验显示果胶酶的影响。

内切葡聚糖酶

对5ml啤酒酵母溶液，200μg内切葡聚糖酶(来自里氏木霉(T.reesei)的内切葡聚糖酶I，来自VTT)于37℃或50℃下孵育5小时。该反应仅与glucanex或glucanex和赛威蛋白酶两者一起进行(参见下文)。

组合的酶促处理

glucanex和赛威蛋白酶的组合效应：

首先如所述用glucanex反应，然后如所述在pH 10用赛威蛋白酶反应。在酶促处理之后进行工艺酸水解，之后通过可溶性实验显示酶的影响。

glucanex和内切葡聚糖酶的组合效应：

如所述，在37℃或50℃下同时用glucanex和内切葡聚糖酶进行反应。在酶促处理之后进行工艺酸水解，之后通过可溶性实验显示酶的影响。

glucanex、内切葡聚糖酶和赛威蛋白酶的组合效应：

首先如所述用glucanex和内切葡聚糖酶在37℃或50℃下反应，然后如所述在pH 10用赛威蛋白酶反应。在酶促处理之后进行工艺酸水解，之后通过可溶性实验显示酶的影响。

结果

每个系列实验包括模拟初始Progut型产物的生产工艺的对照反应，即如材料和方法中所述用工艺酸水解处理啤酒酵母溶液。以反向的方式测量酶促和/或酸水解实验之后组分可溶性的增加：因为可溶性组分的干重在一定程度上不可能测量，因而测量不可溶组分的减少。

链霉蛋白酶的影响

如材料和方法中所述用链霉蛋白酶处理Progut型产物样品。根据细菌黏着抑制测试，PG1作为动物饲料是有效的，看来具有比PG2更好的可溶性。如图9所示，链霉蛋白酶处理极大地增加了两种Progut型产物样品的可溶性，其中显示了不可溶材料的量(这些样品中的初始干重材料是100mg)。

在下一系列的实验中，重复用PG1和PG2的链霉蛋白酶消化，并且如图10所示，结果非常相似。

在该系列实验中还研究了pH在用啤酒酵母的链霉蛋白酶消化中的影响。在pH 5(原初啤酒酵母溶液的pH)和pH 8下进行消化，然后进行酸水解。孵育期间pH的改变不引起可溶性的任何显著差异(数据未显示)。

还研究了在酸水解之前或之后孵育的链霉蛋白酶的活性。图10的结果显示酸水解之后比酸水解之前链霉蛋白酶更有效，这最可能暗示酸水解之后蛋白被变性，并且更容易接近蛋白酶。

因此，链霉蛋白酶将增加Progut型产物的可溶性，即使其在酸水解之前使用。考虑到Progut型产物的生产工艺，这是有益的，因为酸水解将破坏链霉蛋白酶，并且当用作动物饲料时产物本身将没有酶促活性残留。

比较Progut型产物或啤酒酵母的可溶性结果(图10)，看来初始的工业Progut型产物产生工艺(1)在产生更可溶的产物上更有效，并且(2)与用于原初啤酒酵母的实验室规模的酸水解工艺相比，该产物对链霉蛋白酶的作用更敏感。

赛威蛋白酶的影响

为了检查另一种蛋白酶与Progut型产物的反应性，选择了赛威蛋白酶(来自芽孢杆菌属的蛋白酶)，一种以工业生产的碱性蛋白酶。当用Progut型产物测试时，赛威蛋白酶减少了不可溶材料的量几乎一半(图11)。然而，链霉蛋白酶的有效性(图10)看起来更好：尽管链霉蛋白酶减少不可溶材料的量达22％(PG1)，在赛威蛋白酶处理的PG1中，存在53％的残留。与链霉蛋白酶的作用相反，不可溶材料的量不取决于赛威蛋白酶是在工艺酸水解之前还是之后使用(参考图10和图11，使用啤酒酵母的实验)。

因为赛威蛋白酶是工业酶，其可以合理的成本使用。然而，使用赛威蛋白酶不如使用链霉蛋白酶实际：因为赛威蛋白酶是碱性蛋白酶，pH需要调整至10以便获得有效的反应。这意味着在中和后(无论赛威蛋白酶是在工艺酸水解之前还是之后进行)产物的磷酸钠浓度是可观的。

果胶酶的影响

果胶是大的、异型的并且带负电荷的细胞壁多糖。工业果胶酶是果胶裂解酶，另外其还含有几种其他的酶促活性。因此，认为果胶酶处理在Progut型产物溶液中可能是有效的。实际上，在产生更水溶性的Progut型产物中，果胶酶显示比赛威蛋白酶更有效，但不如链霉蛋白酶有效(图10、图11和图12)。例如，链霉蛋白酶减少PG1中不可溶材料的干重达22％，用果胶酶达34％，分别残留8.5mg或15mg不可溶材料。与蛋白酶链霉蛋白酶和赛威蛋白酶相反，果胶酶处理只有在工艺酸水解之后才对啤酒酵母溶液有效(图12)。

glucanex的影响

为了分析β-葡聚糖对Progut型产物可溶性的影响，进行β-葡聚糖酶处理。选择Glucanex(来自哈茨木霉的裂解酶)，因为已知其作为有成本效益的酵母细胞壁葡聚糖水解酶。已知Glucanex还含有纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶活性。首先，在30℃下研究各种量的glucanex的影响。清楚显示少量glucanex不显著增加啤酒酵母的可溶性。然而，如图13所示，用100mg/5ml啤酒溶液，不可溶材料的量减少达46％。在第二个反应系列中，研究温度的影响，使用处于+4℃1个月的使其稍微更加清澈的啤酒酵母进行。增加孵育温度7℃(从30℃至37℃)明显增加了可溶性(不可溶材料从64％至54％)。相反，当温度升高至50℃时，不可溶材料的量仅减少26％，暗示酶不耐受这么高的温度。在37℃下，glucanex产生与链霉蛋白酶和果胶酶大约相同程度的不可溶材料的量的减少(参考图10、图12和图13)。

组合的酶处理的影响

如上文所示，蛋白和多糖降解酶在降低Progut型产物或啤酒酵母溶液中不可溶材料的量上非常有效。然而，这些酶类型单独都不能产生水溶性产物。然后研究蛋白酶和例如葡聚糖酶的反应性是否是组合的，即通过这些酶的组合作用可产生可溶性产物。

Glucanex和赛威蛋白酶

Glucanex和赛威蛋白酶都是有成本效益的工业酶，并且因此被选择来测试组合反应性。当比较单独的glucanex(图13)或单独的赛威蛋白酶(图11)与其组合作用的影响时，清楚地发现这些酶一起更有效地发挥作用(图14)：单独的glucanex(20mg，37℃)处理使不可溶材料降低47％，单独的赛威蛋白酶(4μl，37℃)处理使不可溶材料降低32％，而在其组合反应中，降低了77％(即仅12mg的初始干重材料残留为不可溶)。然而，甚至在进行的最好的反应中(glucanex 100mg于30℃下和赛威蛋白酶4μl于37℃下)，在最初100mg干重材料中仍旧有8.5mg残留于啤酒酵母溶液中。赛威蛋白酶显示不如链霉蛋白酶或果胶酶有效，而glucanex大约与链霉蛋白酶和果胶酶同样有效(参见上文)。glucanex和赛威蛋白酶对啤酒酵母溶液的组合作用产生远比链霉蛋白酶和果胶酶更好的结果，实际上类似于链霉蛋白酶和果胶酶对Progut型产物的有效性。

与glucanex和/或赛威蛋白酶组合的内切葡聚糖酶

为了改善多糖的降解，研究与glucanex和赛威蛋白酶组合的内切葡聚糖酶(来自里氏木霉的内切葡聚糖酶I)的有效性。glucanex和内切葡聚糖酶处理(图15)和单独的glucanex(图13)的实验显示没有累加作用；与对照相比不可溶材料的量分别是54％和53％。相似地，使用glucanex和赛威蛋白酶，在这些实验中，内切葡聚糖酶没有改善可溶性(使用EG为22％的和没有EG 23％的不可溶材料相比于对照)。

酸的影响

为了确立H₃PO₄与其他酸相比溶解作用的差异，选择两种强酸HCl和H₂SO₄用于酸水解实验。还研究了更高酸浓度对啤酒酵母溶液可溶性的影响。

具有或没有赛威蛋白酶的情况下增加浓度的H₃PO₄的影响

图16显示使用啤酒酵母溶液的两组实验的结果。清楚地，更高浓度的H₃PO₄(0.3M、0.5M和1M，于100℃)增加了产物的可溶性(图16，前3个柱对)。使用与80℃下更高浓度的H₃PO₄(0.3M、0.5M、1M和2M)的酸水解组合的啤酒酵母溶液的赛威蛋白酶处理，导致与100℃下的酸水解相当相似的可溶性。

HCl

使用可变的HCl浓度的啤酒酵母溶液的酸水解(图17)显示与用H₃PO₄水解非常相似的有效性。

H₂SO₄

与H₃PO₄水解相比(图16)，使用增加H₂SO₄浓度的啤酒酵母溶液的酸水解(图18)表明酸产生非常相似的溶解性。有趣地，与1M酸相比，使用2M酸降低了酸水解产物的可溶性。2M H₂SO₄可能从啤酒酵母溶液中沉淀组分，因为其是如此强的酸。

均化的影响

为了分析啤酒酵母溶液的机械处理是否将改善酸水解的影响，通过工业匀浆器使啤酒酵母样品均化。当比较均化的和正常的啤酒酵母的1M酸水解结果时，可溶性增加10％(图19，相比于工艺水解，啤酒酵母不可溶材料75％残留，而均化的啤酒酵母不可溶材料65％残留)。相反，如图20所示，均化作用对酶glucanex、赛威蛋白酶和果胶酶的降解效应仅具有微小的影响。

PG、PG WS和PG WS E+的比较

根据本文显示的这些可溶性结果，选择5种样品制备用于细菌黏着抑制实验。这些样品为：

1.用glucanex处理和工艺酸水解的啤酒酵母溶液，

2.用glucanex处理和工艺酸水解的均化的啤酒酵母溶液，

3.对啤酒酵母溶液进行1M H₃PO₄酸水解，

4.对均化的啤酒酵母溶液进行1M H₃PO₄酸水解，和

5.用果胶酶处理的PG1。

这些样品在细菌黏着测定(与在以前的Progut型产物测试工艺中进行的类似)中都产生良好的结果，其中glucanex处理的样品最有效。然而，因为1M H₃PO₄酸水解产物几乎同样有效，其被选择产生用于田间实验。

在工业工艺中产生该水溶性Progut型产物(PG WS)和具有乳化剂的水溶性Progut型产物(PG WS+E)，并且研究来自这些产物的样品的可溶性。图21显示与PG1和PG2相比具有和没有乳化剂的水溶性Progut型产物的可溶性。当比较PG1和PG WS时，不可溶材料的量降低了40％。另一方面，当与PG WS的可溶性相比时，看来乳化剂没有增加可溶性。

另外，将过度水解的Progut型产物样品用于分析。该15小时水解的Progut型产物的可溶性实验显示当与PG1相比时几乎等量的不可溶材料残留。应进行进一步的分析以便能考虑是否存在例如过度降解。

结论

在工艺生产中啤酒酵母溶液的1M H₃PO₄水解产生可作为饮用水组分而递送至动物的产物。这意味着残留于水溶性Progut型产物的不可溶材料的量(26％)足够少以便在对动物的递送过程期间其将保持液态。产生PG-WS的这一工艺显著增加了可溶性，从目前Progut型产物的42％的不可溶材料至PG-WS的26％。Progut型产物或啤酒酵母溶液的与工艺酸水解组合的酶促处理产生比上文提到的单独1M H₃PO₄水解甚至更多的可溶性产物。当用链霉蛋白酶或glucanex和赛威蛋白酶的组合作用处理时，不可溶材料的量最多减少至10％。

实施例3

Progut型产物、新的可溶性产物和竞争剂在水中的可溶性

进一步开发水解工艺以产生Progut型可溶性产物，称为可溶性Progut型，其可作为自动饲料机中的液体混合物用在动物喂食中，而没有递送的问题。Progut型产物的可溶性平均为约50％(n＝9)，而Progut型可溶性产物的可溶性超过70％。竞争性产物都显示低于40％的可溶性(图23)。

Progut型可溶性产物的特性

关于动物的健康和康乐，认为Progut型产物和其他酵母产物中生物相关的材料是可溶性多糖和寡糖。本文中，在1％或更稀释的溶液中，所有寡糖都是可溶的。不可溶部分由细胞壁组分组成，即主要由不可溶多糖和蛋白组成。在凝胶渗透色谱(GPC)中，可溶性多糖和寡糖以及肽(本报道中也称为“中等大小的材料”)在6-14ml洗脱，并在214nm处测量其相对量。

Progut型可溶性产物的改良水解工艺产生中等大小材料的几乎2倍的增加，且在进一步加工的新的Progut型可溶性产物中检测的量几乎是3倍更高(图25和图26)。本发明还揭示了分离的实际上完全可溶的产物，称为水溶性Progut型产物。

多糖和寡糖以及肽的量在3种竞争剂产物中大体上更低(图27和图28)。

可溶性材料与细菌黏着分析的相关性

Progut型产物的生物活性与中等大小材料的量成比例。图29显示更大量的多糖和寡糖以及肽导致更高的细菌黏着活性。还明显的是，携带少量中等大小材料的竞争剂产物显示远远更低的大肠杆菌细菌黏着(图30)。单糖分析-甘露糖含量的比较

相信酵母产物中的甘露聚糖和甘露寡糖是生物活性组分。因此测量可溶性多糖和寡糖级分的甘露糖含量，并且如图31所示，Progut-型产物具有明显比竞争性产物更多的可溶性甘露寡糖。

还比较了甘露糖含量与大肠杆菌的细菌黏着活性。发现甘露糖量和细菌黏着活性之间的相关性不是直接的(图32)。因此假设不是所有的甘露糖多糖和寡糖显示相似的细菌黏着活性，而是某些结构显示更高的生物活性。

可溶性组分的NMR分析

¹H NMR分析能揭示Progut型产物和其他酵母产物中甘露寡糖的结构特征。图33显示了Progut型产物样品的NMR分析。典型酵母甘露聚糖糖类及其特征性NMR峰的结构细节显示于插图中。

通过比较Progut型产物和3种竞争剂产物的NMR光谱(图34)，可以得出结论，末端Manα1-3单元的相对量(图33和图34的蓝色标记)在Progut型产物中明显更高。已显示一些大肠杆菌菌株(对肠道健康有害)优先结合哺乳动物中的Manα1-3结构。具有末端Manα1-3单元的寡糖的增加是Progut型产物工艺水解步骤的结果。

1HNMR分析的详述

根据其糖类组成，NMR样品被分为两类。

含有低分子量甘露多糖/甘露糖寡糖的样品

糖类信号的谱线形状/宽度表明糖类相当大。基于更高甘露聚糖寡糖的发表数据，已指定了成分甘露糖单元的异头1H信号。鉴定了以下甘露寡糖片段。对应于大写字母的甘露糖单元为黑体。每个样品中不同甘露糖残基的相对浓度示于表1。使用峰高度进行积分，并给定A的信号值为1。根据积分，与来自竞争剂的样品相比，PG样品中末端α-D-Manp-(1-3)-α-D-Manp-(1-2)和其他常见甘露糖表位的浓度更高，另外α-D-Manp-(1-3)-α-D-Manp-(1-2)表位B与内部α-D-Manp-(1-2)表位A的相对比例更高。所有这些样品还含有如表3中指示为(+)的淀粉。关键甘露糖信号的积分表明PG型样品中的淀粉含量更低。

对应于甘露糖NMR信号A-E的特定单糖结构的列表

A)

-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-

B)

α-D-Manp-(1-3)-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-

C)

D)

-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-(1-6)-α-D-Manp-

E)

-α-D-Manp-(1-6)-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-

和

和

α-D-Manp-(1-3)-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-

表3.甘露寡糖片段的¹H-NMR信号和不同甘露糖残基的相对浓度。样品名称中的‘大’指示来自凝胶渗透色谱6-12ml洗脱的大的大小的组分。

^X由于背景难于指定，但明显小于5.302。

含有淀粉寡糖的样品

以下样品含有淀粉寡糖作为唯一的可鉴定糖类组分：PG1中等(从GPC于12-16ml洗脱)、PG2中等、PG3中等、PG4中等、PG6中等、PG7中等、PG8中等、PG9中等、PG15h中等、PG10中等、PG11中等、PG12中等、PG13中等、PG14中等、Ag中等、As中等、Al中等和BM中等。

指定是基于分别对应于[α-(1-4)Glcp]_n链、α-(1-6)-Glcp分支点以及还原端α-D-Glcp和β-D-Glcp的异头H1的于5.409ppm、4.972ppm、5.231ppm和4.645ppm处信号的存在。

还存在可能含有除了淀粉寡糖主要组分之外还有甘露寡糖片段的几种样品。这些分子的鉴定需要进一步的研究。

样品PG1中等、PGS中等、PGS+E中等和PG WS中等的NMR谱中，存在对应于末端片段α-D-Manp-(1-3)-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-和α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-的信号。

低淀粉量

表4包括通过NMR对大的糖类级分中淀粉的定量。在优选实施方案中，本发明涉及糖类级分(6-12分钟和任选地还有寡糖)和根据本发明的材料，其中淀粉Glcα4表位的量比Manp-(1-3)-α-D-Manp-(1-2)小3.5倍多，更优选地小于3倍。本发明进一步揭示了在本样品中存在指示低分子量淀粉链的淀粉的还原端信号。另外，根据本发明的优选淀粉含有适量Glcα6分支结构。本发明涉及在大量优选甘露糖糖类中的少量淀粉。应意识到，淀粉片段可由淀粉酶型酶降解。在优选实施方案中，残留的淀粉材料由诸如淀粉酶的淀粉降解酶降解来获得更纯的甘露糖/葡萄糖糖类。中等Superdex肽凝胶过滤级分的分析揭示了在新的可溶性级分(PG水溶性和可溶性)中淀粉寡糖的量特别低。

在新的可溶性制品中存在更大量的甘露糖寡糖

在可溶性(可溶性和水溶性)糖类制品中甘露糖寡糖的信号更明显。当比较可溶性制品之间的α-D-Manp-(1-3)-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-信号与淀粉寡糖信号时，这些信号是至少约20％的淀粉Glcβ4信号，在某些制品中甚至为约30-60％的淀粉信号和约等量的总指定寡糖。在以前的工艺制品中，只观察到非常低的α-D-Manp-(1-3)-α-D-Manp信号，并且仅有很少百分比的，一般低于约5％的淀粉信号。包含在12-16分钟之间洗脱的更大寡糖的中等级分包含大多数寡糖，除了最小的寡糖(二糖和可能部分三糖)但不是单糖。应意识到，更小甘露糖寡糖不可能存在样品中。如凝胶过滤分布所示，中等级分的量(superdex肽12-16)是总糖类类型材料的大部分，估计为总糖类的约20-50％。因此，样品包括总糖类中至少约4％-30％、更优选地至少约5-30％、甚至更优选地至少约10-30％的甘露糖寡糖。基于样品的甘露糖和葡萄糖含量，总的包含甘露糖的糖类中甘露糖寡糖的量为约10-60％，更优选地20-60％。

制品中的甘露糖寡糖高度富集末端Manα3-表位，其为制品中的主要甘露糖信号，表明新的生物活性的甘露糖糖类的富集抑制甘露糖结合病原体。

数据揭示了通过本文优化的产生可溶性的方法而不是包括之前的progut方法的其他方法或通过竞争性方法，有效地产生在12-16分钟之间洗脱的更低分子量的实际上主要的甘露糖寡糖。

令人惊讶地，竞争剂材料看起来不含有大量的甘露糖寡糖，尽管这些寡糖中的一些被广告为甘露寡糖。尽管许多公司的努力，但看起来从酵母中有效产生甘露糖寡糖不是容易的任务。

如还由非常广泛的且弱的NMR信号与根据本发明的材料的更窄和平滑的信号的比较所证明，竞争剂中残留的甘露糖材料看起来作为高分子量可溶性差的材料。在优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的新的糖类材料，其产生与甘露糖信号A-E和根据本发明的Glcβ-信号基本上相似的NMR谱，优选地包括相似的峰宽度和/或相似的峰积分和高度以及相似的少量淀粉信号和/或诸如在约4.7ppm的杂质信号的其他杂质，包括可能的非碳水化合物材料。

NMR分析的参考文献：

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总之，如¹H NMR所示Progut型产物含有更多的末端Manα1-3单元(图33和图34)，并且如通过可溶性材料的单糖分析(图31)所示甘露寡糖含量比竞争剂产物更高。根据这些结果可以得出结论，Progut型产物中活性甘露寡糖的量明显高于竞争性产物。

包含α-Glc和β-Glc的材料的指定

表4显示了Progut型样品中特别存在Glcb材料。通过约4.53ppm处的NMR信号所示，可溶性产物中发现最大量的Glcb材料。本发明特别涉及当约4.53ppm处的GlcβNMR信号量为约5.14ppm处的Manα3信号的至少约80％(表4中0.8倍)、更优选Manα3信号的90％(表4中0.9倍)时的新的可溶性产物。本发明涉及甚至等摩尔量的末端Glcβ和Manα3材料。

应注意，没有竞争性材料含有Glcβ-信号。Glcβ-信号被认为包括大量的Glcβ6-材料，指定为3.31ppm处Glcβ6-H2信号的信号的存在进一步支持了这一点。Glcβ-信号还与谷物葡聚糖信号区重叠，且认为信号形状指示优选糖类材料中谷物葡聚糖衍生的糖类的Glcβ4表位的部分存在。

表4.寡糖片段的¹H-NMR信号和不同单糖残基的相对浓度。样品名称中的‘大’指示来自凝胶渗透色谱6-12ml处洗脱的大的大小的组分。

^a注意：Glcβ1-6和Glcβ1-4的H1信号的值相同。

^bGlcβ1-6葡聚糖中Glcβ1-3分支的H1

^c未测量该信号的强度，而是指该信号是被检测(是)或未被检测(否)

^d注意，4.53ppm处存在相当大的背景；因此，强度可能有些估计过高

+小信号，明显可检测的双峰，太小以致不能被积分

-没有可检测的信号

n.d.未确定，产生自H₂O的信号叠盖了检测该信号的可能性

实施例4.动物试验

使用用在测试Progut中的标准方法(Suomen Rehu发表)，用新的糖类制品水溶性PG作为占饲料或饮用水0.3％-3％量的食物补充剂喂食测试动物。观察到比使用常规Progut制品或竞争性产物更高的体重增加和/或更少的腹泻。

Claims

1.产生用于在动物或人类中预防胃疾患、肠疾病和促进生长的包含糖类的产物的方法，其包括：

a.提供啤酒酵母；

b.通过在70-100℃下在选自HCl或硫酸或磷酸的0.5M至1.25M强酸中持续2-8小时的优化酸水解或通过酶和在70-100℃下在选自HCl或硫酸或磷酸的0.5M至1.25M强酸中持续2-8小时的优化酸水解的水解来产生糖类组合物，其中作为于水中的1%溶液，所述组合物的总体可溶性超过55%，所述酶选自链霉蛋白酶、赛威蛋白酶、果胶酶、内切葡聚糖酶、glucanex和与赛威蛋白酶和/或内切葡聚糖酶组合的glucanex。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述可溶性超过60%。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述可溶性超过70%。

4.如权利要求2所述的方法，其中使用酶促水解和优化酸水解两者。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述优化酸水解在选自组HCl、磷酸或硫酸的0.5M至1.25M强酸中进行，并且水解酶是链霉蛋白酶或赛威蛋白酶或糖苷酶。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述优化酸水解在0.5M至1.25M磷酸中进行。

7.如权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：

a.提供啤酒酵母，并物理均化；

b.通过无机酸水解。

8.如权利要求1所述的方法，其中反应时间是3小时至5小时。

9.如权利要求1所述的方法，其中反应时间是3.5小时至4.5小时。

10.如权利要求6所述的方法，其中所述酸浓度介于0.75M和1.25M之间。

11.如权利要求2所述的方法，其中可溶性糖类级分通过选自以下的组的方法或其任意组合来分离或纯化：

a.色谱方法i至iii

i.用于吸收带电的和/或亲脂的杂质的色谱；

ii.大小排阻色谱来去除低分子量杂质；

iii.具有与糖类或其一部分结合的基质的亲和色谱；

和/或

b.相分离溶液方法，

和/或

c.溶液和沉淀剂的离心和分离；

和/或

d.包含Glcα的糖原/淀粉型糖类的酶促水解。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述相分离溶液方法是用溶剂提取，和/或杂质或糖类的沉淀。

13.如权利要求11所述的方法，其中大小排阻色谱是凝胶过滤，和/或亲和色谱是在活性炭上的色谱，和/或相分离溶液方法是在有机溶剂中沉淀。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述有机溶剂是醇或酮。

15.如权利要求11所述的方法，其中通过疏水和/或离子交换和大小排阻色谱纯化所述糖类级分。