CN117919198A - 一种促进血管再生的酸响应纳米材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进血管再生的酸响应纳米材料及其制备方法。包括：聚乳酸‑羟基乙酸共聚物PLGA纳米颗粒，负载在PLGA纳米颗粒内部的转染HIF‑1α的MSC条件培养基和酸响应因子CG‑CO2，以及包覆在PLGA纳米颗粒表面的红细胞膜和血小板膜。本发明的基于HIF‑1α调控MSC旁分泌促血管生成活性因子的纳米药物递送系统，进入病灶部位后实现酸响应的炸弹效应快速释放药物，MSC高表达血管生成生物活性因子，增强靶向缺血部位的能力。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种促进血管再生的酸响应纳米材料及其制备方法。
背景技术
血管是人体重要的器官之一，它承担着运输氧气、血液以及人体中所需营养物质的重要任务，并参与调节人体的代谢平衡。血管系统障碍会引发一系列的缺血性疾病，如缺血性心脏病和下肢缺血。缺血性心脏病患病率逐年持续上升，并且由于其高致残率和高致死率，已经成为全球性健康问题。缺血性心脏病是由冠状动脉阻塞后心肌梗死引起的，血管阻塞后血管中的血流和氧气减少进而使心肌细胞缺血性坏死，产生梗塞区域并导致心肌的收缩能力下降，最终形成纤维化疤痕而影响心脏功能。下肢缺血是由于动脉狭窄或闭塞导致的，下肢供血不足会使患者出现缺血性疼痛、组织溃疡或坏疽等临床症状，长期的缺血会导致患者下肢坏死以至截肢。治疗缺血性疾病的最有效办法就是对缺血部位坏死的血管进行重建。目前临床上可以利用手术搭桥和血管形成术来重建血管，但是符合手术条件的患者很少，并且术后感染依然是患者面临的一大挑战，因此，开发一种新型无创高效促进血管再生的治疗方法迫在眉睫。
间充质干细胞的组织再生能力为新血管形成提供了一种新的途径，间充质干细胞(MSC)治疗缺血性疾病主要依托其强大的旁分泌能力。MSC旁分泌各种细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)来刺激血管内皮细胞的增殖和分化；MSC旁分泌的肝细胞生长因子(HGF)通过调节基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)来抑制成纤维细胞活化，减少胶原等ECM沉积。近些年，已经有许多实验证明MSC具有治疗缺血性疾病的潜力，但单纯的MSC移植存在移植后存活率低、靶向性差等问题。缺氧诱导因子-1(HIF-1α)在缺氧条件下能够高表达，诱导包括VEGF、SDF-1、IGF-1、血小板衍生生长因子(PDGF)和一氧化氮合酶(iNOS)等促血管新生相关基因的表达，促进血管的新生、抑制纤维化、减少细胞凋亡，促进组织修复，但在常氧条件下，细胞内的HIF-1α容易分解，因此可以通过上调MSC中HIF-1α的表达来提升MSC旁分泌效果，进一步促进血管再生。
随着纳米药物递送系统研究的深入，尤其与MSC联合治疗疾病，弥补了MSC移植疗法的缺陷。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是美国FDA和欧洲药品管理局批准用于药物递送的高分子化合物，具有很好的生物安全性，是药物递送中理想的纳米载体。研究证明在PLGA纳米颗粒(PLGA-NPs)表面涂覆红细胞膜(RBC)，不仅可以增强NPs的生物相容性，还可以延长纳米颗粒在血液中的循环时间。使用细胞膜涂层技术可以赋予纳米载体的独特特性，有时可能也需要将多种细胞类型的功能结合到单个纳米颗粒上。目前的研究中PLGA纳米颗粒主要依靠其自身的缓慢降解来释放药物，往往释放速度比较慢。如何提高PLGA纳米颗粒的药物释放速度是其应用于药物递送中亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进血管再生的酸响应纳米材料。
本发明所提供的促进血管再生的酸响应纳米材料，包括：聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA纳米颗粒，负载在PLGA纳米颗粒内部的转染HIF-1α的MSC条件培养基和酸响应因子CG-CO2，以及包覆在PLGA纳米颗粒表面的红细胞膜和血小板膜，
其中，CG-CO2表示壳聚糖胍基-二氧化碳；
所述转染HIF-1α的MSC条件培养基通过包括如下步骤的方法制备得到：利用慢病毒作为载体向MSC中转染HIF-1α质粒并对MSC进行缺氧处理，促进HIF-1α高表达，得到含生长因子的条件培养基，
具体操作如下：HEK-293t细胞长至80％汇合度时，除去原有含血清的培养基，用PBS洗涤细胞后加入不含血清的DMEM基础培养基，放入培养箱中备用；取polybrene加入到opti-MEM中，另外将psPAX2、pMD2.G及HIF-1ɑ质粒混匀后加入到opti-MEM中，放置1-10min后将二者混合，室温再放置10-30min后加入到HEK-293t细胞中；1-24h后将培养基换成含血清的DMEM基础培养基，24-72h后收集培养基，离心后弃去沉淀，将上清过滤，所得滤液即为慢病毒悬液；将脂肪来源间充质干细胞长至70％-90％汇合度后除去原有含血清的培养基，PBS洗涤后加入慢病毒悬液，培养12-24h(具体可为24h)，弃去慢病毒悬液，PBS洗涤，加入无血清的DMEM基础培养基，低氧培养1-5天(具体可为5天)，得到含生长因子的条件培养基；
所述脂肪来源间充质干细胞为传代至P5代的脂肪来源间充质干细胞。
所述酸响应因子CG-CO2通过包括如下步骤的方法制备得到：将壳聚糖溶于水中，氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸溶于乙腈中，混合，惰性气氛中反应，得到CG固体；将二氧化碳通入CG水溶液中，得到CG-CO2，
其中氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸的结构式如下所示：
制备所述酸响应因子CG-CO2的方法中，反应完全后旋蒸除去溶剂，将旋蒸后的固体重新溶于水中，搅拌下加入四氢呋喃，抽滤除去THF，将得到的固体干燥，得到CG固体，
所述壳聚糖的分子量可为1-10kDa，具体可为3kDa；
壳聚糖与氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸的质量比可为1-5mg:1mg，具体可为8mg:5mg；
所述反应的时间可为1-36h，具体可为20-30h，更具体可为24h；
所述CG水溶液中CG的浓度可为1-5mg/mL，通二氧化碳的时间可为1-5h，具体可为1h。
上述促进血管再生的酸响应纳米材料通过包括如下步骤的方法制备得到：
将二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC和聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶于二氯甲烷中，加入转染HIF-1α的MSC条件培养基和CG-CO2，超声乳化，将乳化好的溶液加入到胆酸钠溶液中，超声，将得到的乳液加入到胆酸钠溶液中，固化并去除有机溶剂，得到负载转染HIF-1α的MSC条件培养基和酸响应因子CG-CO2的PLGA纳米颗粒，加入红细胞膜和血小板膜，挤出使得红细胞膜和血小板膜包覆到PLGA纳米颗粒表面，得到酸响应纳米材料。
上述方法中，所述DPPC与PLGA、条件培养基、CG-CO2中CG的配比依次可为50-100mg:50-100mg：10-50μL：0.01-0.05mg；
所述超声乳化通过功率为20％的细胞破碎仪实现，超声乳化的时间可为5min；
负载转染HIF-1α的MSC条件培养基和酸响应因子CG-CO2的PLGA纳米颗粒与红细胞膜和血小板膜的配比可为1mL：1-5μg：1-5μg，具体可为1mL：5μg：5μg。
上述酸响应纳米材料在制备促进血管再生的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中，所述促进血管再生的产品用于促进缺血部位的血管再生，主要用于治疗缺血性疾病(包括缺血性心脏病和下肢缺血)。
本发明首先利用慢病毒作为载体向MSC中转染HIF-1α质粒并对MSC进行缺氧处理，促进HIF-1α高表达，显著提高MSC的旁分泌功能，尤其是促血管新生因子的表达；另外，依据缺血部位的低pH水平以及PLGA纳米颗粒被细胞摄取后进入溶酶体后处于酸性环境这两个特点，制备可以酸响应引发炸弹效应而释放药物的PLGA纳米颗粒，实现药物递送系统在细胞内快速释放。具体来说是，将转染HIF-1α的MSC条件培养基与酸响应因子CG-CO2一起负载到PLGA纳米颗粒中制备成酸响应的纳米炸弹，利用CG-CO2的酸响应特性实现促血管生成活性因子的快速释放，促进血管的新生、减少炎症反应，从而达到快速治疗缺血性疾病的目的。
本发明发展一种基于HIF-1α调控MSC旁分泌促血管生成活性因子的纳米药物递送系统，并具备以下特性：1.进入病灶部位后实现酸响应的炸弹效应快速释放药物；2.MSC高表达血管生成生物活性因子；3.增强靶向缺血部位的能力。
附图说明
图1为本发明实施例1中慢病毒感染MSC的共聚焦图像。
图2为本发明实施例1中低氧培养3天的MSC中HIF-1ɑ表达情况及荧光强度对比。
图3为本发明实施例1中血管内皮细胞划痕实验及内皮细胞迁移率测定结果。
图4为本发明实施例1中血管内皮细胞成管实验及形成的主血管长度。
图5为本发明实施例2中CG合成路线图。
图6为本发明实施例2中壳聚糖和CG的傅里叶红外光谱图。
图7为本发明实施例2中壳聚糖和CG紫外吸收光谱图。
图8为本发明实施例3中CG-CO2合成路线图。
图9为本发明实施例3中CG及CG-CO2的Zeta电位。
图10为本发明实施例5中酸响应纳米材料的DLS粒径分布。
图11为本发明实施例5中酸响应纳米材料的TEM图像。
图12为本发明实施例5中酸响应纳米材料在PBS中的稳定性。
图13为本发明实施例5中酸响应纳米材料在酸性环境中1-6h的累积释放。
图14为本发明实施例5中酸处理后的酸响应纳米材料的SEM图像。
图15为本发明实施例6中酸响应纳米材料对血管内皮细胞的活力影响。
图16为本发明实施例6中酸响应纳米材料对心肌细胞的活力影响。
图17为本发明实施例7中酸响应纳米材料尾静脉注射到下肢缺血模型后在主要脏器中分布图像。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、高表达HIF-1ɑ的MSC制备
HEK-293t细胞长至80％汇合度时，除去原有含血清的培养基，用PBS洗涤细胞3次后加入10mL不含血清的DMEM基础培养基，放入培养箱中备用。取10μL的polybrene加入到50mL的opti-MEM中，另外取5μg的psPAX2、pMD2.G及HIF-1ɑ质粒(各5μg)混匀后加入到50mL的opti-MEM中，放置5min后将二者混合，室温再放置20min后加入到HEK-293t细胞中。24h后将培养基换成含血清的DMEM基础培养基，48h后收集培养基，3000g离心10分钟后弃去沉淀，将上清用0.20μm的滤器过滤，所得滤液即为慢病毒悬液。传代至P5代的脂肪来源间充质干细胞长至90％汇合度后除去原有含血清的培养基，用PBS洗涤细胞3次后加入5mL慢病毒悬液，放入培养箱中培养24h后弃去慢病毒悬液，PBS洗3遍后加入5mL无血清的DMEM基础培养基，低氧培养5天后收集含生长因子的条件培养基。
图1为慢病毒感染MSC的共聚焦图像(病毒与培养基1:1指慢病毒悬液与无血清的DMEM基础培养基的体积比为1:1)
2.条件培养基的表征
为了证明转染了HIF-1ɑ并低氧培养的MSC能够旁分泌更多的生长因子，利用SDS-PAGE对不同处理条件所收集的条件培养基(Con:未转染HIF-1ɑ常氧培养，No+Tra:转染HIF-1ɑ后常氧培养，Hy:未转染HIF-1ɑ低氧培养，Hy+Tra:转染HIF-1ɑ并低氧)进行了验证。结果表明，转染了HIF-1ɑ并低氧培养的MSC能够旁分泌更多的生长因子。为了进一步验证所收集的条件培养基相较于不转染HIF-1ɑ或不低氧培养MSC的条件培养基具有更强的促血管生成能力，利用收集到的条件培养基进行了血管内皮细胞划痕实验及内皮细胞成管实验。血管内皮细胞划痕实验具体步骤为：将血管内皮细胞消化后用1640培养基重悬并以合适的密度加到六孔板中，培养24h后用枪头笔直的划一条划痕，PBS洗三遍后加入不同条件下收集的条件培养基，置于培养箱中培养。分别在培养2h、4h、6h时用显微镜观察内皮细胞迁移情况。血管内皮细胞成管实验具体步骤为：用预的枪头将150μL的Matrigel基质胶加入到共聚焦皿中，放入37℃培养箱中30min，血管内皮细胞消化后用1640培养基重悬，以2.4x105的密度加入到基质胶上，培养箱培养6h后用显微镜观察成管情况。
图2为低氧培养3天的MSC中HIF-1ɑ表达情况及荧光强度对比；
图3为血管内皮细胞划痕实验及内皮细胞迁移率测定；
图4为血管内皮细胞成管实验及形成的主血管长度；
实施例2、壳聚糖胍酸CG的合成
将分子量为3kDa的壳聚糖800mg溶于10mL去离子水中，500mg的氨基甲烷硫代碘化甲酯溶于8mL乙腈中，将二者共同加入到双耳烧瓶中，经过三次冷冻通气除去氧气，最后通入氩气，搅拌反应24h后终止反应。反应中止后利用旋蒸除去溶剂；为了除去未反应的原料及副产物，将旋蒸后的到的固体重新溶于5mL去离子水中，搅拌状态下逐步加入20mL四氢呋喃(THF)，抽滤除去THF后将得到的固体置于真空干燥箱中干燥，48h后收集CG固体。
图5为CG合成路线图。
图6为壳聚糖和CG的傅里叶红外光谱图。
图7为壳聚糖和CG紫外吸收光谱图。
实施例3、壳聚糖胍基-二氧化碳(CG-CO2)的合成
为了制备壳聚糖胍基-二氧化碳(CG-CO2)，将二氧化碳通入1mg/mL的CG水溶液中1h，得到CG-CO2。
图8为CG-CO2合成路线。
图9为CG及CG-CO2的Zeta电位。
实施例4、酸响应纳米材料的制备
我们设计了一种酸响应的纳米颗粒，来携带干细胞旁分泌的生长因子，以实现保护生长因子不被降解且能靶向缺血部位并快速释放的目标。PLGA和DPPC都有较好的生物相容性以及形变能力，所以在这里我们选择PLGA以及DPPC作为纳米颗粒的相变材料，内部包载实施例1制备的含生长因子的条件培养基和实施例3合成的CG-CO2，酸响应纳米炸弹在pH5.0条件下会释放大量CO2，不断积累后会使纳米颗粒涨破从而释放出其中所包裹的分泌组分。纳米颗粒表面包裹血小板膜及红细胞膜，使纳米颗粒减少被免疫清除的同时还能靶向至缺血部位，在缺血部位更快速的释放包载的分泌组分，从而更有效的利用间充质干细胞分泌组分来促进血管的再生。
具体方法如下：将100mg的DPPC和100mg的PLGA溶于10mL二氯甲烷中，加入20μL的实施例1制备的条件培养基与20μL实施例3制备的CG-CO2溶液，调整细胞破碎仪功率为20％，超声5min乳化溶液，然后将乳化好的溶液加入到5mL的1％(质量浓度)胆酸钠水溶液中，继续以20％功率超声5min，将第二次得到的乳液加入到10mL的0.5％(质量浓度)胆酸钠水溶液中，搅拌6h固化并去除有机溶剂；6h后收集制备好的PLGA纳米颗粒，以13000rpm离心3min后除去上清，用PBS洗3遍。取1mL洗涤好的PLGA纳米颗粒，加入红细胞膜和血小板膜各5μg，用脂质体挤出器挤出20次将膜包覆到PLGA纳米颗粒表面制备成酸响应纳米材料。
实施例5、酸响应纳米材料的表征
利用DLS测定了酸响应纳米材料的粒径大小以及其在PBS中7天的粒径大小稳定性。我们用20mg标准蛋白替换实施例4中的条件培养基制备纳米颗粒中以测定纳米颗粒包载蛋白的能力以及释放包载组分的能力，酸响应纳米材料用酸处理6h后将释放的蛋白用SDS-PAGE表征并将纳米颗粒通过扫描电镜观察纳米颗粒的形貌，SDS-PAGE证明我们所制备的酸响应纳米材料在1-6h有明显的累计释放效果。扫描电镜结果表明酸处理过后的纳米颗粒表面出现孔状形变，表明我们所制备的酸响应纳米颗粒具有快速释药的能力。
图10为酸响应纳米材料的DLS粒径分布，其粒径为80-150nm。
图11为酸响应纳米材料的TEM图像。
图12酸响应纳米材料在PBS中的稳定性，从图中可以看出，在PBS中7天，纳米材料的粒径没有显著的变化，说明其稳定性好。
图13酸响应纳米材料在酸性环境中1-6h的累积释放。
图14酸处理后的酸响应纳米材料的SEM图像。
实施例6、酸响应纳米材料的细胞毒性
为了测定合成的酸响应纳米材料是否可以用于体内实验，我们将包膜前后的纳米颗粒分别作用于血管内皮细胞和心肌细胞，通过CCK-8测定了纳米颗粒处理过后的细胞毒性，结果显示包膜前后的纳米颗粒对血管内皮细胞及心肌细胞均无细胞毒性，故可以用于体内实验。
图15为酸响应纳米材料对血管内皮细胞的活力影响。
图16为酸响应纳米材料对心肌细胞的活力影响。
实施例7、酸响应纳米材料靶向下肢缺血能力
为了评估酸响应纳米材料靶向缺血部位的能力，我们利用小动物活体成像对缺血组织中不同纳米颗粒的分布进行观察。首相选取8周龄的雄性Balb/c小鼠进行下肢缺血(HI)建模，用4％的水合氯醛对小鼠进行麻醉，待小鼠麻醉后使用医用胶带将其四肢固定在手术板上，碘伏擦拭消毒左下肢，用手术剪沿小鼠左下肢根部向下剪开外层皮肤，用镊子将结缔组织剥离开，暴露股动脉、股静脉以及神经，小心将股动脉与股静脉和神经分离，用6-0缝合线在股动脉上缘和下缘分别进行结扎，并在两个结扎点中间位置剪断血管，随后进行伤口缝合，用生理盐水对创口进行擦拭并用碘伏对伤口及周围皮肤进行消毒。另外将浓度为0.02mg/mL的cy 5包载到PLGA纳米颗粒中，然后将一部分PLGA纳米颗粒包覆上血小板及红细胞杂化膜制备成具有靶向性的酸响应纳米材料，分别将不包膜的PLGA纳米颗粒(PLGA-NPs)和具有靶向性的酸响应PLGA纳米材料(PLGA-NPs@CM)通过尾静脉注射到下肢缺血的小鼠体内，12h后通过小动物活体成像系统观察不同纳米颗粒在体内各个器官的分布。
图17为酸响应纳米材料尾静脉注射到下肢缺血模型后在主要脏器中分布图像，由图可以，包覆有血小板及红细胞杂化膜的纳米材料具有显著的靶向缺血部位的能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种酸响应纳米材料包括：聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA纳米颗粒，负载在PLGA纳米颗粒内部的转染HIF-1α的MSC条件培养基和酸响应因子CG-CO2，以及包覆在PLGA纳米颗粒表面的红细胞膜和血小板膜；
其中，CG-CO2表示壳聚糖胍基-二氧化碳。
2.根据权利要求1所述的酸响应纳米材料，其特征在于，所述转染HIF-1α的MSC条件培养基通过包括如下步骤的方法制备得到：利用慢病毒作为载体向MSC中转染HIF-1α质粒并对MSC进行缺氧处理促进HIF-1α高表达，得到含生长因子的条件培养基。
3.根据权利要求2所述的酸响应纳米材料，其特征在于，所述转染HIF-1α的MSC条件培养基通过包括如下步骤的方法制备得到：HEK-293t细胞长至80％汇合度时，除去原有含血清的培养基，用PBS洗涤细胞后加入不含血清的DMEM基础培养基，放入培养箱中备用；取polybrene加入到opti-MEM中，另外将psPAX2、pMD2.G及HIF-1ɑ质粒混匀后加入到opti-MEM中，放置1-10min后将二者混合，室温再放置10-30min后加入到HEK-293t细胞中；1-24h后将培养基换成含血清的DMEM基础培养基，24-72h后收集培养基，离心弃去沉淀，将上清过滤，所得滤液即为慢病毒悬液；将脂肪来源间充质干细胞长至70％-90％汇合度后除去原有含血清的培养基，PBS洗涤后加入慢病毒悬液，培养12-24h，弃去慢病毒悬液，PBS洗涤，加入无血清的DMEM基础培养基，低氧培养1-5天，得到含生长因子的条件培养基。
4.根据权利要求1所述的酸响应纳米材料，其特征在于，所述酸响应因子CG-CO2通过包括如下步骤的方法制备得到：将壳聚糖溶于水中，氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸溶于乙腈中，混合，惰性气氛中反应，得到CG固体；将二氧化碳通入CG水溶液中，得到CG-CO2溶液，
其中氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸的结构式如下所示：
5.根据权利要求4所述的酸响应纳米材料，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为1-10kDa；
壳聚糖与氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸的质量比为1-5mg:1mg；
所述反应的时间为1-36h；
所述CG水溶液中CG的浓度为1-5mg/mL，通二氧化碳的时间为1-5h。
6.制备权利要求1-5中任一项所述的酸响应纳米材料的方法，包括如下步骤：
将二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC和聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶于二氯甲烷中，加入转染HIF-1α的MSC条件培养基和CG-CO2，超声乳化，将乳化好的溶液加入到胆酸钠溶液中，超声，将得到的乳液加入到胆酸钠溶液中，固化并去除有机溶剂，得到负载转染HIF-1α的MSC条件培养基和酸响应因子CG-CO2的PLGA纳米颗粒，加入红细胞膜和血小板膜，挤出使得红细胞膜和血小板膜包覆到PLGA纳米颗粒表面，得到酸响应纳米材料。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DPPC与PLGA、条件培养基、CG-CO2中CG的配比依次为50-100mg:50-100mg：10-50μL：0.01-0.05mg；
负载转染HIF-1α的MSC条件培养基和酸响应因子CG-CO2的PLGA纳米颗粒与红细胞膜和血小板膜的配比为1mL：1-5μg：1-5μg。
8.权利要求1-5中任一项所述的酸响应纳米材料在制备促进血管再生的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促进血管再生的产品用于促进缺血部位的血管再生。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促进血管再生的产品用于治疗缺血性疾病。
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