CN101768583B - 以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法与应用，以强化自然湿地对石油污染水体的净污能力，其特征在于首先是用被石油污染的土壤筛选出石油降解菌种；然后以上述菌种制备石油降解菌菌悬液；最后取配制好的石油降解菌菌悬液加入海藻酸钠，混合后均匀地喷洒到芦苇秸秆上5小时后达到固定化，或将菌悬液加入海藻酸钠与粉碎后的芦苇秸秆，再滴入饱和氯化钙溶液而制成硬化的颗粒以达到固定化。以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法应用于受石油污染的大面积湿地水体的生物净化。本发明具有材料来源广泛、工艺简单、费用低、净化效果好，易于批量生产，降解效果显著，可在芦苇湿地大面积推广使用。

Description

以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法与应用
技术领域
本发明属于微生物固定化技术领域，具体涉及以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法与应用。
背景技术
随着我国经济和社会的不断发展，我国多数地表水都受到不同程度的污染，严重影响人们的正常生产生活。特别是由于石油污染物的很多成份具有难降解的特性，石油污染对水环境的影响更加严重。关于水体中石油污染物的去除，目前使用较多的是采用人工湿地对受污染水体进行生物净化的方法。
生物净化法是利用水生植物对污染物质的吸收、吸附功能以及微生物的降解作用，采用人工措施来创造更有利于水生植物或微生物生长繁殖的环境，培育出大量具有高效净化能力的水生植物或微生物，以提高对污染水体中有机物的降解效率。
应用湿地净化污染水体大多采用人工湿地的方法，但其运行费用很高。我国自然湿地面积大、分布广，如能合理利用，既可以净化水体，又可以节约人力和物力。但由于技术问题，自然湿地净化污染水体的应用还比较少。自然湿地净污主要是利用湿地土壤的吸附作用、湿地植物的吸收作用及其植物根际微生物的降解作用。在自然条件下，湿地的净污能力十分有限，尤其是针对特殊污染物的降解。因此必须采取有效措施提高自然湿地对某些特殊污染物的生物降解能力。
微生物固定化技术是通过采用化学或物理的方法将游离微生物固定于限定空间区域内，既能使其对污染物的降解能力增强，又可反复使用。微生物的固定化载体可以分为化学载体和天然载体，化学载体如海藻酸钠、活性炭，固定化的成本比较高，难以大面积投产使用，而直接利用天然载体比如植物秸秆，则处理效率较低。目前石油降解菌固定化方法多数直接采用昂贵的化学载体和低效的天然载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法与应用，以解决目前石油生物降解中成本高或效率低的技术问题。
本发明将石油严重污染的湿地土壤中的石油降解菌分离，并固定在芦苇秸秆与海藻酸钠相结合的复合载体表面。
具体方法如下：1、石油降解菌的筛选、分离及纯化，2、石油降解菌菌悬液的制备，3、石油降解菌的固定化。
1、石油降解菌的筛选、分离及纯化
将石油污染的土壤10g放入250mL锥形瓶中，用100mL无菌生理盐水充分混匀，静置待固液分离；取其上清液1mL加入液体富集培养基中，在30℃、120r/min的条件下于振荡培养箱中培养7～10天；待培养液混浊后，吸取1mL培养液注入新的液体富集培养基中，重复上述驯化、富集至少三次以完成石油降解菌的筛选；取上述富集培养菌液划线接种于固体富集培养基中，在30℃下进行恒温培养，得到分离、纯化的石油降解菌株。
2、石油降解菌菌悬液的制备
将上述筛选、分离、纯化的石油降解菌接种于液体富集培养基中，在120r/min、30℃条件下培养5天，且培养基中石油降解菌的数量达到3.0×106个/mL以上。
液体富集培养基成分：柴油1g/L，NaNO33.0g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.001g/L，CaCl20.002g/L，且pH 7.0-7.2；固体富集培养基是在上述液体富集培养基中加入15g/L琼脂。
3、石油降解菌的固定化
(1)直接喷洒于芦苇秸秆的固定化方法：
a、芦苇秸秆的预处理：将在湿地采集的芦苇秸秆晒干，加工成5-10cm长，用无菌水洗净，晾干。
b、固定化：将上述预处理后的芦苇秸秆均匀平铺于无菌容器中，取步骤2中的石油降解菌菌悬液，加入0.2％的海藻酸钠，溶解后均匀地喷洒到芦苇秸秆表面，静置5小时达到固定化。
考虑到直接喷洒的固定方法效率低，可将复合载体做成球状颗粒，以提高石油降解菌的降解效率，具体步骤如下：
(2)将石油降解菌固定化于芦苇秸秆复合载体颗粒的方法：
a、将洗净、晾干的芦苇秸秆粉碎，用直径为0.1mm的筛子过筛，取20g过筛粉末加入900mL蒸馏水中，加入海藻酸钠20g，煮沸消毒5分钟，冷却后用无菌蒸馏水定容至900mL，再加入步骤2的石油降解菌菌悬液100mL，得到固定化于芦苇秸秆与海藻酸钠复合载体的石油降解菌菌液。
b、将上述菌液滴入CaCl2饱和溶液中，制成粒径为5-10mm的石油降解菌固定化载体颗粒，在0-4℃下放置1小时使其硬化即可使用。
以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法应用于自然湿地的石油污染物生物净化。
本发明具有材料来源广泛、工艺简单，生产费用低，净化效果好，易于批量生产，可用于大面积芦苇湿地石油污染生物净化的推广使用等优点。
具体实施方式
本发明根据辽河河口湿地普遍受到石油污染的实际情况，以该河口区大量生长的芦苇秸秆为载体，以自现场湿地石油污染土壤为菌种来源，并进行驯化、筛选、分离、纯化，获得耐盐型石油降解菌，再将其固定化在芦苇秸秆与海藻酸钠相结合的复合载体上。
实施例1
本发明包括三个步骤：1、石油降解菌的筛选、分离及纯化，2、石油降解菌菌悬液的制备，3、石油降解菌的固定化。
1、石油降解菌的筛选及分离、纯化具体步骤如下：
将石油污染的土壤10g，放入250mL锥形瓶，用100mL生理盐水充分混匀，静置待固液分离；取其上清液1mL加入液体富集培养基中，在30℃、120r/min的条件下于振荡培养箱中培养7～10天；待培养液混浊后，吸取1mL液体注入新的液体富集培养基中，重复上述驯化、富集至少三次以完成石油降解菌的筛选；取上述富集培养液划线转接入固体富集培养基中，在30℃下进行恒温培养，得到纯化的石油降解菌株。
2、制备石油降解菌菌悬液的具体步骤如下：
将上述纯化的石油降解菌接种于液体富集培养基中，在120r/min、30℃条件下培养5天，确定石油降解菌数量在3.0×106个/mL以上。
液体富集培养基成分：柴油1g/L，NaNO33.0g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.001g/L，CaCl20.002g/L，且pH 7.0-7.2。固体富集培养基是在上述液体富集培养基中加入15g/L琼脂。
3、直接喷洒于芦苇秸秆的固定化方法具体步骤如下：
a、芦苇秸秆的预处理：将在湿地采集的芦苇秸秆晒干，加工成5-10cm长，用无菌水洗净，晾干。
b、固定化：将上述处理过的芦苇秸秆均匀平铺于无菌容器中，取步骤2的石油降解菌菌悬液，加入0.2％的海藻酸钠，溶解后均匀地喷洒到芦苇秸秆表面，静置5小时达到固定化。
实施例2
为了提高固定化之后的石油降解菌的降解效率，可将载体制作成球状颗粒，以增大与受污染水体的接触面积。本发明的第二个实施例，其步骤1、2同实施例1，其步骤3如下：
芦苇秸秆复合载体颗粒的固定化方法：
a、将洗净、晾干的芦苇秸秆粉碎，用直径为0.1mm的筛子过筛，取20g过筛粉末加入900mL蒸馏水中，加入海藻酸钠20g，煮沸消毒5分钟，冷却后用无菌蒸馏水定容至900mL，再加入步骤2的石油降解菌菌悬液100mL，得得到固定化于芦苇秸秆与海藻酸钠复合载体的石油降解菌菌液。
b、将上述固定化菌液滴入CaCl2饱和溶液中，制成粒径为5-10mm的石油降解菌固定化载体颗粒，在0-4℃下放置1小时使其硬化即可使用。
为了便于保存，批量生产之后可用无菌水将上述硬化的颗粒冲洗、装袋、密封，低温保存待用。
将实施例1、2中的以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法应用于受石油污染的大面积湿地水体的生物净化。
可以将培养好的石油降解菌菌悬液加入0.2％的海藻酸钠，然后直接喷洒在芦苇秸秆上；或者取硬化的颗粒直接向湿地芦苇区播撒，如：
取石油降解菌浓度为3.82×106个/mL悬浊液50mL，加入0.1g海藻酸钠，混合均匀后均匀地喷洒到芦苇秸秆上，固定化5小时后，将石油降解菌固定化载体浸入辽河河口石油污染水中。在室温16℃条件下20天后，石油降解菌固定化载体对微污染水的净化效果为57％。
在受石油污染的水中撒入实施例2的颗粒50g，在室温16℃条件下10天后，对石油微污染水的净化效果为58％；20天后对石油微污染水的净化效果为71％。
可见，采用本发明的净化效果显著。

Claims (2)

1.一种以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法，首先对石油降解菌进行筛选、分离和纯化，然后制备石油降解菌菌悬液，其特征在于是将石油降解菌固定于芦苇秸秆上，所述的石油降解菌的固定方法如下1)或2)两种方法：
1)的方法包括如下步骤：
a、芦苇秸秆的预处理：将在湿地采集的芦苇秸秆晒干，加工成5-10cm长，用无菌水洗净，晾干；
b、固定化：将上述处理过的芦苇秸秆均匀平铺于无菌容器中，取浓度为3.0×106个/mL以上的石油降解菌菌悬液，加入0.2％的海藻酸钠，溶解后均匀地喷洒到芦苇秸秆表面，静置5小时达到固定化；
2)的方法包括如下步骤：
a、将洗净、晾干的芦苇秸秆粉碎，用直径为0.1mm的筛子过筛，取20g过筛粉末加入900mL蒸馏水中，加入海藻酸钠20g，煮沸消毒5分钟，冷却后用无菌蒸馏水定容至900mL，再加入浓度为3.0×106个/mL以上的石油降解菌菌悬液100mL，得到固定化于芦苇秸秆与海藻酸钠复合载体的石油降解菌菌液；
b、将上述石油降解菌液滴入CaCl2饱和溶液中，制成粒径为5-10mm的石油降解菌固定化载体颗粒，在0-4℃下放置1小时使其硬化即可。
2.权利要求1所述的以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法的用途，其特征在于所述固定化方法应用于受石油污染的大面积湿地水体的生物净化。
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