CN101766826B - 一种具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法，发明属于生物医学领域，使用肝靶向化合物和葡聚糖反应制备肝靶向化合物修饰的葡聚糖，并与铁盐和亚铁盐水溶液反应制备具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子。这种四氧化三铁纳米粒子用于MRI核磁共振造影，可以显著提高四氧化三铁纳米粒子在肝脏内的累积。
Description
技术领域
本发明涉及一种四氧化三铁纳米粒子的制备方法，尤其是一种具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的的制备方法，属于生物医学工程领域。
背景技术
20世纪80年代中期，基于肝脏的诸多功能和特殊组成成份，研究人员开始寻找能在肝组织内滞留时间更长、以肝脏组织细胞为特殊靶器官、同时又不被肝脏生物摄取的肝脏特异性对比剂。国内武汉大学、兰州大学、南方医科大学、华东师范大学、华中科技大学等单位在这方面做了很多不错的工作，主要集中在Gd水溶性聚合物的合成和超顺磁性氧化铁(SPIO，superparamagnetic iron oxide)被动靶向纳米粒子表面包覆层的制备。
SPIO对比剂具有很好的肝脏造影效果，商品名叫做菲立磁。SPIO对比剂通过肝脏吞噬细胞的吞噬作用来实现对肝脏特异性诊断，实现很好的被动靶向作用。SPIO注射剂量的80％以上可以分布于肝，检出特异度可高达99％。SPIO不仅有助于提高肝脏微小瘤灶的MRI检出水平，也有助于对良性、恶性肿瘤作出定性判断，还提高了肝炎、肝硬化等弥散性肝病的检出敏感性。大量动物实验和临床研究表明，SPIO能成功地检出以往未能检出的微小病灶，进一步提高了恶性病灶的检出率。SPIO粒子可有效地缩短组织的T2值，使组织信号降低，提供较长的扫描时间窗(1-4h)，而且SPIO粒子在被吞噬细胞吞噬后，运送到溶酶体分解，成为机体内的储备铁，释放的铁可与血红蛋白结合。虽然SPIO具有很高的肝脏显影效果，但由于其价格昂贵，在快速注射时有很明显的副反应，临床试验报道的副作用发生率达6.1％-15％，现在国内使用SPIO的已经很少。SPIO副作用的产生原因尚不清楚，有学者指出可能与巨噬细胞的调理素有关，需进一步研究。目前关于SPIO的研究仍主要集中在聚合物包覆方面，通过改变粒子的粒径和表面电荷来降低其毒副作用，其作用机理仍是被动靶向作用。有研究者以单克隆抗体或RGD肽为靶向基团，修饰超顺磁性氧化铁进行肝脏疾病的诊断，研究结果表明，通过抗体或肽类化合物的主动靶向作用，可以明显降低其毒副作用。但抗体和肽类化合物修饰效率较低，成本昂贵，难以大规模应用。而且目前的抗体主要是鼠源性抗体，安全性成为其首要问题。文献中关于采用小分子化合物受体介导的SPIO肝靶向的研究报道不多。值得一提的是以上文献中报道的方法所制备的纳米粒子都缺乏对于病灶部位的特异性，进而限制了他们在动物体内的应用。
随着人们对肝脏早期病变诊断要求的提高和对现在使用的MRI对比剂毒副作用的深入了解，MRI对比剂在动物体内的分布规律和肝特异性识别研究显得尤为重要和迫切，提高MRI敏感性和特异靶向性是核磁共振对比剂研发中面临的重大挑战。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服已有技术的不足，目的在于提供一种具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法，是将采用的技术路线是利用肝靶向化合物和葡聚糖反应制备肝靶向化合物修饰的葡聚糖，并与铁盐和亚铁盐水溶液反应制备具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法。
所述肝靶向化合物为单甘草次酸乙二胺、单甘草次酸丙二胺、单甘草次酸丁二胺、单甘草次酸己二胺、单胆酸乙二胺、单胆酸丙二胺、单胆酸丁二胺和单胆酸己二胺中的任意一种；
所述葡聚糖的分子量为2000～4×104；
所述铁盐为氯化铁和醋酸铁中的任意一种；
所述亚铁盐为氯化亚铁和醋酸亚铁中的任意一种；
所述亚铁盐和铁盐的配料比为1∶2～3，mol/mol。
具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法包括下述步骤：
1.在2～10％的葡聚糖的水溶液中，加入高碘酸钠水溶液，搅拌下反应4～6h，冷却后，将反应液在蒸馏水中透析2～12h，得到氧化的葡聚糖溶液；将肝靶向化合物的水溶液滴加到氧化的葡聚糖溶液中，在25～60℃反应4～6小时，冷却后，加入硼氢化钠的水溶液，继续搅拌反应2～4h，将反应液在蒸馏水中透析2～12h后，加入乙醚沉淀，真空干燥，得到肝靶向化合物修饰的葡聚糖。
所述肝靶向化合物修饰的葡聚糖的合成步骤中的物料配比为：葡聚糖∶高碘酸钠∶硼氢化钠为100.0∶3.0～20.0∶0.50～3.60，g/g；肝靶向化合物∶硼氢化钠为1∶1～3，mol/mol。
2.将铁盐和亚铁盐的水溶液混合均匀，加入肝靶向化合物修饰的葡聚糖的水溶液，通入N2搅拌并加入氨水和去离子水，在50～80℃反应1～4h，加入醋酸调节pH值至7，将反应液透析，超声振荡，用磁铁分离得到四氧化三铁纳米粒子；把得到的四氧化三铁纳米粒子分散到去离子水中，超声振荡5～20min，过450nm微滤膜，得到具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子。
所述肝靶向化合物修饰的葡聚糖与铁盐和亚铁盐水溶液反应制备具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的过程中的物料配比为：肝靶向化合物修饰的葡聚糖∶铁盐为100.0∶5.0～27.0，g/g。
本发明的效果：可以显著提高四氧化三铁纳米粒子在肝脏内的累积。
具体实施方式
为了进一步了解本发明的内容、特点，详细说明如下：
实施例1 单甘草次酸乙二胺修饰的葡聚糖的合成：
在1000ml 5％的葡聚糖的水溶液中，加入含有10.02g高碘酸钠的水溶液，搅拌下反应5h，冷却后，将反应液在蒸馏水中透析4h，得到氧化的葡聚糖溶液；将含有5.24g单甘草次酸乙二胺的水溶液滴加到氧化的葡聚糖溶液中，在50℃反应5小时，冷却后，加入含有0.81g硼氢化钠的水溶液，继续搅拌反应3h，将反应液在蒸馏水中透析4h后，加入200ml乙醚沉淀，真空干燥，得到52.71g单甘草次酸乙二胺修饰的葡聚糖。
实施例2 单胆酸己二胺修饰的葡聚糖的合成：
在1000ml 5％的葡聚糖的水溶液中，加入含有10.02g高碘酸钠的水溶液，搅拌下反应5h，冷却后，将反应液在蒸馏水中透析4h，得到氧化的葡聚糖溶液；将含有7.12g单胆酸酸己二胺的水溶液滴加到氧化的葡聚糖溶液中，在50℃反应5小时，冷却后，加入含有0.81g硼氢化钠的水溶液，继续搅拌反应3h，将反应液在蒸馏水中透析4h后，加入200ml乙醚沉淀，真空干燥，得到55.48g单胆酸己二胺修饰的葡聚糖。
实施例3 单甘草次酸乙二胺修饰的葡聚糖与FeCl3和FeCl2水溶液反应制备具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子：
将含有1.10g FeCl3和0.35g FeCl2的水溶液混合均匀，加入含有5.02g单甘草次酸乙二胺修饰的葡聚糖的水溶液，通入N2搅拌并加入30ml 3M氨水和100ml去离子水，在50～80℃反应1～4h，加入醋酸调节pH值至7，将反应液透析，超声振荡，用磁铁分离得到四氧化三铁纳米粒子；把得到的四氧化三铁纳米粒子分散到去离子水中，超声振荡5～20min，过450nm微滤膜，得到修饰单甘草次酸乙二胺的四氧化三铁纳米粒子。动态光散射测定其粒径为37nm，分散指数为0.17，透射电镜观测粒子为规则的圆球形。
实施例4 单胆酸己二胺修饰的葡聚糖与FeCl3和FeCl2水溶液反应制备具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子：
将含有1.10g FeCl3和0.35g FeCl2的水溶液混合均匀，加入含有5.88g单胆酸己二胺修饰的葡聚糖的水溶液，通入N2搅拌并加入30ml 3M氨水和100ml去离子水，在50～80℃反应2h，加入醋酸调节pH值至7，将反应液透析，超声振荡，用磁铁分离得到四氧化三铁纳米粒子；把得到的四氧化三铁纳米粒子分散到去离子水中，超声振荡10min，过450nm微滤膜，得到修饰单胆酸己二胺的四氧化三铁纳米粒子。动态光散射测定其粒径为29nm，分散指数为0.14，透射电镜观测粒子为规则的圆球形。
实施例5 修饰单胆酸己二胺的的四氧化三铁纳米粒子的大鼠体内分布实验：
利用放射性元素标记结合SPECT技术检测纳米粒子在动物体内的分布是一种快速准确定量的分析检测方法。我们采用这种方法研究了修饰单胆酸己二胺的的四氧化三铁纳米粒子在大鼠体内的分布。
1.修饰单胆酸己二胺的的四氧化三铁纳米粒子(DS-SPIO)的制备：
修饰单胆酸己二胺的的四氧化三铁纳米粒子制备同实施例4；
2.葡聚糖包覆的四氧化三铁纳米粒子(U-SPIO)的制备：
将含有1.10g FeCl3和0.35g FeCl2的水溶液混合均匀，加入含有5.24g葡聚糖的水溶液，通入N2搅拌并加入30ml 3M氨水和100ml去离子水，在50～80℃反应2h，加入醋酸调节pH值至7，将反应液透析，超声振荡，用磁铁分离得到四氧化三铁纳米粒子；把得到的四氧化三铁纳米粒子分散到去离子水中，超声振荡10min，过450nm微滤膜，得到葡聚糖包覆的四氧化三铁纳米粒子。
3.纳米粒子的cDTPA偶联：
分别取4mL0.1g/L DS-SPIO和U-SPIO纳米粒子溶液与80mg二乙烯三胺五乙酸二环酐(cDTPA)混合，在室温下反应1h完成偶联。混合液用Sephadex G75常规凝胶色谱分离，去除游离的二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，淋洗液为蒸馏水，分别得到cDTPA衍生化的DS-SPIO和U-SPIO纳米粒子纳米粒子溶液。
4.纳米粒子的放射性标记：
分别取cDTPA衍生化的DS-SPIO和U-SPIO的纳米粒子溶液(1mg/mL)1mL，亚甲基二磷酸锡盐(MDP-Sn)试剂盒加入1mL生理盐水，每个样品取100μL，分别加入1mCi99mTc和50μL MDP溶液反应10min.标记好的溶液用生理盐水稀释到3mL供小鼠体内分布实验使用。
5.取步骤4的99mTc标记的纳米粒子溶液，大鼠(n＝3)尾静脉注射给药500μL，以大鼠尾静脉注射500μL生理盐水为对照。给药后，分别于0.25、1、3h后做SPECT显像测试。将大鼠处死，提取大鼠肝脏，定量称取其他组织和血液，做放射性测试。
DS-SPIO纳米粒子在注射15min，在肝脏积累达44％，在肾脏达25％。在注射1h后，DS-SPIO纳米粒子在肝脏富集达到82％。U-SPIO纳米粒子在注射15min，在肝脏积累达28％，在肾脏达19％。在注射1h后，U-SPIO纳米粒子在肝脏累计47％。
Claims (7)
1.一种具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法，其特征在于使用肝靶向化合物和葡聚糖反应制备肝靶向化合物修饰的葡聚糖，并与铁盐和亚铁盐水溶液反应制备具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子；
所述肝靶向化合物为单甘草次酸乙二胺、单甘草次酸丙二胺、单甘草次酸丁二胺、单甘草次酸己二胺、单胆酸乙二胺、单胆酸丙二胺、单胆酸丁二胺和单胆酸己二胺中的任意一种；
所述铁盐为氯化铁和醋酸铁中的任意一种；
所述亚铁盐为氯化亚铁和醋酸亚铁中的任意一种。
2.按照权利要求1所述的具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法，其特征在于所述葡聚糖的分子量为2000～4×104。
3.按照权利要求1所述的具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法，其特征在于所述亚铁盐和铁盐的配料比为1∶2～3，mol/mol。
4.按照权利要求1所述的具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法，其特征在于使用肝靶向化合物和葡聚糖反应制备肝靶向化合物修饰的葡聚糖，包括下述制备步骤：
在2～10％的葡聚糖的水溶液中，加入高碘酸钠水溶液，搅拌下反应4～6h，冷却后，将反应液在蒸馏水中透析2～12h，得到氧化的葡聚糖溶液；将肝靶向化合物的水溶液滴加到氧化的葡聚糖溶液中，在25～60℃反应4～6小时，冷却后，加入硼氢化钠的水溶液，继续搅拌反应2～4h，将反应液在蒸馏水中透析2～12h后，加入乙醚沉淀，真空干燥，得到肝靶向化合物修饰的葡聚糖。
5.按照权利要求4所述具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法，其特征在于所述肝靶向化合物修饰的葡聚糖的合成步骤中的物料配比为：
葡聚糖∶高碘酸钠∶硼氢化钠为100.0∶3.0～20.0∶0.50～3.60，g/g；
肝靶向化合物∶硼氢化钠为1∶1～3，mol/mol。
6.按照权利要求1所述的具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法，其特征在于肝靶向化合物修饰的葡聚糖与铁盐和亚铁盐水溶液反应制备具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子，包括下述制备步骤：将铁盐和亚铁盐的水溶液混合均匀，加入肝靶向化合物修饰的葡聚糖的水溶液，通入N2搅拌并加入氨水和去离子水，在50～80℃反应1～4h，加入醋酸调节pH值至7，将反应液透析，超声振荡，用磁铁分离得到四氧化三铁纳米粒子；把得到的四氧化三铁纳米粒子分散到去离子水中，超声振荡5～20min，过450nm微滤膜，得到具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子。
7.按照权利要求6所述具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的制备方法，其特征在于所述肝靶向化合物修饰的葡聚糖与铁盐和亚铁盐水溶液反应制备具有肝靶向功能的四氧化三铁纳米粒子的过程中的物料配比为：
肝靶向化合物修饰的葡聚糖∶铁盐为100.0∶5.0～27.0，g/g。
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