CN109846854A

CN109846854A - 一种爬行动物抗菌肽oh-cath30纳米粒和纳米纤维及其应用

Info

Publication number: CN109846854A
Application number: CN201910023121.0A
Authority: CN
Inventors: 高媛媛; 孙同毅; 李文辉; 邹鹏飞
Original assignee: Weifang Medical University
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-06-07

Abstract

本发明提供了一种爬行动物抗菌肽OH‑CATH30纳米粒和纳米纤维及其应用，本发明制备的纳米粒和纳米纤维能实现对Cathelicidin抗菌肽的二次包封，有效避免了抗菌肽被细胞和体内酶的快速降解，能较长时间发挥其生物学功能。本发明公开的纳米粒采用了静电液滴的制备方法，而纳米纤维采用了高压静电纺丝的方法，所述制备方法简单易行，包封率高。本发明制备的纳米粒和纳米纤维均有显著的抗菌活性，同时对促进细胞迁移、伤口愈合有显著的效果，可应用于抗细菌感染、促进伤口愈合的生物可降解伤口敷料的制备。

Description

一种爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒和纳米纤维及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒和纳米纤维及其应用。

背景技术

技术

皮肤作为人体最外层的保护组织，同时也是人体最大的器官，经常会受到外界的破坏从而造成皮肤的损伤。而皮肤伤口愈合和修复，以及瘢痕的形成，至今仍然是医学领域里各研究者和患者必须要面对的一个重大医疗问题，但目前仍没有找到一种行之有效且经济实惠的治疗手段来解决这一重大的医疗难题。

羧甲基壳聚糖是壳聚糖经羧甲基化反应后得到的一种壳聚糖衍生物，是一种两性聚电解质，具有优良的成膜性、水溶性、保湿性、生物相容性和生物降解性好等特点，同时也被视为是一种优良的药物载体，广泛用于食品、日化、医药领域中。O型羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan, CMCS)由于在C₆上引入羧甲基，极性增强，生理pH显电负性。阳离子抗菌肽可与CMCS可通过离子键、氢键和疏水作用相互结合。CMCS与壳聚糖（Chitosan,CS）按不同比例组合形成纳米凝胶（CMCS/CS-NGs），可改变带电特性，适用于不同等电点的肽类药物包载。

发明内容

本发明的目的是提供一种爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒和纳米纤维及其应用。本发明所提供的爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒、纳米吸纤维具有显著的抗感染、促进伤口愈合的效果，具有载药量高、显著延长包载物作用时间和作用效果。本发明利用纳米技术，通过对爬行动物Cathelicidin抗菌肽OH-CATH30的包载，构建形成纳米材料，所构建的纳米材料不仅可以维持OH-CATH30的活性、并实现局部缓释、防止过早降解失活、延长半衰期，很大程度上避免了肽类活性分子体内应用的缺陷。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒，它通过以下制备方法制得：

（1）用水分别配制羧甲基壳聚糖溶液和抗菌肽OH-CATH30溶液，过滤后灭菌；

（2）将所述羧甲基壳聚糖溶液转移至容器中，将装有所述抗菌肽OH-30溶液的注射器夹在静电纺丝仪器上，推注滴入容器中至推注完毕；

（3）将上述混合液在冰浴条件下超声；

（4）将超声后的混合液离心后再超声，反复两次，最后离心得到爬行动物Cathelicidin抗菌肽OH-CATH30纳米粒。

进一步的：所述步骤（2）中羧甲基壳聚糖与抗菌肽OH-CATH30的质量比是2：1。

进一步的：所述步骤（2）中羧甲基壳聚糖溶液的浓度为0.5 mg/mL -1.5mg/mL，所述抗菌肽OH-CATH30溶液的浓度为0.5 mg/mL -1.5mg/mL。

进一步的：所述步骤（2）中使用静电纺丝仪器的工艺条件是：22号直角针头，正电压0.65±0.02KV，温度25±3℃，湿度45±3%，推注速度0.3-0.7mm/min，转子转速200-300rpm，水平位置30-35cm，垂直高度30-35cm。

进一步的：所述步骤（3）中的超声时间为1-2分钟，功率为15-25W。

本发明还提供了利用所述的抗菌肽OH-CATH30纳米粒制得的爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米纤维，它通过以下制备方法制得：

（1）将壳聚糖溶于乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液；将聚乙烯醇溶于水中，恒温搅拌，得聚乙烯醇溶液；

（2）将DMSO、甘油和吐温80加入到上述聚乙烯醇溶液中，继续搅拌，后冷却至室温；

（3）将所述抗菌肽OH-CATH30纳米粒加入到步骤（1）的壳聚糖溶液中，混合均匀后，再加入到步骤（2）的混合液中继续搅拌；

（4）将上述溶液进行静电纺丝，形成抗菌肽纳米纤维，真空干燥去除溶剂。

进一步的：所述步骤（1）中搅拌温度为90-97℃，搅拌时间为1-2小时。

进一步的：所述步骤（2）中搅拌温度为80-85℃，搅拌时间为0.8-1.5小时。

进一步的：所述步骤（4）中静电纺丝的工艺参数如下：喷射器与接收器之间的距离为20-25cm，喷头高度为35-40cm，纺丝溶液的推注速度为0.02-0.04mm/min，接收电压为-1.45～-1.40KV，实验温度为室温，湿度为45％-50%。

本发明还提供了所述的抗菌肽OH-CATH30纳米粒或所述的抗菌肽纳米纤维在制备抗感染和促进细胞迁移、伤口愈合的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：本发明通过实验证明爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒和纳米纤维具有显著的抗感染作用，尤其是对临床耐药细菌具有很好的抑制作用，具有显著的抗菌效果。同时，制备的爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒和纳米纤维能显著加快皮肤伤口的愈合速度，可以应用于抗微生物感染、促进伤口愈合的伤口敷料的制备，用于人和动物的治疗，具有良好的市场应用前景。而且，所述爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒、纳米纤维的制备方法简单易行，包封率高，具有创新性。

附图说明

图1是本发明制备的爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒电镜图；

图2是本发明制备的爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米纤维电镜图；

图3是本发明制备的爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒抑菌效果图；

图4是本发明制备的爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒细胞划痕的作用效果图。

图5是本发明制备的爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米纤维伤口愈合效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1、爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒的制备以及包封率和缓释检测

1.爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒的制备

爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒的制备包括以下步骤：

（1）用去离子水分别配制浓度为1mg/mL的羧甲基壳聚糖（CMCS）溶液，及1mg/mL的抗菌肽OH-CATH30溶液，分别用0.22um微孔过滤膜过滤到灭好菌的EP管中。

本发明所用的抗菌肽OH-CATH30溶液，简称为OH-30溶液，所述抗菌肽OH-30的序列为：KFFKKLKNSVKKRAKKFFKKPRVIGVSIPF（SEQ ID No:1）。

（2）将上述一定量的CMCS溶液转移至已灭好菌的容器中，容器中内置转子；用5ml无菌注射器吸取相应比例的OH-30溶液，CMCS与抗菌肽OH-30的质量比例是2：1。

将静电纺丝仪器预先紫外灭菌30min。将装有抗菌肽OH-30溶液的无菌注射器夹在静电纺丝仪器上，加一定的正电压，推注滴入装有CMCS溶液的容器中，边滴入边用转子搅拌，至推注完毕。

静电液滴法优化的工艺条件是：22号直角针头，正电压0.65±0.02KV，温度25±3℃，湿度45±3%，推注速度0.5mm/min，转子转速250rpm，水平位置32cm，垂直高度32cm。

（3）将上述样品继续搅拌10分钟后，在冰浴的条件下放入超声破碎仪中超声1分钟，功率为20w左右，超声过程中超3秒，停2s。

（4）超声完成后，取出超声的样品放入已经预冷到4℃的离心机中，4℃条件下12000rpm离心10分钟，用一定去离子水吹打重悬，重复超声过程。取出超声的样品放入已经预冷到4℃的离心机中，4℃条件下12000rpm离心10分钟，得到Cathelicidin抗菌肽OH-CATH30纳米粒（简称为NP）。取上清溶液放置于4℃保存（作为检测未包裹进入CMCS材料的OH-30的量）。所述抗菌肽纳米粒电镜图如图1所示。图1结果显示，所述Cathelicidin抗菌肽OH-CATH30纳米粒的平均粒径在164.57±4.98 nm左右。

2.包封率的检测

包封率的检测使用CY5标记的抗菌肽OH-CATH30制备的纳米粒。具体方法为：使用荧光分光光度计测定荧光强度，实验平行3次（如当天不做，可放入-80℃冰箱中保存备用）。测得实验结果为：包封率达到92.2%，其中，包封率的计算公式为：包封率=（（总的OH30量-未包裹的OH30量）/总的OH30量）×100%。

实施例2、爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米纤维的制备

爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米纤维的制备方法如下：

（1）将2％（w / v）壳聚糖（CS）（0.1g）溶于1mL 15％（v / v）乙酸溶液中，搅拌至溶解。

（2）将9％（w / v）聚乙烯醇（PVA）（1.8g）溶于8.4mL去离子水并在95℃下在恒温下搅拌1.5小时。

（3）将1.4mL DMSO，0.1mL甘油和0.1mL吐温80加入上述PVA溶液中，并在80℃下继续搅拌1小时后冷却至室温。

（4）将实施例1制备得到的所述Cathelicidin抗菌肽纳米粒（纳米粒浓度为0.1-0.3%（w/v））加入到CS溶液中，混合均匀后加入PVA溶液中并磁力搅拌。继续磁力搅拌1小时后，静置除去气泡。

（5）最后，将上述溶液吸入5mL无菌注射器中进行静电纺丝。由纺丝溶液喷射形成的纳米纤维由箔包裹的接收器以正电压接收。所述抗菌肽纳米纤维电镜图如图2所示，图2结果显示，载有不同浓度纳米粒的纳米纤维直径在331.19-371.81nm之间。

静电纺丝的工艺参数如下：喷射器与接收器之间的距离为23cm，喷头高度为39cm，纺丝溶液的推注速度为0.03mm/min，接收电压为-1.44KV，实验温度为室温。湿度为45％。

实施例3、爬行动物Cathelicidin抗菌肽OH-CATH30纳米粒对不同细菌的作用

将待检测菌株在LB培养基中37℃过夜培养，次日接种到新鲜的LB培养基中，37℃继续培养至对数生长期（OD₆₀₀大约在0.9-1之间），然后用新鲜的LB培养基稀释到浓度约10⁶cfu/ml，备用。将上面得到的稀释好的菌液每孔100ul加入的新的96孔板中，然后加入预先制备好的所述抗菌肽OH-CATH30纳米粒（根据包封率预先计算好加入的纳米颗粒的量，使终浓度为100g/ml）与菌液混合均匀，设置空白对照组。于37℃培养12-14小时，酶标仪检测OD₆₀₀，计算抑制率。每个实验进行三次重复实验，实验结果见图3所示。图3结果显示，所述纳米粒对E. coli（ATCC 25922）有显著的抑菌性，在给药2h左右就可以达到99%以上的抑菌率；并在24h内保持持续的抑菌性。

实施例4、爬行动物Cathelicidin抗菌肽纳米粒的细胞迁移实验效果

采用人类永生化细胞（HaCaT）做细胞划痕迁移和Transwell迁移实验。

1. 细胞划痕迁移实验

首先，制备细胞悬液，调节细胞浓度为5×10⁵个/mL，加2mL到6孔板（康宁）中，摇匀过夜长满。次日，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗2-3次，加入1mL的2μmol/L的Calcein-AM染液，避光27℃孵育30min后，吸弃染液，PBS再洗2-3次。其次，使用枪头制备划痕，PBS洗去漂浮的细胞，加入相应的药物，放入37℃、5%CO₂培养箱培养。最后按0h、6h、12h、24h拍照取样。实验设置空白组、CMCS组、OH-30组、CMCS-OH-30 纳米粒（NP）组，实验结果见图4，图4结果显示，与其他组相比，CMCS-OH-30纳米粒组对促进细胞迁移有显著的效果，在给药12h后，细胞迁移率达到47±7.0%；给药24h后，细胞迁移率90±10%。

实施例5、小鼠皮肤创伤模型的建立

实验当天将成年健康的昆明小鼠（KM小鼠，20-25g，雌性）用4%的水合氯醛（0.1mL/10g ）麻醉。用儿童理发器（飞科，ER3300）剔除小鼠背部毛发，尽量保证理发器不会在背部造成的伤口影响后续实验的观察。然后在小鼠背部中线两侧距离其耳朵3-4cm的地方使用皮肤取样器分别制作一个直径0.7mm的圆形全皮层切除伤口。将载有不同浓度纳米粒的纳米纤维膜贴敷在皮肤伤口上，连续给药5天，跟踪拍照观察。这个实验过程中均采用无菌的手术器材，保证整个实验过程中没有外界病原菌的感染，使伤口愈合过程仅和自身及药物处理的愈合能力有关。同时，整个实验过程符合动物实验的有关操作规定。

实验结果如图5所示，图5小鼠皮肤结果显示，与空白对照相比，1mg·mL^-1（约1×1cm²）的纳米纤维膜在24 h内可明显提高模拟伤口愈合率；药物作用48 h后，模拟伤口愈合率可提高23.20 %。说明载有OH-30的纳米纤维膜可促进伤口愈合，并证实其对HaCaT 细胞无细胞毒性。连续给药5天后可明显促进伤口创面愈合，缩短创面愈合所需时间，提高创面愈合率；在创面形成后18天，纳米纤维膜组小鼠皮肤伤口愈合率可达98.09 %。研究结果显示，0.27%（w/v）纳米纤维明显有益于小鼠伤口皮肤愈合。

综上所述，本发明通过系列实验制备了爬行动物Cathelicidin抗菌肽OH30纳米粒及纳米纤维，制备的爬行动物Cathelicidin抗菌肽NA30纳米粒有显著抑制细菌的作用，可以应用于抗感染药物或产品的制备；同时，制备的爬行动物Cathelicidin抗菌肽OH30纳米材料有显著加快伤口愈合，可以应用于促进伤口愈合的伤口敷料制备。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 潍坊医学院

<120> 一种爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒和纳米纤维及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Cathelicidin)

<400> 1

Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys

1 5 10 15

Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe

20 25 30

Claims

1.一种爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒，其特征在于：它通过以下制备方法制得：

（3）将上述混合液在冰浴条件下超声；

2.根据权利要求1所述的爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒，其特征在于：所述步骤（2）中羧甲基壳聚糖与抗菌肽OH-CATH30的质量比是2：1。

3.根据权利要求1所述的爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒，其特征在于：所述步骤（2）中羧甲基壳聚糖溶液的浓度为0.5 mg/mL -1.5mg/mL，所述抗菌肽OH-CATH30溶液的浓度为0.5 mg/mL -1.5mg/mL。

4.根据权利要求1所述的爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒，其特征在于：所述步骤（2）中使用静电纺丝仪器的工艺条件是：22号直角针头，正电压0.65±0.02KV，温度25±3℃，湿度45±3%，推注速度0.3-0.7mm/min，转子转速200-300rpm，水平位置30-35cm，垂直高度30-35cm。

5.根据权利要求1所述的爬行动物抗菌肽OH-CATH30纳米粒，其特征在于：所述步骤（3）中的超声时间为1-2分钟，功率为15-25W。

6.利用权利要求1所述的抗菌肽OH-CATH30纳米粒制得的爬行动物抗菌肽纳米纤维，其特征在于：它通过以下制备方法制得：

7.根据权利要求6所述的爬行动物抗菌肽纳米纤维，其特征在于：所述步骤（1）中搅拌温度为90-97℃，搅拌时间为1-2小时。

8.根据权利要求6所述的爬行动物抗菌肽纳米纤维，其特征在于：所述步骤（2）中搅拌温度为80-85℃，搅拌时间为0.8-1.5小时。

9.根据权利要求6所述的爬行动物抗菌肽纳米纤维，其特征在于：所述步骤（4）中静电纺丝的工艺参数如下：喷射器与接收器之间的距离为20-25cm，喷头高度为35-40cm，纺丝溶液的推注速度为0.02-0.04mm/min，接收电压为-1.45～-1.40KV，实验温度为室温，湿度为45％-50%。

10.权利要求1-5任一项所述的抗菌肽OH-CATH30纳米粒或权利要求6-9所述的抗菌肽纳米纤维在制备抗感染和促进细胞迁移、伤口愈合的药物中的应用。