CN101766809A - 在生长因子和生物基质或载体结构存在下进行细胞增殖和分化的方法和装置 - Google Patents

在生长因子和生物基质或载体结构存在下进行细胞增殖和分化的方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在生长因子和生物基质或载体结构存在下进行细胞增殖和分化的方法和装置。具体而言，本发明涉及细胞增殖和分化的体内和体外方法，其中通过使用生长因子——血小板生成素(TPO)和/或促红细胞生成素(EPO)，和/或生长激素(GH)，特别是人生长激素(HGH)，和/或促生长素抑制素和/或白血病抑制因子(LIF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)——来起始或终止细胞生长过程，并对细胞生长过程进行结构性指导。本发明也涉及含有前述生长因子的生物基质和载体结构，以及制造它们并实行本发明方法的装置和方法。

Description

在生长因子和生物基质或载体结构存在下进行细胞增殖和分化的方法和装置
本申请是申请日为2003年6月20日、申请号为03816829.4、发明名称为“在生长因子和生物基质或载体结构存在下进行细胞增殖和分化的方法和装置”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及使用至少一种分离形式的生长因子进行初级分化细胞的培养，用于成体细胞的局部特异分化和/或定向分化和/或骨、组织和/或内分泌器官的再生。
在个体发生(即生物个体的胚胎发育)中，生长因子被表达，其能够引发基础结构的和与细胞数目相关的众多过程。在正在生长的生物中，因为不再表达这些生长因子而日渐丧失通过再生进行结构性修复的能力。在特定的个体发生过程中，骨髓或造血器官的因子在时间上与其它器官的生长过程耦联。
已知的生长因子(如表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)或肝细胞生长因子(HGF))的缺点是增殖过程是受限的，特别是体外使用初级细胞的增殖过程，而体内的使用由于可能的副作用(如激活致癌基因)存在问题。
至今认为组织提取物(例如来自垂体或下丘脑的组织提取物)特别适合用于引起肝细胞的增殖(例如见US 6008047)。已经将这类动物的(偶尔为人的)提取物加入到细胞培养物中。然而，由于可传播的病毒疾病(如BSE、猪或绵羊病毒)，使在实验室工作或临床中使用动物或人组织提取物存在问题。这类提取物的应用说明对确切的相关因子以及它们潜在的用途和效果缺乏了解。另一实质性缺点是，通过这类通常难以限定并相当依赖于所使用的来源的异质性提取物也向培养物中引入了因子，这些因子在临床使用中可能带来了不需要的副作用或性质。因此，对因子的确切了解和对其剂量的控制，不仅对于能够相应地增殖和分化细胞(特别是在组织工程领域)是重要的因素，并且对于诱导三维(3-D)再生的结构过程也是重要的。
这类结构的设定，特别对于组织工程而言是重要的，其中3-D生长和它的起始至今仍不了解。虽然如聚集培养之类的传统方法能够达到高密度，但必须使用预扩增的或分离自原初组织的细胞(如肝细胞)才能建立起来。到目前为止，产生精细的预定结构的诱导性生长过程还是不可能的。
相反，目前在增殖阶段之后仍然将细胞(如肝细胞)包埋进凝胶中，以避免形成进一步的(也是大的)聚集体(超聚集体)。这些凝胶在维度上是二维的，它们包含很高的细胞密度，因此阻止了细胞增殖。这种导致分层的2-D凝胶内含物已经被Bader等人(1995)，Artif.Organs，19，368-374描述为三明治模型或凝胶包载。虽然聚集体在凝胶中的包埋改善了分化的保持，但并不进一步的生长。
至今，从少数前体细胞到3-D结构的造型生长以及体外和体内组织再生意义上的相邻过程的诱导行为还不可能。然而，细胞的诱导生长行为意味着相当大的创新，特别是对于治疗或生物技术过程。这种由3-D载体基质协助的生长行为应该，不仅能够允许移殖或结构重建意义上的生长，事实上还能够允许从诱导核区的定向地重新形成。这类过程发生在个体形成中，并建立在预先存在的结构上。
仅仅知道生长因子，特别是来自胎儿的神经元祖先细胞的生长因子(如白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质来源的神经营养因子(GDNF)或神经生长因子(NGF))使未分化神经元增殖阶段成为可能。然而，一旦分化完成以后这些因子便失去作用。
在组织工程中，还存在额外的问题，即，使用的是已经比胎儿细胞进一步分化的患者特异性的成体细胞系统。另外，在传统应用中并不考虑原位或体外的共培养。相反，例如甚至尝试在扩增肝实质细胞时避免内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的如存在于肝脏中的共培养，因为它们是不需要的。然而，目前已知在分化培养物中这些所谓的非实质细胞的存在为分化提供了实质性贡献。
因此需要提供能够基本上保持细胞系统生理状态并能提供实质性的结构生长的体外增殖方法和/或体内再生方法。
现在已经发现使用生长因子——血小板生成素(TPO)和/或促红细胞生成素(EPO)和/或生长激素(GH)和/或促生长素抑制素和/或白血病抑制因子(LIF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)——能够起始、终止并在结构上指导细胞增殖和分化。
令人吃惊的是，这不仅引起了细胞增殖还诱导了结构过程，特别是通过对移植物的就地(原位)诱导作用(例如经由所谓的归巢方法(homing process))引起局部特异分化和/或定向分化。这意味着这些生长激素既能诱导也能终止这些结构过程(structure process)。
本发明因此涉及体外增殖和分化细胞的方法，其中通过使用生长因子TPO和/或EPO和/或GH，特别是HGH和/或促生长素抑制素和/或LIF和/或CNTF来起始、终止并在结构上指导细胞的生长过程。
因此已知，TPO也可以作为例如c-Mpl配体、mpl配体、巨生成素或巨核细胞生长和发育因子，并且除了血小板及其前体细胞之外，至今未被用于培养例如成体肝细胞或其它初级细胞。TPO对于巨核细胞和血小板的增殖和发育是必需的，因此对于血液血小板的形成也是必需的。TPO以332个氨基酸长的蛋白质构成产生于肝脏和肾脏。
根据本发明能够使用的其它生长因子有转化生长因子β(TGF β)、前列腺素、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、生长激素释放激素(GHRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、促性腺激素释放激素(GnPH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激素(ADH)、催产素、催乳素、促肾上腺皮质激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升压素。
除了停止或减少所述生长因子向培养物的供给之外，促生长素抑制素和/或TGF β和/或前列腺素也适合终止本发明的生长过程。
生长因子在溶液中的单独浓度通常约1至100ng/ml，优选的是约10至50ng/ml，特别是约10到20ng/ml。然而，在局部覆盖的情况下，生长因子的浓度也可以是上述的几倍。
例如，在内分泌器官再生的情况下，生长因子(特别是生长激素释放激素(GHRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促生长素抑制素、多巴胺、抗利尿激素(ADH)和/或催产素)与载体基质的相互作用可能诱导内分泌细胞原位的分化和/或生长。
对于结构过程可以额外使用催乳素、促肾上腺皮质激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升压素。
在进一步的实施方案中，可以额外使用一种或多种神经再生因子(优选神经生长因子(NGF))和/或一种或多种血管再生因子(优选血管内皮生长因子(VEGF)和/或血小板衍生生长因子(PDGF))。
在内皮细胞存在的情况下还可以实现细胞内皮化，并由此具有最佳的血液相容性(hemocompatibility)。
所述生长因子通常可以通过商业购买，但也可以通过技术人员已知的方法基因操作制备。它们不仅包括天然产生的生长因子，而且也包括基本具有相同的生物活性的生长因子衍生物或变体。
因此，商购获得例如CellSystems GmbH，St Katharinen生产的TPO。对于培养人成体肝细胞而言优选使用人TPO。另外，TPO和它的变体的制备和表征被描述于例如EP 1201246、WO 95/21919、WO95/21920和WO 95/26746中。
合适的TPO变体例如是描述于WO 95/21919的TPO衍生物或描述于WO 95/21920的等位基因变体或种系同源物，或描述于WO 95/26746和EP 1201246的聚乙二醇化的TPO，但并不限于这些。在本发明的范围内，聚乙二醇化的TPO意指与有机聚合物(如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯)连接的TPO衍生物。其它TPO变体还指与TPO具有低于100％序列一致性但具有优选如EP 1201246中所描述的TPO活性的TPO衍生物。TPO衍生物通常与人TPO(包括其具有TPO活性的片段)具有至少70％的序列一致性，优选至少75％，特别是至少80％，尤其是至少85％。特别优选的满足本发明目的的TPO活性是通过TPO或其变体促进巨核细胞或巨核细胞前体增殖、分化和/或成熟为这些细胞的成血小板产生形式。
EPO也被称为TPO的胚胎形式，并和它的变体一起被描述于例如EP0148605、EP 0205564、EP 0209539、EP 0267678或EP 0411678中。
上文详细描述的、举例说明的衍生物和变体也以类似的方式适合于其它所述的生长因子。
根据本发明，术语“生长因子”并不限于天然产生的形式，也包括非天然产生的形式或者变体或衍生物。根据本发明，术语“生长因子”不仅包括生长促进子也包括生长抑制子，例如促生长素抑制素、TGF β和/或前列腺素。通过同时或相继的局部高浓度使用(例如通过水合凝胶或缓慢释放材料)，这类生长抑制子特别适合抑制或阻止已改变的细胞(如肿瘤细胞)的生长。
本发明的生长过程在适合特定细胞的培养物中进行。在这方面，该方法可以通过合适的装置任选地将生长过程形成的细胞聚集体打碎、任选地包囊化以及任选地冷冻。
适当装置的实例是例如具有大小为例如500μm的相交网孔结构的栅格，它具有能反复产生新的亚聚集物(subsidiary aggregate)(如肝细胞的)的效果。这可以有利地发生在完全封闭的系统中。特别是可以使用非接触的、自动或手动控制的泵系统，此系统例如由活塞泵组成产生定向流，或者由磁力或管道压缩空气产生定向流。在内皮细胞存在的情况下，可能通过经灌注的生物反应器中的剪切压力使内皮细胞自发汇合于聚集物表面，这对于进一步的使用可能是有利的。
技术工人已知适合包囊化的材料，其中例如整合了结构化的形状或空间，并且使原位生长结构或放大成为可能。无需包囊化的一种替代的可能性是例如内皮细胞存在的情况下的内皮化，并由此达到最佳的血相容性。
在进一步的实施方案中，细胞的生长过程被定点引发或终止，并接受结构指导，优选的是通过生物基质来完成。
在此，生物基质被例如一种所述生长因子处理或被所述生长因子的组合以混合物的形式或相继被处理。由此即使使用成体细胞系统，仍能使3-D再生和/或人工指导组织修复或组织培养成为可能。
生物基质通常是植入物，例如支架、补片(patch)或导管、移植物，如皮肤移植物和/或用于细胞生长的载体材料，如所谓的缓慢释放材料，如基于如纤维蛋白的水合凝胶和/或聚合物(如聚交酯或聚羟基链烷酸酯)，和/或藻酸盐、骨替代材料(如磷酸三钙)、同种异型、自体或异种无细胞化或非无细胞化的组织(如心脏瓣膜、静脉瓣膜、动脉瓣膜、皮肤、血管、大动脉、腱、角膜、软骨、骨、气管(tracea)、神经、miniscus、椎间盘、输尿管、尿道或膀胱(例如见EP 0989867或EP1172120)、基质(如层粘连蛋白、胶原蛋白IV和/或Matrigel-基质，优选饲养层(如胶原蛋白I、3T3和/或MRC-5饲养层，或胶原纤维))。
在进一步优选的实施方案中，通过技术人员已知的方法，使用细胞预先移殖生物基质，优选组织特异性细胞、前体细胞、骨髓细胞、外周血、脂肪组织和/或纤维组织，例如用来自骨髓的成体前体细胞。通过这种方式可以在体外预先进行体内创伤恢复过程，因此缩短了体内移植后所需的再整合时间。
根据本发明使用的细胞特别是成体细胞，即优选不再具有胚胎或胎儿表型的初级分化细胞，特别优选人成体细胞。它们的例子有成体祖细胞、组织特异性细胞，优选造骨细胞、成纤维细胞、肝细胞和/或平滑肌细胞。
然而，也有可能通过高浓度地同时或相继使用生长抑制子(如促生长素抑制素、TGF β和/或前列腺素)来抑制或阻止已改变的细胞(如肿瘤细胞)。在这种情况下可以使用已经提及的含有或由此富集了至少一种所述生长抑制子的水合凝胶或缓慢释放材料，它们被局部施用或施用在已改变的细胞的附近。
因此，本发明方法特别适合成体细胞的局部特异的或定向的增殖、结构生长和随后的分化，和/或骨、组织和/或内分泌器官的再生，如心脏瓣膜、静脉瓣膜、动脉瓣膜、皮肤、血管、大动脉、腱、角膜、软骨、骨、气管、神经、miniscus、椎间盘、输尿管、尿道或膀胱。
通过单独使用所述生长因子或以混合物或相继的形式使用所述生长因子的组合，或与所述生物基质或载体结构联合使用，本发明的方法也能用于体内局部使用，如用于肝脏再生、心肌再生之类的组织再生或用于糖尿病溃疡或齿龈之类的皮肤区域创伤复原。例如，TPO可以以水合凝胶如纤维蛋白和/或聚合物(如聚交酯或聚羟基链烷酸酯)和/或藻酸盐的形式被用于如肝脏的切除表面促进肝脏再生，或例如在急性肝衰竭中，在导管的协助下经由肝门被局部或全身性给药。因此，所述生长因子可以在肝脏切除或肝组织被除去之前、之中或之后被使用以协助肝脏再生。在使用所述生长因子促进软骨再生时，生长因子可以被直接注射到膝关节。因此，生长因子可能经由滑液直接对新软骨结构的形成发挥作用。
因此本发明也涉及生长因子TPO和/或EPO和/或GH和/或促生长素抑制素和/或LIF和/或CNTF在生产药物中的用途，该药物用于治疗骨、软骨、组织和/或内分泌器官(如实质或非实质器官，特别是心肌、心脏瓣膜、静脉瓣膜、动脉瓣膜、皮肤、血管、大动脉、腱、角膜、软骨、骨、气管、神经、miniscus、椎间盘、肝、肠上皮、输尿管、尿道或膀胱)的再生，或治疗退化性疾病和/或协助创伤复原过程，特别是局限性回肠炎、溃疡性结肠炎和/或皮肤区域的创伤(优选为糖尿病溃疡或齿龈)，和/或用于治疗肝脏疾病，特别是肝硬化、肝炎、急性或慢性肝衰竭，和/或运动损伤后肌肉组织的创伤复原、肌肉疾病、骨损伤、软组织损伤和/或改善创伤复原和组织再生(如手术、急性和慢性疾病后)，和/或改善创伤复原和组织再生(如手术、急性和慢性紊乱后)，和/或刺激血管新生或再生以治疗缺血性心肌病症，和/或治疗受伤和外伤后的缺血，和/或紧随组织损伤后的再生，如心肌梗塞或血栓(中枢或外周)可能导致的随后缺血。在这种情况下，给予EPO使血管新生以及随后或伴随的组织再生成为可能。
在一特定的实施方案中，用作生长因子的还有转化生长因子β(TGF β)、前列腺素、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、生长激素释放激素(GHRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激素(ADH)、催产素、催乳素、促肾上腺皮质激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升压素，或加上一种或多种神经再生因子，优选神经生长因子(NGF)和/或一种或多种血管再生因子(优选血管内皮生长因子(VEGF)和/或血小板衍生生长因子(PDGF))。
描述于本发明的进一步的实施方案以类似的方式也适用于本发明所描述的用途。
进一步的可能性是含有生长因子TPO、EPO、GH，特别是HGH、促生长素抑制素、LIF和/或CNTF的至少一种的生物基质或载体结构，用作为扩增阶段中3-D生长和/或再生的诱导性底物，或用于诱导扩增阶段后的分化，或者用于阻滞生长。例如，至少一种所述生长因子可以与上述例举描述的所谓缓慢释放材料组合被涂敷于支架上。
因此本发明还进一步涉及生物基质或载体结构，它们包含生长因子血小板生成素(TPO)、促红细胞生成素(EPO)、生长激素(GH)，特别是人生长激素(HGH)、促生长素抑制素、白血病抑制因子(LIF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)中的至少一种，其中这种生物基质或载体结构也可以另外包含生长因子TGF β、前列腺素、GM-CSF、GHRH、TRH、GnRH、CRH、多巴胺、ADH、催产素、催乳素、促肾上腺皮质激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升压素中的至少一种，任选地还可以含有一种或多种神经再生因子(优选神经生长因子(NGF))和/或一种或多种血管再生因子(优选血管内皮生长因子(VEGF)和/或血小板衍生生长因子(PDGF))。
本发明生物基质或载体结构是例如植入物、移植物和/或细胞生长的载体材料，该生物基质或载体结构可能是支架、导管、皮肤、水合凝胶、骨替代材料、同种异型、自体或异种无细胞化或非无细胞化的组织、合成的组织、饲养层或纤维片(fabric)，如胶原、层粘连蛋白和/或纤连蛋白形成的纤维片(具有或不具有合成的或其它类型的基础结构(如塑料或生物基质)。上文已经描述了示范性的实施方案。
所述生物基质或载体结构是，如上文已经详细描述的，优选已使用组织特异性细胞、前体细胞、骨髓细胞、外周血、脂肪组织和/或纤维组织进行了预移殖的，或用于体内移殖或诱导性重建已体外准备好的。
所述生物基质或载体结构也可以是被含有至少一种所述生长因子的(生物)聚合物层包覆的。例如纤维蛋白、血浆、胶原和/或聚交酯适用于(生物)聚合物层。
本发明也涉及生产本发明生物基质或载体结构的方法，其中未活化或经活化的、经生长因子TPO、EPO、GH(特别是HGH)、促生长素抑制素、LIF和/或CNTF中的至少一种包覆的生物基质或载体结构，其中所述生物基质或载体结构可以任选地被额外的生长因子TGF β、前列腺素、GM-CSF、GHRH、TRH、GnRH、CRH、多巴胺、ADH、催产素、催乳素、促肾上腺皮质激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升压素中的至少一种包覆，并且任选地还可额外的被一种或多种神经再生因子(优选NGF)和/或一种或多种血管再生因子(优选VEGF和/或PDGF)包覆。
生物基质或载体结构的活化可例如通过等离子离子化(如使用过氧化氢)或激光活化的方式进行。
其它的可能性是使用含有所述生长因子的生物可降解的(生物)聚合物层进行包覆。在此合适的实例是纤维蛋白、血浆、血液、胶原和/或聚交酯。
本发明方法中同样可以使用细胞在体外对生物基质或载体结构进行预移殖，优选使用组织特异性细胞、前体细胞、骨髓细胞、外周血、脂肪组织和/或纤维组织。
以上描述的优选的本发明特征或特征性实例以类似的方式适合于本发明的生产方法。
本发明也延伸至实现本发明方法的装置，其中优选为灌注生物反应器(perfused bioreactor)，特别是封闭形式的灌注生物反应器。
以下实施例意图详细解释本发明，而对本发明不具限制性。
实施例：
1.骨再生
制备具有例如大于15μm的微孔性的单相β磷酸三钙颗粒，并以3-D空缺形状成形，该3-D空缺形状符合患者的需要。这通常通过烧结方法进行。随后通过等离子离子化处理该材料，以便产生表面的活化，并将该构建物置于具有血小板生成素、促红细胞生成素和/或生长激素(GH)的溶液中，由此以微小的量精细地包覆。或者，可以在没有事先进行表面活化的情况下在溶液中孵育，或用含有这些生长因子的生物可降解的(生物)聚合物层包覆。在这种情况下可使用纤维蛋白、血浆、胶原和/或聚交酯。
然后将该构建物立即放入空缺中，或使用组织特异性细胞、前体细胞或骨髓细胞进行体外预移殖。这实现了在体外预先进行体内创伤复原过程，并由此缩短了(例如7天之后)体内植入后的再整合时间。可以与神经再生因子(NGF)或血管再生因子(VEGF、PDGF)联合使用。在此与结构形成因子联用并且考虑环境因素是令人感兴趣的。
在体内和体外都存在造血和富集干细胞的骨髓的整合、造骨细胞分化速率的增加以及载体基质吸收和被正常骨骼取代的速率增加。通过重构能力和诱导特征实现位点特异性整合。
可以通过已经在体外用骨膜于外侧进行覆盖移殖的方式进一步促进整合。
2.心脏瓣膜再生和尿道构建物的产生
使用血小板生成素和促红细胞生成素作为生长因子对生物基质进行预包覆。该生物基质包括：具有和不具有细胞化的同种异型或自体心脏瓣膜，由塑料制成的合成载体结构(其在胶原的化学组成和空间排列方面与目的心血管组织的生理微环境相似)。
然后通过等离子离子化(如使用过氧化氢H2O2)处理该材料，同时达到灭菌作用，以便产生表面的活化，并将该构建物置于具有血小板生成素、促红细胞生成素和/或生长激素(GH)的溶液中，由此以微小的量精细地包覆。或者，可以在没有事先进行表面活化的情况下在溶液中孵育，或用含有这些生长因子的生物可降解的(生物)聚合物层包覆。在这种情况下可使用纤维蛋白、血浆、胶原和/或聚交酯。
然后将该构建物立即置入需要的位置(心脏瓣膜位置，作为补片或血管替代物)，或使用组织特异性细胞、前体细胞或骨髓细胞进行体外预移殖。这实现了在体外预先进行体内创伤复原过程，并由此缩短了(例如7天之后)体内植入后的再整合时间。可以与神经再生因子(NGF)或血管再生因子(VEGF、PDGF)联合使用，但这并不是绝对必需的。
在体内和体外都存在造血和富集干细胞的骨髓的整合、成纤维细胞和平滑肌细胞分化速率的增加以及载体基质吸收和被正常心血管组织取代的速率增加。通过重构能力和诱导特征实现位点特异性整合。
可以通过已经在体外使用内皮细胞于外侧进行覆盖移殖的方式进一步促进整合。
可以通过相应的方式制备尿道构建物。
3.在具有非实质细胞的共培养物中进行成体肝细胞增殖
向培养基上清加入浓度为10-50ng/ml的TPO和/或EPO和/或生长激素(如HGH)以处理来自活检组织或部分切除物的混合肝细胞群体。接种细胞的密度是10000细胞/cm。汇合之后，在加入2g/l的白蛋白或自体血清(10-20％)的情形下，用0.005％的胶原酶和0.01％胰蛋白酶处理5小时。然后吹落细胞，并在培养基(Williams E(Williams等人(1971)Exptl.Cell Res.，69，106)中用含有2g/l白蛋白清洗3次，然后将细胞置于胶原包覆的培养皿上沉淀。
通过用胞外基质覆盖可以实现细胞的分化。
或者通过搅拌阻止细胞沉淀，并使它们聚在一起。
为了防止在生长过程中形成过大的聚集物，可以使细胞通过具有大小为500μm的网孔结构的栅格装置，以便可以反复产生新的亚聚集物。这可以在完全封闭的系统中进行。理想地，可以使用非接触的泵系统(无蠕动系统的挤压，而是由磁力或管道压缩空气产生定向流，或者活塞泵——自动或手动)。
然后可以将细胞包囊化和冷冻。可以在包囊结构中整合进结构化的形状和空间，这使原位结构生长和扩大成为可能。
或者，可以免于进行包囊，通过在该系统中存在内皮细胞以及靶向的加入这些细胞以实现内皮化，并因此达到最佳的血相容性。
灌注生物反应器中的剪切力导致内皮细胞在聚集物表面自发汇合。当达到所需大小时，可以将它们冷冻在例如适合用于培养的袋中。4.软组织(肌肉片、神经、腱)
为了重建腹壁缺损，相应于上文可以制备胶原片或纤维片(如层粘连蛋白、具有或不具有合成或其它类型基础结构(如塑料或生物基质)的纤连蛋白)，或具有限定空间的结构(神经管、腱)。这些胶原片或结构被成形，并用TPO、EPO和/或生长激素(GH)包覆和植入或用目的组织的细胞(如跟腱细胞、神经元)预移殖。
使用血小板生成素和促红细胞生成素作为生长因子对生物基质进行预包覆。该生物基质包括：具有和不具有细胞化的同种异型或自体心脏瓣膜，由塑料制成的合成载体结构(其在胶原的化学组成和其空间排列方面与目的组织的生理微环境相似)。
在这之前或之后，通过等离子离子化(如使用过氧化氢H2O2)处理该材料，同时达到灭菌作用，以便产生表面的活化，将构建物置于具有血小板生成素、促红细胞生成素和/或生长激素的溶液中，由此以微小的量精细地包覆。或者，可以在没有事先进行表面活化的情况下在溶液中进行孵育，或用含有这些生长因子的生物可降解的(生物)聚合物层包覆。在这种情况下可使用纤维蛋白、血浆、胶原和/或聚交酯。
然后将构建物立即引入需要的位置(腹壁、心肌、骨骼肌片)，或使用组织特异性细胞、前体细胞或骨髓细胞进行体外预移殖。这实现了在体外预先进行体内创伤复原过程，并由此缩短了(例如7天之后)体内植入后的再整合时间。可以与神经再生因子(NGF)或血管再生因子(VEGF、PDGF)联合使用，但这并不是绝对必需的。
在体内和体外都存在造血和富集干细胞的骨髓的整合、成纤维细胞和平滑肌细胞分化速率的增加以及载体基质吸收和被正常心血管组织取代速率的增加。通过重构能力和诱导特征实现位点特异性整合。
可以通过已经在体外使用角质细胞(腹肌)、Schwann′s细胞和/或纤维组织于外侧进行覆盖移殖的方式进一步促进整合。
5.组织的体内再生
a)肝脏
肝脏被部分切除后，通过与聚合物联合施用于切除表面而将EPO全身性地和/或局部地施用于患者。聚合物可以是生物聚合物如纤维蛋白(如来自纤维蛋白胶)、聚合血浆、聚合血液或生物粘附剂(如贝类粘附剂)。但是也可以是人工合成的或是生物凝胶和水合凝胶。EPO也可被引入用于止血的纤维片(如胶原纤维片、填筛物(Tamponade)、机织织物和编织物)。
通过EPO的作用，肝脏在两周内恢复到原来的体积。这不仅涉及肝细胞的增殖，还涉及一个协同生长过程，其中血管、胆管和囊状结构生长恢复原来的大小。
可以在30种动物中表明，肝脏的所述再生显著好于(没有提供EPO的)对照动物。
EPO也可以在慢性肝疾病(如硬化、纤维化、肝炎)中被用于肝脏再生。因此可以首次获得对于肝实质的治疗效果。
b)肠炎疾病
局限性回肠炎的患者在肠上皮区域出现创伤复原障碍。更深层的组织结构可能也参与炎症反应。在这些患者中，全身性或局部使用EPO导致肠上皮通过再生而复原。局部施用可通过肠区缓释胶囊或施予使用凝胶的栓剂或使用溶液局部注入而实现。
通过使用聚乙二醇化(PEG)的化合物可以使局部的血管区域的吸收最佳化，以便在发炎区域的局部给药实现整体的效果，并由此实现引发创伤复原过程。
贫血的存在被看作是局限性回肠炎患者的诊断阳性指标。过去认为贫血是独立的伴随性病症或是由于吸收问题导致的消瘦。我们的研究表明创伤复原障碍涉及内源EPO的不足。因此通过使用外源EPO可能高度选择性的治疗局限性回肠炎。也可以进一步应用于溃疡性结肠炎领域。
c)皮肤区域的创伤复原障碍
糖尿病溃疡患者具有营养障碍，它们导致通常在腿部区域的伤口愈合困难。由于基础疾病，导致结构组织的再生能力受限。在这些病例中，通过全身性或局部使用EPO诱导创伤复原。已证明清创术中对底层粗糙处理后使用EPO是有利的。氯化钙诱导的多聚化作用与EPO联合导致EPO整合入血凝块，从而形成一种局部缓释制剂。或者，EPO也可以与纤维蛋白胶或纤维片或包裹EPO的填筛物(如胶原纤维片)联合施用。
对于所有的其它创伤复原需要(如运动损伤后的肌肉区域、肌肉疾病、骨损伤、软组织损伤)和一般的改善创伤复原和组织再生(如术后、急性和慢性疾病)，可以以相似的方式使用EPO。
本发明的优选实施方式如下：
1.进行体外细胞增殖和分化的方法，其特征在于通过使用生长因子血小板生成素(TPO)和/或促红细胞生成素(EPO)，和/或生长激素(GH)，特别是人生长激素(HGH)，和/或促生长素抑制素和/或白血病抑制因子(LIF)和/或睫状神经营养因子(CNTF)起始和终止细胞的生长过程，并对细胞的生长过程进行结构性指导。
2.项目1的方法，其特征在于还使用转化生长因子β(TGF β)、前列腺素、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、生长激素释放激素(GHRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、促性腺激素释放激素(GnPH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激素(ADH)、催产素、催乳素、促肾上腺皮质激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升压素作为生长因子。
3.项目1或2的方法，其特征在于还使用一种或多种神经再生因子，优选神经生长因子(NGF)，和/或一种或多种血管再生因子，优选血管内皮生长因子(VEGF)和/或血小板衍生生长因子(PDGF)。
4.项目1到3中至少一项的方法，其特征在于此方法在内皮细胞存在下进行。
5.项目1到4中至少一项的方法，其特征在于细胞的生长过程被局部引发和终止，并被结构性指导。
6.项目5的方法，其特征在于通过生物基质或载体结构来对细胞的生长过程进行局部引发或终止和结构性指导。
7.项目6的方法，其特征在于使用一种所述生长因子处理所述生物基质或载体结构，或用所述生长因子的组合以混合物形式或相继的形式处理所述生物基质或载体结构。
8.项目6或7的方法，其特征在于植入物、移植物和/或载体材料被用作细胞生长的生物基质或载体结构。
9.项目1到8中至少一项的方法，其特征在于使用细胞，优选组织特异性细胞、前体细胞、骨髓细胞、外周血、脂肪组织和/或纤维组织对生物基质或载体结构进行预移殖，或该生物基质或载体结构已被体外制备，以用于体内移殖或诱导性重建。
10.项目1到9中至少一项的方法，其特征在于使用的细胞是成体祖细胞和/或组织特异性细胞，优选造骨细胞、成纤维细胞、肝细胞和/或平滑肌细胞。
11.项目1到10中至少一项的方法，其用于成体细胞的局部特异和/或定向增殖、结构生长和随后的分化，和/或用于骨、组织和/或内分泌器官的再生。
12.项目1到4中至少一项的方法，其特征在于通过合适的装置任选地打碎细胞在生长过程中形成的聚集物，并且任选地进行包囊化和任选地冷冻。
13.生物基质或载体结构，其含有生长因子TPO、EPO、GH，特别是HGH、促生长素抑制素、LIF和/或CNTF中的至少一种。
14.项目13的生物基质或载体结构，其还含有生长因子TGF β、前列腺素、GM-CSF、GHRH、TRH、GnRH、CRH、多巴胺、ADH、催产素、催乳素、促肾上腺皮质激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升压素中的至少一种，并且任选地，还含有一种或多种神经再生因子，优选NGF，和/或一种或多种血管再生因子，优选VEGF和/或PDGF。
15.项目13或14的生物基质或载体结构，其特征在于该生物基质或载体结构是用作细胞生长的植入物、移植物和/或载体材料。
16.项目13到15中任一项的生物基质或载体结构，其特征在于该生物基质或载体结构是支架、补片、导管、皮肤、水合凝胶、骨替代材料、同种异型、自体或异种无细胞化或非无细胞化的组织、合成组织、饲养层或纤维片。
17.项目13到16中任一项的生物基质或载体结构，其特征在于使用细胞，优选组织特异性细胞、前体细胞、骨髓细胞、外周血、脂肪组织和/或纤维组织对该生物基质或载体结构进行预移殖。
18.项目13到17中任一项的生物基质或载体结构，其特征在于此生物基质或载体结构被含有至少一种所述生长因子的生物可降解的(生物)聚合物层包覆。
19.项目13到18中任一项的生物基质或载体结构的生产方法，其特征在于任选活化的生物基质或载体结构被生长因子TPO、EPO、GH，特别是HGH、促生长素抑制素、LIF和/或CNTF中的至少一种包覆。
20.项目19的方法，其特征在于所述生物基质或载体结构还被另外的生长因子TGF β、前列腺素、GM-CSF、GHRH、TRH、GnRH、CRH、多巴胺、ADH、催产素、催乳素、促肾上腺皮质激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升压素中的至少一种包覆，任选地还被一种或多种神经再生因子，优选NGF，和/或一种或多种血管再生因子，优选VEGF和/或PDGF包覆。
21.项目19或20的方法，其特征在于通过等离子离子化或激光活化的方式活化所述生物基质或载体结构。
22.项目19到21中至少一项的方法，其特征在于使用细胞，优选组织特异性细胞、前体细胞、骨髓细胞、外周血、脂肪组织和/或纤维组织在体外对所述生物基质或载体结构进行预移殖。
23.一种用于实施项目1到12和项目19到22中至少一项的方法的装置。
24.项目23的装置，其特征在于此装置是灌注生物反应器，优选封闭系统的形式。
25.生长因子TPO和/或EPO和/或GH和/或促生长素抑制素和/或LIF和/或CNTF在生产药物中的用途，其中该药物用于治疗骨、软骨、组织和/或内分泌器官，特别是心肌、心脏瓣膜、静脉瓣膜、动脉瓣膜、皮肤、血管、大动脉、腱、角膜、软骨、骨、气管、神经、miniscus、椎间盘、肝脏、肠上皮、输尿管、尿道或膀胱的再生，或用于治疗退化性疾病和/或协助创伤复原过程，特别是局限性回肠炎、溃疡性结肠炎和/或皮肤区域的创伤，优选糖尿病溃疡或齿龈，和/或用于治疗肝脏疾病，特别是治疗肝硬化、肝炎、急性或慢性肝衰竭，和/或运动损伤、肌肉疾病、骨损伤、软组织损伤后肌肉组织的创伤复原，和/或用于改善创伤复原和组织再生，如手术、急性和慢性疾病和/或缺血性心肌疾病后，以刺激血管新生和再生，和/或用于治疗受伤和外伤后的缺血，和/或促进组织损伤后的再生。
26.如项目25中的用途，其特征在于还另外使用转化生长因子β(TGF β)、前列腺素、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、生长激素释放激素(GHRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、促性腺激素释放激素(GnPH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激素、催产素、催乳素、促肾上腺皮质激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升压素作为生长因子。
27.如项目25或26中的方法，其特征在于还另外使用一种或多种神经再生因子，优选神经生长因子(NGF)，和/或一种或多种血管再生因子，优选血管内皮生长因子(VEGF)和/或血小板衍生生长因子(PDGF)。

Claims (6)

1.促红细胞生成素(EPO)或其生物活性衍生物用于制备在创伤复原过程中局部治疗皮肤的药物的用途。
2.权利要求1的用途，其用于治疗齿龈。
3.权利要求1或2的用途，其特征在于将EPO应用于生物基质或载体结构。
4.权利要求3的用途，其中所述生物基质或载体结构是移植物、植入物、支架、补片、皮肤、水合凝胶或骨髓替代材料。
5.权利要求4的用途，其中所述生物基质是水合凝胶。
6.权利要求3的用途，其中使用组织特异性细胞、前体细胞、骨髓细胞、纤维组织或外周血对所述生物基质或载体结构进行预移殖。
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