JP5219329B2 - 下痢の予防又は治療用の医薬組成物 - Google Patents

下痢の予防又は治療用の医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP5219329B2
JP5219329B2 JP2004516828A JP2004516828A JP5219329B2 JP 5219329 B2 JP5219329 B2 JP 5219329B2 JP 2004516828 A JP2004516828 A JP 2004516828A JP 2004516828 A JP2004516828 A JP 2004516828A JP 5219329 B2 JP5219329 B2 JP 5219329B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
receptor
oligosaccharide
pharmaceutical composition
present
receptors
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2004516828A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2006506329A5 (ja
JP2006506329A (ja
Inventor
オングストロム，ヨーナス
テネベリ，スサン
サーリネン，ユハニ
サトマー，テロ
ロフェ，ニアム
ナトゥネン，ヤリ
ミラーポラザ，ハリナ
カールソン，カール−アンデシュ
アブル−ミル，マン
Original Assignee
ネステク、リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FI20021275A external-priority patent/FI20021275A0/fi
Priority claimed from FI20030564A external-priority patent/FI20030564A0/fi
Application filed by ネステク、リミテッド filed Critical ネステク、リミテッド
Publication of JP2006506329A publication Critical patent/JP2006506329A/ja
Publication of JP2006506329A5 publication Critical patent/JP2006506329A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5219329B2 publication Critical patent/JP5219329B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56905—Protozoa
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

本発明は炭水化物生化学と臨床微生物学の分野に関する。本発明は、病原体阻害性オリゴ糖配列である化合物又は病原体阻害性オリゴ糖配列を含有する化合物の精製画分を包含する治療用の医薬組成物を提供する。本発明は、特に、ヒトの下痢の病原体に結合するオリゴ糖含有物質又はレセプターに関する。本発明は、様々な病理学的接着メカニズムを有する種々の異なる病原性細菌についての幅広い研究に基づくものである。本発明者らは、特異的に調節可能な複数の共通のレセプターを見出し、これにより、単一のレセプター配列を用いて効果的な治療を行える可能性が減少した。そして、少なくとも２種の異なるオリゴ糖配列を包含する特別な医薬組成物が特に有用であることを見出した。本発明は特に下痢原性大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌に対して用いられるものであり、また、例えば、ヒト下痢発症性病原体（特に下痢原性大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌）の存在により引き起こされる疾患の予防又は治療用の、オリゴ糖を用いた医薬組成物や栄養組成物などに関する。本発明はまた、上記レセプターを用いたヒト下痢発症性病原体（特に下痢原性大腸菌及び人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌）の診断方法にも関する。
細菌によるコロニー形成と感染について最も関心が高いのは、細菌が上皮細胞表面に接着するメカニズムである。種々の細菌の結合について記載する先行技術文献では、本発明によるレセプターの組み合わせを感染症、特に腸感染症（intestinal infections）に対して用いることについては記載していない。本発明はまた、消化器系感染症（gastrointestinal infections）、特に経口感染症（oral infections）や、肺感染症（lung infections）に対しても使用できる。
EPECの炭水化物結合性
ＣＨＯ細胞の変異株を用いた、グリコシル化がEPEC（腸管病原性大腸菌）の結合に及ぼす影響に関する研究が報告されている。シアル酸とGalを欠損する変異株（sialic-acid-and-Gal-lacking mutant）はシアル酸を欠損する変異株（sialic acid lacking mutant）よりも結合活性が低いので、上記研究報告の筆者らは、結合配列はGalβ3GlcNAc又はGalβ4GlcNAcとシアル酸である可能性を示唆した。また、Galβ3GlcNAc又はGalβ4GlcNAcを使用するアイデアは特許化されている。EPEC介在の細胞脱離（EPEC mediated cell detachment）にシアル酸が必要である可能性が示唆された（Vanmaele, R.P. et al., 1995）。しかし、細胞表面のグリコシル化には何種類もの糖タンパク質と糖脂質が関与しており、グリコシル化の生合成経路は非常に複雑なので、グリコシル化に対して変異が及ぼす様々な生合成上の影響についてはまだ適切な特徴づけがなされていない。本発明によると、全てのシアル酸オリゴ糖配列が活性なのではなく、また、同様に、すべての構造体においてニ糖が単独で活性を示すわけでもない、ということが示された。本発明は、従来のデータからは特定することのできない、更に特異的且つ効果的な構造体の用途を含むものである。上記筆者らの別の研究においては、Ｎ−アセチルラクトサミン−ＢＳＡネオ糖タンパク質とＬｅx−ＢＳＡネオ糖タンパク質を０．４〜０．８ｍｇ／ｍｌの濃度範囲内で用いると、あるEPEC株のＨｅｐ−２細胞への結合が阻害された（Vanmaele, R.P. et al., 1995）。本発明によると、二糖配列やＬｅxはEPECへの強い結合には不十分であり、より大きいか又はより特定された本発明によるオリゴ糖配列のほうが好ましい。また、本発明においては、いくつかの病原体（特定されていないものでもよい）によるあらゆるタイプの下痢発症性感染症の治療を行なうために、２種又はそれ以上のオリゴ糖配列の組成物を同時に用いる。特に、本発明においては、低濃度でも有効で、また強い抗原性やアレルゲン性を有する非天然のタンパク質構造体を含まない、医薬として有用な多価結合体（polyvalent conjugates）が提供される。
ＷＯ９６／３９１９０号はETEC（毒素原性大腸菌）の熱不安定毒素の結合特異性を開示している。この特許文献には、固体の不活性支持体に結合したラクトース、Galβ3GalNAc、GalNAcβ4Gal及びNeuNAcα3Galが開示されている。固体担体と弱い部分的レセプターエピトープを用いて得られた結果は、本発明とは無関係である。上記の最初の２つの二糖エピトープは、１価の阻害剤としては不活性であることが判明した。上記特許出願明細書には、本発明におけるような、より長くより有効なエピトープの記載もないし、可溶性多価結合体の記載もない。
少数の市販の糖脂質を用いたEPEC株の特異性のスクリーニングについて報告されている。活性の高い順に、アシアロ−ＧＭ１、アシアロ−ＧＭ２、グロボシド及びラクトＮ−テトラオースが結合することが判り、一方、シアリル化ガングリオシド、ラクトシルセラミド、グロボトリアオシルセラミド（Galα4Galβ4GlcβCer）及びフォルスマン糖脂質は陰性であった。いくつかの菌株を用いてアシアロ−ＧＭ１の結合が研究された。結合活性エピトープはGalNAcβ4Gal又は活性のより低いGalNAcβ3Galであると考えられる。上記報告の筆者らはまた、アシアロ−ＧＭ１ネオ糖タンパク質とGalNAcネオ糖タンパク質への結合が見られたとしているが、アシアロ−ＧＭ１への結合は、２５μＭ濃度のネオ糖タンパク質又は１ｍＭ濃度の未同定のオリゴ糖では阻害されなかった、と記載している（Jagannatha, H.M. et al., 1991）。上記報告の筆者らは、いくつかの菌株を用いて試験した本発明からは明らかないくつかの結合特異性を見出さなかった。これらの結合特異性には、細菌のラクトシルセラミドへの結合、Galα4Galへの結合（グロボトリオースとフォルスマン抗原に陰性）、及びシアル酸依存性結合が含まれる。この先行文献の結果が具体的に示すのは、上記の矛盾する結合は１価又は多価のオリゴ糖配列により阻害不能であり、したがって、この研究は、本発明におけるような医薬として有用なタイプの結合を示すものではない、ということである。全ての結合と阻害を示すことができなかった原因は、実験過程での技術的な失敗にあるのかもしれない。
ヒト母乳から得たいくつかのオリゴ糖画分について、３ｍｇ／ｍｌ濃度でEPEC株への阻害活性を示すか否かを分析した報告がある。阻害活性は五糖画分、ジフコシルラクトースと考えられる画分、ラクトテトラオース及びネオラクトテトラオースと考えられる画分、七糖画分並びに六糖画分、に見られた。これら画分は、予想される主成分にちなんで名付けられている。画分の組成は、成分の正確な構造まではわからない単糖分析法で決定した。画分の実際の組成や、微量しか含まれない糖や他の糖の存在の有無は調べていない（Cravioto, A, et al., 1991）。活性化合物の特徴づけを行なっていないので、このデータからは本発明に到達し得ない。
ヒト母乳ラクトフェリン、分泌型ＩｇＡ及び遊離分泌型成分がHeLa細胞の糖タンパク質へのEPECの結合を阻害することが示されているが、阻害物質の炭水化物構造は開示されていない（Nascimento de Araujo and Giugliano, 2001）。
Galα4Galβ4GlcへのEHEC（腸管出血性大腸菌）毒素の結合阻害を示すデータ、及びGalβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerに結合する大腸菌の他の毒素の結合データからは疾患の治療は示されていない。Galα4Galβ4Glcを含む固相結合体を毒素の阻害に使用して下痢を治療する方法が示唆されている。単一のエピトープを用いる臨床試験は失敗した。本発明の多価結合体は、具体的には、病原体、特に下痢発症性大腸菌（diarrhea causing E. coli）の菌体付着を効果的に阻害するための可溶性多価結合体として提供される。本発明の具体的態様の一例として、毒素非産生性大腸菌の阻害がある。毒素阻害性オリゴ糖は各種大腸菌に対して適用するためのものではない。
特定のETEC株由来の精製した種々のコロニー形成因子（colonization factor）はアシアロ−ＧＭ１（Galβ3GalNAcβ4Lac-Cer）には結合するが、シアリル化した対照ガングリオシドには結合しないことが示された（Oroe, et al., 1990）。あるコロニー形成因子は、ウサギの腸のいくつかのガラクト糖タンパク質に結合することが示された。この結合はアシアロ−ＧＭ１、ＧＭ１及びＧＭ２により阻害することができるが、ＧＭ３による阻害や、GalNAcβ4Gal−ネオ糖タンパク質に結合した接着因子による阻害はそれほど効果的ではない。ヒト胎便糖タンパク質とその脱シアリル型及び脱フコシル型による阻害はそれらより弱く、ウシ グリコフォリンによる阻害は最も弱かった。Maackia amuriensisのレクチンの結合と同様に、胎便由来の糖タンパク質の結合もおそらくはポリラクトサミンに依存するのであろう。シアル酸残基は結合には重要ではないと考えられる（Neeser, J.R. et al., 1989; Wenneras, C. et al. 1995）。しかし、この研究は、下痢やその他の感染症の治療に役立つ明確な多重エピトープ（multiepitope）を示してはいない。ポリラクトサミンに特異性があるとしても、それは開示されていない。本発明では、ポリラクトサミン型の配列、例えば分岐構造、の全てが活性なのではないことを示している。特異性の組合せを用いることは先行文献には開示されていない。
ヒト母乳ガングリオシドＧＭ１とＧＭ３及びそれより弱いがＧＤ３も、ヒト癌細胞であるCaco-２細胞へのETEC株とEPEC株の結合を阻害したが、ラクトシルセラミド、ＧＤ３−ラクトン及びＮ−アセチルノイラミン酸は陰性であった。本発明では、ラクトシルセラミドの結合及びシアル酸依存性の結合を開示する。この先行文献では、あまり特徴づけされていない１つの特異性の存在の可能性を示しているだけであり、もしそれが存在するとしても、本発明で開示される結合特異性に含まれるものではない。
HeLa細胞へのEPECの結合は１００ｍＭ Ｎ−アセチルガラクトサミンで阻害され、細菌の膜タンパク質はGalNAcを用いるアフィニティークロマトグラフィーで精製された（Scatelsky et al., 1988）。しかし、単糖への弱い結合が開示されているだけであり、その結合の生化学的意義についてのいかなる結論も導くことはできない。
EPECはMan、α−メチル−Man及びMan含有Ｎ−グリカン配列に結合し得る。最も活性な化合物はManα1-3Man-構造を含んでいた（Neeser et al., 1986）。それ以前の研究により、Manα1-3Manβ1-4GlcNAc、Manα1-パラニトロフェニル及びManα1-3(Manα1-6)Manα1-6(Manα1-3)Manα1-OMeが、大腸菌 346株の１型絨毛によく結合するものとして特徴づけられた（Firon et al., 1982）。しかし、これらの先行文献には、エピトープを他の特定の結合性分子とともに用いることは記載されていない。
ETEC株による赤血球凝集が、ムチン II型（Sigma製）、赤血球糖タンパク質製剤、ガングリオシド II型及びシアル酸（１ｍｇ／ｍｌ）により抑制された。赤血球凝集は、プロテアーゼ、シアリダーゼ、過ヨウ素酸塩、尿素及び塩酸グアニジウムで防止できた。この研究は、実験条件下で結合に関与する可能性のあるシアル酸の特性を記載していない。（Barthus et al., 1985）。
ＣＦＡ／Ｉを精製して、重量平均分子量（Ｍｗ）約２３，８００の高分子タンパク質であることを示した。精製タンパク質は、酸で凝集させた際に血球凝集活性を示した。Ｎ−アセチルノイラミン酸だけが血球凝集を阻害した。NeuNAcの効果は非特異的であることが示唆された（Evans et al., 1979）。シアリル化された可能性があり、シアリダーゼに感受性のある糖タンパク質レセプターがETECに関して報告されている（Pieroni, P., and Worobec, E.A., 1988, Wenneras et al., 1990）。
HeLa細胞に対する腸管凝集性大腸菌（EAEC）の結合が、特性付けされていないヒト母乳タンパク質画分で阻害可能であるとの報告がある（Nascimento de Araujo and Giugliano, 2000）。しかし、関与する炭水化物（もしも存在するとして）への結合の特異性については記載されていない。
US 20030405503には、１価のオリゴ糖であるGalα4Galβ4Glcがシガ毒素及びシガ様毒素（shigalike toxin）を阻害することが示唆されているが、この阻害剤は１価型では有用ではないようである。５％濃度の１価の阻害剤（約１００ｍＭのオリゴ糖に相当する）を用いると毒素の阻害にわずかな効果が得られたが、そのような高濃度では脱水その他の予期しない作用が生じることもあり得る。本発明においては、１価のGalα4Galβ4Glcを０．３ｍＭの有用濃度で用いて毒素非産生性の下痢発症性大腸菌を阻害したり、また、グロボレセプターオリゴ糖を低濃度で用いて上記大腸菌を阻害する。
２つの特許出願明細書に、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースを用いてビフィドバクテリウム属細菌を刺激すること（US 5906982）と、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースを用いて大腸菌及びその他の細菌を阻害すること（US 6083934）が記載されている。これらの阻害は大腸菌の結合に対するものではなく、大腸菌の培養中に起こるものである。これらの発明には、上記物質と他の糖との組み合わせの有用性は示していない。これらの出願明細書は、本発明で用いた下痢原性の大腸菌や型に関する阻害を示していない。LundbladとBiocarbの特許出願においては、幼児の便質を向上するためのラクト−Ｎ−ネオテトラオースに関する発明が請求されているが、その発明は下痢の治療（特に、本発明における大腸菌により引き起こされる下痢の治療）が目的ではない。
尿路病原性大腸菌
尿路病原性（uropathogenic）大腸菌の結合に関して多くの研究がなされている。この細菌は、例えば、Galα1-4Gal配列に結合する。PCT/SE81/00065は、腸の疾患ではなく、尿路の疾患を引き起こす大腸菌の結合活性について記載している。そのデータは下痢原性大腸菌のGalα14Galへの結合を示すものではない。尿路病原性細菌は、下痢を引き起こす腸在の病原体、例えばEHEC、ETEC、EPEC、EAEC又はEIECとは異なる。細菌の結合・感染メカニズムは細菌の菌株間や種間でも異なり、ある細菌に関する実験結果を一般化して他の細菌に当てはめることはできない。異なる臓器に感染する細菌の結合特異性は、特定の組織の表面に存在する組織特異的レセプターに適合したものである。ヒトと動物におけるグリコシル化は、一般に、組織特異的且つ種特異的である。種間の交差反応が生じ得る状況か否かを調べるためには、標的組織における正確なレセプター構造及び交差反応する細菌（cross-reacting bacteria）の特異性を特徴付けることが必要である。
一般に、先行技術では、感染症、特に腸感染症の効果的治療のために特定のレセプター活性の有効な組み合わせについて記載してない。先行技術はもっぱら個々の特異性にのみ注目しており、一般にそのような特異性は１つの細菌株に属する複数の細菌に同時に存在しないものである。単一の細菌株にも多様性が存在するため、結合特異性は実験ごとに異なる場合がある。また、先行技術は、本発明におけるような１価のオリゴ糖配列又は多価のオリゴ糖配列を用いた効果的な治療方法を示していない。
先行技術は、炭水化物を媒介とする病原体の結合に対するいくつかの阻害剤を治療のために組み合わせて同時に用いることは示唆していない。炭水化物を媒介とする病原体の結合に対するいくつかの阻害剤を治療に有用に組み合わせて用いることは、以下のような場合に考慮することができる：
１）病原性細菌（病原性細胞）の特定の株がいくつかの結合特異性を有する場合；
２）これら結合特異性のいくつかが病原体に同時に存在する場合；
３）対応するレセプターオリゴ糖配列が標的組織に提示されている場合；そして
４）関連するレセプターオリゴ糖配列が病原体の特異的結合のために存在する場合。
治療用のレセプターの組み合わせの有用性を考える際には、阻害剤として機能する可能性のあるオリゴ糖の個々の効果と組み合わせた場合の効果を明確にすることが必要である。本発明は、病原体の阻害のために有用な物質と組成物を示す。先行技術は結合の可能性を示すだけであり、本発明におけるような、病原体の結合に対する効果的な阻害剤を決定することは、先行技術からは全く不可能である。
ヒト消化器系に存在する関連レセプターオリゴ糖の同定
本発明は、ヒト消化器系上皮で一次又は第一接触レセプター（primary or first contact receptors）として機能できる糖タンパク質結合オリゴ糖配列の存在を開示する。いくつかの新規なレセプター配列を示す。病原体結合データを、最も適切な第一接触レセプターに関する新規な情報と組み合わせることによって、本発明者らは病原体結合に対する有効な阻害剤を決定することができた。本発明によるレセプターの分析により、いくつかの新規なタイプのレセプターが消化器系上皮に存在し、これらは第一接触レセプターとして病原体と一次接触する確率が高いことがわかった。
人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌
これまでに特性付けされたヘリコバクター属細菌は２０種類を越える（２００１年現在）。ヘリコバクター属細菌はいくつもの宿主（霊長類、豚、ネコ科動物、イヌ科動物、家禽、齧歯類など）から分離されている（２００１年現在）。ヘリコバクター属細菌は、宿主の胃腸管においては、胃のニッチと腸肝のニッチの両方から検出されており、ヘリコバクター属細菌は胃と腸肝についての様々な臨床所見と関連づけられている（Fox et al., 2000; Nilsson et al., 2001）。
本発明はまた、H. pylori以外のヘリコバクター属細菌、特に、下痢や肝臓病の病因となる腸肝感染性ヘリコバクター属細菌、も対象としている。このような細菌はｚへリコバクター（zHelicobacter）（複数形はｚへリコバクテリア（zHelicobacteria））と称し、典型的には人畜共通感染性で、即ち、ヒトと動物の両方に感染し、そのような動物としては家畜やペット（犬や猫など）が挙げられる。本発明の他の１つの態様としては、本発明は、ｚへリコバクテリアによる胃の感染も対象とする。
ヒトの胃の病原体であるH. pylori への炭水化物の結合
Helicobacter pyloriは、ヘリコバクター属のうち最も広く研究されている種であり、胃の病理と関連している（Hunt, 1996）。特に、この細菌は、慢性的感染の維持に極めて関連深い可能性のある２つの抗原、即ちLewisb（Leb）抗原（Boren et al., 1993）とシアリル−２量体−Lex（Sialyl-dimeric-Lex）抗原の両方に結合する能力が高い（Gerhard et al., 2001; Madhavi et al., 2002）。糖結合体（glycoconjugates）（脂質をベースにしたものとタンパク質をベースにしたもの）は、この微生物の結合レセプターとして機能することが報告されており、そのような糖結合体の例としては、シアリル化糖結合体（Evans et al., 1988）、スルファチドとＧＭ３（Saitoh et al., 1991）、ポリグリコシルセラミド（Miller-Podraza et al., 1996; 1997a）、ラクトシルセラミド（Angstrom et al., 1998）、ガングリオテトラオシルセラミド（Lingwood et al., 1992; Angstrom et al., 1998）が挙げられる。他にH. pyloriのレセプターである可能性があるのは、例えば、多糖ヘパラン硫酸（Ascensio et al., 1993）やリン脂質ホスファチジルエタノールアミン（Lingwood et al., 1992）などである。最近、ラクトテトラオシルセラミド（Teneberg et al., 2002）への結合と２型ラクトサミン（PCT/FI02/00043）への結合が報告されている。
Zopf et al.の米国特許第5,883,079号 (1999年3月)、第5,753,630号 (1998年5月) 及び第5,514,660号 (1996年5月) には、Neu5Acα3Gal含有化合物がHelicobacter pyloriの接着に対する阻害剤として記載されている。シアリル−ラクトース分子はヒト消化器系細胞株へのH. pyloriの結合を阻害し（Simon et al., 1997）、また、アカゲザルの感染モデルにおいても有効性が認められる（(Mysore et al., 1999）。この化合物は現在臨床試験中である。Krivan et al.の米国特許第5,446,681号 (1995年11月)には、ペニシリン抗生物質に結合したアシアロガングリオシドを含んでなる細菌レセプター抗生物質結合体が記載されている。特に請求されているのは、アモキシリン−アシアロ−ＧＭ１結合体によるHelicobacter pyloriの処理である。この発明に記載されるオリゴ糖配列／糖脂質はガングリオ系糖脂質には属さない。Krivan et al.の米国特許第5,386,027号 (1995年1月)と第5,217,715号 (1993年6月) にはオリゴ糖配列又は糖脂質を用いていくつかの病原性細菌を阻害することが記載されているが、本発明で用いたヘリコバクター属細菌は記載されていない。
上記の先行文献に開示されているのは、本発明の目的とは異なるH. pyloriの炭水化物レセプターである。本発明は更に腸疾患、特に下痢、及び、胆石と肝臓癌を含む肝胆道疾患の治療を目的とするものである。
H. pyloriとH. mustelaeがガングリオテトラオシルセラミドに結合することは以前の研究（Milh et al.）で明らかになったが、今回の研究でそれが確認された。これらの細菌種は本発明と関連するｚへリコバクター（人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌）に属するものではないが、対照種として実験に用いた。
発明の概要
本発明は、少なくとも２種の化合物の精製画分を包含する治療用の医薬組成物であって、該化合物は、下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれる病原体阻害性オリゴ糖配列であるか又は該病原体阻害性オリゴ糖配列を含有する化合物であり、該医薬組成物が下記式（Ｉ）で表される病原体レセプターを１種だけ包含する場合にのみ、下記式（ＩＩ）で表される少なくとも１種のアルファ−ヘキソースレセプターを共に包含することを特徴とする医薬組成物に関する。
[Sacch1]m1Galβx(Fucα4)m2Glc[NAc]m3[β3Gal{β4Glc(NAc)n1}n2]n3[βR2]n4 （Ｉ）
（式中、xは３位又は４位の結合位置を表し；
Sacch1はGlcNAcβ3、Galα3、GalNAcβ4、Galα4又はNeu5Xα3/6であり、式中のXはAc又はGcであり；
n1、n2、n3、n4、m1、m2及びm3は各々独立に０又は１であるが、
但し、xが３位、m1が０、且つm3が１の場合にのみ、m2は１でもよく、
Sacch1がNeu5Xα3、Galα3、GalNAcβ4又はGalα4である場合にのみ、m3は０でもよく、
n4が１の場合には、m3とn3は共に０であり、
n4が０の場合には、m1、m2及びn3のいずれかが１であり；
R2は、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体であり；そして
Sacch1がGalα3又はGalNAcβ4であり、該医薬組成物が式（Ｉ）で表されるレセプターを少なくとも２種包含する場合には、レセプターは互いに式（Ｉ）中のSacch1、x、m2及びn4から選ばれる少なくとも１種が異なり、該医薬組成物は２つのシアル酸レセプター又は２つのネオラクトレセプターを包含しない。）
Hexαp[(Hexαr)]nHex （ＩＩ）
（式中、HexはGal又はManであり、nは０又は１であり、p及びrはMan残基間の３位又は６位の結合位置を表すが、
但し、HexがManの場合には、ｐが３位でｒが６位であるか、ｐが６位でｒが３位であり、
HexがGalである場合には、pが４位でnは０であるが、この時、式（ＩＩ）で表されるレセプターが上記式（Ｉ）で表されるGalα4Galレセプターと共に該医薬組成物に含まれることはない。）
特に本発明は、病原体、特に、下痢原性大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌に結合する上記の炭水化物レセプター、並びに下痢原性大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌への結合活性を有する上記オリゴ糖配列の類似体又は誘導体、からなる群より選ばれる少なくとも２種を同時に用いた、大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌の存在によって起きる下痢の治療及び予防のための方法を開示する。
本発明の目的としては、下痢原性大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌への結合性を有する本発明によるオリゴ糖配列を用いた薬剤、並びに上記オリゴ糖配列を用いた医薬組成物の製造方法、特に大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌の存在によって起きる疾患の治療のための医薬組成物の製造方法が挙げられる。
本発明はまた、下痢原性大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌の存在によって起こる疾患の治療方法に関する。また、本発明は、本発明によるレセプターを大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌を結合又は阻害する物質として用いた、下痢原性大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌の診断方法にも関する。
本発明の他の１つの目的は、大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌に結合するオリゴ糖配列を含む物質、医薬組成物及び栄養補助剤又は栄養補助組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記の大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌に結合する物質を用いた、大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌の型同定の方法であり、また、大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌の結合アッセイである。
本発明はまた、本発明によるオリゴ糖配列を用いた、病原体、特に下痢発症性細菌（例えば下痢原性大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌）の阻害に用いる食品安全性向上製品にも関する。本発明はまた、本発明によるレセプター炭水化物を用いて、下痢発症性大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌が存在するか否かを決定するための食品安全性分析法にも関する。
本発明はまた、ヒト消化管の糖タンパク質に提示されている新規なオリゴ糖レセプターに関する。本発明は、本発明のレセプターを用いた病原体結合と発病条件の解析方法に関する。
発明の詳細な説明
病原性ウイルス及び病原性細菌のヒト組織への結合は、炭水化物レセプターに依存する。いくつかの炭水化物は、病原性細菌又は病原性ウイルスによる感染に対する阻害効果の有無を調べるための臨床試験又は前臨床試験が行われている。例えば、シアリル化オリゴ糖は、ヒト胃在病原体H. pyloriを阻害する可能性があるとされ、他のオリゴ糖は、中耳炎を起こす細菌に対して有効であると示唆されているが、数年の研究の後に行われた最初の試験では結果は出ず、その他の試験も成功しなかったと発表されている。また、細菌毒素を阻害するオリゴ糖結合体に関するフェーズ III試験が２件失敗している。これらの失敗は、ひとつには、疾患の背後にある正確な病因のメカニズムに対する不十分な理解に関係している。本発明は、病因に関するレセプター及び分子機構についての広汎な研究を含み、複数の病原体の処置と診断を可能にするものである。特に、本発明は、大腸菌及び／又は人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌がヒトの腸に結合することによって起こる種々の下痢などの疾患の治療を目的とする。
具体的な態様においては、本発明は、家畜やペットの感染症の治療にも使用することができる。動物に感染する細菌の結合特異性はヒトの病原体の結合特異性とは異なる。しかし、数種の特異性を同時に用いる一般的なメカニズム及び多価結合体（特に本発明による可溶性多価結合体）は、動物の治療にも好ましく用いることができる。結合特異性はまた、部分的な交差反応性を有し、本発明に記載のいくつかのレセプターの組み合わせは、動物の治療に有用であるほか、ウシなどの動物から伝播するいくつかの細菌株に対しても有用である。本発明はまた、ヒトと一緒に生活する動物に由来し、おそらく感染の伝播（例：ウシからヒトへの感染）に関与するレセプター配列も示す。
本発明は、病原体を阻害し、病原体の処置に使用することができる炭水化物組成物及び炭水化物物質に関する。病原性細菌、毒素、ウイルス、菌類又は寄生生物などの病原体のヒトや動物の組織への結合は、主に、レセプター炭水化物に依存する。（本発明において、「病原体細胞」とは、病原性細菌、菌類及び寄生生物などの真核細胞並びに原核細胞を含む病原体を意味する。）本発明は、特に、いくつかの結合特異性を有する病原体又は病原体細胞による感染症の治療を目的とする。本発明は、病原体を阻害する炭水化物組成物及び炭水化物物質に関する。本発明の炭水化物組成物及び炭水化物物質は、炭水化物レセプターが媒介する病原体の結合を阻害し、その相互作用を防止又は阻害する。本発明は、特に、数種の結合特異性を同時に使用してヒト又は動物の細胞又は組織の表面に結合する病原体細胞の阻害を目的とする。
レセプター炭水化物はしばしば、病原体に感染しているヒト又は動物の細胞表面に存在する。あるいはレセプター炭水化物は病原体の表面に存在し、宿主である動物又はヒトによって認識される。レセプター炭水化物は、レクチンなどの炭水化物結合性タンパク質、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ又はトランスグリコシル化酵素などの炭水化物結合性酵素あるいは抗体によって認識され得る。もしくは、２種のオリゴ糖配列が、炭水化物−炭水化物間相互作用により相互に認識し得る。
公知の一般的なレセプター群（group of defined general receptors）、特に、病原体阻害性オリゴ糖配列を組み合わせて用いることによる、病原体の一般的な妨害
本発明は、オリゴ糖を用いる治療における非効率性の問題を解決する。本発明は、代表的な病原体が示す数種の結合特異性の同時使用を明示する。本発明は、病原体の存在によって生じる病態を治療するために、少なくとも２種の異なる病原体阻害性オリゴ糖配列を用いることが好ましく、少なくとも３種の異なる病原体阻害性オリゴ糖配列を用いることがより好ましい。好ましい態様においては、４種以上の異なるオリゴ糖配列が用いられる。本発明は、特に、数種の炭水化物結合特異性を有する病原体又は病原体細胞による感染症の治療を目的とする。本発明による炭水化物結合特異性は、一価又は多価の炭水化物によって阻害することができる。本発明によると、感染症を起こす病原体は、少なくとも３種の異なる阻害可能な炭水化物結合特異性を有することが好ましく、少なくとも４種の異なる阻害可能な炭水化物結合特異性を有することがより好ましい。本発明は、特に、レセプターオリゴ糖が病原体のターゲット組織に提示されている場合に、関連する感染症の治療を目的とする。２種以上のオリゴ糖配列の好ましい組み合わせは、使用する組成物の適切性、組成物の阻害能力及び１種以上の病原体に対する組成物の特別な相乗効果に基づく。
本発明は、特に、大腸菌による下痢の治療を目的とする。本発明は、下痢原性大腸菌、特に、EPEC（腸管病原性大腸菌）、ETEC（毒素原性大腸菌）、EHEC（腸管出血性大腸菌）、EAEC（腸管凝集性大腸菌）及びEIEC（腸管侵入性大腸菌）を含む大腸菌の菌体による感染症の治療に有用なレセプター活性オリゴ糖配列の組み合わせを示す。本発明は、多種の大腸菌株を示し、全ての下痢発症性大腸菌の菌体に共通した８種のレセプター活性からなる群を明示する。従来技術は、限定された数のレセプター配列及びEPECやETECなどの特定の病原体の中の限定された数の菌株に関するものであり、また特異性に関して矛盾するデータを含むものであった。大腸菌株間の違いにより、型又は株の異なる細菌の結合特異性に関していかなる一般化も不可能である。結合特異性がより多様な菌株からなる群又は主要な型の大腸菌に関連しているかどうかは、本発明によって示されているように、多数の菌株を研究することによってのみ評価することができる。下痢を起こす主要な病原体及び病原体の型に共通の結合特異性についての正確な知識は、効果的な治療法の合理的な設計を可能にする。
本発明は、新しい一般的な下痢の治療法を提供する。本発明によると、治療の対象となる下痢は大腸菌によるもの、つまり、その感染症が、主要な下痢原性（即ち、下痢発症性の）大腸菌の菌体、特に、EPEC（腸管病原性大腸菌）、ETEC（毒素原性大腸菌）、EHEC（腸管出血性大腸菌）、EAEC（腸管凝集性大腸菌）及びEIEC（腸管侵入性大腸菌）などのサブグループに属する大腸菌によるものである。これら５つのサブグループによる下痢は、下痢原性大腸菌による臨床上関連のある全ての下痢の大部分を包含する。従来技術においては、大腸菌による下痢の５つの主要な型に対する、炭水化物に基づく治療は記載されていない。従来の抗生物質を使用すると薬剤耐性の問題が発生するため、上述の下痢に対する一般的な治療は特に有用である。炭水化物に基づく抗付着治療（antiadhesion therapies）は、消化器系内に存在しうるレセプターの数が限られているために、薬剤耐性の問題を生じる可能性が低い。本発明の一般的で広範囲な下痢治療は、患者の下痢の病原体が診断されていない場合にも有用である。
本発明によると、いくつかのレセプターオリゴ糖配列は下痢発症性大腸菌の菌体に共通である。これらのレセプターは、下痢原性大腸菌による下痢の診断又は下痢の治療に有用である。本発明は、下痢発症性大腸菌の菌体の主要な型の全てに一般的に効果のある治療方法を初めて示す。本発明は、特に、少なくとも２種又は複数種のレセプターオリゴ糖配列を、下痢原性大腸菌に対して用いることを含む方法を提供する。更に、本発明は、下痢原性大腸菌の診断又は下痢原性大腸菌による感染症の予防又は治療のために、レセプター活性オリゴ糖配列の特定の組み合わせを用いることを含む方法を提供する。
本発明はまた、従来の抗生物質に耐性を示す細菌に感染した患者における腸内感染症の治療を目的とする。本発明は、更に、従来の抗生物質の治療効果を改善するために、本発明のレセプターオリゴ糖配列を従来の抗生物質と共に用いること含む方法を提供する。
本発明のこのような方法は、８種のレセプター結合特異性又は本発明に記載のその好ましい特定のサブグループに関する、特定の病原体菌株の分析と共に用いることができる。
本発明はまた、下痢発症型の大腸菌に対する一般的な治療を目的とする。先行の発明や研究は、下痢発症性大腸菌菌体の１つの型のみに関するものであった。種々の型の病原体を含む多くの菌株を研究した結果、８種の結合特異性が、EPEC（腸管病原性大腸菌）、ETEC（毒素原性大腸菌）、EHEC（腸管出血性大腸菌）、EAEC（腸管凝集性大腸菌）及びEIEC（腸管侵入性大腸菌）などの下痢発症性大腸菌の主要な型の全てに共通であることが初めて明らかになった。本発明は、少なくとも３つの型の大腸菌菌体に対し、より好ましくは４つ以上の型、最も好ましくは５つの型全部に対して、８種のレセプター結合特異性のうち１つを用いることを含む方法を提供する。同様に、本発明は、下痢原性大腸菌の主要な型のうちの少なくとも３つ、より好ましくは全部に対して、８種のレセプター結合特異性を組み合わせて用いることを含む方法を提供する。
本発明はまた、感染症の予防に特に有用な結合特異性の特定の組み合わせに関する。その組み合わせは下記の事柄に基づく。
−細菌阻害剤としてのオリゴ糖配列の特性についての知識、
−腸内上皮に存在する関連レセプター構造についての知識、
−感染カスケードにおいてレセプターが関与する様々な段階についての知識、
−正常細菌叢との相互作用を防止するために、病原体に対して特に有用なレセプターについての知識、
−特に安価な結合特異性阻害剤の設計、そして
−特定の菌株が結合特異性のサブグループに対する結合活性を有する場合の、局所感染症（local infection）のための特定のレセプターの組み合わせの設計。
本発明はまた、重要だが、あまり研究されていない、下痢発症性大腸菌の型又は種に対する治療を目的とする。本発明は、特に、EAEC（腸管凝集性大腸菌）による感染症の治療を目的とする。本発明は、また、EIEC（腸管侵入性大腸菌）による下痢の治療を目的とする。これらの細菌への感染は、特に発展途上国の子ども達の下痢の病因となり、このような感染症を治療するための新しい治療方法が重要となっている。細菌の特異性についての知識が欠けているため、EAEC及びEIECによる感染症の治療用阻害物質の必要性が強調される。
１つの具体的な態様においては、本発明は、毒素非産生性の下痢原性病原体、好ましくは毒素非産生性下痢原性大腸菌、による下痢の治療を目的とする。毒素阻害剤としてのオリゴ糖は、そのような病原体に対していかなる効果も発揮すべきではない。毒素非産生性下痢原性大腸菌は、ベロ毒素のような毒素を認識するGalα4Galベースとした炭水化物を分泌しないことが好ましい。他の１つの態様においては、毒素非産生性下痢原性大腸菌は、熱に不安定な毒素を発現しない。毒素非産生性下痢原性大腸菌は、好ましくはEPEC、EAEC又はEIECであり、より好ましくはEAEC又はEIECである。
本発明においては、驚くべきことに、Galα4Gal炭水化物が、毒素非産生性下痢原性大腸菌の阻害に使用できることを見出した。本発明は、グロボレセプターのみを、組織に結合するあらゆる型の大腸菌の阻害に用いること、より好ましくは毒素非産生性下痢原性大腸菌の処置に用いることを含む方法を提供する。好ましい態様においては、本発明は、本発明のによるオリゴ糖を用いた毒素産生性の病原体、好ましくは病原性大腸菌及びzヘリコバクターの結合の阻害、具体的には、オリゴ糖に結合する毒素の不在下において病原体の結合を阻害することを含む方法が提供され、また、本発明の他の１つの態様においては、本発明は、阻害剤としてのオリゴ糖に結合する毒素の存在下で感染症の治療及び病原体の除去を行なうことことを含む方法が提供される。
本発明に記載の８種の結合特異性からなる群は、あまり研究されていない大腸菌の型及び種に対する新規なレセプターの結合特異性を含む。本発明は、このようなレセプター単独及びレセプターをその一部として包含する組成物を特定の型の大腸菌に対して用いることを含む。好ましい態様においては、少なくとも２種又は３種のオリゴ糖レセプターをEAEC及び／又はEIECに対して用いる。本発明はまた、本発明によるレセプターオリゴ糖種の特定の組み合わせをEAEC及び／又はEIECに対して用いることを含む。
本発明はまた、ETECに対する新規な治療用オリゴ糖及びオリゴ糖の組み合わせを提供することも目的とする。
本発明はまた、EPECに対する新規な治療用オリゴ糖及びオリゴ糖の組み合わせを提供することも目的とする。
本発明はまた、EHECに対する新規な治療用オリゴ糖及びオリゴ糖の組み合わせを提供することも目的とする。
本発明の治療の対象となる下痢疾患の好ましい例は、水様下痢、出血を伴う下痢及び重症下痢を含む。具体的な適応症は、更に、旅行者下痢、特に発展途上国における小児下痢、出血性の下痢を含む重症下痢に関連する疾患、及び（特にEHECによる）溶血性尿毒症症候群（HUS）などを含む。本発明はまた、（特にEAECによる）持続性下痢の治療を目的とする。持続性下痢とは、具体的には、１４日以上続く下痢を意味する。本発明はまた、細菌性赤痢様の下痢（shigellosis like diarrheas）であって、特にEIECによるものにも用いることができる。細菌性赤痢型の下痢は、シゲラ属細菌（Shigella spp.）による疾患（水様下痢及び出血を伴う下痢を含む）に非常に似ている（そして細菌性赤痢型の下痢の病原体はシゲラ属細菌に非常に似ている）。細菌性赤痢とEIEC感染症を区別することは困難又は不可能な場合もある。旅行者下痢は、発展途上国を旅行する人々の間で共通する感染症であり、いくつかの型の大腸菌、特にETECによって発症する。
発展途上国においては、数億人の子ども達が下痢発症性大腸菌に感染している。発展途上国の小児下痢は具体的には、EPEC（腸管病原性大腸菌）、ETEC（毒素原性大腸菌）、EHEC（腸管出血性大腸菌）、EAEC（腸管凝集性大腸菌）及びEIEC（腸管侵入性大腸菌）を含む複数の型の大腸菌によるものである。現在、これらの下痢に特異的な一般的治療法はない。従来の抗生物質に対する細菌の耐性は増しており、ますます問題となっている。本発明は、特に、発展途上国における小児下痢の治療と分析を目的とする。発展途上国における小児下痢の治療に関しては、医薬組成物及び医薬物質は、（例えば塩とショ糖を含む）水分補給用溶液（hydration solution）に含まれた状態で下痢の治療に用いてもよい。医薬組成物はまた、木炭の錠剤と共に用いても、木炭の錠剤に混ぜてもよい。本発明による組成物及び物質は、感染症の従来の治療、特に、大腸菌による下痢などの消化器系感染症の治療と組み合わせて用いることができる。
本発明は、更に、EHECの菌体が関与しない、一般的により軽度の感染症に関する。一般的により軽度の感染症は、従来の抗生物質を用いて治療しないことが好ましい。より軽度の感染症はETEC、EAEC及びEIECの菌株によって生じる場合もある。以前に提案されたが臨床上は失敗に終わった、EHECによる下痢の毒素阻害性グロボトリオース−シリカを用いる治療法は、天然糖脂質レセプターへのEHECの結合を阻害しなかった。本発明は、EHECにおいては、グロボ糖質への結合は非常にまれか、もしくは存在しないことを示した。これは、下痢を起こす大腸菌の一般的結合特異性の例外となっている。
大腸菌及び他の下痢発症性細菌による感染症の治療に有用な、好ましい一般的オリゴ糖レセプター群
本発明は、下痢を起こす大腸菌のレセプター サブタイプの共通構造モチーフを開示する。１つのレセプター群は共通構造Galβ3/4Glc(NAc)0-1に基づく群であり、これらレセプターの主鎖エピトープは、ラクトース（Galβ4Glc）又は類似したラクトサミンである Galβ3GlcNAc（１型ラクトサミン、ラクトレセプター）及び Galβ4GlcNAc（２型ラクトサミン、ネオラクトレセプター）を含む。主鎖エピトープ自体は、あまり効果的ではないか、あるいは二糖類としては事実上不活性である。本発明は、主鎖の構造に基づく、活性化構造の数種の組み合わせの存在を開示する。しかし、本発明は、好ましくは、ヒトの組織に提示されている天然型の活性レセプターエピトープに関する。これらの構造から生み出された治療剤は有毒である可能性は低く、また、レセプターを産生する天然の酵素が存在するため、これらの構造は特に好ましい。
ラクトースエピトープ及びＮ−アセチルラクトサミン構造には、糖生物学で知られる多数のレクチン及び酵素によって同様に認識される共通の骨格が存在する。二糖エピトープは、ガラクトシル化された構造を認識するタンパク質との相互作用において共通の立体配座を共有する。例えば、ヒト フコシルトランスフェラーゼ IIIは、アクセプターとして３つの配列全てを認識する。本発明によって、二糖配列が種々の天然修飾型グリカンによって活性化され得ることが示された。活性化部位はガラクトース残基又はＮ−アセチル化修飾を有していてもよいグルコピラノース構造に結合させることができる。修飾により、炭水化物阻害剤が細菌上の種々のレセプターへ導かれる。本発明者らは、活性レセプター遮断性炭水化物の特定の組み合わせが、病原体の効果的な阻害に必要であることを見出した。
レセプターの主鎖構造は、ガラクトース、ラクトース又は他のラクトサミンへのβ３−結合による還元末端からの伸長などの種々の誘導体化により活性化され、特に、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）、Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）、Galβ4GlcNAcβ3Gal及びGalβ3GlcNAcβ3Galなどの天然型構造を生じる１型及び２型のラクトサミンによる伸長によって活性化される。更に、レセプターの主鎖構造は、特定のヒドロキシ脂肪酸（Angstrom et al., 1998において H. pyloriに関して記載される）を含むセラミド構造によって活性化され得るが、これは本明細書においてラクトシルセラミド結合として記載した特別なラクトシルセラミドにより実証された。
更に、ラクトサミン（特にGalβ4GlcNAc）又はラクトース構造は、特定の天然単糖を非還元末端に付加することにより活性化できる。特に活性化効果の高い非還元末端構造にはシアル酸が含まれ、α３−結合又はα６−結合したNeuNAc又はNeuGcが好ましく、好ましい態様においてはNeuNAc又はNeuGcはα６−結合している。シアル酸結合の最も好ましい構造は、シアリルラクトース（NeuNAcα6Galβ4Glc、NeuNAcα3Galβ4Glc、NeuGcα6Galβ4Glc及びNeuGcα3Galβ4Glc）、対応するシアリルラクトサミン（NeuNAcα6Galβ4GlcNAc、NeuNAcα3Galβ4GlcNAc、NeuGcα6Galβ4GlcNAc及びNeuGcα3Galβ4GlcNAc）、並びにこれらの、伸長されたＬＮＴ及びＬＮｎＴベースとした構造である。末端糖鎖を有していないシアル酸エピトープでさえ大腸菌に対する結合活性を有する。Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、特に強い活性構造である。
その他の、非還元末端側の活性構造としては、本発明においてガングリオレセプターとして記載されている、天然型レセプター構造を生じるGalNAcβ4又はGalβ3GalNAcβ4がある。更に、非還元末端側の活性構造には、グロボレセプターと呼ばれる天然型レセプターを生じるGalα4及びGalNAcβ3Galα4が含まれる。ガングリオレセプター及びグロボレセプターは、末端二糖としての活性をも有する。よって、好ましいグロボレセプターの型は、最小構造Galα4Galを含む、α結合へキソースレセプターに分類される。
本発明者らは、更に、ラクトサミンレセプター（特にネオラクトレセプター）は、末端GlcNAcβ3構造を示し得ることを発見した。
本発明においては、更に、１型ラクトサミンのGlcNAcへFucα4−構造を結合してルイスａ構造と呼ばれるGalβ3(Fucα4)GlcNAcを形成することで、１型ラクトサミンの活性化を行なう。フコシルレセプターとしてはラクトシルセラミドなどの還元活性構造を有するものが特に好ましい。
末端Galα4−構造による活性化は、Galα4Gal−構造が、還元末端Glc/GlcNAcなしでも活性であることから有効であることが示された。最小活性エピトープは、従って、Galα4Galであり、更に好ましくはGalα4Galβである。これらの構造は、共通のGal−構造を共有し、またGalα4Galβ4Glc及びGalα4Galβ4GlcNAcなどの三糖類エピトープとして活性である。本発明は、更に、部分エピトープ（Neu5Gcα3Gal、Neu5Acα6Gal、Neu5Gcα6Gal及びNeu5Acα3Gal）に関し、他の一つの態様においてはGalNAcβ4Galに関する。
ラクトサミンレセプターの他に、本発明は、特に、Galα4Galレセプター及びManα3/6Manレセプターに関する。アルファ結合へキソースレセプターの２つの型は、安価な天然レセプターであるため、特に好ましい。
本発明を、特に下痢の治療用薬剤として用いる場合の諸態様を以下に示す。

少なくとも２種の化合物の精製画分を包含する医薬組成物であって、該化合物は、下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれる病原体阻害性オリゴ糖配列であるか又は該病原体阻害性オリゴ糖配列を含有する化合物であり、該医薬組成物が下記式（Ｉ）で表される病原体レセプターを１種だけ包含する場合にのみ、下記式（ＩＩ）で表される少なくとも１種のアルファ−ヘキソースレセプターを共に包含することを特徴とする医薬組成物。
[Sacch1]m1Galβx(Fucα4)m2Glc[NAc]m3[β3Gal{β4Glc(NAc)n1}n2]n3[βR2]n4 （Ｉ）
（式中、xは３位又は４位の結合位置を表し；
Sacch1はGlcNAcβ3、Galα3、GalNAcβ4、Galα4又はNeu5Xα3/6であり、式中のXはAc又はGcであり；
n1、n2、n3、n4、m1、m2及びm3は各々独立に０又は１であるが、
但し、xが３位、m1が０、且つm3が１の場合にのみ、m2は１でもよく、
Sacch1がNeu5Xα3、Neu5Xα6、Galα3、GalNAcβ4又はGalα4である場合にのみ、m3は０でもよく、
n4が１の場合には、m3とn3は共に０であり、
n4が０の場合には、m1、m2及びn3のいずれかが１であり；
R2は、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体であり；そして
Sacch1はGalα又はGalNAcβであり、該医薬組成物が式（Ｉ）で表されるレセプターを少なくとも２種包含する場合には、レセプターは互いに式（Ｉ）中のSacch1、x、m2及びn4から選ばれる少なくとも１種が異なり、該医薬組成物は２つのシアル酸レセプター又は２つのネオラクトレセプターを包含しない。）
Hexαp[(Hexαr)]nHex （ＩＩ）
（式中、HexはGal又はManであり、nは０又は１であり、p及びrはMan残基間の３位又は６位の結合位置を表すが、
但し、HexがManの場合には、ｐが３位でｒが６位であるか、ｐが６位でｒが３位であり、
HexがGalである場合には、pが４位でnは０であるが、この時、式（ＩＩ）で表されるレセプターが上記式（Ｉ）で表されるGalα4Gal−レセプターと共に該医薬組成物に包含されることはない。）
好ましい態様においては、本発明は、少なくとも２種の化合物の精製画分を包含する医薬組成物に関し、化合物は、式（Ｉ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれる病原体阻害性オリゴ糖配列であるか又は病原体阻害性オリゴ糖配列を含有する化合物であるが、但し、非還元末端活性化配列が、Galα4、GalNAcβ4、Neu5Xα3又はNeu5Xα6である場合、組成物は、還元末端Glc又はGlcNAcを有さない短いオリゴ糖配列であるGalα4Gal、GalNAcβ4Gal、Neu5Xα3Gal又はNeu5Xα6Galを包含してもよい。更に好ましくは、末端活性化配列がGalα4の場合、組成物は部分エピトープであるGalα4Galを包含してもよい。組成物は、所望により、オリゴ糖配列であるManα3[(Manα6)]nMan（式中、nは０又は１である）を含有するマンノースレセプターを更に包含してもよい。
ラクトースに基づく活性構造
具体的な態様においては、本発明は、オリゴ糖配列を含む天然型ラクトースを包含する組成物とその用途を目的とする。このようなオリゴ糖配列には、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ及びシアリルラクトースなどの乳オリゴ糖配列、天然型糖脂質コア配列であるGalα4Galβ4Glc及びGalNAcβ4Galβ4Glc、並びにヒドロキシ脂肪酸を有するラクトシルセラミドレセプターが挙げられる。ラクトサミン基であるGalβ4GlcNAc及びGalβ3GlcNAcは、ＬＮＴ及びＬＮｎＴ、ならびにそれらに基づく伸長構造が有するラクトース残基に対する活性化基であると考えられる。ラクトース残基には下痢発症性大腸菌に対する付着阻害活性は観察されなかった。しかしながら、高活性化単糖単位であるGalNAcβ4、Galα4、Neu5Xα3又はNeu5Xα6、更に伸長した二糖単位であるGalNAcβ3Galα4、Galβ3GalNAcβ4、Galβ4GlcNAcβ3又はGalβ3GlcNAcβ3、あるいは三糖単位であるNeu5Xα3Galβ4GlcNAcβ3、Neu5Xα6Galβ4GlcNAcβ3又はGlcNAcβ3をラクトース残基の非還元末端側に付加することにより、効果的にラクトース残基を活性化して、好ましい高活性物質を得ることができる。別の態様においては、非還元末端活性化基は、ルイスａ構造であるGalβ3(Fucα3)GlcNAcβ3、Galα4Galβ4GlcNAcβ3又はGalNAcβ4Galβ4GlcNAcβ3である。更に好ましくは、非還元末端活性化構造は、存在頻度の高い配列であるGalα4、Neu5Xα3 及び Neu5Xα6 から選ばれるか、あるいは伸長した二糖単位であるGalβ4GlcNAcβ3 及び Galβ3GlcNAcβ3中に存在する配列である。本発明で用いる、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド構造は、還元末端における活性化構造として用いることができる。好ましい態様においては、これらの活性化構造を組み合わせて用いる。
好ましい態様においては、本発明は、少なくとも２種の化合物の精製画分を包含する治療用の医薬組成物であって、該化合物は、簡略化された下記式（Ｉｂ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれる病原体阻害性オリゴ糖配列であるか又は病原体阻害性オリゴ糖配列を含有する化合物であることを特徴とする医薬組成物に関する。
[A1]m3Galβ4Glc[βA2]n4 （Ｉｂ）
（式中、m3及びn4は各々独立に０又は１であり；
A1は、GalNAcβ4、Galα4、Neu5Xα3、Neu5Xα6、GalNAcβ3Galα4、
Galβ3GalNAcβ4、Galβ4GlcNAcβ3、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、Galβ3GlcNAcβ3、
Neu5Xα3Galβ4GlcNAcβ3、Neu5Xα6Galβ4GlcNAcβ3 及び Galβ3(Fucα3)GlcNAcβ3からなる群、好ましくはGalα4、Neu5Xα3、Neu5Xα6、Galβ4GlcNAcβ3 及び
Galβ3GlcNAcβ3からなる群より選ばれる天然型非還元末端活性化配列であり；そして
A2は、本発明で用いる、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドであり、
但し、オリゴ糖配列はA1及びA2の一方又は両方を含有する。）
A1のみを含有するオリゴ糖配列を２つだけ用いる場合には、A1はいずれもシアリル化されていないことが好ましい。
上記医薬組成物は、所望により、オリゴ糖配列であるManα3[(Manα6)]nMan（式中、nは０又は１である）を含有するマンノースレセプターを更に包含する。
好ましい態様においては、本発明は、少なくとも２種の化合物の精製画分を包含する治療用の医薬組成物であって、該化合物は、下記式（Ｉｃ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれる病原体阻害性オリゴ糖配列であるか又は病原体阻害性オリゴ糖配列を含有する化合物であることを特徴とする医薬組成物に関する。
[Sacch1]m1[Galβx(Fucα4)m2GlcNAcβ3]m3Galβ4Glc[βA2]n4 （Ｉｃ）
（式中、xは３位又は４位の結合位置を表し；
Sacch1はGlcNAcβ3、Galα3、GalNAcβ4、Galα4又はNeu5Xα3/6であり、式中のXはAc又はGcであり；
n4、m1、m2及びm3は各々独立に０又は１であるが、
但し、xが３位の場合にのみ、m2は１でもよく、
Sacch1がGlcNAcβ3の場合には、m3は１であり、且つxは４位であり、
m1が１の場合又はn4が１の場合にのみ、m3は０でもよく、
n4が０の場合には、m1又はm3が１であり；そして
A2は、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体であるが；
但し、医薬組成物が包含する少なくとも２種のレセプターは互いに式（Ｉｃ）中のSacch1、x、m2及びn4から選ばれる少なくとも１種が異なり、好ましくは医薬組成物は２つのシアル酸レセプターを包含しない。）
上記医薬組成物は、所望により、オリゴ糖配列であるManα3[(Manα6)]nMan（式中、nは０又は１である）を含有するマンノースレセプターを更に包含する。
好ましい態様においては、本発明は、上記式（Ｉｃ）中のm2が０である化学式によって表される化合物を少なくとも２種包含することを特徴とする医薬組成物に関する。好ましい態様においては、本発明は、式（Ｉｃ）中のn4が０である化学式によって表される化合物を少なくとも２種包含することを特徴とする医薬組成物に関する。
好ましい態様においては、本発明は、少なくとも２種の化合物の精製画分を包含する治療用の医薬組成物であって、該化合物は、下記式（Ｉｄ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれる病原体阻害性オリゴ糖配列であるか又は病原体阻害性オリゴ糖配列を含有する化合物であることを特徴とする医薬組成物に関する。
[Sacch1]m1[GalβxGlcNAcβ3]m3Galβ4Glc （Ｉｄ）
（式中、xは３位又は４位の結合位置を表し；
Sacch1はGalα4、Neu5Xα3又はNeu5Xα6であり、式中のXはAc又はGcであり；そして
m1及びm3は各々独立に０又は１であるが、但し、m1又はm3が１であり；
但し、医薬組成物が包含する少なくとも２種のレセプターは互いに式（Ｉｄ）中のSacch1及びxから選ばれる少なくとも１種が異なり、好ましくは医薬組成物は２つのシアル酸レセプターを包含しない。）
好ましい態様においては、Neu5XはNeu5Acである。
本発明の組成物及び方法に用いる、ラクトースをベースとしたより好ましいオリゴ糖配列としては、式（Ｉｃ）で表される以下の好ましい物質が挙げられる：Galα4Galβ4Glc、NeuNAcα3Galβ4Glc、NeuNAcα6Galβ4Glc、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及びGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc。好ましい態様において、式（Ｉｃ）で表される好ましいシアリル化構造としては、シアリルラクトサミンであるNeuNAcα3Galβ4GlcNAc及びNeuNAcα6Galβ4GlcNAcが挙げられる。従って、本発明で用いる非常に好ましい７種のオリゴ糖配列としては、Galα4Galβ4Glc、NeuNAcα3Galβ4Glc、NeuNAcα6Galβ4Glc、NeuNAcα3Galβ4GlcNAc、NeuNAcα6Galβ4GlcNAc、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及びGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcが挙げられる。
好ましい態様においては、好ましいシアリル化構造は、ウシ乳に共通して存在するシアリルオリゴ糖であるNeuNAcα3Galβ4Glc、NeuNAcα6Galβ4Glc及びNeuNAcα6Galβ4GlcNAcの１種又は全てを含むものである。ウシ乳オリゴ糖は、Nakamura et al., 2003に記載されているように、ウシ乳画分として得られたものでもよい。別の態様においては、オリゴ糖配列を含有するＮ−グリコリルノイラミン酸が好ましい。好ましいＮ−グリコリルオリゴ糖配列としては、NeuNGcα3Galβ4Glc、NeuNGcα6Galβ4Glc、NeuNGcα3Galβ4GlcNAc及びNeuNGcα6Galβ4GlcNAcが挙げられる。
好ましい態様においては、本発明の組成物及び方法に用いるラクトースをベースとしたオリゴ糖配列は、中性オリゴ糖配列であるGalα4Galβ4Glc、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc（ＬＮｎＴ）及びGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc（ＬＮＴ）である。
好ましい態様においては、少なくとも１種の好ましいシアリル化オリゴ糖（より好ましくはシアリル化オリゴ糖を含有するウシ乳画分）を、少なくとも１種の好ましい中性オリゴ糖と共に用いる。
好ましい態様においては、組成物はヒト母乳又はヒト母乳オリゴ糖画分ではない。原料の不足及び感染症の危険性ゆえに、ヒト母乳はオリゴ糖の好ましい材料ではない。好ましい態様においては、２種のオリゴ糖配列を包含する組成物は、ＬＮＴとＬＮｎＴとの混合物を含有すると考えられるヒト母乳オリゴ糖画分ではない。最も好ましい中性オリゴ糖類からなる好ましい２成分の組み合わせは、ＬＮｎＴとGalα4Galβ4Glcを包含する組成物及びＬＮＴとGalα4Galβ4Glcを包含する組成物である。他の一つの好ましい態様においては、ＬＮＴを包含する組成物よりもＬＮｎＴを包含する組成物のほうが好ましく、これは細菌の局地流行性の感染株がＬＮｎＴ特異性を利用している場合である。ＬＮｎＴはまた、特に低濃度の阻害剤を用いる場合には、一価の阻害剤組成物に用いることも好ましい。
好ましい構造の単一成分物質としての用途
本発明は特に、式（Ｉｄ）で表される単一成分物質を、所望により、本発明で用いる他の構造と共に用いた、下痢発症性大腸菌、好ましくはヒト下痢原性大腸菌の阻害方法に関する。更に好ましくは、本発明は、本明細書に記載した全ての種類の毒素非産生性下痢原性大腸菌の阻害に関する。好ましい態様においては一価オリゴ糖を使用し、より好ましくは一価オリゴ糖を終濃度２ｍＭ未満、更に好ましくは１ｍＭ未満で使用する。具体的な態様においては、グロボトリオースオリゴ糖を０．３ｍＭ未満又は０．１ｍＭ未満の濃度で用いるが、０．０１ｍＭを超える濃度で用いるのが好ましい。
他の一つの態様においては、上記オリゴ糖を可溶性多価結合体として用いる。可溶性多価結合体は単一のオリゴ糖を含有し、所望により、本発明で用いる他の炭水化物を更に含有する。更に好ましくは、オリゴ糖を、本発明で用いる可溶性オリゴ糖又は可溶性多糖との多価結合体として用いる。本発明は更に、本発明で開示する単一オリゴ糖エピトープを用いた、本明細書に記載した大腸菌の型の一種、好ましくはEAEC及びEIEC、によって生じる下痢の治療に関する。
好ましい構造、例えば本発明で開示する高頻度結合エピトープは、多様な用途において好ましく用いられる。糖が、効率的な商業生産に利用できたり、天然に存在して天然型の配列として許容されるといった性質が、糖を更に好ましいものとする。本発明による最も好ましいオリゴ糖混合物は、細菌付着に対する一価型阻害剤としても好ましい。実験結果によると、グロボレセプター、ラクトレセプター、シアル酸レセプター及びネオラクトレセプターは、対応する一価オリゴ糖によって低濃度で特異的に細菌付着を阻害することが判明した。遊離の一価の特異的オリゴ糖を下痢発症性大腸菌に対する付着阻害剤として用いることはこれまで報告されていない。更に、遊離の好ましいオリゴ糖の活性を示す組み合わせを開示した。例えば、グロボオリゴ糖、ＬＮｎＴ及びシアリルオリゴ糖の混合物、即ちこれらを同時に使用すると、下痢発症性大腸菌に対して活性な低濃度阻害剤となった。本発明はまた、特定の下痢原性大腸菌に複数の結合活性が同時に存在することを初めて示す。更に、これらのオリゴ糖は、ヒトの下痢原性細菌の種々のレセプター構造に対して有効な活性ラクトース構造からなる構造的に定義された群を形成する。
本発明は更に、本明細書に記載した感染における異なる接触段階で用いる種々のレセプターの用途に関する。第一接触レセプターは糖タンパク質レベルで提示されており、おそらく最も大きな糖脂質である。一方、第二接触レセプターは本明細書に記載するように、膜近くの糖脂質上に提示されている。
少なくとも２種の化合物の精製画分を包含する本願請求項１の治療用の医薬組成物においては、式（Ｉ）で表される病原体阻害性オリゴ糖配列である化合物又は病原体阻害性オリゴ糖配列を含有する化合物を使用するが、病原体阻害性オリゴ糖配列は下記（ａ）及び（ｂ）からなる群より選ばれるものである。
（ａ）下記式（ＩＩＩ）で表されるラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコースレセプター及びシアル酸レセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種の第一接触レセプター：
[Sacch1]m1Galβx(Fucα4)m2Glc[NAc]m3[β3Gal{β4Glc(NAc) n1}n2]n3 (ＩＩＩ)
（式中、xは３位又は４位の結合位置を表し；
Sacch1はNeu5Xα3/6であり、式中のXはAc又はGcであり、従ってシアル酸はNeu5Ac、
Neu5Gc又はGlcNAcβ3であり；そして
n1、n2、n3、m1、m2及びm3は各々独立に０又は１であるが、
但し、xが３位の場合にのみ、m2は１でもよく、
Sacch1がNeu5Xα3/6である場合にのみ、m3は０でもよい。）；及び
（ｂ）下記式（ＩＶ）で表されるラクトシルセラミドレセプター、ガングリオレセプター及びGalα4Galレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種の第二接触レセプター：
[Sacch4]m1Galβ4Glc(NAc) n1[βR2]n3 （ＩＶ）
（式中、n1及びn3は各々独立に０又は１であるが、但しn3が１の場合、n1は０であり；
m1は１又は０であるが、但し、n3が０の場合、m1は１であり、
R2はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体であり；そして、
Sacch4はGalα又はGalNAcβである。）
所望により、上記医薬組成物は、下記式（ＩＩ）で表される少なくとも１種のアルファへキソースレセプターを更に包含する。
Hexαp[(Hexαr)]nHex （ＩＩ）
（式中、HexはGal又はManであり、nは０又は１であり、p及びrはMan残基間の３位又は６位の結合位置を表すが、
但し、HexがManの場合には、ｐが３位でｒが６位であるか、ｐが６位でｒが３位であり、
HexがGalの場合には、pが４位でnは０であるが、この時、式（ＩＩ）で表されるレセプターが式（ＩＶ）で表されるGalα4Galレセプターと共に医薬組成物に包含されることはない。）
更に好ましい第一接触レセプターとしては、シアリルレセプター、ラクトレセプター及びネオラクトレセプターが挙げられる。第二接触レセプターの中では、Galα4Galレセプターが特に好ましい。具体的な態様においては、高マンノース構造は糖タンパク質に提示されているので、マンノースレセプターは第一接触レセプター群に含まれる。
胃病原体、特に下痢発症性大腸菌、において高頻度で存在する結合特異性
本発明は、好ましくは、下痢発症性大腸菌において最も高頻度で存在する結合特異性の用途に関する。最も高頻度で存在する結合特異性としては、グロボレセプター、シアリルレセプター、ラクトレセプター及びネオラクトレセプターに対する結合が挙げられる。高頻度で存在する構造としては、下記式（Ｖ）で表されるオリゴ糖配列が挙げられる。
[Sacch1]pGalβyGlc(NAc)rβ3{Galβ4[Glc(NAc)u]v}s （Ｖ）
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、
yは３位又は４位の結合位置を表し、
xは３位又は４位の結合位置を表し、
Sacch1はNeuNXα3、NeuNXα6、Galα4又はGlcNAcβ3であるが、
但し、sが０で、且つSacchがNeuNXα3、NeuNXα6又はGalα4の場合にのみ、rは０でもよい。）
また、グロボレセプターは他の末端Galα4Gal配列でもよい。
高頻度で存在する結合特異性のうち、グロボレセプターは特に強く安定した結合を示す。シアリルレセプター、ラクトレセプター及びネオラクトレセプターもまた、安定した強い結合を示し、感染の際にはその重要性が増すので好ましい。本発明者らは、一価オリゴ糖はたとえ低濃度であっても、対応する糖脂質配列に対する結合特異性を阻害できることも示した。高頻度で存在する結合特異性の好ましい例としては、活性化された強い結合型の配列が挙げられ、更に好ましくは、ヒト及び動物の乳オリゴ糖であるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、シアリルラクトース（NeuNAcα3Lac及びNeuNAcα6Lac）ならびにシアリルラクトサミン（NeuNAcα3LacNAc及びNeuNAcα6LacNAc）及びその伸長型（NeuNAcαGalβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及びNeuNAcα6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc）が挙げられる。更に、ヒト天然型オリゴ糖配列であるGalα4Galβ4Glc及びカルボン酸還元ペクチン型配列であるGal[α4Gal]nも好ましい。
本発明は、好ましくは、高頻度で存在する種々の結合特異性を有する配列の中の異なる種類から選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖配列を用いた、下痢発症性病原体、好ましくは大腸菌、更に好ましくは毒素非産生性下痢原性大腸菌又は重症度の低い下痢を発症させる大腸菌の阻害に関する。好ましい態様においては、少なくとも３種の異なる種類のオリゴ糖レセプターを用い、最も好ましくは、高頻度で存在するオリゴ糖レセプターの４種を全て用いる。
他の一つの好ましい態様においては、使用するレセプター種のうち少なくとも１種はグロボレセプターである。他の一つの態様においては、使用するレセプター種のうち少なくとも１種はシアル酸レセプターである。シアル酸レセプターとグロボレセプターも用いることが好ましく、更にラクトレセプター又はネオラクトレセプターと共に用いることがより好ましい。
他の一つの好ましい態様においては、ラクトレセプターをネオラクトレセプターと共に使用し、更にグロボレセプター又はシアル酸レセプターも用いる。
他の一つの好ましい態様においては、シアル酸レセプターをネオラクトレセプター又はラクトレセプターと共に用い、所望により、グロボレセプターを更に用いる。好ましい態様においては、乳型オリゴ糖レセプターであるラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びシアル酸レセプターを共に用いる。
本発明は更に、高頻度で存在する結合エピトープを、ラクトシルセラミドレセプター、マンノースレセプター、フコシルレセプター及びガングリオレセプターなどからなる群より選ばれる少なくとも１種の他の結合特異性を示すレセプターと共に用いる好ましい組み合わせの用途に関する。
好ましい態様においては、高頻度で存在するレセプターとラクトシルセラミドレセプターとの好ましい組み合わせを用いる。
好ましい態様においては、高頻度で存在するレセプターとマンノースレセプターとの好ましい組み合わせを用いる。
好ましい態様においては、高頻度で存在するレセプターとガングリオレセプターとの好ましい組み合わせを用いる。
本発明に関するデータは、主として、種々の下痢発症性大腸菌株を多数用いて得られたものである。腸管レセプターの普遍的性質については、数種の人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌を用いて更に研究した。本発明者らは、大腸菌の特異的結合性について少なくとも５種の重複する結合特異性を見出した。これらは、ラクトシルセラミドレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、ガングリオレセプター及びシアル酸レセプターに対するものである。これらのレセプターは、ヒト、多くのペット及び家畜に共通する傾向にある。
人畜共通感染性と考えられる病原体に対する活性を有する一般的レセプター
上記のレセプター群は、人畜共通感染症の可能性を有する下痢における「一般的レセプター」として好ましい。一般的レセプターの最も安定した形は、中性ガラクトースをベースとしたレセプターによって示された。このファミリーのレセプターの内、ラクトース／ラクトサミンレセプターは、構造的に類似した特別なクラスのレセプターを形成する。
本発明の好ましい態様においては、化合物の少なくとも１種が、下記式（ＶＩ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれる病原体阻害性オリゴ糖配列を含有し、好ましくは薬学的に許容される担体及びアジュバントを更に包含する医薬組成物が提供される。
ｉ） [Galβy]p[Hex(NAc)rαz/βz]sGalβx[Glc(NAc)u]v （ＶＩ）
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、yは３位又は４位の結合位置を表し、xは３位又は４位の結合位置を表し、zは３位又は４位の結合位置を表し、HexはGal又はGlcであり、
更に、
vが１及びuが０の場合、xは４位であり、
vが０の場合、sは１であり、好ましくはpも１であり、
sが０の場合、pは０であり、vは１であり、
pが１及びyが３位の場合、HexはGalβ又はGlcβ、そしてrは１であり、又は、pが１及びyが４位の場合、HexはGlcβ、そしてrは１であり、従って末端Galは、GlcNAcβにβ３結合又はβ４結合するか、又はGalNAcβにβ３結合し、
pが０及びzが４位の場合、HexはGalβ、そしてrは１であり、従って末端単糖構造はGalNAcβ4となり、又はpが０及びzが３位であり、従って末端はHexNAc/Hexα/β3となり、
非還元末端Galβ3/4が存在する場合、SAα3/6によって置換することができる（但し、SAはシアル酸、好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸（NeuNAc）又はＮ−グリコリルノイラミン酸（NeuNGc）である。）
本発明において好ましい中性ガラクトースをベースとした一般的レセプター
本発明において、ガラクトースβ3/4をベースとした一般的レセプターは、下記式（ＶＩＩ）で表される構造を含む。
[Galβy]p[Hex(NAc)rαz/βz]sGalβx[Glc(NAc)u]v （ＶＩＩ）
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、yは３位又は４位の結合位置を表し、xは３位又は４位の結合位置を表し、zは３位又は４位の結合位置を表し、HexはGal又はGlcであり、
更に、
vが１及びuが０の場合、xは４位であり、
vが０の場合、sは１であり、好ましくはpも１であり、
sが０の場合、pは０であり、vは１であり、
pが１及びyが３位の場合、HexはGalβ又はGlcβ、そしてrは１であり、又は、pが１及びyが４位の場合、HexはGlcβ、そしてｒは１であり、従って末端Galは、GlcNAcβにβ３結合又はβ４結合するか、GalNAcβにβ３結合し、
pが０及びzが４位の場合、HexはGalβ、そしてrは１であり、従って末端単糖構造はGalNAcβ4となり、又はpが０及びzが３位であり、従って末端はHexNAc/Hexα/β3となる。）
本発明による一般的レセプターの主な種類
上記式は以下の主要構造群に分けられる。
１．ラクトース／ラクトサミン型の炭水化物レセプター。
この構造群は、更にラクトースレセプター、並びにラクトレセプター及びネオラクトレセプターを含むラクトサミンレセプターも包含する。
２．ガングリオレセプター
３．シアル酸レセプター
好ましいラクトース／ラクトサミン型の一般的レセプター
[Galβy]p[Hex(NAc)ra3]sGalβx[Glc(NAc)u]v （ＶＩＩＩ）
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、yは３位又は４位の結合位置を表し、xは３位又は４位の結合位置を表し、aはα結合又はβ結合であり、HexはGal又はGlcであり、
更に、
pが１の場合、HexはGlcβ、rは１、そしてaはβ結合であり、従って末端GalはGlcNAcβ3にβ３結合又はβ４結合し、
pが０の場合、好ましくは
HexはGal、rは０、そしてaはαであり、従って末端構造はGalα3となり、又は
HexはGlc、rは１、そしてaはβであり、従って末端構造はGlcNAcβ3となる。）
好ましい態様においては、ラクトース／ラクトサミン型の一般的レセプターは、下記式（ＩＸ）で表される。
[Galβy]p[GlcNAcβ3]sGalβx[Glc(NAc)u]v （ＩＸ）
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、yは３位又は４位の結合位置を表し、xは３位又は４位の結合位置を表し、
更に、
少なくともpが１又はvが１であり、
pが１の場合、sは１であり、
u、s及びpがいずれも０の場合、xは４位であり、還元末端Glcがヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドに結合している。）
最も好ましいラクトース／ラクトサミン型の一般的レセプターとしては、ヒト母乳四糖であるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及びGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc、及びラクトシルセラミドが挙げられる。
好ましいラクトサミン構造としては、Galβ4GlcNAc、Galβ3GlcNAc、Galβ4Glc、Galβ4GlcNAcβ3Gal、Galβ3GlcNAcβ3Gal、GlcNAcβ3Galβ4Glc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc及びGalβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcからなる群より選ばれるオリゴ糖配列及びオリゴ糖も挙げられる。
増加しつつある（emerging）下痢原性病原体及び現存する（present）下痢原性病原体の効果的な処置には、８種全てのレセプター特異性が有用である。病原体が大腸菌ではない場合に関しては、従来技術においてサルモネラ菌に対するマンノースの結合が一般的に存在することが示されている。本発明により、Galα4Gal−オリゴ糖配列への結合特異性、更にはフコシルレセプター型結合特異性さえもが下痢発症性ヒト腸在病原体において見出されることも予測することができる。
好ましいレセプター群も考え合わせると、ラクトレセプター及びネオラクトレセプターは、第一接触レセプター、高頻度で存在するレセプター及び一般的レセプターに属する。そのため、ラクトレセプター及びネオラクトレセプターを、本発明において特に好ましいＬＮＴやＬＮｎＴなどの活性化された状態で、単独もしくは組み合わせて用いることは特に好ましい。
本発明者らは、８種の異なる結合特異性を、多くの下痢発症性大腸菌の菌体及びヒトの腸組織に存在する菌体に対応するレセプターのいくつかについて特徴付けた。オリゴ糖配列には、以下の（ａ）〜（ｇ）のレセプターオリゴ糖配列からなる群より選ばれる少なくとも１種が含まれる。
腸病原体の８種の独立したレセプターオリゴ糖配列
（ａ）ラクトシルセラミドレセプター：例えば、セラミドがヒドロキシ脂肪酸を含む、ラクトシルセラミド及びイソグロボトリアオシルセラミドに結合する。
（ｂ）ガングリオレセプター：例えば、ガングリオトリアオシルセラミド及びガングリオテトラオシルセラミドに結合する。
（ｃ）Galα4Galレセプター：例えば、ガラビアオシルセラミド、グロボトリアオシルセラミド、グロボテトラオシルセラミド及びフォルスマン グリコスフィンゴ脂質に結合する。
（ｄ）ラクトレセプター：例えば、ラクトテトラオシルセラミドに結合する。
（ｅ）ネオラクトレセプター：例えば、ネオラクトテトラオシルセラミド、ネオラクトヘキサオシルセラミド、NeuGcα3−ネオラクトヘキサオシルセラミド及びGlcNAcβ3Gal（特にGlcNAcβ3Galβ4GlcNAc）を含有するオリゴ糖配列に結合する。
（ｆ）フコシルレセプター：例えば、Lea-5グリコスフィンゴ脂質に結合する。
（ｈ）シアル酸レセプター：例えば、異なるシアル酸（特にＮ−アセチルノイラミン酸（NeuAcα）及び／又はＮ−グリコリルノイラミン酸（NeuGcα））を有する種々のオリゴ糖配列に結合する。
（ｇ）マンノースレセプター：Manα3(Manα6)Man−ネオ糖脂質で表される。
レセプター群における好ましいオリゴ糖配列
本発明は、好ましくは、遊離のオリゴ糖又はその誘導体の用途に関し、誘導体は糖脂質ではない（但し、後述するヒドロキシ脂肪酸含有ラクトシルセラミド糖脂質を例外とする）。一般的に、糖脂質は組織中に拡散し、実際に病原体の結合を増加させ得るので、この現象を妨げる組成物の製造は困難であると考えられている。本発明で用いるラクトシルセラミド糖脂質のセラミド中のヒドロキシ基は、糖脂質間の接触をより強固なものとするので、例えば膜状の組成物中でより効果的に糖脂質をまとめ、腸上皮への糖脂質の拡散を防止する。本発明で開示する好ましい多価結合体は、例えば、有力な免疫原であることから免疫反応を起こすのに使用できるアルブミン結合体のようなネオ糖タンパク質ではない。本発明で用いる多価結合体は非免疫原性であることが好ましく、免疫原性のタンパク質部位又はペプチド部位を含まないことが好ましい。
ラクトシルセラミドレセプター
下痢発症性大腸菌のラクトシルセラミドレセプターは、セラミド上のヒドロキシ脂肪酸の存在に依存する。本発明は、大腸菌感染に対するヒドロキシ脂肪酸含有ラクトシルセラミドの用途に関する。本発明において、「ラクトシルセラミドレセプター」とは、ラクトシル残基が天然型ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド構造に結合している分子を含むラクトース残基、あるいはラクトシル残基が水酸基含有セラミド模倣構造に結合しているラクトシルセラミド構造の模倣物である。ヒドロキシ脂肪酸又はセラミド模倣構造の水酸基は、セラミド又はセラミド模倣構造と結合しているGlc残基と水素結合を形成することが好ましい。ラクトシルセラミド又はその模倣物は、Gal残基の３位又は４位を天然オリゴ糖配列で置換することができる。ラクトシルセラミドレセプター糖脂質の例には、ヒドロキシ脂肪酸を含むラクト系糖脂質及びネオラクト系糖脂質も含まれる。本発明の他の１つの態様は、ラクトシル残基及びヒドロキシ脂肪酸を含む、グロボ系糖脂質及びガングリオ系糖脂質の用途に関する。又、本発明は、水酸基含有セラミド模倣構造に結合したラクト系又はネオラクト系オリゴ糖配列の類似体の用途にも関する。更に本発明は、水酸基含有セラミド模倣構造に結合したグロボ系又はガングリオ系オリゴ糖配列の類似体の用途にも関する。本発明の好ましい態様は、本発明によるラクトシルセラミドレセプターを非シアリル化型で用いることに関する。好ましい態様には、下記式（Ｘ）で表される分子が含まれる。
R1xGalβ4GlcβR2 （Ｘ）
（式中、xは３位又は４位の結合位置を表し；
R2は、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体であり；そして
R1は、Galα、Galβ、GalNAcβ又はGlcNAcβ、これら残基の１つを還元末端に有する長鎖のオリゴ糖、あるいはNeu5Xαであり；
但し、R2がGlcNAcβ又はNeu5Xαである場合、xは３位であり、
Neu5Xはシアル酸、好ましくはNeu5Ac又はNeu5Gcである。）
本発明は、本発明によるラクトシルセラミドレセプターの多価結合体、特に本発明によるラクトセラミド構造の模倣物の多価結合体を含む物質又は組成物に関する。特に、ラクトシルセラミド又はラクトシルセラミド構造の模倣物が、所望によりスペーサー基を介して多糖に結合している場合、ラクトシルセラミド構造の模倣物の多価結合体が好ましい。特定の態様においては、多価結合体はラクトシルセラミド糖脂質より好ましい。糖脂質の使用は、組織へのレセプターの拡散を防止する必要があるため、多価結合体の使用よりも難しい。しかし、組織へのレセプターの拡散の防止は、例えば、医薬用炭素マトリックス（medical carbon matrix）、安定化膜（stabile membrane）又はミセル構造に糖脂質を導入することにより達成できる。
本発明においては、単一のラクトシルセラミドレセプターがレセプター結合特異性の内の２種、更には３種以上でさえもを示すことができることを見出した。
本発明はまた、消化器系の疾患、特に下痢、更に具体的には、大腸菌の菌体によって生じる下痢の治療用の、ヒドロキシ脂肪酸を含むラクトシルセラミド、並びにその類似体及び誘導体の用途にも関する。好ましい態様においては、感染症はETEC、EPEC、EHEC、EIEC又はEAEC、更に好ましくはEHEC、EIEC又はEAECによって生じたものである。本発明の好ましい態様は、ヒドロキシ脂肪酸を含むラクトシルセラミドを含有する乳の画分の用途に関する。乳は、牛やその他の、ヒドロキシ脂肪酸含有ラクトシルセラミドを産生する乳用動物から得られるものが好ましい。上述した従来技術は乳糖脂質の用途に関するが、この技術においては、下痢発症性大腸菌の菌体に対してヒドロキシ脂肪酸含有糖脂質を用いることの有用性は認識されていない。本発明によるラクトシルセラミドレセプターは、特に栄養補助剤として機能性食品又は機能性飼料に用いられる。
ガングリオレセプター
好ましいガングリオ系レセプターは、下記式（ＸＩ）で表されるオリゴ糖配列を含んでいる。
[Galβ3]n1GalNAc[β4Gal{β4Glc}n2]n3 （ＸＩ）
（式中、n1、n2及びn3は各々独立に０又は１であるが、但し、好ましくはn1又はn3は１であり、且つ、オリゴ糖配列にシアル酸は結合していない。）
好ましいオリゴ糖配列はGalβ3GalNAcβ4Galβ4Glc、Galβ3GalNAcβ4Gal、Galβ3GalNAc、GalNAcβ4Gal及びGalNAcβ4Galβ4Glcである。本発明によれば、GM1オリゴ糖配列でさえ、新規な組み合わせによる治療方法に用いることができるが、構造の複雑さ故にあまり好ましくない。本発明の実施例における、広汎に渡る各種ガングリオ系レセプターのスクリーニング及び構造の比較は、ガングリオ系レセプターオリゴ糖配列の好ましい新規なレセプターオリゴ糖配列としてGalβ3GalNAcを決定することを可能にした。そのデータは、GM1−配列における末端Galβ3GalNAcでさえも下痢発症性大腸菌に結合し得ることを示している。末端二糖への結合はこれまでに実証されておらず、そして四糖エピトープはより効果的な末端二糖の提示を可能にする処方において用いてもよい。本発明の１つの態様によると、Galβ3GalNAcは、ラクトースにβ４結合していないことが好ましい。二糖エピトープは、概して、四糖エピトープよりも製造コストが低い。より好ましくは、オリゴ糖配列はGalβ3GalNAcβ（但し、二糖エピトープがラクトースに結合していないもの）、もしくはGalβ3GalNAcβ4Gal（但し、還元末端Galがグルコースに結合していないもの）である。
新規なガングリオレセプターは、末端二糖のGalβ3GalNAc（但し、二糖がラクトースにβ４結合していないもの）を含有する。二糖エピトープは、概して、四糖エピトープよりも製造コストが低い。より好ましくは、オリゴ糖配列はGalβ3GalNAcβ（但し、二糖エピトープがラクトースに結合していないもの）、あるいはGalβ3GalNAcβ4Gal（但し、還元末端Galがグルコースに結合していないもの）である。末端二糖配列及び末端三糖配列は、下痢発症性細菌の菌体に対するレセプターとしても、EPECの菌体に対するレセプターとしても、これまでに記載されたことはない。末端二糖の使用は、既知の四糖レセプターよりも、合成のための費用効果が高いため好ましい。
Galα4Galレセプター
本発明の好ましいエピトープは、Galα4Gal、Galα4Galβ4Glc及びGalα4Galβ4GlcNAcである。本発明はまた、グロボシド及びフォルスマン抗原などのGalα4Gal−配列の３’−置換型が共通して認識され得ることを示す。好ましいGalα4Galレセプターは、下記式（ＸＩＩ）で表される少なくとも１種のオリゴ糖配列を含んでいる。
[GalNAcβ3]n1Galα4Gal{β4Glc(NAc)n2}n3 （ＸＩＩ）
（式中、n1、n2及びn3は各々独立に０又は１であり、但し、好ましい態様においては、n1又はn3が１であり、GalNAc残基は、所望により、他の単糖残基又はオリゴ糖残基（好ましくは、フォルスマン抗原などの天然オリゴ糖配列に類似しているもの）により置換されている。）
より好ましいオリゴ糖レセプターとしては、合成がより簡単であるため、Galα4Gal、Galα4Galβ4Glc及びGalα4Galβ4GlcNAcが挙げられ、本発明による二糖のGalα4Gal及びペクチンをベースとしたオリゴ糖配列、あるいは類似した他の天然オリゴ糖配列（オクラに存在するオリゴ糖配列など）が特に好ましい。
ラクトレセプター
好ましいラクト系レセプターは、下記式（ＸＩＩＩ）で表される少なくとも１種のオリゴ糖配列を含んでいる。
Galβ3GlcNAc[β3Gal{β4Glc(NAc)n1}n2]n3 （ＸＩＩＩ）
（式中、n1、n2及びn3は各々独立に０又は１である。）
好ましい態様においては、少なくともn3が１である。本発明において高親和性レセプターと呼ばれる最も好ましいオリゴ糖配列としては、以下のオリゴ糖配列が挙げられる：Galβ3GlcNAcβ3Gal、Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc、Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc及びGalβ3GlcNAcβ3Galβ3GlcNAc。ラクトテトラオースであるGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcを、所望により、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及び／又はGalβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glc及び／又はGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcなどのその他の乳オリゴ糖と共に用いることは、治療用の用途、並びに食品、飼料及びその他栄養補助的な用途に特に好ましい。
本発明は、ＬＮＴ配列全体（Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc）が、ラクト結合を効果的に阻害するのに好ましく用いられることを見出した。実施例中のデータは、先行技術で示唆されている二糖エピトープであるGalβ3GlcNAcは、対応する糖脂質中の結合エピトープがネオ糖脂質構造中のβ６−GlcNAcによって遮断された場合と同様に、単体では効果的な結合をサポートできないことを示した。本発明は特に、下痢発症性大腸菌に対する一価阻害剤として、並びに可溶性多価阻害剤として、Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcを用いる方法を提供する。この物質は、高頻度で見られる結合特異性を有するため、単一成分物質として用いても有用であることが見出された。
ネオラクトレセプター
好ましいネオラクト系レセプターは、下記式（ＸＩＶ）で表される少なくとも１種のオリゴ糖配列を含んでいる。
[GlcNAcβ3]n1Galβ4GlcNAc[β3Gal{β4Glc(NAc)n2}n3]n4 （ＸＩＶ）
（式中、n1、n2、n3及びn4は各々独立に０又は１であり、n1が１の場合には、式中の非還元末端GlcNAcは他の単糖残基又はオリゴ糖残基（好ましくはGalβ4又はGlcNAcβ3Galβ4）によって置換することができる。）
本発明の好ましい態様においては、n4及びn1の少なくとも一方が１である。本発明において高親和性レセプターと呼ばれる最も好ましいオリゴ糖配列としては、以下のオリゴ糖配列が挙げられる：GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、Galβ4GlcNAcβ3Gal、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及びGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc。好ましいGlcNAcβ3Galβ4GlcNAc−構造としては、還元末端からβ６−結合したオリゴ糖配列が挙げられ、特に、以下の配列が挙げられる：GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Gal、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GalNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Glc及びGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Man。ネオラクトテトラオースであるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcは、治療用の用途、並びに食品、飼料及びその他栄養補助的な用途に特に好ましい。
本発明は、ＬＮｎＴ配列全体（Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc）が、ネオラクト結合を効果的に阻害するのに好ましく用いられることを見出した。実施例中のデータは、先行技術で示唆されている二糖エピトープであるGalβ4GlcNAcは、単体では効果的な結合を支持できないことを示した。分枝型のGalβ4GlcNAcβ3(Galβ4GlcNAcβ6)Galβ4GlcβCerは、中央のガラクトースが側鎖により遮断されるため、二糖エピトープが２つあっても結合を支持することはできない。ネオ糖脂質中の結合エピトープがβ６−構造に変えられた場合、即ち、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc が GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Galβ4Glcに変わった場合も、結合は非常に弱められる。本発明は特に、下痢発症性大腸菌に対する一価阻害剤並びに可溶性多価阻害剤として、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及びGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcを用いる方法を提供する。この物質は、高頻度で見られる結合特異性を有するため、単一成分物質としても有用であることが見出された。
本発明の好ましい態様は、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc及びGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcなどの末端GlcNAc構造を含有するネオラクト結合配列に関する。本発明によれば、末端二糖配列であるGlcNAcβ3Galも用いることができるが、活性が比較的弱い。直鎖状β3−結合ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ4GlcNAc[β3Galβ4GlcNAc]nβ3Galβ4Glc（式中、nは１以上の整数である））は下痢発症性大腸菌株のレセプターであることと、末端GalはNeu5Xα3又はGlcNAcβ3などの他の単糖残基により置換できることが初めて明らかになった。好ましい一価阻害剤は、バッファロー乳から発見されたGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、一般的な乳オリゴ糖であるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、及びGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcとGalβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcを含む混合物を包含するものである。
フコシルレセプター
好ましいフコシルレセプターは、下記式（ＸＶ）で表される少なくとも１種のオリゴ糖配列を含むものである。
Galβ3(Fucα4)GlcNAc[β3Gal{β4Glc(NAc)n1}n2]n3 （ＸＶ）
（式中、n1、n2及びn3は各々独立に０又は１である。）
好ましい態様においては、上記式（ＸＶ）中の少なくともn3が１である。より好ましい本発明のオリゴ糖配列は、Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Gal、Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc及びGalβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcである。ルイスａ五糖（Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glc）は、治療用の用途、並びに食品、飼料及びその他栄養補助的な用途に特に好ましい。
シアル酸レセプター
最も広い意味においては、シアル酸レセプターは、天然型糖結合体に含まれるいかなるシアル酸でもよい。シアル酸は、好ましくはＮ−グリコリルノイラミン酸又はＮ−アセチルノイラミン酸である。
本発明は、下痢発症性病原体、特に下痢発症性大腸菌の菌体に効果的に結合し得る特定のシアル酸を見出した。
好ましいシアル酸レセプターオリゴ糖配列は、下記式（ＸＶＩ）で表される。
Neu5XαpGalβr[(Fucαs)]n1Glc(NAc)n2 （ＸＶＩ）
（式中、XはAc又はGcであり、従ってシアル酸残基はNeu5Ac又はNeu5Gcであり;
n1及びn2は各々独立に０又は１であり；
pは３位又は６位の結合位置を表し；そして
r及びsはいずれも３位又は４位の結合位置を表すが、但し、rが３位である場合にはsは４位であり、rが４位である場合にはsは３位である。）
より好ましいオリゴ糖配列としては、Neu5Xα3Galβ3(Fucα4)GlcNAc、Neu5Xα3Galβ4(Fucα3)GlcNAc、Neu5Xα3Galβ4(Fucα3)Glc、Neu5Xα3Galβ3GlcNAc、Neu5Xα3Galβ4GlcNAc、Neu5Xα3Galβ4Glc、Neu5Xα6Galβ4GlcNAc及びNeu5Xα6Galβ4Glc（式中、XはAc又はGcである）で表されるオリゴ糖配列からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。Neu5Xα3Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc、Neu5Xα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、シアリル−ルイスａ六糖（Neu5Xα3Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glc）、シアリル−ルイスｘ六糖（Neu5Xα3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glc）及びシアリル−ラクトース（Neu5Xα3Galβ4(Fucα3)Glc、Neu5Xα3Galβ4Glc、Neu5Xα6Galβ4Glc）などの乳オリゴ糖の少なくとも１種を用いることは、治療用の用途、並びに食品、飼料及びその他栄養補助的な用途に特に好ましい。オリゴ糖配列がヒトに用いられる場合、本発明の１つの具体的な態様においては、天然ヒト型のオリゴ糖で、上記式（ＸＶＩ）中のXがAcであり、従ってNeu5XがNeu5Acであるオリゴ糖を用いることが好ましい。ヒト−動物間で交差反応しうる菌株をより効果的に阻害することを目的とする他の１つの態様においては、上記式（ＸＶＩ）中のXはGcであり、従ってシアル酸はNeuGcである。
本発明は、特に、シアリルラクトース（Neu5Xα3Galβ4Glc及びNeu5Xα6Galβ4Glc）、シアリルラクトサミン（Neu5Xα3Galβ4GlcNAc及びNeu5Xα6Galβ4GlcNAc）及びその伸長型（Neu5Xα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及びNeu5Xα6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc）に対する正確なシアル酸結合特異性に関するものであり、この結合特異性はこれまでに特徴付けがなされていなかった。本発明はまた、合理的な低濃度のオリゴ糖により結合特異性を効果的に阻害できることを示した。他の１つの態様においては、本発明は、下痢発症性大腸菌を阻害するために、Neu5Xα3−シアリルラクトース又はシアリルラクトサミンを用いること、特に、Neu5Xα3Galβ4Glc、Neu5Xα3Galβ4GlcNAc、Neu5Xα6Galβ4GlcNAc及びNeu5Xα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcを用いる方法を提供する。
他の１つの態様においては、本発明は、特に、下痢発症性大腸菌を阻害するために、Neu5Xα6−シアリルラクトース又はシアリルラクトサミンを用いること、特に、Neu5Xα6Galβ4Glc、Neu5Xα6Galβ4GlcNAc及びNeu5Xα6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcを用いる方法を提供する。Neu5Xα6−構造は、高活性であるため特に好ましい。１つの具体的な態様においては、NeuNAc含有オリゴ糖は、天然配列としてヒト及びヒト母乳に存在する糖なので使用する。他の１つの態様においては、NeuGc含有オリゴ糖を使用する。動物乳から得られるシアリルオリゴ糖が好ましく、ウシ乳から得られるシアリルラクトース及びNeu5Acα6Galβ4GlcNAcが特に好ましく、ウシ乳に含まれるシアリルオリゴ糖の少なくとも１種を豊富に含む精製画分が更に好ましい。Neu5Xα6−構造を含有する画分が特に好ましい。本発明において、シアリルオリゴ糖が、ヒトの下痢、特に本発明に記載した下痢、特に大腸菌による下痢に対して有用であることが初めて知見された。シアリルオリゴ糖はまた、単一成分物質として、あるいは混合物として用いてもよいことが見出された。シアリルオリゴ糖は、大腸菌に対する有用な一価型阻害剤であり、多価可溶性結合体として用いることもできる。シアル酸オリゴ糖は、毒素非産生性大腸菌の阻害に用いることもできる。
他の１つの態様においては、本発明は、本発明においてポリシアル酸組成物と呼ばれる、ポリシアル酸型配列、好ましくはNeu5NAcα8NeuNAcで表されるオリゴ糖配列を包含する組成物に関する。ポリシアル酸組成物におけるポリシアル酸配列は、更に、もしくは上記オリゴ糖配列の代わりに、Neu5NAcα9NeuNAcで表されるオリゴ糖配列を含有することができる。好ましくは、ポリシアル酸配列は糖脂質型配列に提示されていない。他の１つの態様においては、ポリシアル酸物質はNeu5NAcα8NeuNAc及び／又はNeu5NAcα9NeuNAcで表されるオリゴ糖配列を含み、且つ、下記の条件を満たすものである。
１．シアル酸オリゴ糖類の少なくとも９５％が１０シアル酸残基以上のオリゴ糖であるか、
２．シアル酸オリゴ糖類の少なくとも９５％が３シアル酸残基以上のオリゴ糖であるか、
３．シアル酸オリゴ糖類の少なくとも９５％が１０シアル酸残基未満のオリゴ糖であり、より好ましくは、シアル酸オリゴ糖類の少なくとも９５％が５シアル酸残基未満であるオリゴ糖組成物である、又は、
４．シアル酸オリゴ糖類の少なくとも８０％が２シアル酸残基以上であり、且つ、６シアル酸残基未満のオリゴ糖である。
オリゴ糖生産のための、ポリシアル酸多糖又はポリシアル酸オリゴ糖／前駆体は、細菌、例えばコロミン酸を産生する大腸菌によって製造することができる。ポリシアル酸型オリゴ糖物質は、Neu5NAcα8NeuNAc及び／又はNeu5NAcα9NeuNAcで表されるオリゴ糖配列を含むが、ポリシアル酸型オリゴ糖配列が、Neu5NAcα8NeuNAc及び／又はNeu5NAcα9NeuNAcで表されるオリゴ糖配列を包含する治療用オリゴ糖であることが好ましい。ポリシアル酸型オリゴ糖物質は、好ましくは２から１０のシアル酸残基を含有する。
本発明は、また、ポリシアル酸型オリゴ糖物質又はポリシアル酸組成物を用いた治療方法及び薬剤を提供する。該物質及び組成物を、特に、ワクチンを使用しない治療法及び薬剤に用いる。本発明は、また、下痢に対する薬剤及び医薬組成物並びに本発明に記載の生体外（ex vivo）の用途に用いる組成物を製造するための多価シアル酸型オリゴ糖物質に関する。
マンノースレセプター
本発明によるマンノースレセプターは、ManαMan構造を含むものである。好ましいマンノースレセプターオリゴ糖配列は、下記式（ＸＶＩＩ）で表される。
Manαp[(Manαr)]n1Man （ＸＶＩＩ）
（式中、n1は０又は１であり；そして
p及びrはMan残基間の３位又は６位の結合位置を表すが、但し、ｐが３位である場合にはｒは６位であり、ｐが６位である場合にはｒは３位である。）
好ましいマンノースレセプターオリゴ糖配列としては、Manα3(Manα6)Man及びManα3Manが挙げられる。１つの具体的な態様においては、オリゴ糖配列はManα3Manβ4GlcNAc又はManα3Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcである。好ましい態様においては、Manα3(Manα6)Manの還元末端残基は開鎖型、還元型又は誘導体化された開鎖型であり、例えば、還元的にアミノ化され、スペーサー又は担体に結合している。好ましい態様においては、マンノースを含有するマンナンオリゴ糖配列又はホスホマンナンオリゴ糖配列が用いられる。マンナン又はホスホマンナンは、好ましくはα−結合マンノースを含有する。マンナン又はホスホマンナンは、パン酵母（S. cerevisiae）などの、無害な酵母から得られるものであることが好ましい。
下痢発症性ヘリコバクター属細菌の結合特異性に関する結果
本発明の主要な目的は、種々の病原体による下痢の治療方法を提供することである。本発明者らは、全く違う型の細菌と共有され得るレセプターの型であって、他の種から伝播する人畜共通感染症にも関連するレセプターの型を示すために、下痢発症性ヘリコバクター属細菌を選択した。人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌は、特に人畜共通感染症の予防を目的とした動物の治療方法の開発のターゲットでもある。本発明は、人畜共通感染症の危険性と関連付けられるレセプターの特殊な種類を発見した。これらは、シアル酸修飾を伴う可能性のあるガラクトースをベースとするレセプターのファミリーを含む。
本発明はまた、H. pylori以外のヘリコバクター属細菌、特に、下痢や肝疾患の病因となる腸肝感染性ヘリコバクター属細菌、も対象としている。これらの細菌はｚへリコバクター（zHelicobacter）（複数形はｚへリコバクテリア（zHelicobacteria））と称し、典型的には人畜共通感染性である、即ち、ヒトと動物の両方に感染する細菌であり、そのような動物としては家畜やペット（犬や猫など）が挙げられる。本発明の他の１つの態様としては、本発明は、ｚへリコバクテリアによる胃の感染症の治療方法を提供する。従来技術は、H. pylori、H. mustelae（フェレットの非人畜共通性胃感染性病原体）及び、下痢発症性の各種大腸菌など腸管感染性の種々の非ヘリコバクター属細菌に関するものである。異なる種の細菌は異なる結合特異性を有し、ｚヘリコバクテリアのレセプターを従来技術から推測することはできない。消化管内の異なる部位に感染する細菌、あるいはヘリコバクターと大腸菌のように全く異なるファミリーに属する細菌の間では、特に大きな違いが予測される。本発明は、ｚヘリコバクターとH. pylori間の結合特異性挙動の違いを明らかにした。人畜共通感染性細菌は、人畜共通感染性細菌に特有のレセプター群の存在を明らかにした。
ｚヘリコバクターからなるグループには種特異的なヒト Helicobacter pyroliは含まれない。本発明は更に、H. mustelaeによるフェレットの感染症は、ヒトとの接触による人畜共通感染の危険のあるペット又は家畜の感染症ではないため対象としない。ｚヘリコバクテリアはヒト及び／又はヒトのペットに感染し、ヒト（特に免疫機構の弱い人）に感染する人畜共通感染能を有する。本発明は、細菌の種間感染作用を媒介することのできるｚヘリコバクターの炭水化物結合特異性を特徴付けた。
結果の概要
本発明者らは、ＴＬＣオーバーレイアッセイによって、糖脂質のライブラリーに対する数種類のｚヘリコバクター属細菌の結合特異性を分析した。
既にH. pylori 及び H. mustelae のガングリオテトラオシルセラミドへの結合と同様の結合が、H. felis、H. canis、H. hepaticus 及び H. bilisについて確立されている（表３）。更に本発明者らは、H. pylori と同様に、試験した胃感染性ヘリコバクター属細菌及び腸肝感染性ヘリコバクター属細菌は、ラクトテトラオシルセラミド、フィトスフィンゴシン及び／又はヒドロキシ脂肪酸を有するラクトシルセラミド、並びにイソグロボトリアオシルセラミドへの結合能を有することを発見した。一方、Leb グリコスフィンゴ脂質への結合は、H. pylori CCUG 17875株にしか見られなかった（表３）。
ヒト顆粒球由来の酸性グリコスフィンゴ脂質画分に含まれる遅移動性ガングリオシドに対するある種のH. pylori株の結合はシアル酸依存性であるため（Miller-Podraza et al., 1999)、この画分をシアル酸認識の指標として用いた。ヒト顆粒球におけるシアリル化された構造は、主にNeuNAcα3Gal− 及び NeuNAcα6Galである。この画分に対する結合は H. hepaticus CCUG 33637株（図４のＢ、レーン１に例示した）及び H. pylori CCUG 17874株に見られ、時には H. mustelae CCUG 25715株にも見られた（表３）。他の物質でアッセイできるシアル酸結合能も、少なくともH. bilis 属細菌には見られた。
ヘリコバクター属細菌には更に、直鎖状ポリラクトサミン糖脂質への結合が見られた。結合エピトープは、ポリラクトサミン主鎖中に存在するため、特定の末端の除去は結合には本質的な影響を与えない。
本発明は、炭水化物特異性が、糖脂質アッセイの他に、各種の方法によっても測定できることを見出した。様々な生物種由来の細胞を用いて行う従来の細胞アッセイ法を含む、細胞をベースとしたタンパク質型糖結合体を用いるアッセイによってさえも結合が観察された。これらのアッセイ法は、糖脂質の分析を裏付ける結果を与えている。
本発明において、ｚヘリコバクターによる人畜共通性感染症に対して用いられる好ましい炭水化物構造

β−ガラクトースをベースとしたレセプター
本発明によれば、ｚヘリコバクター属細菌由来のガラクトースβ３／４をベースとしたレセプター（zHelicobacter species Galactoseβ3/4-based receptor）の最も一般的な結合特異性の挙動を示すのは、下記式（ＶＩ）で表される構造を含むものである。
[Galβy]p[Hex(NAc)rαz/βz]sGalβx[Glc(NAc)u]v (ＶＩ)
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、yは３位又は４位の結合位置を表し、xは３位又は４位の結合位置を表し、zは３位又は４位の結合位置を表し、HexはGal又はGlcであり；
更に、
vが１及びuが０の場合、xは４であり、
vが０の場合、sは１であり、好ましくはpも１であり、
sが０の場合、pも０であり、vは１であり、
pが１及びyが３位の場合、HexはGalβ又はGlcβ、そしてrは１であり、又は、pが１及びyが４の場合、HexはGlcβ、そしてｒは１であり、従って末端Galは、GlcNAcβにβ３結合又はβ４結合するか又はGalNAcβにβ３結合し、
pが０及びzが４位の場合、HexはGalβ、そしてrは１であり、従って末端単糖構造はGalNAcβ４となり、又は、pが０及びzが３位であり、従って末端はHexNAc/Hexα/β3となり、
非還元末端Galβ3/4が存在する場合、SAα3/6によって置換することができる（但し、SAはシアル酸、好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸（NeuNAc）である。）
β−ガラクトースをベースとしたレセプター、組み合わせ式
ガラクトースβ3/4に基づくレセプターは、集合的に、下記式（XVIII）で表されるオリゴ糖配列を有する。
[Galβy]p[Hex(NAc)rαz/βz]sGalβx[Glc(NAc)u]v (XVIII)
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、yは３位又は４位の結合位置を表し、xは３位又は４位の結合位置を表し、zは３位、４位又は６位の結合位置を表し、HexはGal、Glc又はSA（シアル酸）であり；
更に、
vが１及びuが０の場合、xは４位であり、
vが０の場合、sは１であり、好ましくはpも１であり、
sが０の場合、pも０であり、vは１であり、
pが１及びyが３位の場合、HexはGalβ又はGlcβ、そしてrは１であり、又、pが１及びyが４位の場合、HexはGlcβ、そしてrは１であり、従って末端Galは、GlcNAcβにβ３結合又はβ４結合するか、又はGalNAcβにβ３結合し、
HexがSAの場合、zは３位又は６位、好ましくは３位であり、
pが０及びzが４位の場合、HexはGalβ、そしてrは１であり、従って末端単糖構造はGalNAcβ４となり、又はpが０及びzが３位であり、従って末端はHexNAc/Hexα/β３となり、又はHexがSA及びzが３位又は６位であり、従って末端構造はSAα３Gal又はSAα６Galとなる。）
好ましい態様においては、活性型のGalβ型レセプターは、シアル酸を含まない中性オリゴ糖配列である。一つの態様においては、末端pは０であり、Hexはシアル酸（SA）、好ましくはα３結合又はα６結合したNeuNAc（Ｎ−アセチルノイラミン酸）である。
本発明による、中性ガラクトースをベースとした好ましいレセプター
本発明によれば、ｚヘリコバクター属細菌由来のガラクトースβ３／４をベースとしたレセプターの最も一般的な結合特異性の挙動を示すのは、下記式（VII）で表される構造を含むものである。
[Galβy]p[Hex(NAc)rαz/βz]sGalβx[Glc(NAc)u]v (VII)
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、yは３位又は４位の結合位置を表し、xは３位又は４位の結合位置を表し、zは３位又は４位の結合位置を表し、HexはGal又はGlcであり；
更に、
vが１及びuが０の場合、xは４位であり、
vが０の場合、sは１であり、好ましくはpも１であり、
sが０の場合、pは０であり、vは１であり、
pが１及びyが３位の場合、HexはGalβ又はGlcβ、そしてrは１であり、又はpが１及びyが４位の場合、HexはGlcβ、そしてｒは１であり、従って末端Galは、GlcNAcβにβ３結合又はβ４結合するか、GalNAcβにβ３結合し、
pが０及びzが４位の場合、HexはGalβ、そしてrは１であり、従って末端単糖構造はGalNAcβ４となり、又はpが０及びzが３位であり、従って末端はHexNAc/Hexα/β３となる。）
本発明によるレセプターの主な種類
上記式は以下の主要構造群に分けられる。
４．ラクトース／ラクトサミン型の炭水化物レセプター。
この構造群は、更にラクトースレセプター、並びにラクトレセプター及びネオラクトレセプターを含むラクトサミンレセプターも包含する。
５．ガングリオレセプター
６．シアル酸レセプター
ｚヘリコバクターに対する好ましいラクトース／ラクトサミン型レセプター
[Galβy]p[Hex(NAc)ra3]sGalβx[Glc(NAc)u]v (VIII)
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、yは３位又は４位の結合位置を表し、xは３位又は４位の結合位置を表し、aはα結合又はβ結合であり、HexはGal又はGlcであり；
更に、
pが１の場合、HexはGlcβ、rは１、そしてaはβ結合であり、従って末端GalはGlcNAcβ3にβ３結合又はβ４結合し、
pが０の場合、好ましくは
HexはGal、rは０そしてaはα結合であり、従って末端構造はGalβ3となり、又は
HexはGlc、rは１、そしてaはβ結合であり、従って末端構造はGlcNAcβ3となる。）
好ましい態様においては、ｚヘリコバクターに対するラクトース／ラクトサミン型レセプターは、下記式（IX）で表される。
[Galβy]p[GlcNAcβ3]sGalβx[Glc(NAc)u]v (IX)
（式中、p、r、s、u及びvは各々独立に０又は１であり、yは３位又は４位の結合位置を表し、xは３位又は４位の結合位置を表し；
更に、
少なくともpが１又はvが１であり、
pが１の場合、sは１であり、
uが０の場合、xは４位であり、好ましくは還元末端Glcが水酸基に結合している。）
最も好ましいラクトース／ラクトサミン構造としては、ヒト母乳四糖であるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcやGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc、及びラクトシルセラミドが挙げられる。
好ましいラクトサミン構造としては、Galβ4GlcNAc、Galβ3GlcNAc、Galβ4Glc、Galβ4GlcNAcβ3Gal、Galβ3GlcNAcβ3Gal、GlcNAcβ3Galβ4Glc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc 及び Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcからなる群より選ばれるオリゴ糖及びオリゴ糖配列も挙げられる。
本発明による、人畜共通感染性病原体、特にｚヘリコバクターの阻害に用いる５つのレセプターサブグループ
（ａ）ラクトースレセプター
（ｂ）ラクトレセプター
（ｃ）ネオラクトレセプター
（ｄ）ガングリオレセプター
（ｅ）シアル酸レセプター
本発明は、上記５つのレセプターのうち少なくとも２種を組み合わせて用いる用途にも関する。また、上記レセプターはいずれも他のレセプターと合わせて用いることが好ましい。ラクトースレセプターはラクトサミンレセプター及び／又はガングリオレセプター及び／又はシアル酸レセプターと組み合わせて用いることが好ましい。また、ラクトース／ラクトサミンレセプターはガングリオレセプター及び／又はシアル酸レセプターと組み合わせて用いることが更に好ましい。
本発明は、少なくとも１種、他の一つの態様においては少なくとも２種又は３種の化合物の精製画分を包含する治療用の医薬組成物であって、該化合物は病原体阻害性オリゴ糖配列であるか又は該病原体阻害性オリゴ糖配列を含有する化合物であることを特徴とする医薬組成物に関する。複数のオリゴ糖配列を用いる場合、オリゴ糖配列は、上述した病原体レセプターから選ばれる少なくとも２種、他の一つの態様においては少なくとも２種であることが好ましい。
ラクトースレセプター
広義において、ラクトースレセプターはオリゴ糖配列Galβ4Glcを含む構造である。好ましい態様においては、ラクトースレセプターは、ラクトース構造がセラミドに結合しているラクトシルセラミドレセプターである。より好ましくは、セラミドがヒドロキシ脂肪酸構造を有するものである。特に、本発明は、ラクトースレセプター、特にヒドロキシ脂肪酸を有するラクトシルセラミドをｚヘリコバクター感染症に対して用いる方法に関する。
本発明において「ラクトシルセラミドレセプター」とは、ラクトシル残基が天然型ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド構造に結合している分子を含むラクトース残基、あるいはラクトシル残基が水酸基含有セラミド模倣構造に結合しているラクトシルセラミド構造の模倣物である。ヒドロキシ脂肪酸又はセラミド模倣構造の水酸基は、セラミド又はセラミド模倣構造と結合しているGlc残基と水素結合を形成することが好ましい。ラクトシルセラミド又はその模倣物は、Gal残基の３位又は４位を天然オリゴ糖配列で置換することができる。ラクトシルセラミドレセプター糖脂質の例には、ヒドロキシ脂肪酸を含むラクト系糖脂質及び／又はネオラクト系糖脂質も含まれる。本発明の他の１つの態様は、ラクトシル残基及びヒドロキシ脂肪酸を含む、ラクト系糖脂質、ネオラクト系糖脂質及びガングリオ系糖脂質からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖脂質の用途に関する。又、本発明は、水酸基含有セラミド模倣構造に結合したラクト系又はネオラクト系オリゴ糖配列の類似体の用途にも関する。更に本発明は、水酸基含有セラミド模倣構造に結合したガングリオ系オリゴ糖配列の類似体の用途にも関する。本発明の好ましい態様は、本発明によるラクトシルセラミドレセプターを非シアリル化型で用いることに関する。好ましい態様には、下記式（XIX）で表される分子が含まれる。
R1xGalβ4GlcβR2 (XIX)
（式中、xは３位又は４位の結合位置を表し；
R2は、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体であり；そして
R1は、Galα、Galβ、GalNAcβ又はGlcNAcβ、これら残基の１つを還元末端に有する長鎖のオリゴ糖、あるいはNeu5Xαであり；
但し、R1がGlcNAcβ、Galα又はNeu5Xαである場合、xは好ましくは３位であり、
Neu5Xはシアル酸、好ましくはNeu5Ac又はNeu5Gcである。）
本発明は、本発明によるラクトースレセプターの多価結合体、特に本発明によるラクトセラミド構造の模倣物の多価結合体を含む物質又は組成物に関する。特に、ラクトシルセラミド又はラクトシルセラミド構造の模倣物が、所望によりスペーサー基を介して多糖に結合している場合、ラクトシルセラミド構造の模倣物の多価結合体が好ましい。特定の態様においては、多価結合体はラクトシルセラミド糖脂質より好ましい。糖脂質の使用は、レセプターの組織への拡散を防止する必要があるため、多価結合体の使用よりも難しい。しかし、レセプターの組織への拡散の防止は、例えば、医薬用炭素マトリックス（medical carbon matrix）、安定化膜（stabile membrane）又はミセル構造に糖脂質を導入することにより達成できる。
本発明においては、単一のラクトシルセラミドレセプターがレセプター結合特異性の内の２種、更には３種以上でさえもを示すことができることを見出した。
更に、本発明は、ヒドロキシ脂肪酸含有ラクトシルセラミド、その類似体及びその誘導体を用いた、胃腸疾患の治療、特に下痢及び肝胆道性疾患の治療、特にｚヘリコバクター属細菌による疾患の治療方法にも関する。本発明の好ましい態様は、ヒドロキシ脂肪酸を含むラクトシルセラミドを含有する乳の画分の用途に関する。乳は、牛やその他の、ヒドロキシ脂肪酸含有ラクトシルセラミドを産生する乳用動物から得られるものが好ましい。上述した従来技術は乳糖脂質の用途に関するが、この技術においては、下痢発症性ｚヘリコバクター属細菌に対してヒドロキシ脂肪酸含有糖脂質を用いることの有用性は認識されていない。本発明によるラクトシルセラミドレセプターは、特に栄養補助剤として機能性食品又は機能性飼料に用いられる。
部分オリゴ糖配列の用途
他の一つの態様においては、本発明による１個又は数個のオリゴ糖配列を、部分オリゴ糖配列で置換する。部分オリゴ糖配列は一般的にオリゴ糖配列より効果は低いが、より高い濃度で用いることができる。部分オリゴ糖配列は好ましくは単糖であり、より好ましくは、本発明によるオリゴ糖配列の末端単糖残基と同じアノマー構造を有する非還元ピラノース型単糖残基であり、更に好ましくは、非還元ピラノース型単糖残基は対応するオリゴ糖配列の隣に位置する単糖を部分的に模倣するポリヒドロキシ化合物に結合しているものである。好ましい態様において、ポリヒドロキシ化合物は非炭水化物化合物であり、最も好ましいポリヒドロキシ化合物は、本明細書の式（２）で表される可とう性の親水性リンカーである。好ましい部分オリゴ糖配列としては、他のレセプターオリゴ糖配列について記載した部分オリゴ糖配列からなる多価結合体及び可溶性多価結合体が挙げられる。
部分オリゴ糖配列は、好ましくはManαであり、より好ましくは、非還元ピラノース型Manαが、対応するオリゴ糖配列の隣に位置する単糖を部分的に模倣するポリヒドロキシ化合物に結合しているものである。他の一つの態様においては、部分オリゴ糖配列は、NeuNAcα、Galβ、Galα、Fucα、GlcNAcβ及び末端オリゴ糖配列Fucα4GlcNAcからなる群より選ばれ、場合によっては対応するオリゴ糖配列の隣に位置する単糖を部分的に模倣するポリヒドロキシ化合物に結合していてもよい。部分オリゴ糖配列は、低コストのオリゴ糖配列と共に用いることが好ましい。ピラノース型の部分オリゴ糖配列は、本明細書で開示するオリゴ糖配列の少なくとも一種と共に用いることが好ましく、より好ましくは二種、最も好ましくは三種のオリゴ糖配列と共に用いる。他の一つの態様において、少なくとも二種の部分オリゴ糖配列を少なくとも一種の本発明で開示するオリゴ糖配列と共に用いる。部分オリゴ糖配列は、本発明に基づく治療方法、特に飼料及び食物に関連した用途に用いることが好ましい。
自然感染カスケード（natural infection cascade）に最も関連性のある炭水化物結合特異性の特定
後述するように、病原性細胞表面に存在する炭水化物特異性は、病原体の結合阻害に用いることができる。例えば、可溶性多価炭水化物を、本明細書に記載されている被覆方法により用いることができる。しかし、特に好ましいのは、感染した組織に存在する適切なレセプターに対する炭水化物結合特異性をターゲッティングする方法である。この方法は、本発明による一価の物質を用いる場合に好ましい。病原細胞の阻害に可溶性多価結合体を用い、最も関連性の高い炭水化物特異性を用いる場合、多価結合体、あるいはオリゴ価結合体（oligovalent conjugate）であっても、本発明による他のレセプター相互作用の立体阻害のために用いる結合体ほど大きい必要はない。本発明においては、ヒト腸の糖タンパク質に含まれる数個の新規な炭水化物レセプター構造を開示しており、これら新規な炭水化物レセプター構造を、アッセイにより示される結合特異性と関連づけている。従来技術においては、特定の腸在病原性大腸菌の結合特異性について記述されていることもあったが、本発明において初めてヒト腸における天然レセプター糖類を特徴づけることによって、腸管病原性大腸菌の感染への関連性について示している。いくつかの従来の研究において、レセプター構造の組み合わせ及び結合の可能性について、別々にある程度示されている。しかし、これらの可能性のあるレセプター及び結合特異性を特徴づけることにより、より効果的なレセプターオリゴ糖配列の設計が可能となった。
ヒト腸に最も関連性の高い炭水化物結合特異性
ヒト腸の糖タンパク質の分析により、意外にも、幾つかの興味深い炭水化物レセプター構造が明らかになった。細菌の結合のデータとレセプターの存在の組み合わせから、生物学的に最も有用な治療用構造及び診断用構造の決定が可能になる。このカテゴリーにおける６つの結合特異性は、正常で有用な細菌叢においてはあまり一般的ではないレセプター特異性を用いることも目的としている。
マンノース含有Ｎ−グリカン
幾つものマンノース及びリン酸残基を含有するＮ−グリカン型構造などの特別な構造を、ヒト消化管からの糖脂質のサンプルにより特徴づけた。これまでに、マルチマンノース含有Ｎ−グリカン（Multi-mannose comprising N-glycan）はヒト腸からは特徴づけられていない。リン酸残基の存在も驚くべき特徴である。ホスホマンナンは特定の生物学的炭水化物レセプターに結合することが報告されているが、現在までに、ホスホマンナンがヒト腸内に存在するということや、あるいは天然レセプターとしてヒト腸組織内に存在するということは特徴づけられていない。本発明によるデータは、分岐マルチマンノース構造は下痢発症性大腸菌の菌体に対する結合レセプターであることを示している。従来のデータは、大腸菌又はネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）などの特定の細菌がマルチマンノース含有Ｎ−グリカンに結合できることも示している。腸内におけるマンノースＮ−グリカンの存在に関連する本発明のデータは、マンノースの結合の発病における関連性を明らかにしている。この結合を阻害する物質、例えば炭水化物オリゴマー又は多価炭水化物結合体を含有するマンノース又はマンノース類似体などは、細菌とヒトとの間で生じる有意な炭水化物結合を阻害することができるので特に効果的である。
また、本発明においては、新規のマルチマンノースレセプター、特にリン酸化マルチマンノースレセプターをレセプターへの病原体の結合の分析に用いることができることを見出した。
本発明の特定の態様においては、マルチマンノースレセプター、特にリン酸化マルチマンノースレセプターは、レセプター構造に接着・結合するか、又はレセプター構造を分解可能であるプロバイオティックな細菌に対するレセプター又は基質として用いることができることを見出した。
また、本発明の特定の態様においては、マルチマンノースレセプター、特にリン酸化マルチマンノースレセプターは、レセプター構造及びそれより小さい誘導体又は類似体への腸在病原体の結合の分析又は診断に用いることができることも見出した。
シアル酸含有レセプター及びシアル酸結合特異性
シアル酸含有構造と考えられるものは、ヒト腸の糖タンパク質からは特徴づけられていなかった。本発明は、いくつかの新しいシアリル化構造、及びこれら構造への下痢発症性大腸菌の結合を示している。下痢発症性大腸菌のシアル酸結合特異性はこれまで詳細に特徴づけられていなかった。従来のわずかな報告においては、数種の菌株しか用いていないため、本発明による主要なシアル酸結合特異性は明らかにされておらず、従来はその特異性はレセプター構造とは関連づけられていない。
本発明においては、驚くべきことに、人体では合成されないＮ−グリコリル−ノイラミン酸に対しても、種々のオリゴ糖鎖においてはヒト感染性大腸菌の菌体が効果的に結合することが示される。食物由来のＮ−グリコリル−ノイラミン酸がヒト組織に提示され得ることが示唆されてきた。動物性の食物を食べない完全菜食主義者の場合でも、NeuGc結合はシアル酸結合の阻害に有用であり、又はNeuGcに対する結合は、本願明細書において説明した他の結合の立体阻害のための多価結合体の製造にも用いることができる。
驚くべきことに、シアル酸依存性結合特異性は一価のシアリル−ラクトースオリゴ糖によって効果的に阻害できることが示された。
本発明においては、ヒト消化管における、タンパク質結合シアリル化第一接触レセプター（protein linked sialylated first contact receptors）の存在を示すことができた。シアル酸レセプターが存在し、病原体結合に用いることができることがデータに示されており、病原性に関連したレセプターであること、特に下痢発症性大腸菌による感染症との関連性が示されている。
下痢発症性大腸菌のGalα4Galレセプター
この結合特異性は、下痢発症性大腸菌の菌体に関しては特徴づけされていない。このオリゴ糖配列は、単独、あるいは多価の不溶性結合体としてEHECのシガ様毒素の阻害に用いることが知られていた。しかしこのアプローチの失敗は、おそらくEHECの結合の効果的な阻害の失敗によるものであろう。不溶性の担体を用いると、本願明細書に説明した可溶性多価結合体による多価阻害（polyvalent inhibition）が行なえない。
シガ様毒素の結合と細胞接着との違いは、一価型の構造による阻害能力及び結合の厳密な特異性によっても示されている。シガ様毒素阻害のための好ましいエピトープは、三糖であるGalα4Galβ4Glc及びGalα4Galβ4GlcNAcである。本発明によれば、下痢発症性大腸菌の接着因子は二糖のGalα4Galも認識し、この二糖は、三糖よりも経済的に天然多糖から生産できる。また、本発明は、置換Galα4Galに対する認識特性は毒素の種類により異なるが、グロボシドやフォルスマン抗原などのGalα4Galの３’置換体は一般的に接着因子により認識されることを示した。接着因子の機能は、細菌内で出現したり、切断したりする。
従来技術における毒素とは対照的に、本発明においては、一価のオリゴ糖による効果的なGalα4Gal結合阻害が示されている。一価のGalα4Galはシガ様毒素の結合を阻害しないと明示的に報告されている。従来技術においては、Galα4Galを用いてEHEC結合活性の一つ又はいくつかを阻害することについて記載していない。本発明は、EHECの感染にはいくつかの結合特異性が係わっていることも示している。従来技術においては、他の下痢発症性大腸菌の菌体による他の下痢疾患を、該配列を用いて治療することについても記載していない。シガ様毒素は種々の毒素の一つに過ぎないが、毒素の役割は、炭水化物を認識する特異性、及びEPEC、ETECなどの種々の大腸菌によって引き起こされる疾患の種類によって異なる。
このエピトープの自然感染症への関連については多少議論が分かれるが、レセプターは腸内又は腸上皮に存在するかもしれない。本発明は、腸タンパク質からエピトープを検索し、自然感染との関連を確認することも目的としている。少量の天然レセプターしか存在しないとしても、本発明による可溶性多価結合体としてGalα4Gal構造を用いて細菌表面を被覆し、細菌の他の接着因子を立体的に阻害することができる。
フコシルレセプター
本発明においては、ルイスａ構造などのフコシル化配列に対する新規な結合についても示した。このような結合は、従来、下痢発症性大腸菌の菌体については報告されていなかった。ルイスａ結合は従来報告されていなかったが、ヒト腸の糖脂質の中にはレセプターと考えられる構造も知られていた。この結合の好ましい阻害剤はヒト母乳オリゴ糖であるGalβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcである。
本発明においては、ヒト消化管におけるタンパク質結合フコシル化第一接触レセプターの存在を示すことができた。フコシルレセプターが存在し、それに病原体が結合できることをデータが示しており、レセプターの発病との関連性、特に下痢発症性大腸菌感染症との関連性を示している。
ラクトレセプター及びネオラクトレセプター
本発明においては、ヒト消化管におけるラクト型及びネオラクト型の第一接触レセプターの存在を示すことができた。ラクトレセプター及びネオラクトレセプターが存在し、それに病原体が結合できることをデータが示しており、レセプターの発病との関連性、特に下痢発症性大腸菌感染症との関連性を示している。
正常な細菌叢にも共通して存在する一般的な結合特異性
ラクトシルセラミドレセプター及びガングリオレセプターは正常な細菌叢に結合することが知られている。これらレセプターは正常な細菌叢、即ちプロバイオティック細菌を減らすため、プロバイオティック細菌又はプロバイオティック物質と組み合わせて用いることが好ましい。これらレセプターは第二接触レセプター類に分類され、最も効果的な治療法が必要な場合、第一接触レセプターとして上述した他のレセプターと関連して用いるのに最も有用である。また、Galα4Gal構造は、部分的には、正常な細菌叢に結合する構造とみなすこともできる。他の一つの態様においては、Galα4Gal構造をプロバイオティック細菌と共に用いる。
ラクトシルセラミド結合
ヒドロキシ脂肪酸を含有する糖脂質レセプターであるラクトシルセラミドは、下痢発症性大腸菌の新規なレセプター活性を有している。この特異性を示すものには、３’修飾ラクトシルセラミド、即ちラクトシルセラミドのGal残基の３位の炭素を修飾したもの又は３位の炭素からオリゴ糖鎖を延長したものも含まれる。ヒドロキシ脂肪酸を含有するラクトシルセラミドは腸組織に存在することが知られており、下痢発症性大腸菌の一般的なレセプターであると考えられている。
ラクト結合特異性の改良及びその新規な適応症
従来技術において、Galβ3GlcNAcをEPECの阻害に用いるための方法が提案されており、そこではこの二糖を化学合成した非天然結合体（chemical non-natural conjugate）として含有するネオ糖タンパク質を用いている。本発明では、より長いオリゴ糖配列であるGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcへの効果的な結合が示された。この四糖は、一価であっても、下痢発症性大腸菌のラクト結合阻害に用いることができる。本発明では、EHECのラクト結合を阻害をすることは、HUS（溶血性尿毒症症候群）などのEHECによって生じる感染症の治療に用いることができることを示している。ラクト結合の阻害は、ETEC、EIEC及びEAECに対しても有用である。
大腸菌のネオラクト結合の改良及びその新規な適応症
従来技術において、Galβ4GlcNAcをEPECの阻害に用いるための方法が提案されており、そこではこの二糖を化学合成した非天然結合体として含有するネオ糖タンパク質を用いている。ラクト−Ｎ−ネオテトラオースはEPECの培養上皮細胞株への結合を阻害することができるが、この知見に基づいて結合の関連性を示すことはできない。培養細胞のグリコシル化は細胞ごとに異なり、細胞が由来する元の組織の天然グリコシル化に必ずしも近いものではない。本発明によれば、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースをEPECの結合阻害に用いることができる。また、本発明によれば、二糖配列Galβ4GlcNAc及びこの二糖配列を含有するオリゴ糖配列を用いてEHEC、ETEC及びその他の下痢発症性大腸菌を阻害することができる。更に、本発明においては、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcやGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcなどの末端GlcNAc構造を含有する、ネオラクト結合のための新規な変異体を示す。更に、本発明により、直鎖状のβ３結合したポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンであるGalβ4GlcNAc[β3Galβ4GlcNAc]nβ3Galβ4Glc（但しnは１以上の整数）が下痢発症性大腸菌株のレセプターであることを初めて見出した。このレセプターの末端Galは他の単糖残基で置換できる。好ましい一価の阻害剤は、バッファローの乳に存在すると報告されているGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、及びGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc と Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcを含有する混合物である。
病原体に用いるガングリオレセプター阻害剤の新規な適応症
ガングリオ結合性はいくつかのEPEC株及びETEC株について観察されている。本発明によりガングリオ糖の結合スペクトルは、EHEC型、特にEIEC型及びEAEC型の大腸菌にまで広がった。
一価のレセプターによる病原体の阻害
一般的に、レセプターへの炭水化物の結合、特に病原性細菌の結合は、一価の相互作用としては非常に弱いと考えられる。例えば、培養細胞への大腸菌のシガ様毒素の結合は、Galα4Gal配列からなる高密度多価炭水化物結合体でしか阻害できないことが示されている。
本発明により、特に、ネオラクトレセプター、グロボレセプター、ラクトレセプター及びシアル酸レセプターへの、下痢発症性大腸菌で高頻度に見られる結合特異性は、特異的に阻害できることを示す。このような阻害は比較的低濃度の一価のオリゴ糖配列を用いて達成できる。天然の糖脂質レセプターを用いたin vitroの試験条件下では、オリゴ糖は終濃度が０．３ｍＭでも阻害活性を有する。実験から推測した一般的な有効濃度範囲は以下の通りである。有効濃度範囲は約３ｍＭ未満、より好ましくは２ｍＭ未満、更に好ましくは１．５ｍＭ以下である。本発明は更に、１．０ｍＭ未満及び０．５ｍＭ未満の好ましい濃度に関し、特に好ましい濃度は約０．３ｍＭである。濃度の好ましい下限は０．００５ｍＭを超え、より好ましくは０．０１０ｍＭを越え、更に好ましくは０．１ｍＭを越え、最も好ましくは０．１ｍＭを越える。本発明は特に、上記したような有効濃度範囲で一価のオリゴ糖を用いることに関し、特に２ｍＭ未満及び１ｍＭ未満の濃度範囲で一価のオリゴ糖を用いることに関する。糖の過剰な使用を避けるために、オリゴ糖の濃度又は量を特定のオリゴ糖に合わせて更に最適化することができる。オリゴ糖は、一価の阻害反応（monovalent inhibition）に用いる好ましい濃度範囲で用いることができるので、ヒト母乳又は、例えばウシ乳の濃度に近似する濃度に調節する。乳に関するデータに基づくいくつかの好ましい濃度及び量が、本明細書中に記載されている。オリゴ糖を乳と同じ濃度で用いることは、このような濃度は安全であると考えられるので特に有益である。
１．一価のオリゴ糖を用いて細菌接着結合特異性を阻害することができる。
２．細菌接着結合特異性は、比較的低濃度の遊離の一価オリゴ糖配列で阻害可能である。
レセプター結合特異性の特異的な阻害、特に本願実施例において記載している高頻度で存在する結合特異性の特異的な阻害は、更に以下のことを示している。
１．結合特異性は独立である。
２．高頻度で存在する結合特異性は、糖脂質担体又はいかなる他の担体構造とも無関係である。
３．治療用途に用いる場合、本発明で開示するレセプターファミリーへの結合特異性はそれぞれ独立に阻害する必要がある。
更に、本発明者らは、高頻度で存在する結合特異性を組み合わせて用いることによって、オリゴ糖からなる阻害剤が細菌結合を同時に阻害することを示す。データは以下のことを示している。
１．単一の細菌株又は細菌の集合体は、複数の阻害可能な結合特異性を同時に発現できる。従来技術においては、細菌の同時結合及び結合同時阻害を示す実験は行われていない。本発明により、結合特異性は単一の株ごとに出現し、株ごとに無作為に異なることが明らかになったので、様々な時期に行われた種々の実験から得られた過去のデータを組み合わせるいかなる試みによっても、科学的な関連性を見出すことはできない。
２．実験に用いたオリゴ糖においては、同時阻害を妨げる、オリゴ糖間の相互作用は見られない。
構造体を調製する際、一価のオリゴ糖配列を用いるアプローチは合成費用を削減することができる。多価結合体は、副作用又は制御しなければならない問題を生じうる非天然及び非生分解性のリンカー構造も含有する場合がある。一般的に、一価のオリゴ糖は低濃度で活性を有することが望ましく、その結果、オリゴ糖の費用効果的な使用が可能となる。本明細書において「一価のオリゴ糖」とは、オリゴ糖の一価の結合体、例えばグリコシルアミン、グリコシルアミド、メチルグリコシド、（Ｎ−グリコシド、Ｃ−グリコシド及びＳ−グリコシドを含む）その他のグリコシド、あるいは還元反応又は還元的アミノ化反応により還元末端が修飾されている活性な誘導体を意味する。還元末端単糖残基を還元すると、結合活性炭水化物エピトープの外側に存在するスペーサーとして用いることができる。このようなアプローチにおいては、オリゴ糖配列中の所望のレセプターエピトープよりも少なくとも１単糖残基は長いオリゴ糖を用いる必要がある。
本発明により、意外にも、高親和性の一価の結合活性が見出され、比較的低濃度の一価炭水化物を用いて結合を阻害ができることが示された。好ましい一価の物質は、以下の群より選ばれる少なくとも１種の末端非還元末端配列を含有する： Galα4Gal、Galα4Galα4Gal、Galα4Galβ4Glc、Galα4Galβ4Glc、α結合シアル酸、Neu5Acα、Neu5Acα3、Neu5Acα6、Neu5Acα3Gal、Neu5Acα6Gal、Neu5Acα9Neu5Ac、Neu5Acα8Neu5Ac、Galβ3GalNAc、GalNAcβ4Gal、Galβ3GlcNAc、Galβ3(Fucα4)GlcNAc、Galβ4GlcNAc、GlcNAcβ3Gal 及び GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc。
更に好ましくは、少なくとも１種の一価の物質は、以下の群より選ばれる少なくとも１種の末端非還元末端配列を含有する： Galα4Gal、Galα4Galα4Gal、Galα4Galβ4Glc、Galα4Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galα4Gal、GalNAcβ3Galα4Galβ4Glc、Neu5Acα3Gal、Neu5Acα6Gal、Neu5Acα3Galβ4Glc、Neu5Acα6Galβ4Glc、Neu5Acα8Neu5Acα8Neu5Ac、Neu5Acα8Neu5Ac、Neu5Acα8/9Neu5Acα8/9Neu5Ac、Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glc、GalNAcβ4Galβ4Glc、Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc、Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glc、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、Neu5Xα3Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc、Neu5Xα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、Neu5Xα3Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glc、Neu5Xα3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glc、Neu5Xα3Galβ4(Fucα3)Glc、Neu5Xα3Galβ4Glc 及び Neu5Xα6Galβ4Glc。
最も好ましくは、一価の物質は、以下の群より選ばれる少なくとも１種の末端非還元末端配列を含有する： Galα4Gal、Galα4Galβ4Glc、Galα4Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galα4Gal、GalNAcβ3Galα4Galβ4Glc、Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc、Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、Neu5Acα3Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glc、Neu5Acα3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glc、Neu5Acα3Galβ4(Fucα3)Glc、Neu5Acα3Galβ4Glc、Neu5Acα6Galβ4Glc、Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glc、GalNAcβ4Galβ4Glc、Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc、Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glc、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc 及び GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc3Galβ4Glc。
このような群には、天然のGalα4Gal配列、天然型アシアロガングリオシド配列、及び動物又はヒトの乳に存在するオリゴ糖が含まれる。また、好ましい一価の物質には、Manα3Man及びManα3(Manα6)Manオリゴ糖配列構造も含まれる。
他の一つの態様においては、オリゴ糖配列は安価な天然原料から選ばれる。カルボン酸基が還元されているペクチンオリゴ糖が安価なオリゴ糖の一例として挙げられ、このような還元ペクチンオリゴ糖の配列はGal[α4Gal]n（式中、ｎは１〜約１０の整数である）であり、より大きなオリゴ糖も用いることができるが、一般的にあまり効果的ではないことに注目すべきである。エステル型のペクチン（例えば、天然のメタノールエステル）を還元する方法やカルボジイミドによってペクチンを還元する方法が報告されている。大きなペクチン多糖は、例えば、化学的加水分解やペクチナーゼによる酵素的分解によってオリゴ糖に分解することができる。天然原料（例えば、植物のオクラ）由来のGalα4Galオリゴ糖配列、その類似体又は部分オリゴ糖配列も、本発明で開示する用途に好ましい。安価な天然原料としては、細菌によって産生されたポリシアル酸も挙げられる。このような天然材料は、ポリマー状の配列であるNeu5Ac[α8Neu5Ac]n、Neu5Ac[α9Neu5Ac]n又はα９−結合とα８−結合を交互に有するNeu5Acを有する。ポリシアル酸には鎖中結合性（intrachain binding）を有するものがあるので、特定の態様においては、ポリシアル酸を重合性阻害剤として用いることを目的とする。多糖は、公知の方法でオリゴ糖又は低分子量多糖に分解することができる。低コスト天然原料の中では、酵母マンナン及びホスホマンナンあるいはそれらから誘導したオリゴ糖が本発明に用いるのに好ましい。低コスト天然オリゴ糖配列は、食品及び飼料の栄養補助に用いるのが特に好ましい。
未同定の病原体の処置
炭水化物を含有する組成物及び物質は、特に感染症を生じる病原体が同定されていない場合、病原体による感染症の治療に用いることを目的としている。多くの場合、病原体を診断できないため、診断結果が得られる前に治療を開始しなくてはならない。発展途上国においては、診断ができないか、あるいは高価すぎる場合が考えられる。戦時下の地域、又は人口の少ない遠隔地においても診断ができないと考えられる。本発明による組成物及び物質は、異なる多数の病原体によって生じた感染症の症状を和らげるために用いることができる。本発明は特に、病原体が同定不可能なもの又は病原性大腸菌である場合における、疾患の治療、好ましくは下痢などの消化器系疾患の治療に関する。
複数の炭水化物レセプター結合を操作することで得られる相乗効果
第一の相乗効果は、患者の細胞表面に結合する複数の接着因子を提示している単一の病原体を阻害する効率又は病原体に結合する効率が意外に高いことである。単一のオリゴ糖エピトープを用いて阻害する従来の試みにおいては、通常、病原体は更なる炭水化物結合特異性を有するため、病原体は組織内で生き延びることができる。複数の結合部位を可能な限り阻害した場合、結合の防止又は阻害はより効率的になる。多価結合体を用いた場合、結合体の最も親和性の高い部分が、より低い親和性を有するレセプターと考えられるオリゴ糖配列を、病原体の表面に的中させる。阻害物が病原体の結合機構の大部分を網羅する場合には、阻害は閾値を超えるので、病原体群を組織から液体で流し去ることが可能になり、病原体に対する劇的な防止効果が得られる。本発明を一つの疾患に関わる微生物及び毒素を同時に阻害するのに用いる場合、２つの手段、即ち細菌及び毒素の両方の除去により疾患を和らげることができる。
また、２種以上のオリゴ糖配列の使用は、制止療法（inhibition therapy）に対する耐性の獲得に対しての相乗効果もある。耐性の獲得は、現行の抗生物質療法における共通の問題である。ターゲット組織内の病原体に対する炭水化物レセプターと考えられるものの量に限りがある場合、２種以上のオリゴ糖を使って治療を行うと、細菌には組織への接着という選択肢はなくなる。
いくつかの病原体に対して２種以上のオリゴ糖を用いる場合、相乗的な阻害効果が得られる。いくつかの病原体が同時に感染している場合、それらの病原体や病原体による感染症はしばしば互いの存在を支持している。
病原体と宿主組織との間、病原体同士の間、又は病原体と正常な細菌叢との間における効果のほかにも、病原体の阻害に対する相乗効果は、患者の免疫防御との相互作用により生じる。病原体は免疫防御細胞を弱める場合がある。
共感染の場合、操作可能ないくつかの炭水化物相互作用が関与すると考えられる。例えば、インフルエンザウイルスに感染した細胞はいくつかの肺の病原性細菌により効果的に共感染する。インフルエンザウイルスのシアリダーゼは、細菌に対する非シアリル化レセプターを感染肺細胞に提示させることが示唆されている。また、インフルエンザウイルスはそのヘマグルチニンレセプターを用いて顆粒球へ結合し、白血球の機能不全をもたらす相互作用を引き起こす。
病原体の結合を阻害する相乗効果を用いる方法

１．複数の結合活性を有する単一の病原体に対して少なくとも２種のレセプター炭水化物を用いることによる相乗効果
ａ）少なくとも２種の結合特異性が同時に存在している場合に、同一の病原体に提示されている少なくとも２種の結合特異性を同時に阻害すると、病原体の代替的な結合特異性を効果的に阻害することができる。
ｂ）同様に、第一の結合特異性を阻害した際にそれに代わる第二の結合特異性が発生すると考えられる場合に、病原体の少なくとも２種の結合特異性を阻害することは望ましい。細菌と同様に細胞病原体は、第一の結合特異性を出現させることさえ可能である。下記項目３で多価型の可溶性炭水化物に関連して記載する被覆方法による阻害によって、第一の結合特異性を切断することができるが、それは第一の特異性に対する単一の多価炭水化物では不可能である。そのような切り替えは、例えば、細菌の相変異によって起こり得る。提示されていないレセプターに対する炭水化物接着因子の産生は不必要にエネルギーを消費することになるので、結合性の切り替えは、複数の炭水化物レセプターを用いることのできる病原性細胞には有用である。本発明者らは、本発明による結合特異性は下痢発症性大腸菌株において切断することができることに気づいた。したがって、いくつかの結合性オリゴ糖配列、特に本発明によるオリゴ糖配列を、下痢及び他の腸疾患を生じる細菌の結合を阻害するために用いるのは有用である。本発明は、研究した多数の細菌株の結合特異性は任意に切断されることがあることを明らかにした。長い培養期間中に、すべての結合特異性が切断されることもある。
ｃ）本発明は、結合特異性は、同一の適応症においてさえ、異なる株において安定には発現されないことを明らかにした。これは更に、効果的な治療のためには複数の阻害剤、特に１価の阻害剤、が必要であることを強調する。
ｄ）感染の様々な段階で存在するレセプターの阻害。病原体、例えば下痢といった腸疾患を生じる細菌及びウイルスの阻害についての特別の場合として、本発明は、病原体の結合を２つのレセプター段階で阻害することが有用であることを示す。第一の結合相互作用は、細胞表面を被覆する炭水化物マトリックスの外部で生じる。この外部には、糖タンパク質のオリゴ糖配列、及びおそらくいくつかのポリグリコシルセラミド型の構造が含まれる。本明細書においては、第一の結合相互作用を「第一接触」と称し、第一の結合に関与するレセプターを「第一接触レセプター」と称する。また、本明細書においては、「第二接触」と称する第二の結合相互作用は細胞膜表面に提示された、その大きさが中から小の糖脂質で生じる。本明細書においては、このような中から小の大きさの糖脂質からなるレセプターを「第二接触レセプター」と称する。従来技術は、このような構造的に特徴付けられたオリゴ糖配列をヒトの腸又は消化管の細菌に対する第一接触レセプターとしては記述していない。
本発明は、本発明によるレセプター種の中のいくつかの新規な第一接触レセプターは、ヒト腸のムチン糖タンパク質に提示されていることを示す。新規なレセプターとしては、マンノース含有オリゴ糖配列、Galβ3GlcNAc、Galβ4GlcNAc、ルイスａ及びシアリル化糖タンパク質オリゴ糖配列が挙げられる。更に好ましいレセプターは、第一の結合相互作用に関与するものである。糖タンパク質レセプターへの結合は、細胞表面糖脂質のより短い鎖状オリゴ糖配列への結合とは異なる段階の結合相互作用に基づく。Galβ3GlcNAc、Galβ4GlcNAc、ルイスａ及びシアリル化糖タンパク質オリゴ糖配列は、長い鎖状のポリラクトサミン糖脂質及びそれより短い鎖状の糖脂質にも提示されている。全部又は少なくとも大部分が第二接触レセプターとして発現されている炭水化物構造としては、ラクトシルセラミドレセプター、ガングリオ結合レセプター及びグロボ結合レセプターが挙げられる。
具体的な態様によると、一次接触レセプターを用いることが好ましく、一次接触及び感染を効果的に阻害するために、更に好ましくは少なくとも２種の一次接触レセプターを用いる。本発明は初めて、次に挙げる、ヒト腸に存在する複数の第一接触レセプターを開示する：マルチマンノースレセプター、ネオラクト結合レセプター、ラクト結合レセプター、ルイスａ結合レセプター及びシアル酸結合レセプター。
また、新規な第一接触レセプターはこのようなレセプターに対する他の病原体結合性の探索に有用であることも判明した。結合構造を見出した場合には、レセプター糖質を大腸菌の菌体に対する本明細書に記載したような阻害剤の設計に利用することができる。
フコシル化が不完全なレセプター
好ましい第一接触レセプターの中で更に好ましいのは、ネオラクトオリゴ糖配列、ラクトオリゴ糖配列及びルイスａオリゴ糖配列のようなフコシル化が不完全なレセプターである。このようなレセプターは、分泌型α2-Fuc-Tやルイス式血液型フコシルトランスフェラーゼなどのフコシルトランスフェラーゼを欠失しているヒトに共通して存在する。グリコシル化が不完全な消化管を有するヒトはより感染しやすい傾向にある。本発明は、このような傾向が見られる理由と有効な治療方法とを開示する。病原性大腸菌は、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース及びGalβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcからなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴ糖又はその結合体、好ましくはその多価結合体、によって阻害できる。
本発明は初めて、新規な適応症、即ち、修飾変性が不完全なラクトサミン配列、特にフコシル化が不完全な上皮ラクトサミン配列によって増加する感染症の治療法を開示する。本発明は特に、ルイスフコシルトランスフェラーゼ（フコシルトランスフェラーゼ III）陰性及び／又は分泌型フコシルトランスフェラーゼ陰性であるヒトの治療に関する。上皮細胞上で病原体レセプターとして機能する同様の不完全フコシル化配列は、ヒトの患者が他のフコシルトランスフェラーゼ、特にフコシルトランスフェラーゼ V及び／又はフコシルトランスフェラーゼ VI、を欠失している場合に生じ得る。本発明は、ネオラクトレセプター、ラクトレセプター及びフコースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴ糖配列を含有する炭水化物によって１種の又は複数の病原体を阻害することにより、患者においてこれらの構造が増加している場合に病原体の腸への接着を防ぐことに関する。
好ましい態様においては、次式で表される少なくとも１種のより活性な伸長されたオリゴ糖配列を用いる：
Galβx(Fucα4)nGlcNAcβR
（式中、xは３位又は４位の結合位置を表し、nは０又は１であり、但し、xが４位である場合にはnは０であり；
Rは、単糖残基又はオリゴ糖あるいはその結合体であり、好ましくは、RはGlcNAcβに結合しており、3Gal(NAc)m（式中、mは０又は１である）を含有する）。
好ましい配列としては、以下の配列が挙げられる：Galβx(Fucα4)nGlcNAcβ3Gal、Galβx(Fucα4)nGlcNAcβ3Galβ4Glc、Galβx(Fucα4)nGlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、Galβx(Fucα4)nGlcNAcβ3Galβ3GlcNAc、Galβx(Fucα4)nGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、Galβx(Fucα4)nGlcNAcβ3Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc及びGalβx(Fucα4)nGlcNAcβ3GalNAc。
好ましくは２種のオリゴ糖配列を用いる。２種のオリゴ糖配列の好ましい組み合わせとしては、非還元末端オリゴ糖配列であるGalβ4GlcNAcβ3Gal と Galβ3GlcNAcβ3Galとの組み合わせが挙げられ、これらの配列は共に修飾又はフコシル化が不完全な１型又は２型のＮ−アセチルラクトサミンであり、腸病原体に対するレセプターとして機能する。他の１つの好ましい組み合わせとしては、腸で特に一般的な Galβ3GlcNAcβ3Gal と Galβ3(Fucα4)GlcNAc含有１型ラクトサミンとの組み合わせが挙げられる。好ましい態様においては、上記の３種のオリゴ糖配列を全て用いる。
本発明により以下の事柄が始めて明かになった。
１．単一の病原体、特にヒト消化管に感染する病原性細菌（例えば腸在下痢原性大腸菌）は、標的組織に提示されている特異的なオリゴ糖レセプターのうちの限定数に結合する。いくつかのレセプター結合特異性は同時に機能し得る。
２．多価結合体として用いるオリゴ糖配列又は免疫学的に活性な組成物中のオリゴ糖配列はまた、細菌や菌類のような複数種の病原体を標的とする（例えば、腸内の）免疫防御機構も活性化することができる。炭水化物は特に、非特異的免疫防御反応を活性化するのに用いることができる。
３．患者と複数種の結合相互作用を生じる可能性がある病原体に提示された炭水化物結合活性に対して共通の少なくとも１種の炭水化物レセプターを包含する多価可溶性炭水化物は、細菌を被覆するために用いることができる。細菌の表面を多価可溶性炭水化物で被覆すると、他の結合相互作用は立体的に阻害される。立体的な阻害には適当な分子量を必要とし、一般的には、分子量は効果的な阻害が可能な程度に大きくなければならないが、一方では、ある用途においては可溶性炭水化物を効果的に拡散させることができる程度に小さくなければならない。被覆に用いる多価可溶性炭水化物はいくつかの病原体をまとめて結合して凝集物を形成し、これを、例えば、肺又は腸の上皮の分泌物であるムチンと共に除去する。いくつかの病原体は、種々の種又は株の病原生物、いくつかの細胞、あるいは同じ種、株又は型から得られるいくつかのタンパク性の病原物質を含有していてもよい。
４．共感染している場合に単一の病原体に対する阻害性炭水化物を用いることは、阻害されずに増加する余地を与えられた他の共感染病原体による感染を増大させ得る。１種の病原体の防御はまた、接着が見られる場合には共感染病原体に対する相乗効果も有し、共感染病原体を阻害したり、いくつかの細菌をまとめて排除したりすることができる。多価可溶性炭水化物を用いると、共感染病原体の間で複合体が形成される場合がある。１種、好ましくは少なくとも２種の炭水化物をすべての共感染病原体に対して用いると、１種の相互作用のみを標的とした場合に比べて、感染が格段に効果的に弱められる。すべての共感染病原体を阻害することができる少なくとも２種の炭水化物配列によって共感染を阻害する相乗効果は、少なくとも２種の共感染病原体が存在し、例えば重症の肺炎や下痢を予防する場合に有用である。
下痢発症性大腸菌に対する阻害剤の好ましい組み合わせ
感染症によって接触段階が異なるため、第一接触レセプターオリゴ糖配列を組み合わせて用いることが好ましい。第一接触レセプターは細菌を結合させやすく、阻害のための標的として好ましい。本発明は感染症の治療及び予防にも関し、ヒト胃上皮に対する病原体接着の第一接触レセプターの遮断を、特に、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコースレセプター、シアル酸レセプター及びマンノースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、最も好ましくは少なくとも４種のオリゴ糖レセプターを用いて行う。他の１つの態様においては、少なくとも１種、更に好ましくは少なくとも２種の第一接触レセプターを、Galα4Galレセプター、ラクトシルセラミドレセプター及びガングリオレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種の第二接触レセプターと共に用いる。別の態様においては、Galα4Galレセプター、ラクトシルセラミドレセプター及びガングリオレセプターからなる群より選ばれる少なくとも２種の第二接触レセプターを、所望によりプロバイオティック細菌又はプレバイオティック化合物と共に用いる。
大腸菌によって生じる下痢のような感染症の予防又は治療、及び下痢原性大腸菌の診断には、Galα4Galレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコースレセプター、シアル酸レセプター及びマンノースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖レセプターを用いることも好ましい。ラクトシルセラミドレセプター及びガングリオレセプターは正常な細菌叢の相互作用とも関連するので、上記のレセプターを用いて行うことが好ましい場合がある。
好ましい態様においては、大腸菌によって生じる下痢のような感染症の予防又は治療、及び下痢原性大腸菌の診断は、下記のレセプターグループ（ａ）及び（ｂ）からなる群より選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖レセプターを用いて行うことが好ましい：
（ａ）ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びマンノースレセプター；並びに
（ｂ）フコースレセプター、Galα4Galレセプター及びシアル酸レセプター。
レセプターを選択する際には、少なくとも１種のオリゴ糖レセプターはレセプターグループ（ａ）より選び、他の一方のオリゴ糖レセプターはレセプターグループ（ｂ）より選ぶようにする。更に好ましくは、レセプターグループ（ｂ）から選んだ少なくとも２種のオリゴ糖配列を、少なくとも２種のオリゴ糖レセプターとして用いる。このような組み合わせは、病因特異的レセプターの好ましい組み合わせであり、疾患を生じる病原体を分析した後に得られた特定の下痢発症性株又は疾患種に対する処置を特に目的としている。
好ましい態様においては、大腸菌によって生じる下痢のような感染症の予防又は治療、及び下痢原性大腸菌の診断は、ヒトの母乳又は乳用動物の乳に存在するオリゴ糖から選ばれる異なるオリゴ糖配列を含有する少なくとも２種の物質を用いて行う。乳から得られる好ましい遊離オリゴ糖としては、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコースレセプター、シアル酸レセプター及びラクトシルセラミドレセプターの糖脂質が挙げられる。好ましい態様においては、乳型オリゴ糖配列を１種又は複数の非乳型オリゴ糖配列（好ましくは、Neu5Acα8Neu5Ac、Galα4Gal及びマンノースレセプターオリゴ糖配列からなる群より選ばれるオリゴ糖配列）と共に用いる。
好ましい態様においては、大腸菌によって生じる下痢のような感染症の予防又は治療、及び下痢原性大腸菌の診断は、Galα4Galレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びマンノースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも２種の低コスト化合物を用いて行い、更に好ましくは、低コスト化合物はGalα4Galレセプター及びマンノースレセプターである。
少なくとも２種のレセプターオリゴ糖配列を用いる本発明の方法においては、オリゴ糖配列の１種が本発明によるフコースレセプターであることは、この配列が一般的な天然の第一接触レセプターであるので好ましい。
少なくとも２種のレセプターオリゴ糖配列を用いる本発明の方法においては、オリゴ糖配列の１種が本発明によるGalα4Galレセプターであることは、この配列が大腸菌に対して特に効果的なレセプターであるので好ましい。
少なくとも２種のレセプターオリゴ糖配列を用いる本発明の方法においては、オリゴ糖配列の１種が本発明による高親和性のネオラクトレセプターであることは、この配列がヒト下痢原性大腸菌に対して特に効果的なレセプターであるので好ましい。
少なくとも２種のレセプターオリゴ糖配列を用いる本発明の方法においては、オリゴ糖配列の１種が本発明による高親和性のラクトレセプターであることは、この配列がヒト下痢原性大腸菌に対して特に効果的なレセプターであるので好ましい。
少なくとも２種のレセプターオリゴ糖配列を用いる本発明の方法においては、オリゴ糖配列の１種が本発明によるNeu5Gcレセプターを含有するオリゴ糖配列であることは、この配列がヒト下痢原性大腸菌に対して特に効果的なレセプターであるので好ましい。
ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びフコースレセプターの組み合わせは、上記のような、修飾が不完全な配列の組み合わせとして好ましい。
多価の担体及び結合体
好ましい態様においては、少なくとも１種の病原体阻害性／病原体レセプターオリゴ糖配列は、多価の担体に結合しており、更に好ましくは、少なくとも２種の病原体阻害性のオリゴ糖配列が結合している。具体的な態様においては、少なくとも２種の病原体阻害性のオリゴ糖配列が同じ多価担体に結合している。多価担体は、好ましくは炭水化物担体（例えば多糖又はオリゴ糖）であり、好ましい態様においては、炭水化物担体は可溶性炭水化物担体である。好ましい態様においては、炭水化物担体は細菌由来の多糖である。
他の１つの態様においては、少なくとも１種の病原体阻害性オリゴ糖配列は粒状担体上に発現されている。粒状担体としては、炭水化物粒子、合成重合体粒子又は細胞が好ましい。細胞は、細菌又は酵母の細胞であることが好ましい。好ましい粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍの範囲内である。
多価結合体は、非抗原性及び非免疫原性となるように設計されているものが好ましく、こうすることで結合体による免疫反応をわずかにするか、完全に抑える。多糖の他の好ましい特性の例として、多糖及び／又はその分解産物の低毒性が挙げられる。
細菌の阻害を目的とする多価結合体は、上皮に対する炭水化物結合特異性が現れないように設計する。炭水化物結合特異性を有する場合、結合体は上皮に付着し、組織に対する病原体の病原性結合が増加する。
細菌の細胞外多糖（exopolysaccharide）又は細菌の莢膜多糖が好ましく、特に非病原性細菌（例えば乳酸菌）の多糖が好ましい。本発明によるオリゴ糖レセプターのいくつかは、細菌の多糖から見出されている。本発明はまた、レセプターオリゴ糖エピトープを得るための、細菌の多糖、特に非病原性細菌（例えば乳酸菌）の多糖の工学的改変にも関する。工学的改変は、遺伝学的に、又は、多糖の化学的修飾（例えば、特異的加水分解やグリコシル基転移反応）によって行うことが可能である。本発明によれば、本発明による少なくとも２種のレセプターオリゴ糖を含む、細菌性多糖又は細菌性多糖の混合物を用いることができる。更に好ましくは、本発明による少なくとも３種のレセプターオリゴ糖配列を含む、細菌性多糖又は細菌性多糖の混合物を用い、他の１つの態様においては、本発明による少なくとも４種のレセプターオリゴ糖を含む、細菌性多糖又は細菌性多糖の混合物を用いることが好ましい。
NeuNAcα6Gal 又は NeuNAcα3Galを含む好ましい多糖物質は、多糖に結合したNeuNAcα6Galβ4/3GlcNAc、NeuNAcα3Galβ4/3GlcNAc、NeuNAcα6Galβ4/3Glc 又は NeuNAcα3Galβ4/3Glcを含有する。NeuNAc3Galを含有するこのような多糖は、Ｂ型のストレプトコッカス属細菌の特定の細胞外多糖に既に提示されている。類似の多糖は、非病原性細菌（例えば乳酸菌）で発現することができる。NeuNAcα6Galを含有する多糖は、NeuNAcα3Galβ4GlcNAcを含有する多糖を完全に又は部分的に脱シアリル化し、続いてGalの６位をシアリル化するトランスフェラーゼ（例えばα６−シアリルトランスフェラーゼ）を用いて再度シアリル化することによって製造できるので、更に好ましい。また、Galβ4/3GlcNAc又はGalβ4/3Glcを末端に有する非シアリル化多糖をシアリル化することもできる。本発明によるオリゴ糖配列（例えば、Galβ4/3GlcNAc、Galβ4Glc 及び Galβ3GalNAc）並びに本発明による長いオリゴ糖配列を含有する、非シアリル化細菌性多糖又はその誘導体もまた、本発明の方法において好ましく用いられる。好ましい態様においては、Galβ4/3GlcNAc 及び／又は Galβ4Glc配列を含有する部分的シアリル化多糖を用いる。
他の１つの態様には、抗原性、免疫促進性又は免疫調節性の炭水化物結合体が含まれる。具体的な態様においては、抗原性又は免疫原性の炭水化物結合体は、少なくとも１種の本発明によるオリゴ糖配列と共有結合している。
病原体を免疫細胞又は免疫防御タンパク質に交差結合させるための多価結合体
また、炭水化物組成物は、病原体を免疫細胞（例えば種々の白血球）又は免疫防御タンパク質（例えば抗体、免疫レクチン（immune lectins）又は他の病原体阻害剤）に交差結合させるために用いることができ、これによって病原体を阻害することができる。
病原体に対する複数のレセプターが免疫細胞の表面に見出されることが報告されている。免疫細胞に提示されている好ましいレセプター、例えば食作用レセプターは病原体の破壊を目的としている。多価又はオリゴ価のオリゴ糖配列は、感染病原体に対する食作用や破壊を防止することができるようにあまり大きくないことが好ましい。このようなレセプターとしては、マクロファージ上のマンノースレセプター及びＮ−アセチルグルコサミンを結合するナチュラルキラー細胞のレセプターが挙げられる。いくつかの天然の及び合成した炭水化物をこのような配列の類似体として用いることができることは明らかである。マンノースレセプターに結合する好ましい炭水化物は、自由な軸結合性の水酸基（free axial hydroxyl group）を少なくとも２個有する末端単糖又は単糖類似体を含有する。免疫細胞に結合させる多価の炭水化物配列としては、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン又はグルコースを含有する多価結合体が挙げられる。単糖は、ヒトの体に存在する天然成分を選択することが好ましい。即ち、マンノースはＤ−マンノピラノース、フコースはＬ−フコピラノース、Ｎ−アセチルグルコサミンはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミノピラノース、Ｎ−アセチルマンノサミンはＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミノピラノース、そしてグルコースはＤ−グルコピラノースが好ましい。最も好ましい態様においては、単糖残基は天然型のグリコシド結合によって隣接する単糖に結合しており、例えばManα1-3、Manα1-6、Manα1-2、GlcNAcβ1-3、GlcNAcβ1-2、GlcNAcβ1-6、Fucα1-2、Fucα1-3、Fucα1-4 又は Fucα1-6 などの結合が挙げられる。好ましいオリゴ糖配列は、次に挙げる末端二糖を含有する：Manα1-3Man、Manα1-6Man、Manα1-2Man、GlcNAcβ1-3Gal、GlcNAcβ1-2Man、GlcNAcβ1-6Gal、Fucα1-2Gal、Fucα1-3GlcNAc、Fucα1-4GlcNAc 又は Fucα1-6GlcNAc。
具体的な態様においては、少なくとも１種の病原体と、病因阻害性免疫細胞又は白血球との両方に対する結合特異性を有する重合体炭水化物を、病原体と免疫細胞とを交差結合させるために用いる。具体的には、α−マンノース含有炭水化物を、細菌（例えばサルモネラ属細菌や大腸菌）と白血球／補体系との同時結合に用いる。
他の１つの態様においては、少なくとも２種の本発明によるオリゴ糖配列を含有する多価物質を、少なくとも１種の病原体と、病原体を阻害可能な少なくとも１種の免疫細胞との同時結合に用いる。少なくとも２種の本発明によるオリゴ糖配列を含有する多価物質に含まれるオリゴ糖配列の１種は、Manα含有オリゴ糖配列であることが更に好ましい。
病原体を被覆し凝集させる可溶性多価結合体
好ましい多価結合体の例として、可溶性の又はゲル形成性の多価結合体が挙げられる。更に好ましくは、多価結合体は、可溶性であって細菌の表面を被覆することができるものである。細菌を被覆する可溶性多価結合体の分子量は、少なくとも５，０００ダルトンであることが好ましく、更に好ましくは少なくとも約１０，０００ダルトンであり、最も好ましくは少なくとも約２０，０００ダルトンである。いくつかの用途においては、結合体が胃粘膜で効果的に拡散するために、結合体の分子量を制限すべきである。多価結合体の分子量の上限は、約３００，０００ダルトンが好ましく、約１５０，０００ダルトンがより好ましく、５０，０００ダルトンが最も好ましい。更に好ましい分子量範囲は約５，０００〜約５０，０００ダルトンであり、約１０，０００〜５０，０００ダルトンがより好ましく、約２０，０００〜約１００，０００ダルトンが最も好ましい。分子量の限定においては、少なくとも約７０％の分子が所望の範囲にあることが好ましく、少なくとも８０％の分子が所望の範囲にあることが更に好ましい。
いくつかの種類の結合を阻害しなければならない場合、病原体の表面に拡散し、それを被覆できる多価結合体は、病原体の阻害に特に効果的である。多価結合体は、存在する病原体に最も一般的な結合活性に対応する炭水化物を含んでいる。多価結合体による表面の被覆は、病原体の表面上の他の炭水化物結合レセプターを立体的に遮蔽する。少なくとも２種の病原体被覆性の多糖を用いることが好ましい。より好ましいものは、２種の異なるレセプターオリゴ糖配列が同じポリマーに結合している。
最も好ましくは、可溶性多価結合体は多糖主鎖を含有している。
このように、本発明は、多価物質、特に、少なくとも２種（好ましくは少なくとも３種）のレセプターオリゴ糖配列を含有する可溶性多価物質に関する。本発明はまた、少なくとも４種のレセプターオリゴ糖配列を含有する多価物質に関する。
自己に対する炭水化物結合性を誘導することができる多価結合体
本発明はまた、病原体が付着しようとする多価の天然表面を模倣する多価結合体によって病原体細胞に誘導可能な炭水化物結合特異性に関する。誘導され得る結合特異性は、常に活性である必要はなく、病原体がレセプターに結合する必要のあるときに活性化されればよい。本発明によれば、病原体細胞、特に、大腸菌のような細菌は、誘導可能なレセプター炭水化物結合をレセプターとの接触により活性化する。誘導のメカニズムは、少量の誘導可能なレセプターが細胞表面に存在し、それがシグナルを送ることにより、多量のレセプターを誘導する、というものである。
レセプターの誘導のために、上記の多価結合体を用いることができる。標的となる病原体細胞がムチン層に含まれる高分子量体に接近可能な場合には、高分子量の結合体が好ましい。この用途においては、標的となる病原体細胞が接近可能な場合には、不溶性の高分子量結合体（non-soluble polymeric conjugates）でさえ用いることができる。
治療の対象
本発明では、腸感染症又は肺感染症の治療が１つの好ましい態様である。「治療」とは、予防的及び防御的治療をも意味する。同様に、本発明は、経口感染症又は消化器系感染症の治療、患者の他の上皮、体表面（例えば皮膚）又は生殖器（例えば膣）表面の感染症の治療にも適用することができる。本発明は更に、患者の循環血液に対してさえも用いることができるが、この場合には、使用する物質や組成物の適性について特別の注意を要する。
本発明は、特に好ましくは、腸在病原体の処置に関する。好ましい腸在病原体は、下痢を発症するものである。下痢発症性病原体の例として、腸疾患を生じるすべての大腸菌を挙げることができる。大腸菌の例として、EPEC（腸管病原性大腸菌）、ETEC（毒素原性大腸菌）、EHEC（腸管出血性大腸菌）、EAEC（腸管凝集性大腸菌）及びEIEC（腸管侵入性大腸菌）が挙げられ、これらの大腸菌に対して本発明の組成物を用いることができる。
非大腸菌感染症及び共感染症の治療と予防
大腸菌以外のいくつかの病原体が、ヒトにおいても、また動物においてさえも、本発明の炭水化物レセプターを含む類似のレセプター環境（特に、消化管レセプター環境、特に腸レセプター環境）において生息することが判明した。ヒト（特にヒトの消化管）に感染する非大腸菌病原体、具体的には、ヒトの腸に感染する非大腸菌病原体は、少なくとも１種の本発明によるレセプターオリゴ糖配列を用いる傾向がある。他の病原体による感染症の本発明による治療は、病原体が少なくとも２種（好ましくは少なくとも３種）の本発明によるレセプターオリゴ糖配列に結合し、且つ、本発明によるオリゴ糖配列を用いることが特に有益である場合に、好ましい。このように、本発明は、少なくとも２種のレセプターオリゴ糖配列を含有する複数の化合物を包含する組成物をヒト消化管（特に腸）の病原体に対して用いる方法に関する。
病原体が大腸菌でない場合、病原体は他のレセプター又は類似オリゴ糖配列を利用するか結合することができる。本明細書において「レセプターオリゴ糖配列」と称する他のオリゴ糖配列には、好ましくはFucα2Gal、Fucα3GlcNAc、Fucα3Glc、ガングリオ系ガングリオシド及びNeuNAcα8NeuNAcが含まれる。更に好ましいフコシル化配列としては、Fucα2Galβ3/4GlcNAc、Fucα2Galβ4Glc、Fucα2Galβ4(Fucα3)Glc、Galβ4(Fucα3)GlcNAc及びFucα2Galβ3/4(Fucα4/3)GlcNAcが挙げられる。本発明は、少なくとも２種の本発明によるレセプターオリゴ糖配列を含有する化合物と共に上記の他のレセプターオリゴ糖配列の少なくとも１種を包含する組成物を、ヒト消化管（特に腸）に存在する病原体に対して用いる方法に関する。本発明は、また、少なくとも１種の下痢原性大腸菌と少なくとも１種の非大腸菌病原体とによって生じる複数の感染症の同時治療に関する。
Fucα2Gal構造は他の（大腸菌ではない）病原体に結合するので、本発明の物質と組み合わせて用いるのに有益である。好ましい態様においては、Fucα2Gal構造やFucα2Gal-Xyl構造は、植物のヘミセルロースに由来するものである。本発明は、植物のヘミセルロースに由来するFucα2Gal構造を包含する医薬物質にも関する。この医薬物質は、食品、飼料、飲料などの栄養補助組成物、内服薬、内服薬に類似した医薬組成物などに用いることができる。
レセプター炭水化物の組み合わせ及び本発明による多価結合体の標的となり得る他の細菌の例として、Vibrio choleraeを含むビブリオ属細菌、Campylobacter jejuniを含むカンピロバクター属細菌、Salmonella typhimuriumを含むサルモネラ属細菌、リステリア属細菌、シゲラ属細菌、アエロモナス属細菌、腸ウイルス（特にロタウイルス）、及びエントアメーバ属原虫を含む腸内寄生真核生物が挙げられる。他の腸在病原体は、例えば赤血球を用いた血球凝集パターンの研究によって示されているように、下痢発症性大腸菌と同様の結合挙動を示す。他の病原体は、下痢発症性大腸菌が生息するのと類似の環境に生息し、使用するレセプターの少なくとも一部は、下痢発症性大腸菌の用いるレセプターと同一である。
腸や肺などにおける多くの感染症には、複数の病原体が関与する。このような感染症は、治療が困難であり慢性化する可能性がある。多くの下痢や肺疾患は、当初は軽度の感染症であったとしても、致死的なものになる可能性がある。合併症は、複数の病原体の共感染によってしばしば生じる。患者に感染しているか感染していると考えられる２種以上の病原体による疾患を治療するために、炭水化物組成物を用いることが特に好ましい。本発明の組成物は、病原性細菌、毒素、ウイルス、菌類及び寄生生物からなる群より選ばれる少なくとも２種の病原体を同時に阻害するために用いることができる。好ましくは、本発明の組成物は、病原性細菌、毒素及びウイルスからなる群より選ばれる少なくとも２種の病原体を同時に阻害するために用いることができる。毒素と病原性細菌との組み合わせの好ましい１例として、大腸菌の毒素と大腸菌の菌体との組み合わせが挙げられる。毒素タンパク質は、１つ、通常はオリゴマー状に整列した数個のレクチン部位を含む。例えば、コレラ毒素やシガ様毒素などの細菌毒素は、環状タンパク質の５量体の中に５つのレクチン ドメイン含まれる。細菌の表面においては、接着レクチン（即ち、接着因子）が多価の型で提示されている。細菌由来の炭水化物は、細胞外多糖、莢膜多糖、リポ多糖又はペプチグリカンのような大きな多価結合体として、対生物活性炭水化物エピトープを提示する。どのような効果的な阻害剤も、２つ以上のレクチン部位を阻害できることは知られていない。好ましい多価の又はオリゴ価の結合体は、特別の炭水化物結合体である。
本発明によれば、２種の異なる病原体を同時に阻害することが好ましい。好ましい態様においては、本発明はウイルスと細菌とによる共感染症の治療を目的としている。好ましくは、細菌はエシェリキア属細菌、ビブリオ属細菌、サルモネラ属細菌、リステリア属細菌、シゲラ属細菌、アエロモナス属細菌又はカンピロバクター属細菌である。最も好ましくは、細菌は下痢発症性大腸菌又は大腸菌のいくつかの株であり、ウイルスは下痢発症性ウイルス（例えばロタウイルス）である。他の好ましい組み合わせの例として、肺病原性細菌（好ましくはHaemophilus influenzae、Klebsiella pneumoniae、Streptococcus pneumonia及びPseudomonas aeruginosa）と肺感染ウイルス（例えばインフルエンザウイルス）との組み合わせが挙げられる。
ウイルスの表面及び接着メカニズムと細菌のそれらとは異なる。ウイルスの表面は、比較的小さな曲がった表面上の規則的な表面構造の中に感染性レクチンが含まれる。一方、ウイルスより大きい細菌の表面は、通常は繊毛やべん毛のような線状の規則的構造を有する接着性レクチンを含んでいる。したがって、ウイルス感染と細菌感染とを効果的に同時に予防することは特に困難である。本発明は、ウイルスと細菌とによる共感染症の処置に用いることのできる特別なオリゴ価又は多価の組成物又は物質を用いる方法を開示する。このオリゴ価又は多価の組成物又は物質は、好ましくは、１つ又は複数の病原体表面に提示された２種以上のレクチンによる結合を阻害することができる特別な炭水化物結合体として活性炭水化物を含有する。
炭水化物の新規な適応症に対する、レセプターオリゴ糖配列を単独又は組み合わせる用途
レセプターオリゴ糖配列を、下痢発症性大腸菌に関する治療又は他の用途のために、単一成分物質又はその一部として用いることができる。本発明は、下痢に関する新規で一般的な適応症を開示する。この適応症においては、下痢は、下痢発症性大腸菌の５つの主要な型、即ち、EPEC（腸管病原性大腸菌）、ETEC（毒素原性大腸菌）、EHEC（腸管出血性大腸菌）、EAEC（腸管凝集性大腸菌）及びEIEC（腸管侵入性大腸菌）、のうちの１種によって生じることもあるし、未分類又は分類不能の下痢発症性大腸菌野生株によって生じることさえある。
本発明のレセプターオリゴ糖は、下痢発症性大腸菌のいずれかの型によって生じる感染症の治療のための単一成分物質又はその一部として用いることができる。好ましい態様においては、感染症は上記の５つの主要な型の下痢発症性大腸菌のすべてによって生じる感染症であり、更に好ましくは、上記の５つの主要な型の下痢発症性大腸菌のうちの少なくとも４種によって生じる感染症であり、更に別の態様においては、少なくとも３種によって生じる感染症である。また、１つのオリゴ糖配列の最初の適応症が示唆された場合には、本発明のオリゴ糖配列は、いくつかの下痢発症性大腸菌によって生じる下痢の治療のための医薬組成物を調製するために好ましく用いられる。オリゴ糖配列を単独で用いる場合は、複数のオリゴ糖配列を組み合わせて用いる本発明の場合ほどには効果的ではない。下痢発症性大腸菌の全部又は主要な型によって生じる感染症に対して炭水化物物質を用いるという一般的方法が新規であり進歩性を有するものであるから、レセプターオリゴ糖配列を組み合わせて用いることは、更に新規であり進歩性を有する。
治療のために最も新規なレセプターオリゴ糖の単独の用途
先行技術において、いくつかのオリゴ糖配列が特定の型の下痢発症性大腸菌の阻害剤として機能することが示唆されている。しかし、先行技術において示されているデータは矛盾した結果を含むものであり、どのオリゴ糖配列を単独で用いることができるかは分からない。先行技術は、考えられる結合の治療への応用は示しておらず、炭水化物を媒介とする病原体の結合に対する阻害剤を提供するための結合特異性をただの１つも示していない。先行技術は、治療上最も重要な炭水化物結合のための単純な第１の基準を与えていない。治療上有益な、炭水化物を媒介とする病原体の結合は、以下の場合に考慮することができる：
１）病原性細菌（又は病原性細胞）の特定の株が再現性のある結合特異性を有し、
２）結合特異的部位が病原体に提示されており、
３）対応するレセプターオリゴ糖配列が関連する標的組織に提示されており、且つ
４）標的組織上の関連するレセプターオリゴ糖配列が病原体の結合特異性のために存在する場合。
治療の有用性を考慮する場合には、阻害剤として機能する可能性のあるオリゴ糖配列の効果を明確にする必要がある。本発明は、病原体を阻害するために有用な物質と組成物を示す。結合の可能性があるものについての先行技術では、病原体の結合に対する効果的な本発明の阻害剤を決定することができない。本発明は、初めて、ヒトの消化管において下痢発症性大腸菌が利用する第一接触レセプターとして、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコシルレセプター、シアリル酸レセプター及びマンノースレセプターを開示する。下痢発症性大腸菌が組織に結合するためのレセプターとしては、ラクトシルセラミドレセプター及びGalα4Galレセプターは先行技術文献には記載されていないし、Galβ3GalNAcへの特異的結合についても記載されていない。毒素を処置するための先行技術の方法では、疾患を治癒することはできず、特定の大腸菌株による疾患の症状を和らげることができるだけである。本発明は、下痢発症性大腸菌による一般的及び特定の適応症の治療のために、下記のオリゴ糖配列を、単一成分物質として又は単一成分物質の一部として用いることに関する：
ａ）ラクトシルセラミドレセプター、
ｂ）Galβ3GalNAcレセプター、
ｃ）Galα4Galレセプター、
ｄ）ラクトレセプター、好ましくはGalβ3GlcNAcβ3Galレセプター、
ｅ）ネオラクトレセプター、好ましくは(GlcNAcβ3)0-1Galβ4GlcNAcβ3Galレセプター、
ｆ）フコシルレセプター、
ｇ）シアル酸レセプター、及び
ｈ）マンノースレセプター。
また、１つのオリゴ糖配列の最初の適応症が示唆された場合には、本発明のオリゴ糖配列は、いくつかの型の下痢発症性大腸菌によって生じる下痢の治療のための医薬組成物を調製するために好ましく用いられる。オリゴ糖配列を単独で用いる場合は、複数のオリゴ糖配列を組み合わせて用いる本発明の場合ほどには効果的ではない。本発明における特定のオリゴ糖配列の重要性の発見は、オリゴ糖配列の特定の組み合わせを用いる本発明の方法の進歩性を高める。適切なオリゴ糖配列は、本発明において開示する１価又は多価の阻害剤として用いることができる。
個々の下痢原性大腸菌適応症に関連した治療、予防及び処置に用いる好ましいレセプターオリゴ糖配列

EHEC感染症に対して用いる好ましく且つ新規な物質及び組成物
本発明はまた、腸管出血性大腸菌（EHEC）によって生じる疾患の治療にも関する。Galα4Galを含む物質が大腸菌のシガ様毒素を阻害することについてはすでに報告されている。複数のオリゴ糖配列を用いる方法、特に、細菌の結合を阻害する方法についてはこれまで知られていない。本発明においては、複数のEHEC株をスクリーニングした。好ましい結合特異性について特別な結合挙動が見られた。本発明によると、このような特異性が８種の特異性の中でEHECの処置には好ましい。次のオリゴ糖配列を含む物質がEHEC感染症の治療に好ましい：ラクトシルセラミドレセプター、ガングリオレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコースレセプター及びマンノースレセプター；更に好ましくはラクトシルセラミドレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びフコースレセプター。上記物質は、本発明で開示したオリゴ糖配列を少なくとも２種包含する組成物に用いることも好ましい。
上記オリゴ糖配列を毒素阻害性オリゴ糖配列、例えばシガ様毒素に対するGalα4Gal型レセプター、と共に用いることが可能である。いくつかのオリゴ価及び多価のオリゴ糖、特にGalα4Galβ4Glc型及びGalα4Galβ4GlcNAc型の配列は、毒素に対して効果的な阻害剤となることが報告されている。これまでの研究を鑑みると、毒素の阻害だけでは治療効果が十分ではない。本発明によると、Galα4Gal型オリゴ糖はEHEC接着及び効果的な治療のための主要な接着レセプターではない。
EHECの予防、治療又は診断に関する好ましい態様においては、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びフコースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種のレセプターを用い、更に好ましくは少なくとも２種のレセプターを用いる。少なくとも３種又は少なくとも４種のレセプターを用いることも好ましい。これらのレセプターは病原性生物に対する特異性が高いために好ましい。ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びフコースレセプターからなる群より選ばれるレセプターの高親和性型を用いることが特に好ましい。本発明はまた、ヒト胃上皮へのEHEC接着に関与する第一接触レセプターを遮断することによるEHEC感染症の治療にも関し、特に、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコースレセプター及びマンノースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種のレセプターを用い、更に好ましくは少なくとも２種のレセプターを用いる。他の１つの態様においては、少なくとも１種の第一接触レセプター、更に好ましくは少なくとも２種の第一接触レセプターを、ラクトレセプター及びガングリオレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種の第二接触レセプターと共に用いる。好ましい態様においては、本発明による好ましいレセプターオリゴ糖配列の高親和性変異体を用いる。
EPEC感染症に対して用いる好ましく且つ新規な物質及び組成物
本発明はまた、腸管病原性大腸菌（EPEC）によって生じる疾患の治療にも関する。特徴付けられていない複数の結合特異性がEPECに関して示唆されている。これらの結合特異性の治療上の有用性については証明されていない。結合と感染との関連性は示されておらず、これまでのデータでは、公知の結合特異性の中から有用なものを特定することはできない。報告は矛盾しており、このような物質は治療に用いるのに有用ではないことを示す報告もある。複数のオリゴ糖配列を用いる方法、特に、細菌の結合を阻害するために複数のオリゴ糖配列を用いる方法についてはこれまで開示されていない。本発明においては、複数のEPEC株をスクリーニングした。次のオリゴ糖配列を含む物質がEPEC感染症の治療に好ましい：ラクトシルセラミドレセプター、Galα4Galレセプター、シアル酸レセプター、高親和性ネオラクトレセプター及び新規なガングリオレセプター。
高親和性ネオラクトレセプターは、下記式（ＸＩＶ）で表される末端オリゴ糖配列を含んでいる。
[GlcNAcβ3]n1Galβ4GlcNAc[β3Gal{β4Glc(NAc)n2}n3]n4 （ＸＩＶ）
（式中、n1、n2、n3及びn4は各々独立に０又は１であり、n1が１の場合には、式中の非還元末端GlcNAcは他の単糖残基又はオリゴ糖残基、好ましくはGalβ4又はGlcNAcβ3Galβ4によって置換することができるが、但し、n4及びn1のいずれか一方が１である。）
本発明による新規なガングリオレセプターは、末端二糖のGalβ3GalNAc（但し、好ましくは二糖がラクトースにβ４結合していないもの）を含有する。二糖エピトープは、概して、四糖エピトープよりも製造コストが低い。より好ましくは、オリゴ糖配列はGalβ3GalNAcβ（但し、二糖エピトープがラクトースに結合していないもの）、あるいはGalβ3GalNAcβ4Gal（但し、還元末端Galがグルコースに結合していないもの）である。末端二糖配列及び末端三糖配列は、下痢発症性大腸菌のレセプターとしても、EPECのレセプターとしても、これまでに記載されたことはない。末端二糖及び末端三糖の使用は、既知の四糖レセプターよりも、合成のための費用効果が高いため好ましい。
また、上記の物質は、本発明で開示するレセプターオリゴ糖配列を少なくとも２種包含する組成物に用いることも好ましい。
本発明は特に、少なくとも１種のEPEC阻害性オリゴ糖配列を用いるEPEC結合の阻害及びEPEC感染症に対する治療に関し、該オリゴ糖は、ラクトシルセラミドレセプター、Galα4Galレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、シアル酸レセプター及びフコースレセプターからなる群より選ばれるものであり、更に好ましくは、Galα4Galレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びフコースレセプターからなる群より選ばれるものであり、上記レセプターは本発明で開示するレセプターである。更に、本発明は、本発明において好ましいオリゴ糖配列を少なくとも２種又は少なくとも３種包含する組成物を用いた、EPEC結合の阻害方法及びEPEC感染症の治療方法に関する。
好ましい態様においては、本発明による好ましいレセプターオリゴ糖配列の高親和性変異体を用いる。本発明による一価のレセプター及び多価のレセプター結合体をEPECに関連して用いることも好ましい。
本発明はまた、EPECに対する処置に用いるレセプターオリゴ糖配列と、感染カスケードの後期に関与するインチミンレセプターを阻害可能な少なくとも１種のオリゴ糖配列とからなる組み合わせにも関する。インチミンに対するレセプターは、その末端構造がFucα2Gal、特にフコシルラクトースであるFucα2Galβ4Glc 又は Fucα2Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcを有する構造であると報告されている。
ETEC感染症に対して用いる好ましく且つ新規な物質及び組成物
本発明はまた、毒素原性大腸菌（ETEC）によって生じる疾患の治療にも関する。特徴付けられていない複数の結合特異性がETECに関して示唆されている。これらの結合特異性の治療上の有用性については証明されていない。結合と感染との関連性は示されておらず、これまでのデータでは、公知の結合特異性の中から有用な組成物又は物質を特定することはできない。報告は矛盾しており、このような物質は治療に用いるのに有用ではないことを示す報告もある。複数のオリゴ糖配列を用いる方法、特に、細菌の結合を阻害するために複数のオリゴ糖配列を用いる方法についてはこれまで開示されていない。本発明においては、複数のETEC株をスクリーニングした。次のオリゴ糖配列を含む物質がETEC感染症の治療に好ましい：ラクトシルセラミドレセプター、Galα4Galレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、シアル酸レセプター、フコースレセプター及び新規なガングリオレセプター。ETECの処置又は診断に更に好ましいオリゴ糖配列は、Galα4Galレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びフコースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、上記レセプターは本発明で開示するレセプターである。更に、本発明は、本発明によるオリゴ糖配列の少なくとも２種又は少なくとも３種を包含する組成物を用いた、ETEC結合の阻害方法及びETEC感染症の治療方法に関する。
好ましい態様においては、本発明による好ましいレセプターオリゴ糖配列の高親和性変異体を用いる。
本発明による一価のレセプター及び多価のレセプター結合体をETECに対して用いることも好ましい。
EAEC感染症に対して用いる好ましく且つ新規な物質及び組成物
本発明は腸管付着性大腸菌（EAEC）に対する新規な結合特異性を開示する。本発明で開示する８種の結合特異性のそれぞれに関連したオリゴ糖配列を包含する物質は、単一成分物質であっても、EAECによって生じる感染症の治療又はEAECの診断に用いることが可能である。本発明は特に、Galα4Galレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、シアル酸レセプター及びマンノースレセプターからなる群より選ばれる１種のレセプターを用いたEAECによって生じる感染症の治療方法又はEAECの診断方法にも関する。更に好ましくは、少なくとも２種のレセプターを用いる。これらのレセプターは、病原性生物に対する特異性が高いために好ましい。ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びフコースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種のレセプターの好ましい型又は高親和性型を用いることが特に好ましい。
本発明はまた、ヒト胃上皮へのEAEC接着に関与する第一接触レセプターを遮断することによるEAEC感染症の治療にも関し、特に、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコースレセプター、シアル酸レセプター及びマンノースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種のレセプターオリゴ糖を用いる治療に関する。更に好ましくは、少なくとも２種のレセプターを用いる。他の１つの態様においては、少なくとも１種の第一接触レセプター、更に好ましくは少なくとも２種の第一接触レセプターを、Galα4Galレセプター、ラクトシルセラミドレセプター及びガングリオレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種の第二接触レセプターと共に用いる。
好ましい態様においては、本発明による好ましいレセプターオリゴ糖配列の高親和性変異体を用いる。
また、本発明による一価のレセプター及び多価のレセプター結合体をEAECに対して用いることも好ましい。
EIEC感染症に対して用いる好ましく且つ新規な物質及び組成物
本発明は腸管侵入性大腸菌（EIEC）に対する新規な結合特異性を開示する。本発明で開示する８種の結合特異性のそれぞれに関与したオリゴ糖配列を包含する物質は、単一成分物質であっても、EIECによって生じる感染症の治療又はEIECの診断に用いることが可能である。本発明は特に、Galα4Galレセプター、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、シアル酸レセプター、フコースレセプター及びマンノースレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種のレセプターを用いた、EIECによって生じる感染症の治療方法又はEIECの診断方法にも関する。更に好ましくは、少なくとも２種のレセプターを用いる。これらのレセプターは、病原性生物に対する特異性が高いために好ましい。ラクトレセプター、ネオラクトレセプター及びフコースレセプターからなる群より選ばれるレセプターの高親和性型を用いることが特に好ましい。
本発明はまた、ヒト胃上皮へのEIEC接着に関与する第一接触レセプターを遮断することによるEIEC感染症の治療にも関し、特に、ラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコースレセプター、シアル酸レセプター及びマンノースレセプターから選ばれる少なくとも１種のレセプターオリゴ糖を用いる。更に好ましくは、少なくとも２種のレセプターを用いる。他の１つの態様においては、少なくとも１種の第一接触レセプター、更に好ましくは少なくとも２種の第一接触レセプターを、Galα4Galレセプター、ラクトシルセラミドレセプター及びガングリオレセプターからなる群より選ばれる少なくとも１種の第二接触レセプターと共に用いる。
好ましい態様においては、本発明による好ましいレセプターオリゴ糖配列の高親和性変異体を用いる。
また、本発明による一価のレセプター及び多価のレセプター結合体をEIECに関して用いることも好ましい。
本発明の方法及び組成物を用いた動物の治療
具体的な態様においては、本発明を、家畜やペットの感染症の治療に使用する。動物に感染する細菌の結合特異性はヒトの病原体の結合特異性とは異なる。しかし、数種の特異性を同時に用いる一般的なメカニズム及び多価結合体（特に本発明による可溶性多価結合体）は、動物の治療にも好ましく用いることができる。結合特異性はまた、部分的な交差反応性を有し、本発明に記載のいくつかのレセプターの組み合わせは、動物の治療に有用であるほか、ウシなどの動物から伝播するいくつかの細菌株に対しても有用である。本発明によると、いくつかのレセプターオリゴ糖配列が、ネコやイヌ、更にはブタにさえも消化管に存在している。特定の動物種の間又はヒトと特定の動物との間に見られる、特定の菌株の示す交差反応性は、結合特異性を分析する以前には知りえなかった。動物において菌体が感染症を生じる最も一般的な大腸菌、例えばK99株やK88株、はヒトには感染しない。
本発明は特に、動物からヒト及びその逆にヒトから動物への感染症の伝播の防止に関する。このような伝播は、多くの下痢（例えば、いわゆるハンバーガー病を含むEHECによって生じる疾患）の病因となる重要なメカニズムである。また、家畜、家畜から調製した食物、ペット又は他の動物が国々を移動する際に、下痢といった感染性疾患を蔓延させる危険性もある。
従来から用いられている抗生物質の代替物
従来から用いられている抗生物質の使用が許容されず、また禁止さえされている場合もあることから、動物に対する抗感染性治療が必要とされている。このような治療は、動物の飼料及び処置に用いられてきた従来の抗生物質の全て又は一部の代替となることを目的とする。
本発明はヒトと近接して生活する動物について報告されているレセプター配列を開示し、そのようなレセプター配列はおそらく、家畜からヒトへの感染症の伝播の際に役割を果たしている。本発明はまた、動物の糖脂質に対するヒト下痢発症性大腸菌菌体の実際の結合も示している。いくつかの糖脂質レセプターは動物とヒトの腸組織の間で同じである。本発明はまた、動物に特異的なレセプター、即ち、動物の間でより一般的な動物特異的レセプターにも関する。本発明で対象とする好ましい動物は、主要な家畜又は農場動物あるいは愛玩動物である。家畜又は農場動物としては、ウシ及び他の家畜反芻動物、ブタ、ヒツジ、ウマ、家禽（例えば、メンドリ、アヒルや七面鳥）ならびにウサギが挙げられ、愛玩動物としては、イヌ、ネコ、げっ歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスターやモルモット）及びウサギが挙げられる。一般的な愛玩動物の大部分を実験動物として用いることができ、その健康状態は実験に重要である。例えば自然界、保護区又は動物園の動物も治療を必要とすると考えられる。霊長類、特にチンパンジー及びサルは、ヒトに系統的に最も近いので、ヒト病原体に感染する危険性が特に高い。本発明の治療方法が最も好ましい動物種はイヌ、ネコ、ブタ及びウシである。
本発明はまた、下痢発症性細菌に対する動物特異的レセプターの探索にも関する。
Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸含有オリゴ糖配列はほぼ動物特異的であり、このような構造を形成する生合成酵素はヒトには存在しない。おそらく、上記の単糖を含むヒト レセプターは動物性食物に存在する単糖から合成される。NeuGcは多くの動物において一般的な単糖である。この単糖を含む糖ペプチドは、動物特異的大腸菌K99株に対してウシ下痢の治療に用いられている。本発明は、動物が交差反応性大腸菌に感染している場合に、動物に用いることができるいくつかのNeuGcオリゴ糖配列を開示する。
本発明のex vivoにおける用途
本発明は、ex vivoにおける病原体、特に下痢発症性大腸菌の阻害に用いることができる。また、このような方法は、消毒及び保存のために用いることもできる。好ましくは単一成分物質の部分又は単一成分物質そのものである本発明で開示するレセプターオリゴ糖配列、更に好ましくは、少なくとも２種の本発明で開示するレセプターオリゴ糖配列を包含する組成物を、病原体、好ましくは大腸菌を阻害するためにex vivoで用いる。本発明で開示する多価結合体、特に、病原体、好ましくは下痢原性大腸菌を凝集することができる可溶性多価結合体が、ex vivoでの使用には好ましい。本発明のex vivoでの使用の特殊な態様として、病院や準病院環境などで使用するテーブル、医療器具及び包装容器などの表面の洗浄や消毒において、本発明で開示するレセプターオリゴ糖配列を含有する洗浄剤や消毒剤を用いる方法が挙げられる。本発明で開示するレセプター糖類はまた、病院や準病院環境などにおいて患者の洗浄用又は入浴用石鹸や洗剤の成分としても有用である。
口腔感染症及び口腔衛生製品
本発明が標的とする感染症は経口で、またおそらく鼻から口腔への経路へも広がるものと考えられる。本発明は、ヒトの口に存在している感染症の阻害に関する。本発明は、少なくとも２種の異なるオリゴ糖配列による口腔感染症の治療に関し、該オリゴ糖配列は、病原体（好ましくは経口的に感染する細菌、更に好ましくは下痢発症性細菌）の結合特異性の少なくとも２種を阻害するものである。口腔感染症や鼻腔感染症の予防のために、単一成分物質の部分又は単一成分物質そのものとして本発明で開示するレセプターオリゴ糖配列を用いるか、本発明で開示するレセプターオリゴ糖配列を少なくとも２種包含する組成物として用いることが好ましい。本発明によると、本発明で開示したレセプターオリゴ糖配列を、組成物又は単一成分物質として、ヒトの口腔中の病原体を阻害する製品（ここでは「口腔衛生製品」と称する）に用いる。
ヒトの口腔には、ヒトの腸と同様のレセプターが存在すると考えられ、特にタンパク質上には、少なくともネオラクトレセプター、マンノースレセプター、及び本発明のフコースレセプターに類似したオリゴ糖レセプターが存在するものと考えられる。別の態様においては、本発明の物質及び組成物は、カリエスを発症する病原体を阻害するのにも有用である。具体的な態様においては、本発明は、経口的に広がる他の感染症、例えば、中耳炎を併発する感染症やインフルエンザ、気管支炎又は肺炎を含む肺の感染症を治療するための組成物にも関する。本発明の口腔衛生製品は、カリエス、中耳炎、気管支炎及び肺炎の治療を目的とすることもできる。本発明の具体的態様の一例として、Neu5Acα3Galβ4GlcNAc 及び Neu5Acα3Galβ4Glc からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴ糖配列、より好ましくは Neu5Acα6Galβ4GlcNAc 及び Neu5Acα6Galβ4Glc からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴ糖配列を包含する、口腔衛生製品の製造又は経口的に感染する病原体の阻害のために用いる組成物がある。そのような組成物は、少なくともヒト インフルエンザウイルスの処置を目的とし、好ましくはインフルエンザウイルスに対する予防を目的としたものである。
特に本発明は、病原体阻害性オリゴ糖配列、特に本発明で開示するオリゴ糖配列、を含有する物質又は組成物を包含する口腔衛生製品に関する。口腔衛生製品は、練り歯磨、洗口薬、口腔用タブレット、咀嚼錠（chewing tablets）及びチューインガムからなる群より選ばれることが好ましい。一価のレセプターオリゴ糖配列又は多価のレセプターオリゴ糖配列のいずれかを用いることが好ましい。他の一つの好ましい態様においては、口腔衛生製品は、本発明で開示する多価のオリゴ糖配列を包含する。ヒトの口腔のサイズ及び口腔表面に存在する唾液の容量を考慮すると、口腔において病原体阻害性レセプターの飽和濃度を達成するのには比較的少量のオリゴ糖で十分である。レセプター活性を有する一価エピトープの典型的な量は、レセプター活性オリゴ糖として約１００ｎｍｏｌ〜１００μｍｏｌ（分子量が１，０００Ｄａの場合、１００μg〜１００ｍｇに相当する）の範囲内である。より一般的な量は、約１〜１０μｍｏｌと推定される。別の態様においては、本発明の治療用医薬組成物は、病原体を阻害するスプレー式点鼻薬にも関する。スプレー式点鼻薬は、中耳炎又は肺の感染症の治療を目的としたものである。
局所用製品、洗剤及び化粧品
一般的な病原体は、ヒトの肌、性器上皮、毛髪、日用品の表面及びヒトの環境中に存在する他の表面に広がりうると考えられる。本発明で開示するオリゴ糖配列は、このように環境中に存在する病原体の阻害にも有用である。したがって、局所用製品又は化粧品（例えば、クリーム、ローション又はジェル）に、単一成分物質の部分又は単一成分物質そのものとして本発明で開示するオリゴ糖配列を用いるか、本発明で開示する異なる種類のレセプターオリゴ糖配列を少なくとも２種包含する組成物を用いることも好ましい。また、本発明の物質又は組成物を、ヒトの肌、毛髪又は性器上皮を洗浄するための製品（個人用衛生製品とも言う）や、日用品の表面、皿又は衣服を洗浄するための製品に用いることも好ましい。従来の抗生物質は、日用品用の洗浄液に用いることを目的としているが、本発明の物質とは違って耐性の問題があるため有用ではない。好ましい態様においては、多価オリゴ糖配列を洗浄液に用い、他の一つの好ましい態様においては、一価オリゴ糖配列を洗浄液に用いる。
食品又は飼料、飲料、酒類及び水に用いる食品安全性向上製品
ヒト又は動物の治療方法の他に、本発明は、本発明で開示するレセプター及び組成物を用いた感染症の予防方法、即ち、本発明を用いて食品製品の内部又は表面上の病原体や細菌を中和する方法に関する。例えば、病原体の蔓延を防止するために、食肉生産の際に本発明の炭水化物を食肉製品や動物の体又はその部分の表面に塗布することができる。細菌を被覆し凝集させるために可溶性結合体及び他の多価結合体を用いることが好ましい。固体又は半固体の食品製品の表面に用いる具体的な方法には、細菌に本願の炭水化物レセプターを接触させ、所望により病原体と炭水化物との複合体を洗い流すことが含まれる。この種の方法には、従来の抗生物質を適用することはできない。本発明の炭水化物は、液状食品製品、濃縮物又はそれらの元となる粉末、例えば、ミルク、液状ミルク様製品及びジュース、ソフトドリンク、スポーツドリンク、アルコール飲料などの種々の飲料に対して用いることもできる。
具体的な態様においては、本発明の炭水化物を多価の型で液状食品製品又は飲料製品に対して使用し、潜在的な病原体を多価結合体によって凝集させ、凝集複合体をその大きさや溶解性に基づいた方法によって除去する。非可溶性の凝集物は、沈殿物として標準的な方法、例えば、凝集物の上に存在する溶液をデカンテーションする方法や、より一般的且つ効果的なろ過法で除去することができる。ろ過法は、大きな凝集複合体を除去するのに用いることができる。
本発明の炭水化物で処理する好ましい食品としては、種々の動物性食品製品、特に食肉製品及び加工途中の製品が含まれる。下痢発症性大腸菌菌体を含む多くの病原体は、実質的に正しく洗浄されていない野菜、果物、サラダ及び他の植物性食品から伝播する。洗浄が必要であるにもかかわらず、正しく洗浄されていないか汚染された水で洗浄された食物は、発展途上国で特に問題となっている。本発明は、洗浄することが必要な植物性食品や他の食品の安全性を向上させるための方法であって、病原体、特に食品製品中の病原性大腸菌の菌体量を制御するための方法にも関する。特に本発明は、食品からの感染を防止するための、家庭用製品及び食品工業用製品にも関する。このような製品は、加工中の食品に利用することができる、粉末状又は錠剤状の固体製品か、本発明で開示するレセプターの溶液を内包するカプセルであることが好ましい。このような製品は、発展途上国で発生する下痢、特に子供の下痢の予防に用いることができる。食品安全性向上製品は、旅行者の下痢の予防も目的とする。食品安全性向上製品及び以下に述べる飼料安全性向上製品は、新規な安全性向上保存料であると考えられる。
飲料及び水を精製するためのフィルター製品
汚染された飲料及び水は胃腸器系の疾患、特に下痢の主要な原因である。
本発明で開示するレセプターは、液状食品、飲料及び水（特に、飲料及び食品を作るための水）に存在する病原体、特に細菌を除去するためのフィルターの作製に用いることもできる。少なくとも２種のレセプター構造を用いることが好ましい。フィルターを得るために炭水化物配列を結合させる固相材料を、例えばセルロース、プラスチック、アガロース及びそれに類似した材料から製造する方法は知られている。本発明のフィルターには、公知技術であるアフィニティークロマトグラフィー用の材料も含まれる。このようなフィルターから結合物を除去するための方法は公知であり、具体的な態様においては、フィルターは、汚染物質を除去し、所望により熱又は他の滅菌方法により滅菌することにより、再生する。
飼料安全性向上製品
上記の食品安全性向上製品は、動物用の固体及び液状の飼料ならびに動物用の飲料水に用いることもできる。保護する動物として好ましいものは愛玩動物、特にネコとイヌ、及び家畜又は農場動物（例えばウシや他の反芻動物、ブタ、ヒツジ、ウマ、家禽（例えばメンドリ、アヒルや七面鳥）及びウサギ）が含まれる。
水、食品及び飼料の安全性の分析
本発明のレセプター炭水化物を組み合わせた標準的な分析及び診断方法を用いて水、飲料、食品及び飼料を分析し、レセプター炭水化物に結合する病原体の存在量を測定することができる。汚染病原体の結合特異性に関する知見は、感染患者の治療計画をたてる場合や、上記の病原体を除去又は制御して食品の安全性を向上させるための方法に適用することができる。
本発明によって阻害することのできる、炭水化物に基づく他の相互作用
異なる種類の接着因子の阻害の他にも、本発明は、炭水化物−炭水化物相互作用及び炭水化物−レクチン相互作用の阻害に用いることもできる。
本発明の炭水化物含有組成物及び炭水化物含有物質はオリゴ糖配列を包含している。オリゴ糖配列は、少なくとも１種の病原体及び／又は少なくとも１種の病原体に対するレセプターに結合することによって、少なくとも１種の病原体を阻害する。少なくとも２種の病原体阻害性オリゴ糖配列を用いることが好ましく、少なくとも３種の病原体阻害性オリゴ糖配列を用いることがより好ましい。他の好ましい態様においては、少なくとも４種、５種、６種又は７種の病原体阻害性オリゴ糖配列を用いる。
具体的な治療においては、少なくとも１種のオリゴ糖配列を異なる時期に別々に投与する。これは、特に全種類のオリゴ糖配列の同時投与が正常な細菌叢に負の影響を与える場合に有効である。治療用組成物を別々に投与することは、胃腸器系における本発明のオリゴ糖配列の安定性が胃腸器系の栄養状態の影響を受けることからも有効である。
本発明とプロバイオティック細菌を一緒に用いる方法
本発明を細菌の結合、特に複数の細菌の結合を阻害するために用いる場合、いくつかの有益な細菌の結合も阻害されることが考えられる。正常な細菌叢は、例えばヒト胃腸器系において、多くの重要な機能を有する。しかし、従来の抗生物質を用いた場合に生じる正常な細菌叢の破壊は、より大きな問題となる。
他の態様においては、少なくとも２種の病原体阻害性オリゴ糖配列を、プロバイオティック微生物及び／又はプレバイオティック化合物と共に投与する。本発明においてプロバイオティック微生物とは、例えば食品の消化、栄養及びビタミンの提供又は組織表面の被覆による病原性細菌からの保護といった有益な機能を有する無害な細菌を意味する。プロバイオティック細菌には、正常細菌叢から選ばれる１種、数種又は多種の細菌が含まれることが好ましい。好ましい態様においては、プロバイオティック細菌には、少なくとも１種類又は１株又は１種（species）の乳酸菌が含まれる。
プレバイオティック化合物とは、正常な細菌叢又はプロバイオティック微生物を支える物質である。好ましいプレバイオティック化合物には、プレバイオティック炭水化物（例えば、プレバイオティック化合物として用いられるガラクトースオリゴ糖、キシロースオリゴ糖又はフルクトースオリゴ糖）が含まれ、プレバイオティック活性を有する多糖及び繊維（例えばイヌリン又は修飾した澱粉）も含まれる。本発明は、食品又は栄養補助的目的のために用いられる他の多糖、例えばキトサン又はβ−グルカン（例えばオート麦のグルカン）を用いてコレステロール及び脂肪を減少させる方法にも関する。好ましい態様においては、非還元末端にβ−結合したガラクトース残基を有する炭水化物のようなプレバイオティック化合物としても機能するように、少なくとも１種の病原体阻害性炭水化物を選択する。好ましい治療の方法においては、
ａ）病原体及び正常な細菌叢と考えられるものの一部を、１種、更に好ましくは少なくとも２種の本発明の炭水化物を用いて初めに除去し、そして
ｂ）プロバイオティック微生物及び／又はプレバイオティック化合物を投与する。
上記の第一及び第二の工程は逆の順番で行ってもよく、好ましくは大量のプロバイオティック微生物及び／又はプレバイオティック化合物を用いてから、第一の工程を行う。本発明によると、工程の順番を変えながら、第一及び／又は第二の工程を数回繰り返すこともできる。第一及び第二の工程は同時に行ってもよい。本発明の物質は、プロバイオティック微生物及び／又はプレバイオティック化合物と共に投与することができるが、プロバイオティック微生物及び／又はプレバイオティック化合物を本発明の組成物に含ませることもでき、その場合、第一及び第二の工程は同時に行うことができる。
本発明のオリゴ糖配列の中には、プレバイオティック効果を有することが知られているものがある。そのようなものの例としては、Ｎ−アセチル−ラクトサミン型オリゴ糖配列や、特にヒト母乳オリゴ糖などのフコシル化オリゴ糖配列が挙げられる。本発明の１つの態様として、ヒト母乳オリゴ糖と共に、プロバイオティック微生物及び／又はプレバイオティック化合物、特に、例えばラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パララクト−Ｎ−ヘキサオース、パララクト−Ｎ−ネオヘキサオースからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有するＮ−アセチル−ラクトサミン、及び／又はそれらより誘導されるフコシル化オリゴ糖（例えば、モノフコシル化、ジフコシル化又はトリフコシル化したラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）やラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ））、及び／又はフコシルラクトースであるオリゴ糖（例えば２’フコシルラクトース、３−フコシルラクトースやジフコシルラクトース）を投与する方法がある。
本発明の物質及び／又は組成物と共に用いられるその他の有用な物質
本発明によると、病原体阻害性（pathogenesis preventing）炭水化物を、グリコシダーゼ阻害剤と併用することも有用である。
本発明によると、病原体阻害性炭水化物を、レクチン又はそれ以外の炭水化物結合性タンパク質と併用することも有用である。レクチンは、炭水化物レセプター、例えば、菌体外多糖類をブロックするために用いることができる。
ヒドロキシ物質とは、ヒドロキシル基を含有する脂肪酸を含むセラミド、より好ましくはその類似体を意味する。該類似体は、オリゴ糖配列と担体を結合させるスペーサーであることが好ましい。
好ましい組成物は、ＬＮＴ又はＬＮｎＴなどのヒト母乳オリゴ糖主鎖の混合物を含み、最も好ましくはその伸長構造又は分岐構造、及び／又は天然シアル酸とフコースによって修飾されたものを含む。
ここで大腸菌（E. coli）とは、Escherichia coli を意味する。本発明が標的とする大腸菌（E. coli、即ち Escherichia coli）とは、下痢発症性大腸菌、即ち下痢原性大腸菌を意味する。下痢原性大腸菌とは、特にヒトの下痢の原因となる、未分類の大腸菌野生株を含む全ての大腸菌を指す。より限定的な態様においては、下痢原性大腸菌は、下痢原性大腸菌の主要な５型、即ちEPEC（腸管病原性大腸菌）、ETEC（毒素原性大腸菌）、EHEC（腸管出血性大腸菌）、EAEC（腸管凝集性大腸菌）及び EIEC（腸管侵入性大腸菌）を含むものである。EHECなどの略称には、特定の種類の大腸菌株が複数含まれるが、複数の株を意味するときは、「EHECs」などのように略称の末尾に「s」を付けて表すこともできる。
本発明において、「類似体」及び「誘導体」は次のように定義される。本発明によると、大腸菌結合性オリゴ糖配列の構造類似体や誘導体を設計することができる。従って、本発明は、本発明の結合性物質の構造類似体にも関する。本発明における構造類似体は、大腸菌のオリゴ糖配列に対する結合に重要な構造因子を包含する。効果的な構造類似体を設計するには、大腸菌と糖類との結合に重要な構造因子を知ることが重要である。重要な構造因子は、修飾されていないか、重要な構造因子を模倣するように修飾されていることが好ましい。これらの因子には、好ましくは三糖又はオリゴ糖からなるエピトープのGalβ4残基の４−又は６−ヒドロキシル基が含まれる。また、環構造の間の結合の位置も重要な構造因子である。高親和性結合においては、二糖又は三糖からなるエピトープの還元末端GlcNAcのアセトアミド基の位置に対応する位置に、アセトアミド基又はアセトアミド模倣基があることが好ましい。アセトアミド模倣基は他のアミド基、例えば、アルキルアミド、アリールアミド及び第２級アミンであり、好ましくはＮ−エチル又はＮ−メチル、Ｏ−アセチル又はＯ−アルキル（Ｏ−エチルやＯ−メチルなど）である。
本発明における構造誘導体は、大腸菌に対する結合能を保持するか向上するように本発明のオリゴ糖鎖を化学的に修飾したものである。本発明によると、オリゴ糖鎖のヒドロキシル基又はアセトアミド基の１つ又は複数を誘導化することが好ましい。本発明は、類似体や誘導体を調製する際に変えることのできる分子上の位置を複数開示する。本発明のレセプターオリゴ糖配列の誘導体の好ましい例として、オリゴ糖配列の還元末端誘導体が挙げられる。オリゴ糖と他の炭水化物又はアグリコン分子又は様々な担体とを結合させる多重誘導法は周知である。還元末端単糖残基のＣ１炭素を硫黄原子、炭素原子又は窒素原子を介して他の炭水化物又はアグリコン分子又は様々な担体、特に多価担体と結合させることができる。還元アミノ化法などの方法は、単糖残基の還元末端を開いても病原体を結合する炭水化物エピトープが破壊されない場合に用いることができる。また、アセトアミド基による誘導体も好ましい。アセトアミド基は、例えば他のカルボン酸などによって脱アセチル化及び誘導化してもよく、アセトアミド誘導体はより高い病原体結合力を得るためにスクリーニングしてもよい。誘導体は、誘導化しようとするオリゴ糖の前駆体、例えばヘキソサミン残基を包含するオリゴ糖配列などからも生成できる。レクチン結合性のオリゴ糖類似体を製造する方法はよく知られている。例えば、シアリル化ルイスｘオリゴ糖の類似体は複数製造されており、これらは異なる骨格の活性官能基である（Sears and Wong 1996、１２０９０ページを参照）。同様に、へパリンオリゴ糖の類似体もサノフィ社によって製造されており、シアリダーゼに対するシアリル酸模倣型阻害剤、例えばZanamivirやTamiflu（Relenza製）、が複数のグループによって製造されている。オリゴ糖類似体は少なくとも１つの六員環又は五員環構造に基づいて構築されていることが好ましく、類似体は６個又は５個の原子を包含する少なくとも２つの環構造を含有することがより好ましい。
模倣構造においては、単糖環はシクロヘキサンやシクロペンタンなどの環状分子、ベンゼン環を含む芳香環によって置換されていてもよく、そのようなヘテロ環構造は酸素原子の他に、例えば窒素原子や硫黄原子を包含してもよい。活性環状立体構造を固定するためには、環状構造を許容できる結合基で繋ぐこともできる。典型的な模倣構造は、オリゴ糖配列又はその一部に対するペプチド類似体構造を更に包含してもよい。
活性基が結合活性に与える影響は累積するので、１つの活性基が失われても、分子の異なる場所に活性残基を付加することで補うことができる。分子モデリング、好ましくはコンピューターを用いた分子モデリングを本発明で用いる大腸菌結合性オリゴ糖配列の類似構造を製造するのに用いることができる。種々のオリゴ糖配列の分子モデリングの結果が実施例に示されており、ＮＭＲとＸ線結晶回折を除く方法と同じ又は類似した方法を用いて本発明で用いる他のオリゴ糖配列に対する類似体を得ることができる。コンビナトリアルケミストリーによってオリゴ糖の誘導体を調製することで、レクチンに対して高い活性を示すように１価、オリゴ価又は多価のオリゴ糖を活性化することもできる。オリゴ糖配列の１つ又は複数の残基を置換することでライブラリーを構築した場合には、それは誘導体ライブラリーと考えることができ、また、本発明で開示するオリゴ糖配列の類似体からライブラリーを構築することもできる。コンビナトリアルケミストリーによるライブラリーは本発明で用いるオリゴ糖、その前駆体又は糖結合体に基づいて構築することができる。例えば、種々の還元末端を有するオリゴ糖をカーボハイブリッド技術（carbohydrid technology）と呼ばれる技法によって製造することができる。本発明の好ましい態様においては、コンビナトリアルケミストリーによるライブラリーは、本発明で開示する大腸菌結合性物質に結合されている。更に好ましい態様においては、ライブラリーは少なくとも６種の異なる分子を包含する。このようなライブラリーは、本発明で用いるオリゴ糖配列に対する微生物性の結合を検出するために用いるのが好ましい。アミノ酸又は有機アミド類のコレクションは市販されており、このような物質はアセトアミド類似体のコンビナトリアルケミストリーによるライブラリーを合成するために用いることができる。コンビナトリアルケミストリーによるライブラリーから高親和性のバインダーを同定することができ、例えば、ライブラリー中の化合物を用いて本発明で開示する糖脂質又は糖結合体に対する細菌の結合を阻害する物質を同定する阻害アッセイを行うことができる。本発明において好ましい構造類似体や誘導体は、本発明で用いる大腸菌結合性のオリゴ糖配列が大腸菌に結合するのを阻害することができる。
還元末端にグルコースを有するネオラクトレセプター類似三糖エピトープ
現行のＴＬＣアッセイでは、脂質部分又は近接したシリカ表面による立体障害はネオラクト類似エピトープであるGlcNAcβ3Galβ4Glcの定量を制限しているものと考えられる。末端単糖が結合に寄与することを考慮すると、エピトープの還元末端にGlcが存在することは可能である。Glcが還元末端に存在する三糖からなるエピトープは、オリゴ価型、より好ましくは多価型で存在する場合に、大腸菌結合性物質の有効な類似体であると考えられる。本発明の１つの態様はGlcを還元末端に有する糖であり、高濃度、好ましくは１〜１００ｇ／ｌ、より好ましくは１〜２０ｇ／ｌ、の遊離還元糖として用いるものである。このような糖は０．１〜１ｇ／ｌの濃度でも、微量な活性を示すことがわかっている。
本発明においては、病原体レセプター又は病原体阻害剤、換言すれば、特に下痢原性大腸菌に対するレセプターを「オリゴ糖配列」と称する。本発明においてオリゴ糖配列とは、天然又は合成の糖結合体の一部あるいは遊離オリゴ糖又は遊離オリゴ糖の一部である。このようなオリゴ糖配列は、例えば、糖鎖が細菌の多糖の一部である場合に、多糖配列中の種々の単糖、オリゴ糖や多糖に結合してもよい。更に、単糖に対する天然の修飾も多数知られており、オリゴ糖配列のＯ−アセチル化誘導体や硫酸化誘導体が例示できる。本発明において大腸菌レセプターオリゴ糖配列は、天然又は合成の糖結合体の一部、あるいは対応する遊離オリゴ糖又は遊離オリゴ糖の一部であるオリゴ糖配列を包含してもよい。大腸菌レセプターオリゴ糖配列は複数の大腸菌レセプターオリゴ糖配列の混合物を更に包含してもよい。好ましい態様においては、本発明で用いるオリゴ糖配列は非還元末端オリゴ糖配列であり、これは本明細書においては、オリゴ糖配列は、所望によりオリゴ糖配列の還元末端を除いた部分から他の単糖構造又はオリゴ糖構造に結合していないことを意味する。オリゴ糖配列が結合体として存在する場合にはオリゴ糖配列の還元末端から結合していることが好ましいが、病原体の結合により許容される他の結合位置も用いることができる。更に具体的な態様においては、本発明で用いるオリゴ糖配列は天然のグリコシド結合によって他の単糖構造又はオリゴ糖構造に結合していない対応オリゴ糖残基を意味する。オリゴ糖残基は、遊離のオリゴ糖あるいはオリゴ糖残基の還元末端から結合した結合体又は誘導体であることが好ましい。
病原体レセプターオリゴ糖配列は、グリコシルトランスフェラーゼによって酵素的に合成するか、あるいはグリコシダーゼ又はトランスグリコシダーゼによって触媒されるトランスグリコシル化反応で合成することができる（Ernst et al., 2000）。これらの酵素の特異性及び補因子の必要性については改良することができる。修飾された特定の酵素を用いてより効率よく合成することもでき、例えば、グリコシンセターゼをトランスグリコシル化のみを触媒するよう修飾することができる。本発明で開示する糖及び糖結合体又はそれらと類似した化合物の有機合成も知られている（Ernst et al., 2000）。糖物質は天然の原料から単離して、化学的又は酵素学的に修飾して病原体レセプター化合物とすることができる。種々の反芻動物の乳から天然のオリゴ糖を単離することができる。グリコシル化酵素を発現するトランスジェニックな生物、例えばウシや微生物も糖の製造に用いることができる。
別の態様においては、病原体レセプター物質に含まれるオリゴ糖がアシアロガングリオ糖、ラクトレセプター又はネオラクトレセプターではない場合には、病原体レセプター物質は、抗生物質、好ましくはペニシリン系抗生物質、に結合していてもよい。病原体レセプター物質は抗生物質を病原体に的中させる。このような結合体は、大腸菌に対する処置や治療に必要な抗生物質が少量となるので治療に有利であり、その結果、抗生物質による副作用を低減させる。結合体の抗生物質部分は細菌を殺すか弱めるためのものであるが、結合体は更に本明細書に記載するような接着防止効果を有してもよい。本発明は特に、本発明で用いるレセプターオリゴ糖配列を少なくとも２種包含する組成物であって、該レセプターオリゴ糖配列が従来から用いられている１種又は複数の抗生物質との結合体である組成物に関する。レセプターオリゴ糖配列及び抗生物質は多価の担体に結合していてもよい。組成物を消化器系における感染、更に好ましくは下痢発症性大腸菌を標的とすることが好ましい。
病原体レセプター物質、好ましくはオリゴ価又はクラスター状のものは、病原体、好ましくは下痢発症性大腸菌の存在によって生じる疾患又は病態の治療に用いることができる。これは大腸菌レセプター物質を付着防止、即ち、大腸菌がターゲット細胞や組織のレセプター エピトープに結合するのを阻害することで達成される。大腸菌結合性物質又は医薬組成物を投与すると、それは細菌の結合に対してターゲット細胞上のレセプター糖結合体と競合する。その結果、細菌の一部又はすべてがターゲット細胞や組織のレセプターのかわりに大腸菌レセプター物質に結合する。大腸菌レセプター物質に結合した細菌は患者から（例えば、消化器系における液体の流入によって）除去し、その結果、患者の健康に細菌が与える影響を低減させる。使用する結合性物質は、好ましくは大腸菌レセプター物質を包含する可溶性の組成物である。結合性物質は、担体、好ましくはタンパク質以外の担体に結合してもよい。担体分子を用いる場合には、複数の大腸菌レセプター物質を１つの担体に結合し、阻害効率を改善することもできる。
本発明においては、大腸菌は種々のオリゴ糖配列に結合することを明示した。特定の株による結合のいくつかはより共生的な相互作用であり、重度の病態に進行することはない。従って、細菌の完全な除去は大腸菌関連疾患の予防には必ずしも必要ない。病原性の低い細菌は、病原性の高い大腸菌株の予防においてプロバイオティックな効果を発揮することも考えられる。
本発明によると、大腸菌レセプター物質を、所望により担体と共に、医薬組成物に導入することができる。このような医薬組成物は、大腸菌が患者に存在することによって生じる病態の治療に有用であり、また、大腸菌結合性物質を用いたこのような病態の治療方法に用いることもできる。本発明によって治療することのできる病態の具体例としては、全部又は少なくとも部分的に大腸菌感染によって生じる消化器系疾患及びそれに関連する疾患である。
病原体レセプター、好ましくは下痢原性大腸菌レセプター物質、を包含する医薬組成物は、他の物質、例えば不活性なベヒクル又は医薬的に許容される担体や保存剤などの公知の物質を包含してもよい。病原体レセプター、好ましくは下痢原性大腸菌レセプター物質を他の薬物、例えば病原体、具体的には大腸菌に対して使用されている抗生物質、と共に投与することができる。
病原体レセプター、好ましくは下痢原性大腸菌レセプター物質又はこのような物質を包含する医薬組成物は、適当な方法で投与すればよく、経口投与が好ましい。
本発明で用いるレセプターオリゴ糖配列は病原体、特に病原性細菌の阻害に用いることを目的としているので、レセプターオリゴ糖配列を「病原体阻害性オリゴ糖配列」とも称する。更に具体的な態様においては、病原体は下痢発症性大腸菌であるため、レセプターオリゴ糖配列は「病原体阻害性オリゴ糖配列」又は「大腸菌レセプター物質」とも称する。特定のレセプターオリゴ糖配列の命名及び他の長い用語も、ダッシュの有無や（英語表記における）頭文字の大文字使用によって異なっていてもよく、例えば、「ラクト−レセプター」と「ラクトレセプター」や「lacto receptor」と「Lacto receptor」は同じものを意味する。
本願で用いる「精製画分（purified fraction）」という用語は、天然又は人工の原料から精製又は単離したオリゴ糖である。好ましい態様においては、精製画分に含まれる少なくとも一種の活性オリゴ糖配列の量を分析及び／又は調整し、所望により関連する他の炭水化物構造の量も分析した。精製画分では、その原料に由来する不活性物質（例えばタンパク質、単糖前駆体、ラクトース又は脂肪）の量が減少している。有害であると考えられる物質、例えば合成の際に混入した有害な化学物質、アレルゲン性タンパク質あるいは宗教的又は食文化的理由から道徳上有害であると考えられる物質は、最終製品が無害であると考えられる水準まで除去する。医療用途のための好ましい精製画分は、実質的に純粋（即ち、純度が９８％以上）であるか、関連のない物質が精製画分の質量の半分未満となるように調整されている。関連のない物質は、精製画分の質量の２０％未満であることがより好ましく、精製画分の質量の５％未満であることが最も好ましい。本発明の好ましい態様においては、動物の乳の少なくとも一種から精製画分を製造する方法は、乳タンパク質及び／又は乳脂肪を少なくとも部分的に除去する工程を包含する。精製には、ろ過法（例えば、ゲルろ過又は限外ろ過）に加えて、乾燥及び／又は濃縮工程が含まれてもよい。非医療用途のための好ましい精製画分は、実質的に純粋であるか、関連のない物質が精製画分の質量の９５％未満である。関連のない物質は、精製画分の質量の７５％未満であることがより好ましく、精製画分の質量の２５％未満であることが最も好ましい。精製画分はそのものを用いてもよいし、所望の製品の他の成分と共に用いてもよい。
本願において「治療」とは、疾患又は病態を治癒又は改善するための治療と、疾患又は病態の発症を予防するための治療の両方を意味する。治療は急性的又は慢性的に行うことができる。
本願において「患者」とは、本発明による治療を必要とするヒト又はヒト以外の哺乳類である。本発明は特に、患者がヒトである場合には腸管感染症、とりわけ下痢の治療に関する。
病原体レセプター物質、好ましくは下痢原性大腸菌レセプター物質、をレセプター物質に結合する物質のスクリーニングに用いることもでき、例えば、（炭水化物−炭水化物相互作用によって）大腸菌レセプター物質に結合する炭水化物をスクリーニングするために用いることができる。スクリーニングは、例えば、アフィニティークロマトグラフィーで行うことができる。
更に、ヒト組織に提示されている大腸菌レセプター物質に特異的に結合するか不活化する物質を用い、大腸菌の結合を防止することもできる。このような物質の例としては、Erythrina cristagalli 及び Erythrina corallodendronなどの植物性レクチンが挙げられる（Teneberg et al., 1994)。ヒトに用いる場合には、このような結合性物質はその用途に適したものでなければならず、例えば、ヒト化抗体又はヒト由来の組み換えグリコシダーゼなどの非免疫原性であり、大腸菌レセプター物質の少なくとも１種の末端単糖残基を解裂させることのできる物質である。しかし、消化器系においては、例えば、食品に由来する多種の天然のレクチンやグリコシダーゼが許容されている。
栄養補助食品及び栄養補助飼料への用途
更に、食品及び飼料を含む栄養補助組成物の一部として病原体レセプターオリゴ糖配列又は大腸菌レセプターオリゴ糖を用いることができる。栄養補助組成物、栄養補助食品又は栄養補助飼料に、単一成分物質の部分又は単一成分物質そのものとして本発明で用いるオリゴ糖レセプター配列を用いることが好ましく、本発明で用いる異なる種類のレセプターオリゴ糖配列を少なくとも２種包含する組成物を用いることがより好ましい。大腸菌レセプターオリゴ糖配列を物質又は組成物として、いわゆる機能性食品又は機能化食品の一部として用いることが好ましい。機能性食品は、大腸菌がターゲット細胞又は組織に結合するのを阻害するか防止することでヒト又は動物の健康に対して好ましい効果を示す。本発明で用いる大腸菌レセプター物質又は組成物は既に知られている食品や機能性食品組成物の一部として用いてもよい。機能性食品は、専門機関、例えば米国ＦＤＡ、によって許可されている他の許容される食品材料を包含してもよい。本発明で用いる大腸菌レセプター物質又は組成物は栄養補助添加剤、好ましくは食品用又は飲料用の添加剤として機能性食品又は機能性飲料を製造するために用いることができる。食品又は食品添加剤は、例えば、ウシやその他の家畜が多量の大腸菌レセプター物質又は組成物を天然にその乳に産生するようにすることで得ることもできる。これは、動物の乳に適切なグリコシルトランスフェラーゼを過剰発現させることで達成される。家畜の特定の品種又は種を選択し、大腸菌レセプター物質又は組成物を多量に産生するように交配することができる。栄養補助組成物又は栄養補助剤のための大腸菌レセプター物質又は組成物は、細菌や酵母などの微生物によって製造することもできる。
大腸菌レセプター物質又は組成物を乳幼児用の食品の一部、好ましくは乳児用ミルクの一部として用いることは特に有用である。多くの乳児は、ヒトの天然乳の代わりとして特別な処方のミルクを与えられている。このような処方はヒト母乳に存在する特別なラクトースをベースとしたオリゴ糖を欠くことがあり、そのようなオリゴ糖としては特に、伸長されたオリゴ糖、例えばラクト−Ｎ−ネオテトラオースであるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、ラクト−Ｎ−テトラオースであるGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc、及びそれらの誘導体が挙げられる。ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース（Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc）及びパラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース（Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc）と同様にGalβ3Galβ4Glcもヒト母乳から得られることが知られていることから、乳幼児用の食品に用いる添加剤又は成分として安全であると考えられる。シアリル化及び／又はフコシル化糖含有ヒト母乳オリゴ糖及びバッファロー乳オリゴ糖である GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc は、本発明において病原体レセプターとして開示しているが、機能性食品及び乳幼児用ミルクに用いることも好ましい。少なくとも２種の乳オリゴ糖を組み合わせて用いることが好ましい。下痢発症性大腸菌は特に乳児及び幼児に高い感染性を示し、この疾患を鑑みると、この段階で感染を予防することは妥当である。
摂取される機能性食品（例えば、調製した乳児用ミルク）に含まれるヒト母乳中のオリゴ糖の好ましい濃度は、天然のヒト母乳に含まれるオリゴ糖の合計濃度と同じ程度であることが好ましい。天然のヒト母乳は、本発明で開示されるオリゴ糖配列を包含する多数の遊離オリゴ糖と糖結合体（多価のものも含む）を含有するので、単一分子を天然の濃度よりも高い濃度で用いたとしても、危険な副作用を伴うことなく、大腸菌に対して強い阻害能を発揮させることもできる。天然のヒト母乳は、個体差があるものの、少なくとも１０〜２１０ｍｇ／ｌのラクト−Ｎ−ネオテトラオースを含有する（Nakhla et al., 1999)。その結果、機能性食品においても、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの使用量は好ましくは０．０１〜１０ｇ／ｌであり、より好ましくは０．０１〜５ｇ／ｌ、最も好ましくは０．１〜１ｇ／ｌである。ラクト−Ｎ−テトラオースはこの約２〜５倍を用いることができる。また、機能性食品に用いる糖類の合計濃度は、天然のヒト母乳中の糖類（即ち、本発明で開示する物質又は組成物のように大腸菌に結合するか、あるいは本発明で開示する結合エピトープ／オリゴ糖配列を含むもの）の合計濃度と同一か同程度となるように用いる。
シアリル−ラクトース及びシアリルラクトサミンは、ウシ乳中に存在し、その濃度は３種の主要なオリゴ糖と初乳に存在する NeuNAcα3Galβ4Glc、NeuNAcα6Galβ4GlcNAc 及び NeuNAcα6Galβ4Glcの合計量としては、数十μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ未満である（Nakamura et al., 2003）。製品中の含有量は０．０１〜１０ｇ／ｌであることが好ましく、より好ましくは０．０１〜５ｇ／ｌ、最も好ましくは０．１〜１ｇ／ｌである。NeuNAcα6Galβ4Glcはウシ乳に最も多量に存在し、下痢原性大腸菌に対する効果的な阻害剤としても好ましい。
乳幼児用ミルクは、本発明で用いる物質又は組成物のほかに、乳幼児用ミルクに用いる他の物質、例えば、反芻動物のミルクから得られた画分（例えば、ホエータンパク質）、大豆タンパク質調製物又はタンパク質加水分解物を含有する。乳幼児用ミルクは、乳幼児用ミルクに有用であるか許容される他の炭水化物、例えばラクトースオリゴ糖やガラクトースオリゴ糖、を含んでいてもよい。
本発明の栄養補助組成物は、特定の用途に望ましい量の可食の多量栄養素、ビタミン、ミネラルを含む。そのような成分の量は、組成物を正常なヒト、健康な乳幼児、子供、大人又は特定の欠乏状態、例えばある種の病的状態（例えば代謝障害）に伴う欠乏状態、のある対象のいずれに用いるかによって変わる。本発明の栄養補助組成物に用いる成分は半精製又は精製された材料であることは当業者は理解している。半精製又は精製された材料とは、天然材料の精製又は合成により調製された材料を意味する。このような技術は公知である（例えば、食品成分及び食品加工に関する連邦行政命令集（Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing）、推奨栄養所要量、第１０版、１９８９年；米国、ワシントン Ｄ．Ｃ．、ナショナルアカデミープレスを参照）。
好ましい態様においては、本発明の栄養補助組成物は乳幼児経腸栄養補助製品である。従って、本発明の更なる態様においては、乳幼児に与えるのに適する栄養補助組成物を提供する。組成物には、上記のオリゴ糖に加えて、乳幼児の一日栄養要求量を提供するように設計した量のビタミンやミネラルが含まれる。
多量栄養素の成分としては、例えば、食用脂肪、炭水化物及びタンパク質が挙げられる。食用脂肪としては、やし油、大豆油ならびにモノグリセリド及びジグリセリドが挙げられる。炭水化物としては、グルコース、食物レベルの（可食の）ラクトース及び加水分解したコーンスターチが挙げられる。典型的なタンパク質材料としては、例えば、大豆タンパク、電気透析したホエー及び電気透析したスキムミルクやミルクホエーならびにこれらのタンパク質の加水分解物が挙げられるが、他のタンパク質材料も入手及び使用可能である。これらの多量栄養素は、一般的に許容されている栄養補助化合物として、エネルギー量換算（即ち、カロリー単位）でヒト母乳に存在するのと同等量を添加する。
乳幼児用ミルクには次のビタミン及びミネラルが含まれていることが好ましい：カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素ならびにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ及びビタミンＢ複合体。
乳幼児用ミルクは滅菌し、そのまま与えることのできる（ready-to-feed、ＲＴＦ）状態で用いるか、濃縮液体又は粉末として保存することができる。粉末は、例えば上記のように調製した乳幼児用ミルクをスプレー乾燥することで調製することができ、乾燥濃縮物は、例えば、水を加えて再構成することができる。乳幼児用栄養補助ミルクは当業界でよく知られており、市販されている（例えば、Similac（登録商標）及び Alimentum（登録商標）；Abbott Laboratories社のRoss Products Divisionより購入可）。
本発明の栄養補助組成物の例としては、乳幼児用ミルク、栄養補助食品、食事代替食（dietary substituent）及び再水和製品（rehydration products）が挙げられるが、これらに限定されることはない。後者のものは医薬組成物としても考えることができる。特に関心の高い栄養補助組成物としては、乳幼児向けの経腸用及び非経腸用の栄養補助剤、特別な乳幼児用ミルク、年配者向け栄養補助剤ならびに胃腸障害及び／又は栄養吸収不良のあるヒト向けの栄養補助剤が挙げられるが、これらに限定されることはない。確かに、子供、年配者及び免疫無防備状態の人は毒素から重篤で致死的ですらある影響を特に受けやすい。
本発明の栄養補助組成物は、栄養補助の必要がない場合でも、食品に添加することができる。例えば、栄養補助組成物は、マーガリン、改質されたバター（modified butter）、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック食品、サラダ油、調理用油、調理用油脂、肉、魚及び飲料などのいかなる種類の食品にも添加することができ、添加する対象はこれらに限定されることはない。
本発明の好ましい態様においては、栄養補助組成物は、経腸用栄養補助製品、更に好ましくは成人用又は小児用の経腸用栄養補助製品である。例えば、栄養補助組成物は、胃腸の悩みを抱えるか、あるいは慢性的又は急性的な病状のために特別な欠乏状態にある成人や子供に投与することができる。本発明に従って製造した栄養補助組成物は、上記のような多量栄養素、ビタミン及びミネラルを含んでいてもよい。多量栄養素は、ヒト母乳に存在するのと同等の量又はエネルギー量（即ち、カロリー量）として許容される量が存在してもよい。
液状又は固体状の経腸用及び非経腸用の栄養補助輸液を処方する方法は当業界でよく知られている。経腸用輸液は、例えば滅菌して、そのまま投与可能な（ready-to-feed、ＲＴＦ）状態で用いるか、濃縮液体又は乾燥凍結粉末として保存することができる。粉末は、例えば上記のように調製した輸液をスプレー乾燥することで調製することができ、乾燥濃縮物は水を加えて輸液を再構成することができる。成人及び小児用の栄養補助輸液は当業界でよく知られており、市販されている（例えば、Similac（登録商標）、Ensure（登録商標）、Jevity（登録商標）及び Alimentum（登録商標）；Abbott Laboratories社のRoss Products Divisionより購入可）。
本発明の栄養補助組成物のエネルギー密度は、液状の場合、約０．６キロカロリー／ｍｌ〜約３キロカロリー／ｍｌである。固体状又は粉末の場合は、栄養補助組成物のエネルギー密度は約１．２キロカロリー／ｇ〜９キロカロリー／ｇであり、好ましくは約３〜７キロカロリー／ｇである。一般的には、液状製品のオスモル濃度は７００ｍＯｓｍ未満であることが好ましく、更に好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満である。
栄養補助輸液は上記の多量栄養素、ビタミン及びミネラルに加えて、本発明による一価のオリゴ糖を含んでいてもよい。このような補足成分の存在は、個体がこれらの要素の一日所要量の最低量を摂取する一助となる。更に、組成物に亜鉛、銅、葉酸及び抗酸化剤を組成物に添加することも望ましい。これらの物質は疲弊した免疫システムを回復させると考えられることから、組成物を摂取する個体に更なる利益をもたらす。上記医薬組成物にもこれらの成分を添加してもよい。
更に好ましい態様においては、栄養補助組成物は、抗酸化剤及び少なくとも一種の一価のオリゴ糖に加えて、少なくとも５重量％が非消化性オリゴ糖（indigestible oligosaccharide）である炭水化物材料を包含する。更に好ましい態様においては、栄養補助組成物はタンパク質、タウリン及びカルニチンを更に包含する。
治療に関連した診断方法及び分析方法
更に、本発明で用いる大腸菌結合性のオリゴ糖レセプターを大腸菌感染によって生じる病態の診断に用いることができる。診断用途には、大腸菌結合性物質を用いた大腸菌の型の同定方法も含まれる。本願で開示した炭水化物レセプターの結合に関連した大腸菌の型の同定は、特定の下痢原性大腸菌株に対する治療用炭水化物の効果的な組み合わせを決定するために用いることができる。これは、局地流行性の感染症に特異的な低コストの治療法を作製するのに有用であり、主要な下痢発症性大腸菌の炭水化物結合挙動は、地理的位置の違いや伝染中に変わる場合がある。
ヒト消化管に存在する新規なタンパク質結合レセプター
本発明はヒト消化管に存在する新規なレセプターを開示する。このようなレセプターは糖タンパク質に提示されていることから、感染する病原体の一次接触レセプターであると考えられる。本発明は新規なタンパク質結合レセプターを用いた、ヒト消化管に対する病原体の結合を分析する方法に関する。また、本発明は新規なタンパク質結合性レセプターを用いた、ヒト消化管の病原体の結合を診断する方法に関する。
消化管上皮の種々の部位から採取したタンパク質結合炭水化物のサンプルを分析した。新規なタンパク質結合レセプターとしては、タンパク質を結合したラクトレセプター、ネオラクトレセプター、フコシルレセプター、マンノースレセプター及びシアル酸レセプター、即ち、本発明で見出したレセプターが挙げられる。新規なタンパク質結合レセプターは遊離のオリゴ糖又はオリゴ糖誘導体として結合アッセイに用いることができるし、また、タンパク質結合オリゴ糖配列を単離した糖タンパク質として用いることもできる。対応のオリゴ糖配列も合成可能である。好ましい態様においては、天然のタンパク質結合レセプターのＯ−グリカンコア構造又はＮ−グリカンコア構造の少なくとも一部が診断用又は分析用の物質に含まれる。新規なタンパク質結合レセプターが豊富に存在するか多量に検出される消化管上皮の一部に病原体が感染している場合には、新規なタンパク質結合レセプターに対する病原体の結合を分析するのに上記配列を用いることが特に好ましい。
新規なタンパク質結合レセプターを類似のオリゴ糖物質の探索又は設計に用いることができる。類似物質は治療上有利に用いるか、下痢の診断に用いることができる。効率よく且つ経済的な合成によって入手可能な構造を探索又は設計することが特に好ましい。
ヒトの感染に関する分析又は診断に用いるいくつかの好ましいタンパク質結合レセプターが構造分析により明らかになった。マンノースレセプターはＮ−グリカン型オリゴ糖である。本発明は、高マンノース型又はマルチマンノース型のＮ−グリカンを用いた診断及び分析に関する。本発明は特に、リン酸エステルを含む高マンノースＮ−グリカンの用途に関する。マンノースレセプターはヒト消化管の主要部位の全てに存在する。ネオラクト型タンパク質結合オリゴ糖配列はＮ−結合グリカンの好ましい態様に含まれ、ネオラクト型レセプターは消化管の全ての部位に存在する。ラクトレセプターは腸組織の糖タンパク質上に特に観察された。ラクトレセプターはＯ−グリカン型配列に、更に好ましくは提示されている。
複数の新規なフコシル化タンパク質結合レセプターを見出した。ルイスａ型配列を特に腸及び喉頭で見出した。ヒト病原体の結合の分析に有用な他の新規なフコシル化レセプターとしては、特にヒトの胃に提示されているFucα2Gal-構造を含むＯ−グリカンが含まれる。
新規なシアリル化タンパク質結合レセプターには、NeuNAcα3Gal-構造及びNeuNAcα6Gal-構造が含まれる。NeuNAcα3Gal-構造の好ましい態様においては、Ｎ−結合グリカンに提示されており、NeuNAcα6Gal-構造は、好ましくはＮ−結合グリカン及びＯ−結合グリカンの両方に提示されている。
新規なタンパク質結合レセプターは病原体が新規なタンパク質結合レセプターに結合するのを阻害し得る物質の探索に用いることもできる。このような物質は抗体、例えば乳に存在する抗体であって、病原体に提示されている炭水化物レセプター結合性物質に結合し得るものである。阻害性物質はまた、新規なタンパク質結合レセプターに結合するレクチンであってもよく、レクチンは、例えば、食物レクチンである。具体的な態様においては、レセプター構造に付着及び結合するか、レセプター構造を分解しうる、プロバイオテック細菌のためのレセプター又は基質として新規なタンパク質結合レセプターを用い得ることも知られている。
具体的な態様においては、レセプター構造及びそれよりも小さな誘導体又は類似体に対する腸管病原体の結合を分析するために、新規なタンパク質結合レセプターを診断方法又は分析方法に用い得ることができる。
結合性物質を診断又は型同定に用いた場合、例えば、結合性物質はプローブやテストスティックに含まれていてもよく、所望により、テストキットの一部を構成してもよい。このようなプローブやテストスティックが大腸菌を含有するサンプルと接触すると、細菌はプローブ又はテストスティックに結合し、サンプルから取り出されて更に分析される。好ましい態様においては、テストキットは少なくとも２種の本発明で用いるオリゴ糖レセプターを包含し、更に好ましくは少なくとも３種、最も好ましくは少なくとも４種の本発明で用いるオリゴ糖レセプターを包含する。別の好ましい態様においては、テストキットは７種又は本発明で用いる全てのオリゴ糖レセプターを包含する。
糖脂質は、天然では多価型で細胞膜に提示されている。このような提示方法は後述する固相アッセイ法や糖脂質又はネオ糖脂質のリポソームを形成することで模倣することができる。
疎水性ヘキサデシルアニリンの還元的アミノ化反応によって製造される本発明で用いるネオ糖脂質は、オリゴ糖を効果的に提示することができた。細菌の結合に用いられていた従来のネオ糖脂質結合体の大部分は、フォスファチジル エタノールアミン ネオ糖脂質のフォスフォロエステルなどの負の電位を帯びた基を有している。このような化合物の問題点は、この物質の負の電位とリン脂質構造を含む天然の生物学的結合である。負の電位を帯びた分子はタンパク質やその他の生物学的物質との多数の非特異的結合に関与することが知られている。更に、多くのこのような構造は不安定であり、酵素学的又は化学的に分解されることがある。本発明は、オリゴ糖配列の非酸性結合体に関するものであり、これはオリゴ糖配列は非酸性化学構造に結合していることを意味する。非酸性結合体は中性の物質であることが好ましく、これはオリゴ糖配列が中性の、電位を帯びていない化学構造体に結合していることを意味する。本発明において好ましい結合体は、多価の物質である。
従来技術においては、生物活性を有するオリゴ糖配列は、レセプター活性型オリゴ糖構造の一部を還元することで担体に結合していることが多い。アルキル鎖（-CH2-)n及び／又はベンゼン環を含有する疎水性のスペーサーが用いられている。しかし、疎水性構造は、一般的にタンパク質やその他の生物活性分子との非特異的相互作用に関与することが知られている。
後述する実施例で得られたネオ糖脂質に関するデータによると、アッセイに用いた実験条件においてはネオ糖脂質化合物のヘキサデシニルアニリン部分は、研究に用いた細菌に対して非特異的に結合しなかった。ネオ糖脂質においては、糖結合体のヘキサデシニルアニリン部分は脂質層状の構造を形成すると考えられ、結合のためには存在していない。本発明は結合エピトープに属する単糖残基を還元すると結合が破壊されることを示す。更に、還元された単糖は、レセプターエピトープと多価に提示された構造体とを繋ぐ親水性スペーサーとして使えることを見出した。本発明によると、生物活性を有するオリゴ糖を親水性スペーサーを介して多価又はオリゴ価の担体分子に結合し、多価又はオリゴ価の構造体を形成することが好ましい。本願においては、多価構造体（１０個を超えるレセプター活性オリゴ糖残基を含むもの）及びオリゴ価構造体（２〜１０個のレセプター活性オリゴ糖残基を含むもの）の全てを多価構造体というが、用途によっては大きな多価構造体よりもオリゴ価構造体のほうが好ましい場合がある。親水性スペーサーは少なくとも１つの水酸基を含むことが好ましい。更に好ましいスペーサーは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つの水酸基を含む。
本発明で用いる多価結合体としては、オリゴ糖配列を多価に提示する構造体が好ましく、オリゴ糖配列に結合している親水性スペーサーが１つ又は複数の−ＣＨＯＨ−及び／又はアセトアミド（−ＮＨＣＯＣＨ3）やアルキルアミドなどのアミド側鎖を含む可とう性鎖であるものが更に好ましい。水酸基及び／又はアセトアミド基はin vivoにおける酵素的加水分解からスペーサーを保護する。「可とう性」という用語は、スペーサーが可とう性の結合を含み、可とう性ではない環構造を形成しないことを意味する。本発明において還元的アミノ化反応によって得られた還元単糖残基は、可とう性親水性スペーサーの一例である。可とう性親水性スペーサーはネオ糖脂質や多価結合体の非特異的結合を防止するために最適である。これは、例えば、医薬や機能性食品の生物活性及びバイオアッセイにおいて必須な最適活性である。
可とう性親水性リンカーを有する結合体は以下の一般式（２）で表される。
[OS-O-(X)n-L1- CH(H/{CH1-2OH}p1)-{CH1OH}p2-{CH(NH-R)}p3-{CH1OH}p4-L2]m-Z （２）
（式中、
Ｌ1及びＬ2は結合基あって、各々独立に酸素原子、窒素原子、硫黄原子又は炭素原子である結合原子あるいは置換基を形成する結合に含まれる２つの原子を包含し、該結合基を形成する結合は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−、−ＮＨ−、−Ｎ（ＣＯＣＨ3）−、
−ＣＯ−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＣＯ−で表されるアミド基、−Ｎ＝Ｎ−（ヒドラジン誘導体）、あるいは−Ｏ−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｏ−で表されるヒドロキシルアミン結合などであり；
ＯＳは本発明のオリゴ糖配列であり；
Ｘは単糖であり；
Ｌ1は該Ｘである単糖の還元末端のＣ１位に結合した結合基であり、ｎが０の場合には、Ｌ1は該Ｘの−Ｏ−を置換して、該ＯＳの還元末端のＣ１位に直接結合しており；
ｐ１、ｐ２、ｐ３及びｐ４は各々独立に０〜７の整数であるが、ｐ１、ｐ２、ｐ３及びｐ４の少なくとも１つが１であり；
｛ＣＨ1-2ＯＨ｝p1が分岐構造を表す場合には、末端基となるＣＨ1-2ＯＨはＣＨ2ＯＨであり、ｐ１が１を超える場合には、該末端基をスペーサーの残りの部分に結合させるための第二級アルコール基である−ＣＨＯＨ−が存在し；
Ｒは好ましくはアセチル基（−ＣＯＣＨ3）、Ｚに連結する結合又はＣ1-4アシル基（好ましくは親水性の基、例えばヒドロキシアルキル）を包含する類似体形成基であり、Ｒが結合である場合にはＬ2は糖鎖末端基の１つ又は２つの原子であり、該Ｃ1-4アシル基はアミド構造、水素原子又はＣ1-4アルキル基を形成するアミンを含み；
ｍは１を超える整数であり；
Ｚは多価の担体である。）
式（２）に示した可とう性親水性スペーサーを有する好ましい多価構造体には、次の大腸菌結合性オリゴ糖配列が含まれる：(OS)β1-3 が Galβ4Glc(red)-Zに結合したもの、OSβ6GlcNAc(red)-Z 及び OSβ6GalNAc(red)-Z。式中、“(red)”は還元末端単糖及び多価担体Ｚのアミン基の還元的アミノ化によって得られたアミン結合構造である。
本発明においてオリゴ糖基は、抗原性やアレルギー反応の出現を防止するために、多価又はオリゴ価の型でタンパク質又はペプチドではない担体に結合していることが好ましく、より好ましくは、担体の骨格は天然の非抗原性多糖である。
従って、本発明において最適な多価非酸性物質は以下の末端オリゴ糖配列を包含する。
Gal(NAc)r1/Glc(NAc)r2β3Galβ4Glc(NAc)u
（式中、ｒ１、ｒ２及びｕは各々独立に０又は１である。）
更に好ましい態様においてはｕは０であり、最も好ましい態様においては多価で提示されているオリゴ糖配列は GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc あるいはその類似体又は誘導体である。
ヒドロキシルアミン結合を有する可溶性多価結合体
生物学的に許容可能な可溶性多価オリゴ糖結合体の効率的な製造は、解決の困難な問題を抱えている。この問題は、カップリングするオリゴ糖の還元末端アルデヒドと反応する化学的に選択されるＯ−ヒドロキシルアミン構造を用いることで解決された。担体の酸素原子を主鎖又はスペーサーに結合させ、窒素原子をオリゴ糖の還元末端の炭素原子に結合させる。この反応を可溶性の多糖主鎖を用い、例えば水性緩衝液中で行うことができる。
本発明は具体的には、Ｏ−ヒドロキシルアミン構造によって多価のオリゴ糖又は多糖の構造体に結合したオリゴ糖に関する。
本発明は更に、下記式（ＳＰ１）で表される下痢原性大腸菌阻害物質に関する。
[OS-(y)p-(S)q-(z)r-]nPO （ＳＰ１）
（式中、POはオリゴマー状又はポリマー状の担体構造であり、好ましくはオリゴ糖又は多糖からなる担体構造であり；
OSは本発明のオリゴ糖配列であり；
nは１以上の整数であって、担体POに共有結合しているオリゴ糖残基の数を表し、
Sはスペーサー基であり；
p、q及びrは、各々独立に０又は１であるが、但し、pとrの少なくとも一方が０ではなく；
y及びzは結合基であり、yとｚの少なくとも一方はＯ−ヒドロキシルアミン残基（-O-NH- 又は -O-N=）であって、yがＯ−ヒドロキシルアミン残基の場合には、その窒素原子がOSに結合し、zがＯ−ヒドロキシルアミン残基の場合には、その窒素原子がPOに結合し、Ｏ−ヒドロキシルアミン残基ではないy又はzが存在する場合には、それは化学的に選択される結合基であるが、
但し、ｎが１である場合には、POはオリゴ糖又は多糖である。）
本発明は好ましくは、オリゴ糖が還元末端からＯ−ヒドロキシルアミン構造の窒素原子に結合している多価の構造体に関する。
化学的に選択される結合基
化学的に選択される結合基であるｙ及び／又はｚは、OS-基をスペーサー基にカップリングさせるが、OS-(y)p-(S)q-(z)r-基をPO担体にカップリングさせる化学基、特にカップリング反応において保護基、触媒又は活性化剤を用いる必要のない化学基である。本発明によると、結合基であるy及びzの少なくとも一方がＯ−ヒドロキシルアミン残基（-O-NH- 又は -O-N=）である。存在してもよい他の化学的に選択される結合基としては、ヒドラジン基（-N-NH- 又は -N-NR1-）、エステル基（-C(=O)-O-）、ケト基（-C(=O)-）、アミド基（-C(=O)-NH-）、-O-、-S-、-NH-、-NR1-（式中、R1は水素原子又は低級アルキル基（好ましくは炭素数６以下の低級アルキル基）である）などが挙げられる。好ましい化学的に選択される結合基は、PO又は生体関連物質（Bio group）上で、ヒドロキシ基と形成するエステル基（-C(=O)-O-）、及びアミン基と形成するアミド基（-C(=O)-NH-）である。好ましい態様においては、yはＯ−ヒドロキシルアミン残基であり、zはエステル結合である。
また、好ましくはｐ、ｑ及びｒは１である。ｑが０の場合には、ｐ及びｒのいずれか一方が０である。
好ましい多糖又はオリゴ糖主鎖（PO）構造体としては、グリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン又はケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパリン前駆体（例えば、Ｎ−アセチルヘパロサン及びヘパラン硫酸）；キチン、キトサン、デンプン及びデンプン画分又はグリコーゲン画分が挙げられる。好ましい主鎖構造はシクロデキストリンである。有用なデンプン画分としては、アミロース画分及びアミロペクチン画分が挙げられる。
本発明は特に、水溶性の主鎖構造、例えば、非常に低分子量のキトサン多糖混合物又は６量体及びより大きいキトサンオリゴ糖（本明細書においては「キトサン鎖（chitomer）」と称する）を含むキトサンオリゴマー画分の用途に関する。
好ましいスペーサー構造体としては、上記の親水性リンカーに関して記載したもの、例えばアミノオキシ酢酸が挙げられる。本発明の態様によると、スペーサー基が存在する場合には、直鎖又は分岐鎖である、炭素数が１〜１０、好ましくは１〜６のアルキレン基及び直鎖又は分岐鎖である、炭素数が２〜１０、好ましくは２〜６のアルケニレン基からなる群より選ばれる基である。このような基はメチレン基又はエチレン基であることが好ましい。スペーサー基においては、少なくとも１種の鎖構成基を-NH-、-O-、-S-、-S-S-、=N-O-、アミド基（-C(O)-NH- 又は -NH-C(O)-）、エステル基（-C(O)O- 又は -O-C(O)-）又は -CHR2（式中、R2は炭素数が１〜６、好ましくは１〜３のアルキル基又はアルコキシ基、あるいは -COOHである）で置換できる。鎖構成基を置換する基は-NH-、-O-、アミド基又はエステル基であることが好ましい。
本発明の具体的な態様においては、本発明で可溶性多価結合体として開示する最小二糖エピトープ及び部分エピトープを使用する。
人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌
本発明は、ヒト及びヒトと近接して生活する動物に胃感染症を生じるヘリコバクター属細菌にも関する。人畜共通感染性細菌は本明細書に記載するような他の疾患も生じる。この種の細菌は変異性の人畜共通感染能を有する。ヒトと近接して生活する動物に存在する細菌としては、H. pullorum から H. westmaediiまでを含む腸肝ヘリコバクター属細菌からなる大きな群及びH. suis から H. salomonisまでの胃ヘリコバクター属細菌が挙げられ、ここにはウシ ヘリコバクター属細菌（H. bovis）及びサル ヘリコバクター属細菌（Dewhurst et al., 2000 の図１）も含まれることが好ましい。このような種の細菌は人畜共通にヒトに感染することが知られている異種同型の細菌群を形成する。このような分類には、治療の標的として関心の低いH. mustelae のような「野生動物」型の種は含まれない。これらのヘリコバクター属細菌は人畜共通活性を有することが知られる異種同型の細菌群を形成する。更に、本発明は細菌を蔓延させる炭水化物結合活性について記載する。上記の種はルイスｂを有し、詳細に研究されているシアル酸に基づく感染メカニズムを用いる H. pyloriとは異なる。本発明は、好ましくは、人畜共通感染を生じることが知られているヘリコバクター属細菌の阻害に関する。好ましい種としてはgastrospirilla 属細菌、ならびにネコ及びイヌの病原体であるH. felis、H. bizzezeronii 及び H. salomonisが挙げられ、これらの細菌は、ヒトH. heilmanniiと命名されたヒト感染性細菌群と同一であるか酷似しており、他の種類のH. helimanniiは、H. suis （ブタ ヘリコバクター）と暫定的に分類されるものと似ている。他の１つの人畜共通細菌群には、ヒツジ流産胎仔、イヌ及びヒトの糞ならびにブタ腸から単離された、Flexipira rappiniとして特徴付けられた種が含まれる。H. rappiniと称されるヘリコバクター属細菌の群も、H. bilis 及び H. trogantumと同様に、ヒトに感染することが知られている。特に、人畜共通感染種には、H. canis 及び H. pullorum（家禽からヒトに感染）（２００１年現在）ならびにH. fenellilae、H. cinaedi、H. canadiens、H. winghamensis 及び H. westmaedi（Fox, 2002）も含まれる。
下痢及び他の腸疾患を生じる人畜共通感染性腸感染
本発明は、人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌によって生じる下痢の治療及び／又は予防にも関する。好ましい態様においては、少なくとも１種の炭水化物を、ヒトと近接して生活する動物における感染の急性的又は予防的な治療に用いる。本発明は特に、人畜共通的に蔓延するヘリコバクター属細菌に感染し得る愛玩動物の治療に関する。このような感染動物からヒトへの感染が生じることが報告されており、その結果、下痢を含む疾患を生じる。具体的な態様においては、免疫防御機能の低下又は免疫不全を患うヒト又は動物にこの治療を行う。
肝胆道性疾患を生じる人畜共通感染性ヘリコバクター感染
本発明は、人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌によって生じる肝胆道疾患の治療及び／又は予防にも関する。好ましい態様においては、少なくとも１種の炭水化物を、ヒトと近接して生活する動物における感染の急性的又は予防的な治療に用いる。本発明は特に、人畜共通的に蔓延するヘリコバクター属細菌に感染し得る愛玩動物の治療に関する。このような感染動物からヒトへの感染が生じることが報告されており、その結果、肝胆道疾患を含む疾患を生じる。具体的な態様においては、免疫防御機能の低下又は免疫不全を患うヒト又は動物にこの治療を行う。
胃又は肝臓の疾患を生じる人畜共通ヘリコバクター感染
本発明は、人畜共通ヘリコバクター属細菌によって生じる胃又は肝臓の疾患の治療及び／又は予防にも関する。好ましい態様においては、少なくとも１種の炭水化物を、ヒトと近接して生活する動物における感染の急性的又は予防的な治療に用いる。本発明は特に、人畜共通的に蔓延するヘリコバクター属細菌に感染し得る愛玩動物の治療に関する。このような感染動物からヒトへの感染が生じることが報告されており、その結果、胃感染症を含む疾患を生じる。具体的な態様においては、免疫防御機能の低下又は免疫不全を患うヒト又は動物にこの治療を行う。
腸肝ヘリコバクター属細菌
本発明はH. pylori以外の腸肝ヘリコバクター属細菌が共有する共通の結合特異性を第一の標的とする。このような種としては、H. canis、H. bilis 及び H. hepaticusが挙げられる。ガラクトースに基づく同様の結合特異性の挙動が、ヒト及び動物の糖結合体に対してH. fenelliae、H. rappini 及び H. pullorumでも見られる。一般的には、腸肝系における生態的ニッチは限られた量のレセプター炭水化物の有効な使用を可能にする。本発明では、ヒト及び動物の腸肝系に対する結合に有用な主要なレセプター炭水化物を同定した。特定の態様においては、ガラクトース結合特異性は、更にヒト及び動物の腸肝系において同じ伝染性挙動を示す他の腸肝ヘリコバクター属細菌の阻害及び結合アッセイに用いることができる。
胃感染を生じる人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌
本発明は更に、H. pylori以外のヘリコバクター属細菌であって、主として動物、好ましくは愛玩動物、特に好ましくはネコ及びイヌに感染し、人畜共通にヒトにも感染する細菌による感染症の治療に関する。人畜共通感染性胃病原体の例としては、H. felis 及び H. heilmanniiが挙げられる。本発明は、ヒト又は一般的なペット、例えばネコ及びイヌに感染することが知られていないH. mustellaeの結合特異性に関連するものではなく、H. mustellaeは対照として用いたに過ぎない。
糖脂質及び炭水化物の命名は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨する命名法（Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29）に従った。
Gal、Glc、GlcNAc 及び Neu5AcはＤ型であり、FucはＬ型であり、全ての単糖単位はピラノース環構造であるものとする。グルコサミンはGlcN又はGlcNH2と示し、ガラクトサミンはGalN又はGalNH2と示す。グリコシド結合は略記で示す場合と正式名称で示す場合とあり、Neu5Ac-残基のα３及びα６結合はそれぞれα２−３及びα２−６結合と同じであり、他の単糖残基については、α１−３、β１−３、β１−４及びβ１−６結合はそれぞれα３、β３、β４及びβ６と略すことができる。ラクトサミンはＮ−アセチルラクトサミン（Galβ4GlcNAc）を示し、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）又はその他の天然のシアル酸を示す。シアル酸はまとめてNeuNX（式中、XはAc又はGcである）と表す。Neu5Ac/Gc/X を NeuNAc/NeuNGc/NeuNXと表すこともある。本願においてグリカンという用語は、ヒト又は動物に存在する糖結合体、特に糖脂質又は糖タンパクに含まれるオリゴ糖や多糖鎖を広く包含する。脂肪酸と塩基の略記命名法においては、コロンの前の数字が分子の炭素鎖の長さを示し、コロンの後の数字が炭化水素鎖の二重結合の合計を示す。ＧＳＬという略語はグリコスフィンゴ脂質を示す。グリコスフィンゴ脂質の略語、略称又は記号は表２に記載した。大腸菌とは、大腸菌に類似した細菌も意味する。
「末端オリゴ糖配列」という表現は、他の単糖残基によってオリゴ糖が非還元末端残基に置換されていないことを示す。
「α３／β３」は、オリゴ糖配列において隣り合った糖残基は互いにα３−又はβ３−結合していることを示す。
本発明の技術背景を明らかにするため、また、特に、実施に関する補足的な詳細を提供するために本明細書で用いた刊行物及び他の資料は、それらの記載によって本明細書に組み込まれているものとする。
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実験方法
培養条件と標識化 − 大腸菌の菌株はそれぞれ、１０μｌの35Ｓ−メチオニン（４００μＣｉ；英国、Amersham Pharmacia Biotech製）を添加したルリア−アガー上で、３７℃で１２時間培養した。細菌は培地からかき取ることで回収し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ)（ｐＨ７．３）で３回洗浄し、次いで １×１０8ＣＦＵ／ｍｌとなるようにＰＢＳ（１％マンノース（ｗ／ｖ）添加／無添加）に再懸濁した。懸濁液の比活性は細菌１００個当たり約１ｃｐｍだった。
参照用グリコスフィンゴ脂質 − 総酸性グリコスフィンゴ脂質画分及び総非酸性グリコスフィンゴ脂質画分は、標準的な方法（１）で得た。個々のグリコスフィンゴ脂質は、総グリコスフィンゴ脂質画分そのもの又はそのアセチル化誘導体をケイ酸カラムクロマトグラフィーに付すことで単離した。精製グリコスフィンゴ脂質の特定は、質量分析法（２）、プロトンＮＭＲ分光法（３）、及び分解的手法（degradation studies）（４、５）で行った。
ネオ糖脂質の調製 − 末端GlcNAcを有するオリゴ糖として、フィンランド国、Carbion Oy製の合成オリゴ糖である GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc 及び GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc を使用し、マンノース オリゴ糖としては英国、Dextralabs製を使用した。これらのオリゴ糖をシアノ水素化ホウ素の存在下、４−ヘキサデシルアニリン（“ＨＤＡ”と略す；スウェーデン国、ストックホルム、Aldrich製）による還元的アミノ化反応（Halina Miller-Podraza、出版準備中）に付した。得られた産物を質量分析法で特徴づけたところ、オリゴ糖とＨＤＡとの結合体の還元的アミノ化産物であることが確認された。
薄層クロマトグラフィー − グリコスフィンゴ脂質の薄層クロマトグラフィーは、ガラス又はアルミニウムで裏打ちしたシリカゲル６０ ＨＰＴＬＣプレート（ドイツ国、ダルムシュタット、Merck製）上で、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（容量比は６０：３５：８）を溶媒系として行った。化学検出はアニスアルデヒドで行った（６）。
グリコスフィンゴ脂質結合アッセイ − 薄層クロマトグラム上のグリコスフィンゴ脂質に対する35Ｓ−標識細菌の結合は公知の方法（７）で行った。乾燥したクロマトグラムを、０．５％（ｗ／ｖ）ポリイソブチルメタクリレート（ウイスコンシン州、ミルウオーキー、Aldrich Chem. Comp. Inc. 製）を含むジエチルエーテル／ｎ−ヘキサンの混合溶媒（容量比は１：５）に１分間浸漬した。クロマトグラムを乾燥した後、２％ウシ血清アルブミン（ｗ／ｖ）、０．１％ ＮａＮ3（ｗ／ｖ）及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（容量比）を含むＰＢＳに室温で２時間浸漬した。次いで、ＰＢＳで懸濁した放射線標識細菌（２〜５×１０6ｃｐｍ／ｍｌ）でクロマトグラムを被った。室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳで繰り返し洗浄した。その後、XAR-5 Ｘ線フィルム（ニューヨーク州、ロチェスター、Eastman Kodak製）を用いてクロマトグラムのオートラジオグラフィーを１２時間の行った。オートラジオグラムはＣＣＤカメラ（インディアナ州、ミシガンシティ、Dage-MTI, Inc.製）で撮影し、得られたイメージを公知のＮＩＨイメージプログラム（国立健康協会（National Institute of Health）によって開発され、http://rsb.info.nih.gov/nih-image/より入手可能）を用いて解析した。
可溶性オリゴ糖による阻害 − 可溶性糖類による結合阻害の可能性を試験するために、35Ｓ−標識大腸菌株を約１．５ｍＭのグロボトリアオース、グロボテトラオース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、３’−シアリルラクトース及び６’−シアリルラクトースを含むＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートした。ＴＬＣプレート上の阻害性オリゴ糖の終濃度は０．３ｍＭだった。ラクトースは終濃度が１ｍｇ／ｍｌ及び２ｍｇ／ｍｌとなる条件で試験した。その後、上述したようにクロマトグラム結合アッセイを実施した。
ヒト消化器系のグリコシル化産物の分析 − ヒト粘膜サンプルは外科手術の際に入手した。入手した粘膜は、咽頭及び消化管（即ち胃と結腸）の上皮組織である。
還元オリゴ糖を非還元的β−離脱法で単離した。精製後のオリゴ糖は、主としてタンパク質から分離される、あらゆる細胞グリカン類だった。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、Voyager-DE STR BioSpectrometry Workstationを用い、Saarinen et al. (1999)、Papac et al. (1996) 及び Harvey (1993) の記載と実質的に同様に行った。中性オリゴ糖は、リフレクター型の陽イオンモード（positive ion reflector mode）において、２，５−ジヒドロ安息香酸をマトリックスとして分析し、酸性オリゴ糖は、リニア型の陰イオンモード（negative ion linear mode）において、２’，４’，６’−トリヒドロキシアセトフェノンをマトリックスとして分析した。
全てのエキソグリコシダーゼ反応を公知の方法（Nyman et al. (1998) 及び Saarinen et al. (1999)）と実質的に同様に行い、結果はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で分析した。使用した酵素と既に特徴付けられているオリゴ糖を用いた特異的な対照反応を以下に示す：β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、E. coli組換え体；米国、Calbiochem製）は、β１，４−ガラクトシダーゼで処理したラクト−Ｎ−ヘキサオース内のGlcNAcβ1-6Gal-Rを消化したが、合成オリゴ糖内のGalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6Gal-Rは消化しなかった；Arthrobacter ureafaciens 由来のシアリダーゼ（E. coli組換え体；英国、Glyko製）は、合成オリゴ糖内のNeu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc-R及びNeu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc-R の両方を消化した；α２，３−シアリダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、E. coli組換え体；英国、Glyko製）は、合成オリゴ糖内のNeu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc-Rは消化したが、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc-Rは消化しなかった；α１，２−フコシダーゼ（Xanthomonas manihotis由来；英国、Glyko製）は、モノフコシルラクト−Ｎ−ヘキサオース I 内のFucα1-2Galβ1-3GlcNAc-Rは消化したが、ラクト−Ｎ−フコペンタオース III 内のGalβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcは消化しなかった；α１,３／４−フコシダーゼ（Xanthomonas sp.由来；米国、Calbiochem社製）は、ラクト−Ｎ−フコペンタオース III 内のGalβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-Rを消化したが、モノフコシルラクト−Ｎ−ヘキサオース I 内のFucα1-2Galβ1-3GlcNAc-Rは消化しなかった；β１，４−ガラクトシダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、E. coli組換え体；米国、Calbiochem製）は、ラクト−Ｎ−ヘキサオース内のGalβ1-4GlcNAc-Rを消化したが、Galβ1-3GlcNAc-Rは消化しなかった；β１，３−ガラクトシダーゼ（E. coli組換え体；米国、Calbiochem製）は、ラクト−Ｎ−ヘキサオース内のGalβ1-3GlcNAc-Rを消化したが、Galβ1-4GlcNAc-Rは消化しなかった；そして α−マンノシダーゼ（ナタマメ由来；英国、Glyko製）は、高マンノースＮ−グリカン混合物をMan1GlcNAc2 Ｎ−グリカンコア三糖に変換した。対照の消化反応も分析用のエキソグリコシダーゼ反応と並行して行い、その結果も同様に分析した。
結果
下痢原性大腸菌の炭水化物結合活性のスクリーニング
グリコスフィンゴ脂質混合物を用いた実験 − 初期の研究においては、種々の下痢原性大腸菌株（表１にまとめた）の潜在的炭水化物認識について検討するために、非常によく特徴付けられているグリコスフィンゴ脂質の混合物を用いるクロマトグラム結合アッセイを行って、細菌を大量の異なる炭水化物配列に接触させた。その結果、いくつかのグリコスフィンゴ脂質に対する選択的結合が検出されたものの、他の化合物は細菌によって認識されないことが判明した。得られた結合パターンは、図１に示したように、菌株間で異なっていた。
CCUG標準株の精製グリコスフィンゴ脂質への結合 − 更に結合特性を定義するために、２つの標準株（CCUG 38068株及びCCUG 38077株）を用い、図２に示したように、薄層クロマトグラム上で精製グリコスフィンゴ脂質を用いた結合アッセイを行った。結果は表２にまとめた。いずれの株もラクトシルセラミドに結合した。ラクトシルセラミドへの結合は、このグリコスフィンゴ脂質がスフィンゴシン又はフィトスフィンゴシンと共にヒドロキシ脂肪酸を有するセラミドを含んでいる場合（表２のNo. 5）にのみ見られ、スフィンゴシン及び非ヒドロキシ脂肪酸を有するラクトシルセラミド（No. 4）に対しては常に結合しなかった。
両方の細菌に認識された更なるグリコスフィンゴ脂質は、ガラビアオシルセラミド（No. 6)、イソグロボトリアオシルセラミド（No. 7)、グロボトリアオシルセラミド（No. 8)、ガングリオトリアオシルセラミド（No. 10)、ガングリオテトラオシルセラミド（No. 11)、グロボテトラオシルセラミド（No. 12)、フォルスマン グリコスフィンゴ脂質（No. 14)、ネオラクトテトラオシルセラミド（No. 15)、ラクトテトラオシルセラミド（No. 23)、ネオラクトヘキサオシルセラミド（No. 22）及びNeuGcα3-ネオラクトヘキサオシルセラミド（No. 36）である。これらグリコスフィンゴ脂質に対する結合は、セラミド構造に依存していない。
CCUG 38068株は結合しないが、CCUG 38077株は更に多くのガングリオシド（Nos. 28、29、31-36；図２に示した）に結合した。結合活性ガングリオシドには、Ｎ−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイラミン酸の両方が含まれ、ノイラミン酸はβ３結合したものでも、β６結合したものでもよい。しかし、全てのガングリオシドが認識されたわけではなく、例えば、GD1aガングリオシド（No. 30）に対する結合は得られなかった。
一方、CCUG 38068株は、CCUG 38077株が認識しないＬｅa−５グリコスフィンゴ脂質（No. 24）に結合した。
２種の大腸菌株は、更に薄層クロマトグラム上のManα3(Manα6)Manにも結合した。この糖は、還元的アミノ化反応によって脂質末端と結合した後に試験した。２重分岐マンノースを含有するネオ糖脂質を用いた更なる実験によって、結合は糖の存在に依存することが判明した。
末端GlcNAcβ3LacNAcを有するネオ糖脂質も２種のCCUG株によって認識された。
ネオ糖脂質結合実験の一例
五糖異性体は、特異的なβ３−ガラクトシダーゼ（カリフォルニア州、ラホヤ、Calbiochem製）及びβ４−ガラクトシダーゼ（D. pneumonia由来；ミズーリー州、セントルイス、Sigma製）で消化することで得た。市販の六糖であるパラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース（英国、レディング、Dextra laboratories製）及びラクト−Ｎ−ヘキサオース（スウェーデン国、トウリンゲ、Isosep製）をそれぞれ消化して、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及びGalβ3GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4Glcを得た。初めにUDP-Gal（日本国、協和発酵製）を供与体としたβ４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（カリフォルニア州、ラホヤ、Calbiochem製）の反応にGlcNAcβ6Galβ4Glc（ミズーリー州、セントルイス、Sigma製）を付し、次いでβ３−GlcNAc-トランスフェラーゼ（ヒト血清由来）及びUDP-GlcNAc（日本国、協和発酵製）を用いた反応を行うことでGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Galβ4Glcを得た。得られたオリゴ糖はゲルろ過クロマトグラフィーによって精製し、ＮＭＲ分光分析法及び質量分析法によって特徴付けた。上記３種の五糖及びManα3(Manα6)Manをシアノ水素化ホウ素を用いて４−ヘキサアデシニルアニリン（ＨＤＡと略す、スウエーデン国、ストックホルム、Aldrich製）で還元的アミノ化反応に付した（Halina Miller-Podraza, 発行準備中)。反応産物を質量分析法で特徴づけたところ、上記４種のオリゴ糖類はそれぞれ GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA、Galβ3GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4Glc（red)-HDA、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Galβ4Glc(red)-HDA 及び Manα3(Manα6)Man(red)-HDA［“(red)-”は糖質の還元末端グルコース及びヘキサアデシニルアニリン（ＨＤＡ）のアミン基の還元的アミノ化によって得られたアミン結合構造である］であることが確認された。GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA 及び Manα3(Manα6)Man(red)-HDA は２種の下痢原性大腸菌株（CCUG 38068株と38077株）に対して、上述のＴＬＣオーバーレイアッセイにおいて結合活性を示したが、五糖であるGalβ3GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4Glc(red)-HDA と GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Galβ4Glc(red)-HDA は、不活性であるか又は上記と比べて非常に弱い結合活性しか示さなかった。これらの結果は、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc−型のネオラクト構造は効果的に下痢原性大腸菌に結合することを示す。構造内のGlcNAcβ3をGlcNAcβ6に置換することで結合は大幅に減少する。更に実験結果は、ラクトテトラオース構造内のガラクトースをGlcNAc分岐鎖で遮断してGalβ3GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4Glcとすると、ＴＬＣオーバーレイアッセイにおいて結合が喪失するという共通点も示した。
様々な型の下痢原性大腸菌の結合特異性
様々な型の下痢原性大腸菌、即ち、毒素原性大腸菌（ETEC）、腸管病原性大腸菌（EPEC）、腸管凝集性大腸菌（EAEC）、腸管侵入性大腸菌（EIEC）及び腸管出血性大腸菌（EHEC）、における結合特異性のスクリーニングは、ここに開示した結合特異性の大部分がほとんどの株に見られることを示した（典型的な株／標準株に関するデータは表４にまとめた）。従って、ラクトシルセラミド、ラクト構造及びネオラクト構造に対する結合は、試験した全ての菌株で検出され、グロボ構造に対する結合は、野生型EHEC株以外の全ての株で検出された。ここで使用した菌株、主として標準株においては、シアル酸結合は１種の腸管凝集性大腸菌株にのみ検出された。しかし、いくつかの野生型下痢原性大腸菌株はシアル酸に結合する（例えば、図６と図３を参照)。EHECがグロボ系グリコスフィンゴ脂質及びガングリオシドに結合しないことは、図７（それぞれレーン１及びレーン３，５，６，８と９）より明かである。レーン７で得られる結合は、ラクトシルセラミドへの結合に関するものである。
NeuGc-ネオラクトテトラオシルセラミドに対する優先的な認識
下痢原性大腸菌がシアル酸結合を優先する理由を解明するために、この細菌のシアリル-ネオラクトテトラオシルセラミド変異体に対する結合を比較した。細菌は最も高い親和性でNeuGcα3−ネオラクトテトラオシルセラミド（NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer)に結合し、次にNeuAcα6−ネオラクトテトラオシルセラミド（NeuAcα6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer)、そしてNeuAcα3−ネオラクトテトラオシルセラミド（NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer）に結合した。この比較は、糖脂質の段階希釈系列を用いて、糖脂質の量を減らした際に結合の喪失する濃度を比較した。得られた結果を総合的に判断すると、α６−結合NeuGcに対してより強力な結合が得られることが判明した。
結合パターン及び炭水化物構造に基づいて、結合活性を以下の８種の独立した結合特異性に分類した:
ａ）ラクトシルセラミド結合：ラクトシルセラミド（No. 5）及びイソグロボトリアオシルセラミド（No. 7）に代表される結合。
ｂ）ガングリオ結合：ガングリオトリアオシルセラミド（No. 10）及びガングリオテトラオシルセラミド（No. 11）に代表される結合。
ｃ）Galα4Gal結合：ガラビアオシルセラミド（No. 6)、グロボトリアオシルセラミド（No. 8)、グロボテトラオシルセラミド（No. 12）及びフォルスマン グリコスフィンゴ脂質（No. 14）に代表される結合。
ｄ）ラクト結合：ラクトテトラオシルセラミド（No. 23）に代表される結合。
ｅ）ネオラクト結合： ネオラクトテトラオシルセラミド（No. 15)、ネオラクトヘキサオシルセラミド（No. 22）及びNeuGcα3-ネオラクトヘキサオシルセラミド（No. 36）に代表される結合。
ｆ）フコシル化グリコスフィンゴ脂質に対する結合：Ｌｅa−５グリコスフィンゴ脂質（No. 24）に代表される結合。
ｇ）NeuAc/NeuGc-Xに対する結合：ガングリオシド（Nos. 28、29、31-36）に代表される結合。
ｈ）マンノース−Ｘに対する結合：Manα3(Manα6)Man-ネオ糖脂質に代表される結合。
野生株（表１）はいずれも上記で列挙した結合特異性の少なくとも２つを示し、結合特異性の組み合わせは菌株によって異なっていた。菌株の大部分が３つ以上の結合特異性さえ示した。４つ以上の結合特異性を示すものも多数存在し、全ての結合特異性が必ずしも常時発揮されているわけではないが、菌株の大部分が全て又はほとんどの結合特異性を示す能力を有する可能性も有る。２つ以上のオリゴ糖配列を同時に使用する必要性は、菌株間で発現される結合が異なるという事実から明確である。
阻害実験
グロボテトラオースと３’−シアリルラクトースとの混合物による阻害
下痢原性大腸菌による薄層プレート上のグリコスフィンゴ脂質への結合を可溶性オリゴ糖が干渉する能力は、クロマトグラムに結合させる前に細菌をグロボテトラオースと３’−シアリルラクトースとの混合物とインキュベートすることで検討した。結果を図３に示す。細菌をオリゴ糖混合物とインキュベートすることで、グロボテトラオシルセラミド及び３’−シアリル−パラグロボシドの両方への結合が阻害された。グロボトリアオシルセラミドへの結合阻害も、細菌を１．５ｍＭ グロボトリアオースと共に終濃度が０．３ｍＭとなるようにプレインキュベートすることで得られた。
グロボトリオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースと６'−シアリルラクトースとの混合物による阻害
下痢原性大腸菌による薄層プレート上のグリコスフィンゴ脂質への結合を可溶性オリゴ糖が干渉する能力は、クロマトグラムに結合させる前に細菌をグロボテトラオースと６’−シアリルラクトースとの混合物とインキュベートすることで更に検討した。結果を図６に示す。細菌をオリゴ糖混合物とインキュベートすることで、グロボトリアシルセラミド、NeuNGcα3ネオラクトヘキサオシルセラミド（糖鎖中にネオラクト エピトープを有する）及びNeuGcα3ネオラクトテトラオシルセラミドへの結合が同時に阻害された。データは１つの分子内に存在する２つのエピトープに対する同時阻害を示した。更に、NeuGcα3ネオラクトテトラオシルセラミドに対する結合は６'−シアリルラクトースによって阻害されることが判明し、これは同じ細菌性接着因子がα３−結合シアル酸及びα６−結合シアル酸に結合することを示す。
阻害試験で得られたその他の結果
対照実験においては、上記した一価の遊離オリゴ糖は、同じレセプター構造を有する糖脂質への結合を特異的に阻害したが、それ以外の糖脂質への結合は阻害しなかった。上述した終濃度が０．３ｍＭの条件で、グロボ系オリゴ糖はグロボレセプターへの結合を阻害し、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースはネオラクト糖脂質への結合を阻害し、そしてシアリルラクトースはシアリルレセプター糖脂質への結合を阻害したが、しかし交差反応は見られなかった。更にラクト−Ｎ−テトラオースは、上述した阻害実験において最も低い濃度の糖脂質を用いた場合には下痢原性大腸菌がラクトテトラオシルセラミドへ結合するのを阻害した。対照として、阻害活性が見られない、終濃度が１〜２ｍｇ／ｍｌ（３〜６ｍＭ）の条件でラクトースを試験した。興味深いことに、二糖末端ガングリオシド エピトープであるGalβ3GalNAcも０．３ｍＭの濃度ではガングリオレセプター糖脂質に対して一価型阻害剤として機能せず、二糖配列は一価型阻害剤としてよりも多価担体に結合しているほうがより有用であることを示した。
阻害実験によると、本発明における高頻度で存在する結合特異性は、一般的に次の３つの特徴を有する。
１．独立しており、
２．比較的低濃度の一価のオリゴ糖で阻害可能であり、そして
３．複数のオリゴ糖の存在によって、有害な副作用を伴うことなく同時に阻害可能である。
結合特異性の選択的な切断
研究の過程において、下痢原性大腸菌を長期に渡って継代培養した際には、１種以上の結合特異性が選択的に失われるという現象に直面した。これは図７に例示されており、イソグロボトリアオシルセラミド（レーン４）に対する結合が失われるものの、ガングリオテトラオシルセラミド（レーン５）及びグロボテトラオシルセラミド（レーン６）に対する結合は保持されていることから、イソグロボテトラオシルセラミド/ラクトシルセラミド結合性接着因子の負の調節を示唆している。イソグロボシルセラミドは活性ヒドロキシ脂肪酸を含有し、活性ヒドロキシ脂肪酸はラクトシルセラミド ファミリーの活性を付与している。しかし、この結合性の切断（switch-off）には特異的なパターンは見られない、即ち、異なる結合特異性が異なる実験で損失した。本発明者らは、結合特異性の比較的無作為な損失を観測した。どの結合特異性も失われることがあるので、本発明においては、少なくとも２種の一価又は多価の本発明による阻害剤を使用することが好ましい。
高頻度で見られる結合特異性
膨大な型の下痢原性大腸菌株を用いた、数々のＴＬＣ−オーバーレイアッセイを行った。試験した細菌においては、以下の４種の結合特異性が非常に高頻度で観測された：グロボレセプター、シアル酸レセプター、ネオラクトレセプター及びラクトレセプターのそれぞれに対する結合。グロボレセプターに対する結合は、特に突発的な「切断」に対して安定である。
ヒト消化器系におけるタンパク質のグリコシル化反応の分析 − サンプルに含まれる末端グリカンエピトープ構造のいくつかを以下に例示した。以下の分析において検出レベルは、もっとも多量に存在する成分に対する存在率として５％のオーダーである。
Galβ1-4GlcNAcβ-R. 末端II型Ｎ−アセチルラクトサミニル基は、Streptococcus pneumoniae 由来のβ１,４−ガラクトシダーゼ消化に対して感受性を示すことから明かなように、分析した全ての組織、即ち、咽頭、胃及び結腸、において検出された。例えば、結腸サンプルのリフレクター型陽イオンモードの質量スペクトルにおいては、イオン構造 [Hex5HexNAc4Fuc+Na]+ （calc. m/z = 1809.64）に帰属するピークがｍ／ｚ １８０９．７３に観測されるが、これはβ１，４−ガラクトシダーゼ処理にによって消失し、[Hex3HexNAc4Fuc+Na]+（calc. m/z = 1485.53）に帰属するｍ／ｚ１４８５．６８のピークに変換された。
Galβ1,3-R. β１，３−ガラクトシダーゼ感受性の末端ガラクトース残基は結腸上皮にのみ検出され、咽頭と胃の上皮には検出されなかった。リフレクター型陽イオンモードの質量スペクトルにおいては、イオン構造 [Hex3HexNAc2+Na]+（calc. m/z = 933.32）に帰属するｍ／ｚ ９３３．３７に観測されるピークの強度が、β１，４−ガラクトシダーゼで前処理後にβ１，３−ガラクトシダーゼで処理することで顕著に上昇した。更に、イオン構造 [Hex4HexNAc5Fuc2+Na]+（calc. m/z = 1996.72）に帰属するｍ／ｚ１９９６．８４に観測されるピークの強度が、β１，４−ガラクトシダーゼ前処理後にβ１，３−ガラクトシダーゼで処理することで顕著に上昇した。この結果は、これら構造のβ１，３−ガラクトシル化誘導体が存在することを意味する。
Fucα1,2-R. 末端α１,２−フコシル残基と考えられるものが胃の上皮サンプルに検出されたが、咽頭上皮及び結腸上皮には検出されなかった。胃サンプルをα１,２−フコシダーゼで消化したところ、リフレクター型陽イオンモードの質量スペクトルにおいて、イオン構造 [HexHexNAc2Fuc+Na]+（calc. m/z 755.27）に帰属するｍ／ｚ７５５．２４に観測されるピークとイオン構造 [Hex2HexNAc2Fuc+Na]+（calc. m/z 917.32）に帰属するｍ／ｚ９１７．２９に観測されるピークの強度が上昇し、この結果は、これら構造のフコシル化誘導体が存在することを意味する。
Fucα1,3-R 及び Fucα1,4-R. 末端Lewisa又はLewisx血液型決定基と考えられるものが咽頭上皮及び結腸上皮には検出されたが、胃サンプルには検出されなかった。例えば、結腸サンプルのリフレクター型陽イオンモードの質量スペクトルにおいては、イオン構造 [Hex5HexNAc5Fuc+Na]+（calc. m/z = 2012.72）に帰属するｍ／ｚ２０１２．８１に観測されるピークの強度が、α１，２−フコシダーゼで前処理後にα１,３／４−フコシダーゼで処理することで顕著に上昇した。この結果は、この構造のフコシル化誘導体が存在することを意味する。
Manα-R. 末端α−マンノシル残基が全てのサンプルに検出され、α−マンノシダーゼ消化は、リフレクター型陽イオンモードの質量スペクトルにおいては、種々のピーク群、即ち、計算値がｍ／ｚ７７１．２６の[Hex2HexNAc2+Na]+、ｍ／ｚ９３３．３２の[Hex3HexNAc2+Na]+、ｍ／ｚ１０９５．３７の[Hex4HexNAc2+Na]+、ｍ／ｚ１２５７．４２の[Hex5HexNAc2+Na]+、ｍ／ｚ１４１９．４８の[Hex6HexNAc2+Na]+、ｍ／ｚ１５８１．５３の[Hex7HexNAc2+Na]+、ｍ／ｚ１７４３．５８の[Hex8HexNAc2+Na]+ 及びｍ／ｚ１９０５．６３の[Hex9HexNAc2+Na]+ に帰属するシグナルに影響を与えた。α−マンノース消化後には、これらシグナルは計算値がｍ／ｚ６０９．２１の[Hex1HexNAc2+Na]+ に帰属する単一ピークに変換され、これは消化に付した構造体が高マンノースＮ−グリカンであることを意味する。
NeuAcα2,3-R. Galにα２,３−結合している末端シアル酸（Toivonen et al., 2002）がサンプル中に検出された。例えば、胃グリカンをα２,３−シアリダーゼ消化に付した場合、イオン構造 [NeuAc2Hex5HexNAc4Fuc-H]-（calc. m/z = 2369.1）に帰属されるｍ／ｚ２３６９．４に検出されるピークの相対強度が低下した。
NeuAcα2,6/8/9-R. Galにα２,３−結合以外の結合で繋がっている末端シアル酸、又はGalNAcにα２,３−結合しているシアル酸（Toivonen et al., 2002）がサンプル中に検出された。例えば、α２,３−シアリダーゼで処理した胃グリカンを Arthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼで消化したところ、ｍ／ｚ１９３１．６の [NeuAc1Hex5HexNAc4-H]-（calc. m/z = 1931.7）、ｍ／ｚ２０７７．９の [NeuAc1Hex5HexNAc4Fuc-H]-（calc.m/z = 2077.9）、ｍ／ｚ２２２３．３の [NeuAc2Hex5HexNAc4-H]-（calc. m/z = 2223.0）、ｍ／ｚ２３６９．４の [NeuAc2Hex5HexNAc4Fuc-H]-（calc. m/z = 2369.1）、ｍ／ｚ２７３５．１の [NeuAc2Hex6HexNAc5Fuc-H]-（calc. m/z = 2734.5）及びｍ／ｚ３０２６．５の [NeuAc3Hex6HexNAc5Fuc-H]-（calc. m/z = 3025.7）に帰属するピークが消失した。分子が大きいことと典型的な単糖組成から、上記のグリカンはＮ−グリカンである可能性が高いが、Ｏ−グリカンである可能性も否定できない。しかし、A. ureafaciens由来のシアリダーゼの影響を受けるより小さなグリカン、即ち、ｍ／ｚ１０３８．７の [NeuAcHex2HexNAc2-H]-（calc. m/z = 1038.9）及びｍ／ｚ１１８５．４の [NeuAcHex2HexNAc2Fuc-H]-（calc. m/z = 1185.1)、はＯ−グリカンである可能性が高い。この段落に記載した構造のうち、１つのシアル酸残基を有する全ての構造においては、結合はα２，６結合（又はGalNAcへのα２，３結合）である点に注意されたい。
本発明で検討した胃腸在来種には、国立タイプ カルチャー コレクション（National Collection of Type Cultures、ＮＣＴＣ）及びゲーテボルグ大学カルチャー コレクション（Culture Collection of the University of Gothenberg、ＣＣＵＧ）より入手した、Helicobacter mustelae のフェレット単離株である NCTC 12198/CCUG 25175（異なる材料より得た同一株)、CCUG 23950株及びCCUG 23951株、ネコ由来のHelicobacter felis CCUG 28539株、並びに H. pylori CCUG 17874株、CCUG 17875株、及び臨床単離株である119/95株が含まれる。動物由来の腸肝感染性ヘリコバクターである Helicobacter canis CCUG 33835株、Helicobacter bilis CCUG 38995株、Helicobacter hepaticus CCUG 33637株及びHelicobacter fennelliae（CCUG 18820株）はＣＣＵＧより入手した。
糖脂質結合アッセイ
ヘリコバクター属細菌の、酸性及び非酸性グリコスフィンゴ脂質画分に対する結合
標準的な方法（Karlsson, 1987）に従って、グリコスフィンゴ脂質を単離した。精製グリコスフィンゴ脂質の特定は、質量分析法（Samuelsson et al., 1990）、ＮＭＲ分光分析法（Koerner et al., 1983）、及び分解的手法（Stellner et al., 1973； Yang and Hakomori, 1971）で行った。
続いて、グリコスフィンゴ脂質の混合物（４０μｇ／レーン）又は精製化合物（２μg／レーン）を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に付した。クロマトグラフィーはガラス又はアルミニウムで裏打ちしたシリカゲル６０ ＨＰＴＬＣプレート（ドイツ国、ダルムシュタット、Merck製）上で、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（容量比は６０：３５：８）を溶媒系として行った。化学検出はアニスアルデヒドで行った（Waldi, 1962）。ヘリコバクター属細菌はそれぞれ35Ｓで標識し（Angstrom et al., 1998）、懸濁液の比活性が細菌１００個当たり約１ｃｐｍとなるようにＰＢＳに再懸濁（１０8ＣＦＵ／ｍｌ）した。ＴＬＣで分離したグリコスフィンゴ脂質に対する標識細菌の結合は、バクテリア オーバーレイ アッセイとオートラジオグラフィーを組み合わせた方法で検出した。オートラジオグラフィーは、XAR-5 Ｘ線フィルム（ニューヨーク州、ロチェスター、Eastman Kodak製）を用いて公知の方法（Hansson et al., 1985）で実施した。
人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌の炭水化物結合特異性
既にH. pylori 及び H. mustelae のガングリオテトラオシルセラミドへの結合と同様の結合が、H. felis、H. canis、H. hepaticus 及び H. bilisについて確立されている（表３）。更に本発明者らは、H. pylori と同様に、試験した胃感染性ヘリコバクター属細菌及び腸肝感染性ヘリコバクター属細菌は、ラクトテトラオシルセラミド、フィトスフィンゴシン及び／又はヒドロキシ脂肪酸を有するラクトシルセラミド、並びにイソグロボトリアオシルセラミドに結合することを発見した。一方、Leb グリコスフィンゴ脂質への結合は、H. pylori CCUG 17875株にしか見られなかった（表３）。
ヒト顆粒球由来の酸性グリコスフィンゴ脂質画分に含まれる遅移動性ガングリオシドに対するある種のH. pylori株の結合はシアル酸依存性であるため（Miller-Podraza et al.,1999)、この画分をシアル酸認識の指標として用いた。この画分に対する結合は H. hepaticus CCUG 33637株（図４のＢ、レーン１に例示した）及び H. pylori CCUG 17874株に見られ、時には H. mustelae CCUG 25715株にも見られた（表３）。他の物質でアッセイできるシアル酸結合能も、少なくともH. bilis 属細菌には見られた。
主として胃感染性及び腸肝感染性のヘリコバクターがグリコスフィンゴ脂質に結合する能力は、これら細菌種の結合戦略における宿主炭水化物への結合の用途を暗示するものである。
種々のヘリコバクテリアの結合特異性は、腸及び肝胆道分岐（hepatobillary tree）で発現されている種々のレセプターに特異的なニッチの形成を暗示する。更に、炎症組織で発現される抗原は変化するため、感染の異なる段階においては異なる戦略を用いることが有効である（Mahdavi et al., 2002）。現在の研究から、胆肝道感染性ヘリコバクター、即ち、H. hepaticus 及び H. bilis、は H. pyloriと同じ接着戦略を共有していることは明かである。このような胆肝道感染性病原体は種々の糖結合体及びある種のシアリル化構造までもを結合する能力を有する。
本発明に基づく、オリゴ糖配列の可溶性多価結合体の製造
キトサンオリゴ糖のアミド化
アミノオキシ機能化キトサンを製造するために、上述したように調製した１９量体のキトサンをＢＯＣ−アミノオキシ酢酸でアミド化した。具体的には、キトサンを７５％ピリジン水溶液に溶解し、そこに５倍の過剰モル量（キトサンのアミノ基当たり）のＢＯＣ−アミノオキシ酢酸、ＨＢＴＵ及びジイソプロピルエチルアミンを加えた。室温、暗黒で４２時間反応させ、ロータリーエバポレーターで乾燥した。低分子量の試薬は透析で除去し、キトサンはプロトンＮＭＲ解析に付した。解析結果は平均４．５個のＢＯＣ−アミノオキシ酢酸基がキトサン鎖に存在することを示した。
生体認識炭水化物とアミノオキシ−キトサン鎖との結合
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とのインキュベーションによる保護基の除去。Ｂｏｃ−Ｏ−ヒドロキシアミン変性キトサン鎖をＴＦＡで可溶化し、室温で約１０分インキュベートした。ＴＦＡは真空下で蒸発除去した。０．２Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中で、種々のアルデヒド含有分子をＯ−ヒドロキシアミン末端と３７℃で４２時間反応させた。反応生成物は、水に対する透析又はゲル濾過クロマトグラフィーで精製した。
Ｏ−ヒドロキシアミンキトサン鎖とラクトースとの反応生成物は、ＮＭＲ分光分析で特徴付けた。ＮＭＲスペクトルから、β−アノマーグリコシド構造（４．１３６ｐｐｍの Glc H1 シグナル）と二重結合を有するオキシム構造（７．６９０ｐｐｍの Glc H1 シグナルと４．６２６ｐｐｍの H2 シグナル）の両方が観測された。４．５６０ｐｐｍ及び４．５１２ｐｐｍのシグナルは共にＨ１に帰属し、３．０５４ｐｐｍのシグナルは GlcN 骨格のＨ２プロトンに帰属した。４．４７９ｐｐｍのシグナルはラクトース残基のGalのＨ１シグナルに対応する。４．１６３ｐｐｍのシグナル及び４．４４９ｐｐｍのシグナルはアミノオキシ酢酸で形成したスペーサー分子に帰属され、それぞれ閉環グリコシド型スペーサーのＣＨ2プロトン及び二重結合型スペーサーのＣＨ2プロトンに対応した。ラクト−Ｎ−ネオテトラオースをポリマー状の担体に結合するとほぼ同一のデータが得られ、更に末端Ｎ−アセチルラクトサミンに帰属するシグナルも分析することができた。
表１： ＴＬＣプレート上で分離した糖脂質に対する結合を試験した下痢原性大腸菌株

２つの標準株（CCUG 38068株及びCCUG 38077株）について、膨大な種類の天然糖脂質（別表を参照）に対する結合をより詳細に検討した。試験した種々の他の株は以下の表に示した２種の標準株と同様の結合特異性を示したが、個別の株ごとに結合パターンは異なっていた。この結合パターンの差異は、詳細に検討した２つの標準株の間に見られる差異と同等であった。
Figure 0005219329
Figure 0005219329
Figure 0005219329
Figure 0005219329
Figure 0005219329
Figure 0005219329
参考文献

Angstrom, J., S. Teneberg, M. A. Milh, T. Larsson, I. Leonardsson, B. M. Olsson, M. O. Halvarsson, D. Danielsson, N. a. I, A. Ljungh, T. Wadstrom, and K. A. Karlsson. 1998. Glycobiology 8:297-309.

Bartus, H., Actor, P., Snipes, E., Sedlock, D., and Zajac, I. J. Clin. Invest. (1985) 21, 951-954.

Boren, T., Falk, P., Roth, K. A., Larson, G. and Normark, S. (1993) Science, 262, 1892-1895.

Cravioto, A, Tello, A., Villafan, H., Ruiz, J., del Vedovo, S., and Neeser, J-C. (1991) J. Infect. Dis. 1247-1255.

De Ree, J.M., Schwillens, P., and van den Bosch, JF FEMS Microbiol. Lett., (1985) 29, 91-97.

Dewhurst, F.E., Fox, F.G., and On, S.L.W. (2000) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 2231-37.

Ernst, B., Hart, G.W., and Sinay, P. (eds.) (2000) Carbohydrates in Chemistry and Biology, ISBN 3-527-29511-9, Wiley-VCH, Weinheim.

Evans, D.G., Evans, D.J.jr., Glegg, S., Pauley, J.A. Infect. Immun. (1979) 25, 738-748.

Evans, D. G., Evans Jr, D.J., Molds, J. J., and Graham, D. Y. (1988) Infect. Immun., 56, 2896-06.

Firon, N., Ofek, I., and Sharon, N. BBRC (1982) 105, 1426-1432.

Fox, J.G. (2002) Gut 50, 273-283.

Fox, J. G., N. S. Taylor, M. Ihrig, M. I. Esteves, R. T. Chung, and M. M. Kaplan. 2000. Gut 47:A67-A67.

Gerhard, M., S. Hirmo, T. Wadstrom, H. Miller-Pedroza, S. Teneberg, K. A. Karlsson, B. J. Appelmelk, S. Odenbreit, R. Haas, A. Arnqvist, and T. Boren. 2001. p. 185-206. In M. Achtman and S. Suerbaum (ed.), Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Horizon Scientific Press, Wymondham.

Hansson, G. C., Karlsson, K.-A., Larson, G., Stromberg, N., and Thurin, J. (1985) Anal. Biochem. 146, 158-163.

Harvey, D.J., et al. (1993) Rapid Commun. Mass Spectrom. 7(7):614-9.

Hunt, R. H. 1996. Scand J Gastroenterol Suppl 220:3-9.

Idota, T., and Kawakami, H. (1995) Biosci. Biotech. Biochem. 59 (1) 69-72.

Jagannatha, H.M., Sharma, U.K., Ramaseshan, T., Surolia, A., and Balganesh, T.S. (1991) Microbial pathogenesis (11) 259-268.

Karlsson, K.-A. (1987) Methods Enzymol. 138, 212-220.

Koerner Jr, T. A. W., Prestegard, J. H., Demou, P. C., and Yu, R. K. (1983) Biochemistry 22, 2676-2687.

Lingwood, C. A., Huesca, M. and Kuksis, A. (1992) Infect. Immun., 60, 2470-2474.

Mahdavi, J., B. Sonden, M. Hurtig, F. O. Olfat, L. Forsberg, N. Roche, J. Angstrom, T. Larsson, S. Teneberg, K. Karlsson, S. Altraja, T. Wadstrom, D. Kersulyte, D. E. Berg, A. Dubois, C. Petersson, K.-E. Magnusson, T. Norberg, F. Lindh, B. B. Lundskog, A. Arnqvist, L. Hammarstrom, T. Boren, and T. Boren. 2002. Proceedings from the 5th International Workshop on Pathogenesis and Host Response in Helicobacter Infections:P3.

Miller-Podraza, H., J. Bergstrom, S. Teneberg, M. Abul Milh, M. Longard, B.-M. Olsson, L. Uggla, and K.-A. Karlsson. 1999. Infect. Immun. 67:6309-13.

Miller-Podraza, H., Abul Milh, M., Bergstrom, J. and Karlsson, K.-A. (1996) Glycoconj. J., 13, 453-460.

Miller-Podraza, H., Bergstrom, J., Abul Milh, M. and Karlsson, K.-A. (1997a) Glycoconj. J.,14, 467-471.

Mysore, J.V., Wiggington, T., Simon, P.M., Zopf, D., Heman-Ackah, L.M. and Dubois, A. (1999) Gastroenterology, 117, 1316-1325.

Nakamura, T., Kawase, H., Kimura, K., Watanabe, Y., Ohtani, M., Arai, I., and Urashima, T (2003) J. Dairy Sci. 86: 1315-1320.

Nakhla, T., Fu, D., Zopf, D., Brodsky, N., and Hurt, H. (1999) British J. Nutr, 82, 361-367.

Nascimento de Araujo, A., and Giugliano, L.G. (2001) BMC Microbiol. 1, 25.

Nascimento de Araujo, A., and Giugliano, L.G. (2000) FEMS Mircrobiol. Lett. 184, 91-94.

Neeser, J.-R., Koellreutter, B., and Wuersch, P. (1986) Infect. Immun. 52, 428-436.

Neeser, J.-R., Chambaz, A., Golliard, M., Link-Amster, H., Fryder, V., and Kolodziejczyk (1989) Infect. Immun. 57, 3727-3734.

Nilsson, H. O., M. Castedal, R. Olsson, and T. Wadstrom. 1999. J. Physiol. Pharmacol. 50:875-82.

Nyman, T.A., et al. (1998) Eur. J. Biochem. 253(2):485-93.

On, S. L. 2001. J. Appl. Microbiol. 90 Suppl:1S-15S.

Oroe, H.S., Kolstoe, A-B., WennerAs, C., and Svennerholm, A.-M. FEMS Mircrobiol. Lett. (1990), 289-292.

Papac, D.I., et al. (1996) Anal. Chem. 68(18):3215-23.

Pieroni, P., Worobec, E.A., Paranchych, W., and Armstrong, G.D. (1988) Infect. Immun. 56, 1334-1340.

Saarinen, J., et al. (1999) Eur. J. Biochem. 259(3):829-40.

Saitoh, T., Natomi, H., Zhao, W., Okuzumi, K., Sugano, K., Iwamori, M. and Nagai, Y. (1991) FEBS Lett., 282, 385-387.

Samuelsson, B. E., Pimlott, W., and Karlsson, K.-A. (1990) Methods Enzymol. 193, 623-646.

Scatelsky, I.C.A., Milani, S.R., Trabulsi, L.R., and Travassos, L.R. Infect. Immun. (1988) 56, 2979-298.

Sears, P. and Wong, C-H. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 12086-12093.

Simon, P. M., Goode, P. L., Mobasseri, A., and Zopf, D. (1997) Infect. Immun. 65, 750-757.

Stellner, K., Saito, H., and Hakomori, S.-i. (1973) Arch. Biochem. Biophys. 155, 464-472.

Teneberg, S., I. Leonardsson, H. Karlsson, P.A., Jovall, J., Angstrom, D. Danielsson, I. Naslund, A. Ljungh, T. Wadstrom, and K. A. Karlsson. 2002. J. Biol. Chem. 277:19709-19.

Toivonen, S., et al. (2002) J. Biol. Chem. 276(40):37141-8.

Vanmaele, R.P., Finlayson, M.C., and Armstrong, G.D. (1995) Infection and Immunity 63 (1) 191-198.

Vanmaele, R.P., Heerze, L.D., and Armstrong, G.D. (1999) Infection and Immunity 67, 3302-7.

Waldi, D. (1962) Dunnschicht-Chromatographie. (Stahl, E., ed.) pp. 496-515. Springer-Verlag, Berlin.

WennerAs, C., Neeser, J-R., and Svennerholm A.-M. Infection and Immunity (1995) 640-646.

WennerAs, C., Holmgren, J., and Svennerholm A.-M. FEMS Mircrobiol. Lett. (1990) 66, 107-112.

Yang, H. J., and S. I. Hakomori. 1971. J. Biol. Chem. 246:1192-200.
野生型下痢原性大腸菌のグリコスフィンゴ脂質混合物に対する結合。図中の（Ａ）はアニスアルデヒドによるグリコスフィンゴ脂質の検出結果であり、（Ｂ）と（Ｃ）は放射線標識した野生型下痢原性大腸菌単離株の結合後に得たオートラジオグラムである。グリコスフィンゴ脂質は、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（容量比は６０：３５：８）を溶媒系としてアルミニウムで裏打ちしたシリカゲルプレート上で分離し、結合アッセイは実施例の「実験方法」の欄に記載した方法で実施した。レーンは次の通りである。レーン１：マウス糞の非酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；レーン２：モルモット赤血球の非酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；レーン３： フォルスマン グリコスフィンゴ脂質（GalNAcα3GalNAcβα4Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン４：ガングリオトリアオシルセラミド（GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン５：ガングリオテトラオシルセラミド（Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン６：ヒト胎便の非酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；レーン７：ヒト胃の非酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；レーン８：グロボシド（GalNAcβGalα4Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；及びレーン９：ヒト赤血球の酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ。オートラジオグラフィーは１２時間行った。 下痢原性大腸菌 CCUG 38077株の薄層クロマトグラム上の精製グリコスフィンゴ脂質に対する結合。図中の（Ａ）はアニスアルデヒドによる化学検出の結果であり、（Ｂ）は35Ｓで標識した大腸菌 CCUG 38077株の結合後に得たオートラジオグラムである。グリコスフィンゴ脂質は、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（容量比は６０：３５：８）を溶媒系としてアルミニウムで裏打ちしたシリカゲルプレート上で分離し、結合アッセイは実施例の「実験方法」の欄に記載した方法で実施した。レーンは次の通りである。レーン１：ラクトテトラオシルセラミド（Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン２：NeuAc-GM3（NeuAcα3Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン３：NeuGc-GM3（NeuGcα3Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン４：NeuAcα3−シアリルパラグロボシド（NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン５：NeuGc−シアリルパラグロボシド（NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン６：シアリル−Ｌｅaヘキサグリコシルセラミド（NeuAcα3Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン７：NeuGc−ネオラクトヘキサオシルセラミド（NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；及びレーン８：GD1aガングリオシド（NeuAcα3Galβ3GalNAcβ4(NeuAcα3)Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ。オートラジオグラフィーは１２時間行った。 オリゴ糖とのプレインキュベーションによる効果。放射線標識した野生型大腸菌である44株をグロボテトラオース（１．５ｍＭ）と３’−シアリルラクトース（１．５ｍＭ）との混合物と共にＰＢＳ中で室温で１時間インキュベートした。その後、大腸菌懸濁液をクロマトグラム結合アッセイに用いた。図中の（Ａ）は放射線標識した野生型大腸菌 44株の結合を示し、（Ｂ）はグロボテトラオースと３’−シアリルラクトースとインキュベートした大腸菌 44株の結合を示す。レーン１〜５は、グロボシド（GalNAcβGalα4Galβ4Glcβ1Cer）と３’−シアリルパラグロボシド（NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）の段階希釈系列である。レーン１：各化合物を４μｇ；レーン２：各化合物を２μｇ；レーン３：各化合物を１μｇ；レーン４：各化合物を０．５μｇ；レーン５：各化合物を０．２μｇ；及びレーン６：Ｂ７ １型へプタグリコシルセラミド（Galα3(Fucα2)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer；負の対照）、４μｇ。グリコスフィンゴ脂質は、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（容量比は６０：３５：８）を溶媒系としてアルミニウムで裏打ちしたシリカゲルプレート上で分離し、結合アッセイは実施例の「実験方法」の欄に記載した方法で実施した。オートラジオグラフィーは１２時間行った。 図３−１の結果をデンシトメトリーで定量して作製した結合カーブ。図３−１の（Ａ）と（Ｂ）のオートラジオグラムをＮＩＨのイメージプログラムで解析した。 薄層クロマトグラム上で分離したグリコスフィンゴ脂質に対する、化学検出の結果（Ａ）、及び種々のヘリコバクター属細菌の結合後に得たオートラジオグラム（Ｂ〜Ｉ）である。レーン１：ヒト顆粒球の酸性グリコスフィンゴ脂質画分、４０μｇ；レーン２：イヌ腸のGalβ4Glcβ1Cer（ラクトシルセラミド）、２μg；レーン３：イヌ腸のGalα3Galβ4Glcβ1Cer（イソグロボトリアオシルセラミド）、２μg；レーン４：マウス糞のGalβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer（ガングリオテトラオシルセラミド）、２μg；レーン５：ヒト胎便のGalβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｌｅa−５グリコスフィンゴ脂質）、２μg；レーン６：ヒト胎便のFucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｌｅb−６グリコスフィンゴ脂質）、２μg；レーン７：ヒト赤血球のGalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ1Cer（グロボテトラオシルセラミド）、２μg；及びレーン８：ヒト胎便のGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（ラクトテトラオシルセラミド）、２μg。 可溶性オリゴ糖による腸管病原性大腸菌のグリコスフィンゴ脂質への結合阻害。放射線標識した野生型大腸菌である37株をグロボトリアオース（１．５ｍＭ）、ネオラクトテトラオース（１．５ｍＭ）及び６’−シアリルラクトース（１．５ｍＭ）との混合物と共にＰＢＳ中で室温で１時間インキュベートした。その後、大腸菌懸濁液をクロマトグラム結合アッセイに用いた。図中の（Ａ）は放射線標識した野生型大腸菌 37株の結合を示し、（Ｂ）はグロボトリアオース、ネオラクトテトラオース及び６’−シアリルラクトースとの混合物と共にインキュベートした大腸菌 37株の結合を示す。レーン１〜４は、グロボトリアオシルセラミド（Galα4Galβ4Glcβ1Cer）とNeuGc−ネオラクトヘキサオシルセラミド（NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNacβ3Galβ4Glcβ1Cer）の段階希釈系列である。レーン１：各化合物を２μｇ；レーン２：各化合物を１μｇ；レーン３：各化合物を０．５μｇ；及びレーン４：各化合物を０．２μｇ。レーン５〜８は、NeuGc−ネオラクトテトラオシルセラミド（NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）の段階希釈系列である。レーン５：各化合物を２μｇ；レーン６：各化合物を１μｇ；レーン７：各化合物を０．５μｇ；及びレーン８：各化合物を０．２μｇ。グリコスフィンゴ脂質は、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（容量比は６０：３５：８）を溶媒系としてアルミニウムで裏打ちしたシリカゲルプレート上で分離し、結合アッセイは実施例の「実験方法」の欄に記載した方法で実施した。オートラジオグラフィーは１２時間行った。 図５−１の結果をデンシトメトリーで定量して作製した結合カーブ。図５−１の（Ａ）と（Ｂ）のオートラジオグラムをＮＩＨのイメージプログラムで解析した。図中の白丸は、グロボトリアオシルセラミドへの結合を表し（図５−１の（Ａ））、黒丸はオリゴ糖とインキュベートした後のグロボトリアオシルセラミドへの結合を表す（図５−１の（Ｂ））。図中の白い四角は、NeuGc−ネオラクトヘキサオシルセラミドへの結合を表し（図５−１の（Ａ））、黒い四角はオリゴ糖とインキュベートした後のNeuGc−ネオラクトヘキサオシルセラミドへの結合を表す（図５−１の（Ｂ））。図中の白い三角は、NeuGc−ネオラクトテトラオシルセラミドへの結合を表し（図５−１のＡ）、黒い三角はオリゴ糖とインキュベートした後のNeuGc−ネオラクトテトラオシルセラミドへの結合を表す（図５−１のＢ）。 腸管出血性大腸菌はグロボ系グリコスフィンゴ脂質やシアル酸含有グリコスフィンゴ脂質には結合しない。野生型腸管出血性大腸菌 W135A株のグリコスフィンゴ脂質混合物に対する結合。グリコスフィンゴ脂質は、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（容量比は６０：３５：８）を溶媒系としてアルミニウムで裏打ちしたシリカゲルプレート上で分離し、結合アッセイは実施例の「実験方法」の欄に記載した方法で実施した。レーンは次の通りである。レーン１：血液型Ｏの赤血球の非酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；レーン２：ウシ腸の非酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；レーン３：ウシ腸の酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；レーン４：ヒツジ腸の非酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；レーン５：ヒツジ腸の酸性グリコスフィンゴ脂質（フォルチ分配後の上相）、４０μｇ；レーン６：ヒツジ腸の酸性グリコスフィンゴ脂質（フォルチ分配後の下相）、４０μｇ；レーン７：ネコ腸の非酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；レーン８：ウマ腸の酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ；及びレーン９：ヒト好酸球性顆粒球の酸性グリコスフィンゴ脂質、４０μｇ。オートラジオグラフィーは１２時間行った。 継代培養によるイソグロボトリアオシルセラミドに対する結合の選択的損失。腸管侵入性大腸菌 CCUG 38092株の薄層クロマトグラム上の精製グリコスフィンゴ脂質に対する結合。図中の（Ａ）は35Ｓで標識した大腸菌 CCUG 38092株の結合後に得たオートラジオグラムであり、（Ｂ）は継代培養後の35Ｓで標識した大腸菌 CCUG 38092株の結合後に得たオートラジオグラムである。グリコスフィンゴ脂質は、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒（容量比は６０：３５：８）を溶媒系としてアルミニウムで裏打ちしたシリカゲルプレート上で分離し、結合アッセイは実施例の「実験方法」の欄に記載した方法で実施した。レーンは次の通りである。レーン１：ガラクトシルセラミド（Galβ1Cer）、４μｇ；レーン２：非ヒドロキシセラミドを含有するラクトシルセラミド（Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン３：NeuGc-GM3（NeuGcα3Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン４：イソグロボトリアオシルセラミド（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；レーン５：ガングリオテトラオシルセラミド（Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ；及びレーン６：グロボシド（GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ1Cer）、４μｇ。オートラジオグラフィーは１２時間行った。

Claims (46)

  1. 下痢原性大腸菌及び人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌からなる群より選ばれる細菌によって生じる消化器系感染症の予防又は治療用の医薬組成物であって、該医薬組成物は下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖配列の精製画分を包含する医薬組成物であり、該医薬組成物が下記式（Ｉ）で表される病原体レセプターを１種だけ包含する場合にのみ、下記式（ＩＩ）で表される少なくとも１種のアルファ−ヘキソースレセプターを共に包含することを特徴とする医薬組成物。
    ［Ｓａｃｃｈ１］ｍ１Ｇａｌβｘ（Ｆｕｃα４）ｍ２Ｇｌｃ［ＮＡｃ］ｍ３［β３Ｇａｌ｛β４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎ１｝ｎ２］ｎ３［βＲ２］ｎ４ （Ｉ）
    （式中、ｘは３位又は４位の結合位置を表し；
    Ｓａｃｃｈ１はＧｌｃＮＡｃβ３、Ｇａｌα３、ＧａｌＮＡｃβ４、Ｇａｌα４又はＮｅｕ５Ｘα３／６であり、式中のＸはＡｃ又はＧｃであり；
    ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｍ１、ｍ２及びｍ３は各々独立に０又は１であるが、
    但し、ｘが３位、ｍ１が０、且つｍ３が１の場合にのみ、ｍ２は１でもよく、
    Ｓａｃｃｈ１がＮｅｕ５Ｘα３、Ｇａｌα３、ＧａｌＮＡｃβ４又はＧａｌα４である場合にのみ、ｍ３は０でもよく、ｎ４が１の場合には、ｍ３とｎ３は共に０であり、
    ｎ４が０の場合には、ｍ１、ｍ２及びｎ３のいずれかが１であり；
    Ｒ２は、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体であり；そして
    Ｓａｃｃｈ１がＧａｌα３又はＧａｌＮＡｃβ４であり、式（Ｉ）で表されるレセプターが少なくとも２種包含される場合には、レセプターは互いに式（Ｉ）中のＳａｃｃｈ１、ｘ、ｍ２及びｎ４から選ばれる少なくとも１種が異なり、２つのシアル酸レセプター又は２つのネオラクトレセプターが包含されることはない。）
    Ｈｅｘαｐ［（Ｈｅｘαｒ）］ｎＨｅｘ （ＩＩ）
    （式中、ＨｅｘはＧａｌ又はＭａｎであり、ｎは０又は１であり、ｐ及びｒはＭａｎ残基間の３位又は６位の結合位置を表すが、
    但し、ＨｅｘがＭａｎの場合には、ｐが３位でｒが６位であるか、ｐが６位でｒが３位であり、ＨｅｘがＧａｌの場合には、ｐが４位でｎは０であるが、この時、式（ＩＩ）で表されるレセプターが上記式（Ｉ）で表されるＧａｌα４Ｇａｌレセプターと共に包含されることはない。）
  2. 該オリゴ糖配列の末端活性化配列がＧａｌα４である場合には、該医薬組成物は部分エピトープであるＧａｌα４Ｇａｌを包含してもよく、所望により、下記式：
    Ｍａｎα３［（Ｍａｎα６）］ｎＭａｎ
    （式中、ｎは０又は１である。）
    で表されるオリゴ糖配列を含むマンノースレセプターを更に包含することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 該オリゴ糖配列が下記式（Ｉｂ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
    ［Ａ１］ｍ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ［βＡ２］ｎ４ （Ｉｂ）
    （式中、ｍ３及びｎ４は各々独立に０又は１であり；
    Ａ１は、ＧａｌＮＡｃβ４、Ｇａｌα４、Ｎｅｕ５Ｘα３、Ｎｅｕ５Ｘα６、ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３、ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３、Ｎｅｕ５Ｘα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３、Ｎｅｕ５Ｘα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３及びＧａｌβ３（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ３からなる群より選ばれる天然型非還元末端活性化配列であり、式中のＸはＡｃ又はＧｃであり；そして、
    Ａ２は、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体である。）
  4. 式（Ｉｂ）中のＡ１が、Ｇａｌα４、Ｎｅｕ５Ｘα３、Ｎｅｕ５Ｘα６、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３及びＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３からなる群より選ばれる配列であることを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 該オリゴ糖配列が下記式（Ｉｃ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
    ［Ｓａｃｃｈ１］ｍ１［Ｇａｌβｘ（Ｆｕｃα４）ｍ２ＧｌｃＮＡｃβ３］ｍ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ［βＡ２］ｎ４ （Ｉｃ）
    （式中、ｘは３位又は４位の結合位置を表し；
    Ｓａｃｃｈ１はＧｌｃＮＡｃβ３、Ｇａｌα３、ＧａｌＮＡｃβ４、Ｇａｌα４又はＮｅｕ５Ｘα３／６であり、式中のＸはＡｃ又はＧｃであり；
    ｎ４、ｍ１、ｍ２及びｍ３は各々独立に０又は１であるが、
    但し、ｘが３位の場合にのみ、ｍ２は１でもよく、
    Ｓａｃｃｈ１がＧｌｃＮＡｃβ３の場合には、ｍ３は１であり、ｘは４位であり、
    ｍ１が１の場合又はｎ４が１の場合にのみ、ｍ３は０でもよく、
    ｎ４が０の場合には、ｍ１又はｍ３が１であり；そして
    Ａ２は、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体であるが；
    但し、該医薬組成物が包含する少なくとも２種のレセプターは互いに式（Ｉｃ）中のＳａｃｃｈ１、ｘ、ｍ２及びｎ４から選ばれる少なくとも１種が異なる。）
  6. 該オリゴ糖配列が下記式（Ｉｄ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
    ［Ｓａｃｃｈ１］ｍ１［ＧａｌβｘＧｌｃＮＡｃβ３］ｍ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ （Ｉｄ）
    （式中、ｘは３位又は４位の結合位置を表し；
    Ｓａｃｃｈ１はＧａｌα４、Ｎｅｕ５Ｘα３又はＮｅｕ５Ｘα６であり、式中のＸはＡｃ又はＧｃであり；そして
    ｍ１及びｍ３は各々独立に０又は１であるが、但し、ｍ１又はｍ３が１であり；
    但し、該医薬組成物が包含する少なくとも２種のレセプターは互いに式（Ｉｄ）中のＳａｃｃｈ１及びｘから選ばれる少なくとも１種が異なる。）
  7. 該オリゴ糖配列が、Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、ＮｅｕＮＡｃα６Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＮＡｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ及びＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃからなる群より選ばれる配列であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. シアリル化オリゴ糖を含有するウシ乳の画分を、少なくとも一種の中性オリゴ糖と共に用いることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  9. 該オリゴ糖配列が、グロボオリゴ糖、ネオラクトオリゴ糖及びシアリルオリゴ糖からなる群より選ばれる２種の異なるオリゴ糖からなる混合物を含むことを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
  10. 下記式（Ｉｄ）で表される一価型のオリゴ糖を１つ用いることを特徴とする、毒素非産生性下痢原性大腸菌によって生じるヒト疾患に対する治療用医薬組成物の製造方法。
    ［Ｓａｃｃｈ１］ｍ１［ＧａｌβｘＧｌｃＮＡｃβ３］ｍ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ （Ｉｄ）
    （式中、ｘは３位又は４位の結合位置を表し；
    Ｓａｃｃｈ１はＧａｌα４、Ｎｅｕ５Ｘα３又はＮｅｕ５Ｘα６であり、式中のＸはＡｃ又はＧｃであり；そして
    ｍ１及びｍ３は各々独立に０又は１であるが、但し、ｍ１又はｍ３は１である。）
  11. 下痢原性大腸菌及び人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌からなる群より選ばれる細菌によって生じる消化器系感染症の予防又は治療用の医薬組成物であって、該医薬組成物は下記式（ａ）〜（ｈ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖配列の精製画分を包含することを特徴とする医薬組成物。
    （ａ） 下記式（Ｘ）で表されるラクトシルセラミドレセプター：
    Ｒ１ｘＧａｌβ４ＧｌｃβＲ２ （Ｘ）
    （式中、ｘは３位又は４位の結合位置を表し；
    Ｒ２は、ヒドロキシ脂肪酸を含むセラミド又はヒドロキシ脂肪酸を含むセラミドの類似体であり；そして、
    Ｒ１は、Ｇａｌα、Ｇａｌβ、ＧａｌＮＡｃβ、ＧｌｃＮＡｃβ、還元末端にＧａｌα、Ｇａｌβ、ＧａｌＮＡｃβ又はＧｌｃＮＡｃβを有する更に長いオリゴ糖、あるいはＮｅｕ５Ｘαであり、式中のＸはＡｃ又はＧｃであるが、但し、Ｒ１がＧｌｃＮＡｃβ又はＮｅｕ５Ｘαの場合には、ｘは３位を表す。）
    （ｂ） 下記式（ＸＩ）で表されるガングリオレセプター：
    ［Ｇａｌβ３］ｎ１ＧａｌＮＡｃ［β４Ｇａｌ｛β４Ｇｌｃ｝ｎ２］ｎ３ （ＸＩ）
    （式中、ｎ１、ｎ２及びｎ３は各々独立に０又は１であるが、但し、ｎ１又はｎ３は１であり、且つ、オリゴ糖配列にシアル酸は結合していない。）
    （ｃ） 下記式（ＸＩＩ）で表されるＧａｌα４Ｇａｌレセプター：
    ［ＧａｌＮＡｃβ３］ｎ１Ｇａｌα４Ｇａｌ｛β４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎ２｝ｎ３ （ＸＩＩ）
    （式中、ｎ１、ｎ２及びｎ３は各々独立に０又は１であり；そして
    ＧａｌＮＡｃ残基は、所望により、他の単糖残基により置換されている。）
    （ｄ） 下記式（ＸＩＩＩ）で表されるラクトレセプター：
    Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ［β３Ｇａｌ｛β４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎ１｝ｎ２］ｎ３ （ＸＩＩＩ）
    （式中、ｎ１、ｎ２及びｎ３は各々独立に０又は１である。）
    （ｅ） 下記式（ＸＩＶ）で表されるネオラクトレセプター：
    ［ＧｌｃＮＡｃβ３］ｎ１Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ［β３Ｇａｌ｛β４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎ２｝ｎ３］ｎ４ （ＸＩＶ）
    （式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は各々独立に０又は１であり、ｎ１が１の場合には、非還元末端ＧｌｃＮＡｃは単糖残基又はオリゴ糖によって置換することができる。）
    （ｆ） 下記式（ＸＶ）で表されるフコシルレセプター：
    Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ［β３Ｇａｌ｛β４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎ１｝ｎ２］ｎ３ （ＸＶ）
    （式中、ｎ１、ｎ２、及びｎ３は各々独立に０又は１である。）
    （ｇ） 下記式（ＸＶＩ）で表されるシアル酸レセプター：
    Ｎｅｕ５ＸαｐＧａｌβｒ［（Ｆｕｃαｓ）］ｎ１Ｇｌｃ（ＮＡｃ）ｎ２ （ＸＶＩ）
    （式中、ＸはＡｃ又はＧｃであり、従ってシアル酸残基はＮｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃであり；
    ｎ１及びｎ２は各々独立に０又は１であり；
    ｐは３位又は６位の結合位置を表し；そして
    ｒ及びｓはいずれも３位又は４位の結合位置を表すが、但し、ｒが３位である場合にはｓは４位であり、ｒが４位である場合にはｓは３位である。）
    （ｈ） 下記式（ＸＶＩＩ）で表されるマンノースレセプター：
    Ｍａｎαｐ［（Ｍａｎαｒ）］ｎ１Ｍａｎ （ＸＶＩＩ）
    （式中、ｎ１は０又は１であり；そして
    ｐ及びｒはＭａｎ残基間の３位又は６位の結合位置を表すが、但し、ｐが３位である場合にはｒは６位であり、ｐが６位である場合にはｒは３位である。）
  12. 該ラクトシルセラミドレセプター（ａ）が、ラクトシルセラミド、ヒドロキシ脂肪酸を含むラクトシルセラミド、３位炭素原子が修飾されたガラクトース残基を有するラクトシルセラミド及びイソグロボトリアオシルセラミドからなるレセプターオリゴ糖配列群より選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 該ガングリオレセプター（ｂ）が、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌβ４Ｇｌｃからなるレセプターオリゴ糖配列群より選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 該Ｇａｌα４Ｇａｌレセプター（ｃ）が、Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌα４Ｇａｌからなるレセプターオリゴ糖配列群より選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  15. 該ラクトレセプター（ｄ）を表す式（ＸＩＩＩ）において、ｎ３が１であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  16. 該ラクトレセプター（ｄ）が、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃからなるレセプターオリゴ糖配列群より選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  17. 該ネオラクトレセプター（ｅ）を表す式（ＸＩＶ）において、還元末端ＧｌｃＮＡｃが単糖残基Ｇａｌβ４又はオリゴ糖ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４で置換されているか、あるいはｎ１又はｎ４が１であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  18. 該ネオラクトレセプター（ｅ）が、ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ及びＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃからなるレセプターオリゴ糖配列群より選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  19. 該フコシルレセプター（ｆ）を表す式（ＸＶ）において、ｎ３が１であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  20. 該フコシルレセプター（ｆ）が、ルイスａ構造を有するレセプターオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  21. 該ルイスａ構造を有するオリゴ糖配列が、Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃからなるオリゴ糖配列群より選ばれることを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 該シアル酸レセプター（ｇ）が、Ｎｅｕ５Ｘα３Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ構造、Ｎｅｕ５Ｘα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ構造、Ｎｅｕ５Ｘα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）Ｇｌｃ構造、Ｎｅｕ５Ｘα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ構造、Ｎｅｕ５Ｘα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ構造、Ｎｅｕ５Ｘα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ構造、Ｎｅｕ５Ｘα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ構造又はＮｅｕ５Ｘα６Ｇａｌβ４Ｇｌｃ構造を有するオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  23. 該マンノースレセプター（ｈ）が、Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎ結合体であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  24. 該オリゴ糖配列の少なくとも一種が、一価の型であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  25. 該オリゴ糖配列の少なくとも一種が、多価の担体に結合していることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  26. 一価型のオリゴ糖配列が、グリコシルアミン、グリコシルアミド、メチルグリコシド、並びに他のＮ−グリコシド、Ｃ−グリコシド及びＳ−グリコシドを含むグリコシド類から選ばれる１種であることを特徴とする、請求項２４に記載の医薬組成物。
  27. 該多価の担体が、炭水化物担体又は粒状担体であることを特徴とする、請求項２５に記載の医薬組成物。
  28. 該炭水化物担体が可溶性であることを特徴とする、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 該炭水化物担体が、レセプターオリゴ糖配列を含む細菌由来の多糖又はその部分であることを特徴とする、請求項２７又は２８に記載の医薬組成物。
  30. 該粒状担体が、炭水化物粒子、合成樹脂粒子又は細胞であることを特徴とする、請求項２７に記載の医薬組成物。
  31. 該炭水化物担体が、抗原性又は免疫促進性の炭水化物結合体であることを特徴とする、請求項２７に記載の医薬組成物。
  32. 該オリゴ糖配列が、免疫細胞又は免疫防御タンパク質に病原体を結合しうるものであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
  33. 該感染症が、ＥＰＥＣ（腸管病原性大腸菌）、ＥＴＥＣ（毒素原性大腸菌）、ＥＨＥＣ（腸管出血性大腸菌）、ＥＩＥＣ（腸管侵入性大腸菌）又はＥＡＥＣ（腸管凝集性大腸菌）によるものであることを特徴とする、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. 該感染症の病因を診断していないことを特徴とする、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 少なくとも２種のオリゴ糖配列の精製画分を包含する組成物を用いた、下痢原性大腸菌及び人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌からなる群より選ばれる細菌によって生じる消化器系感染症の予防又は治療用薬剤の製造方法であって、該オリゴ糖配列は請求項１に記載の式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される病原体レセプターからなる群より選ばれるオリゴ糖配列であり、式（Ｉ）で表される病原体レセプターを１種だけ用いる場合にのみ、式（ＩＩ）で表される少なくとも１種のアルファ−ヘキソースレセプターを共に用いることを特徴とする製造方法。
  36. 該医薬組成物をヒトの治療に用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
  37. 該医薬組成物を動物の治療に用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
  38. Ｆｕｃα２Ｇａｌ、Ｆｕｃα３ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα３Ｇｌｃ、ＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３／４ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）Ｇｌｃ、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３／４（Ｆｕｃα４／３）ＧｌｃＮＡｃ及びガングリオ系ガングリオシドからなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴ糖配列を含むオリゴ糖を更に包含することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
  39. 請求項１１に記載の式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）及び（ＸＶ）でそれぞれ表される病原体レセプター（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖配列を包含する、患者の胃腸管にＥＨＥＣ（腸管出血性大腸菌）が存在することによって生じる下痢の予防又は治療用の医薬組成物。
  40. 請求項１１に記載の式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＶ）及び（ＸＶＩ）でそれぞれ表される病原体レセプター（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｇ）からなる群より選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖配列を包含する、患者の胃腸管にＥＰＥＣ（腸管病原性大腸菌）が存在することによって生じる下痢の予防又は治療用の医薬組成物。
  41. 請求項１１に記載の式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）及び（ＸＶＩ）でそれぞれ表される病原体レセプター（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）からなる群より選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖配列を包含する、患者の胃腸管にＥＴＥＣ（毒素原性大腸菌）が存在することによって生じる下痢の予防又は治療用の医薬組成物。
  42. 請求項１１に記載の式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶＩ）及び（ＸＶＩＩ）でそれぞれ表される病原体レセプター（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）及び（ｈ）からなる群より選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖配列を包含する、患者の胃腸管にＥＡＥＣ（腸管凝集性大腸菌）が存在することによって生じる下痢の予防又は治療用の医薬組成物。
  43. 請求項１１に記載の式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）及び（ＸＶＩＩ）でそれぞれ表される病原体レセプター（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）からなる群より選ばれる少なくとも２種のオリゴ糖配列を包含する、患者の胃腸管にＥＩＥＣ（腸管侵入性大腸菌）が存在することによって生じる下痢の予防又は治療用の医薬組成物。
  44. 請求項１〜９のいずれかの医薬組成物を、生体外における病原体の非診断的な阻害又は凝集に用いる方法であって、該病原体が下痢原性大腸菌及び人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌からなる群より選ばれる細菌であることを特徴とする方法。
  45. 該医薬組成物の包含するオリゴ糖配列の１つが、Ｍａｎα、ＮｅｕＮＡｃα、Ｇａｌβ、Ｇａｌα、Ｆｕｃα及びＧｌｃＮＡｃβからなる群より選ばれる非還元ピラノース型単糖残基を含み、且つ、該オリゴ糖配列に対応する部分オリゴ糖配列で置換されていることを特徴とする、請求項１〜３４及び３６〜３８のいずれかに記載の医薬組成物。
  46. シアル酸オリゴ糖配列を含む組成物を用いた、下痢原性大腸菌及び人畜共通感染性ヘリコバクター属細菌からなる群より選ばれる細菌によって生じる消化器系感染症の予防又は治療用の薬剤の製造方法であって、該シアル酸オリゴ糖配列はＮｅｕ５ＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃ及びＮｅｕ５ＮＡｃα９ＮｅｕＮＡｃからなる群より選ばれ、該シアル酸オリゴ糖の少なくとも９５％が１０シアル酸残基未満のオリゴ糖であることを特徴とする方法。
JP2004516828A 2002-06-28 2003-06-30 下痢の予防又は治療用の医薬組成物 Expired - Fee Related JP5219329B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20021275A FI20021275A0 (fi) 2002-06-28 2002-06-28 Terapeuttiset koostumukset käytettäväksi ripulien ehkäisyyn tai hoitoon
FI20021275 2002-06-28
FI20030564 2003-04-14
FI20030564A FI20030564A0 (fi) 2003-04-14 2003-04-14 Zoonoottisia Helicobacter-lajeja sitovia aineita ja niiden käyttö
PCT/FI2003/000528 WO2004002495A1 (en) 2002-06-28 2003-06-30 Therapeutic compositions for use in prophylaxis or treatment of diarrheas

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2006506329A JP2006506329A (ja) 2006-02-23
JP2006506329A5 JP2006506329A5 (ja) 2006-08-10
JP5219329B2 true JP5219329B2 (ja) 2013-06-26

Family

ID=30001920

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004516828A Expired - Fee Related JP5219329B2 (ja) 2002-06-28 2003-06-30 下痢の予防又は治療用の医薬組成物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20060014717A1 (ja)
EP (2) EP2272522B1 (ja)
JP (1) JP5219329B2 (ja)
AT (1) ATE428430T1 (ja)
AU (1) AU2003242799A1 (ja)
DE (1) DE60327211D1 (ja)
DK (1) DK1531832T3 (ja)
ES (1) ES2649736T3 (ja)
IN (1) IN2004KO01960A (ja)
WO (1) WO2004002495A1 (ja)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002952121A0 (en) * 2002-10-17 2002-10-31 Alchemia Limited Novel carbohydrate based anti-bacterials
JP2006516572A (ja) 2003-01-14 2006-07-06 アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 代謝モジュレーターとしての１，２，３−トリ置換アリール誘導体および１，２，３−トリ置換ヘテロアリール誘導体ならびにこれらの誘導体に関連する糖尿病および高血糖のような障害の予防および処置
JP4920410B2 (ja) 2003-07-14 2012-04-18 アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 代謝モジュレーターとしての縮合アリールおよびヘテロアリール誘導体ならびに代謝に関連する障害の予防および治療
GB0321996D0 (en) * 2003-09-19 2003-10-22 Novartis Nutrition Ag Organic compounds
BRPI0415385A (pt) † 2003-10-13 2006-12-12 Nestec Sa moderação do efeito de endotoxinas
EP1634599A1 (en) 2004-08-20 2006-03-15 N.V. Nutricia Iimmune stimulatory infant nutrition
EP1629850B2 (en) 2004-08-24 2013-05-22 N.V. Nutricia Nutritional composition comprising indigestible transgalactooligosaccharides and digestible galactose saccharides
MY148521A (en) 2005-01-10 2013-04-30 Arena Pharm Inc Substituted pyridinyl and pyrimidinyl derivatives as modulators of metabolism and the treatment of disorders related thereto
US8361530B2 (en) 2006-02-10 2013-01-29 Nestec S.A. Oligosaccharide mixture
US20080208486A1 (en) * 2006-03-23 2008-08-28 Jari Natunen Integrated System, Device and Use Thereof
JP5077623B2 (ja) * 2006-03-30 2012-11-21 Ｄｉｃ株式会社 カシュー油変性固形フェノール樹脂の製造方法とゴム組成物
WO2007120478A2 (en) * 2006-04-03 2007-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Glycomic patterns for the detection of disease
FI20060946A0 (fi) * 2006-10-26 2006-10-26 Glykos Finland Oy Influenssaviruksen nukleiinihappoja ja peptidejä
FI20065800A0 (fi) * 2006-12-13 2006-12-13 Glykos Finland Oy Polyvalentit biokonjugaatit
FI20075030A0 (fi) * 2007-01-18 2007-01-18 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solujen modifioimiseksi
WO2009052182A1 (en) 2007-10-15 2009-04-23 Jbs United, Inc. Method for increasing performance of offspring
FI20070471A0 (fi) * 2007-06-13 2007-06-13 Glykos Finland Oy Ravinnelisäkompositiota
US20100196539A1 (en) * 2007-06-25 2010-08-05 Albertus Alard Van Dijk Novel prebiotics
WO2009033011A1 (en) 2007-09-07 2009-03-12 Children's Hospital Medical Center Use of secretor, lewis and sialyl antigen levels as predictors for disease
WO2009060073A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-14 Nestec S.A. Use of oligosaccharides containing n-acetyllactosamine for maturation of immune responses in neonates
ES2658837T3 (es) * 2008-03-14 2018-03-12 Nestec S.A. Mezcla simbiótica
EP2143341A1 (en) 2008-07-08 2010-01-13 Nestec S.A. Nutritional Composition Containing Oligosaccharide Mixture
US8586029B2 (en) * 2008-06-04 2013-11-19 Trustees Of Dartmouth College Prevention or treatment of immune-relevant disease by modification of microfloral populations
GB0817908D0 (en) * 2008-10-01 2008-11-05 Univ Ghent Blood group a/b/h determinant on type 1 core glycosphinglipids chain as recognition point for the fedf protein of f18-fimbriated enterotoxigenic
EP2345656B1 (en) * 2008-10-10 2018-05-02 The Noguchi Institute N-acetylglucosaminyl beta-linked monosaccharide derivative as a helicobacter pylori bacterium proliferation inhibitor
FI20080665A0 (fi) 2008-12-18 2008-12-18 Glykos Finland Oy Luonnollisen tyyppiset sakkaridikoostumukset
US8580278B2 (en) 2009-06-03 2013-11-12 Trustees Of Dartmouth College Nutraceutical composition and methods for preventing or treating multiple sclerosis
US20100311686A1 (en) * 2009-06-03 2010-12-09 Kasper Lloyd H Nutraceutical composition and methods for preventing or treating multiple sclerosis
FI20105824A0 (fi) * 2010-07-26 2010-07-26 Suomen Punainen Risti Veripalv Veriryhmästatuksen käyttö IV
CA2812061A1 (en) 2010-09-22 2012-03-29 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto
WO2012092153A1 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Abbott Laboratories Nutritional compositions comprising human milk oligosaccharides and nucleotides and uses thereof for treating and/or preventing enteric viral infection
WO2012112716A1 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Therapeutic use of mucin glycans
US9567361B2 (en) * 2011-05-13 2017-02-14 Glycosyn LLC Use of purified 2′-fucosyllactose, 3-fucosyllactose and lactodifucotetraose as prebiotics
US9539281B2 (en) 2011-07-12 2017-01-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-containing PSA compositions, methods of isolation and methods of use thereof
WO2013164652A2 (en) * 2012-05-04 2013-11-07 Ineb-Instituto De Engenharia Biomédica Microspheres
WO2014130789A1 (en) 2013-02-21 2014-08-28 Children's Hospital Medical Center Use of glycans and glycosyltransferases for diagnosing/monitoring inflammatory bowel disease
EP2857410A1 (en) 2013-10-04 2015-04-08 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for purification of 2´-fucosyllactose using simulated moving bed chromatography
CN103622901B (zh) * 2013-11-21 2016-01-20 广州立白企业集团有限公司 一种能调节皮肤微生态平衡的皮肤清洁剂组合物及其制备方法
CA2954662C (en) 2014-07-09 2024-03-19 Midori Usa, Inc. Oligosaccharide compositions and methods for producing thereof
MX2017001815A (es) 2014-08-08 2017-05-23 Glycovaxyn Ag Celulas hospederas modificadas y oligosacaridos hibridos para su uso en produccion de bioconjugados.
EP3242666A1 (en) 2015-01-06 2017-11-15 Arena Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating conditions related to the s1p1 receptor
PT3071235T (pt) 2015-01-26 2018-02-21 Kaleido Biosciences Inc Produtos terapêuticos de glicanos e respetivos métodos relacionados
US9492473B2 (en) * 2015-01-26 2016-11-15 Kaleido Biosciences, Inc. Glycan therapeutics and related methods thereof
ES2755042T3 (es) 2015-01-26 2020-04-21 Cadena Bio Inc Composiciones de oligosacáridos para el uso como alimento para animales y sus métodos para producirlas
DE202016008919U1 (de) 2015-03-05 2020-09-07 Société des Produits Nestlé S.A. Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von gastrointestinalen Infektionen/Entzündungen bei Säuglingen oder Kleinkindern
MX2017010923A (es) 2015-03-05 2018-01-16 Nestec Sa Composiciones para usar en el mejoramiento de la consistencia o la frecuencia de las heces en infantes o niños pequeños.
WO2016172657A2 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Kaleido Biosciences, Inc. Glycan therapeutics and methods of treatment
EP3288389A4 (en) 2015-04-28 2018-10-10 Children's Hospital Medical Center Use of oligosaccharide compositions to enhance weight gain
CN108349891B (zh) 2015-06-22 2022-04-05 艾尼纳制药公司 用于s1p1受体相关病症的化合物的结晶l-精氨酸盐
JP6918365B2 (ja) 2015-08-19 2021-08-11 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 脂質化ｐｓａ組成物および方法
CN105410913B (zh) * 2015-12-01 2018-06-01 辽宁三合酒业有限公司 一种壳寡糖口腔清洁含片的制备方法
WO2018014012A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 President And Fellows Of Harvard College Glycolipid compositions and methods of use
CN109562117A (zh) 2016-08-04 2019-04-02 雀巢产品技术援助有限公司 具有2FL和LNnT的营养组合物，用于通过作用于肠道微生物群生态失调来预防和/或治疗非轮状病毒腹泻
US11534424B2 (en) 2017-02-16 2022-12-27 Arena Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for treatment of primary biliary cholangitis
CN108018805B (zh) * 2017-12-31 2018-12-04 江苏来德福汽车部件有限公司 一种太阳能的智能移动护栏
EP3833195A1 (en) * 2018-08-08 2021-06-16 Mars Incorporated Pet food products comprising oligosaccharides and methods of use
CN109212227B (zh) * 2018-09-07 2021-07-16 深圳格道糖生物技术有限公司 基于唾液特异糖蛋白糖链结构的肝病/肝硬化相关筛查、评估的产品及应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5217715A (en) * 1988-08-01 1993-06-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Carbohydrate receptor for bacteria and method for use thereof
US5225330A (en) * 1988-08-01 1993-07-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic kit and diagnostic method utilizing carbohydrate receptors
MX9304638A (es) * 1992-07-31 1994-05-31 Neose Pharm Inc Composicion para tratar e inhibir las ulceras gastricas y duodenales.
CA2171614C (en) * 1994-07-15 2008-04-15 Mamoru Koketsu Pharmaceutical composition containing sialic acid derivatives
US5627163A (en) * 1995-06-05 1997-05-06 Synsorb Biotech, Inc. Treatment of traveller's diarrhea
US6045854A (en) * 1997-03-31 2000-04-04 Abbott Laboraties Nutritional formulations containing oligosaccharides
NL1010770C2 (nl) * 1998-12-09 2000-06-13 Nutricia Nv Preparaat dat oligosacchariden en probiotica bevat.
US6291435B1 (en) * 1999-03-04 2001-09-18 The Governs Of The University Of Alberta Treatment of diarrhea caused by enteropathogenic Escherichia coli
SE9904581D0 (sv) * 1999-12-15 1999-12-15 A & Science Invest Ab A novel helicobacter pylori-binding substance and use thereof
FI20010118A (fi) * 2001-01-19 2002-07-20 Carbion Oy Uudet helicobacter pylori reseptorit ja niiden käyttö
EP1411952B1 (en) * 2001-06-29 2009-04-22 Glykos Finland Oy Use of at least one glycoinhibitor substance against infectious diseases

Also Published As

Publication number Publication date
EP2272522A2 (en) 2011-01-12
WO2004002495A1 (en) 2004-01-08
EP2272522A3 (en) 2011-04-20
ES2649736T3 (es) 2018-01-15
US20060014717A1 (en) 2006-01-19
IN2004KO01960A (ja) 2006-07-21
DE60327211D1 (de) 2009-05-28
EP2272522B1 (en) 2017-09-06
JP2006506329A (ja) 2006-02-23
EP1531832B1 (en) 2009-04-15
AU2003242799A1 (en) 2004-01-19
ATE428430T1 (de) 2009-05-15
EP1531832A1 (en) 2005-05-25
DK1531832T3 (da) 2009-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5219329B2 (ja) 下痢の予防又は治療用の医薬組成物
Kobata Structures and application of oligosaccharides in human milk
Newburg Oligosaccharides and glycoconjugates in human milk: their role in host defense
EP1411952B1 (en) Use of at least one glycoinhibitor substance against infectious diseases
JP2006506329A5 (ja)
AU2002229792B2 (en) Novel receptors for Helicobacter pylori and use thereof
Kelly et al. Nutritional influences on interactions between bacteria and the small intestinal mucosa
AU2002229792A1 (en) Novel receptors for Helicobacter pylori and use thereof
US20060122148A1 (en) High affinity receptors for helicobacter pylori and use thereof
US20050220819A1 (en) Novel binding epitopes for helicobacter pylori and use thereof
WO2004065400A1 (en) Novel binding epitopes for helicobacter pylori and use thereof
Hotchkiss et al. Intestinal infections and prebiotics: the role of oligosaccharides in promoting health
Mossine et al. Food-related carbohydrate ligands for galectins
Hueso et al. Role of milk carbohydrates in preventing bacterial adhesion
Natunen Use of at least one glycoinhibitor substance
Yan Structure and Function Relationships of Galactosylated Oligosaccharides and Their Anti-adhesive Effects Against Enterotoxigenic Escherichia coli K88
Hickey Harnessing milk oligosaccharides for nutraceutical applications
Divya et al. Impact Of Human Milk Oligosaccharide (HMO) In Neonates
Quintero ADHERENCE INHIBITION OF ADHERENCE INHIBITION OF CRONOBACTER SAKAZAKII CRONOBACTER SAKAZAKII AND OTHER PATHOGENS BY PREBIOTIC OLIGOSACCHARIDES, PLANT EXTRACTS, AND OTHER NATURALLY DERIVED MOLECULES
Quintero Adherence Inhibition of Cronobacter Sakazakii and Other Pathogens by Prebiotic Oligosaccharides, Plant Extracts, and Other Naturally Derived Molecules

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060622

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060622

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100531

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100825

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100901

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110830

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20111129

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20111129

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20111219

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120724

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20121017

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20121204

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20121221

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130226

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130305

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160315

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees