CN101766779B - 一种治疗白癜风的复方药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗白癜风的复方药物及其制备方法，是以维药补骨脂、驱虫斑鸠菊、高良姜、盒果藤四味药材为原料，加入药学上可接受的辅料，采用溶剂提取、浓缩、除杂等预处理和超微粉碎制成，该复方药是根据中医药理论，结合民族医药的特点，依据少数民族在长期的民间临床实践，采用简便合理的提取方法，使得每一味药材治疗白癜风的有效成分得以溶出，从提取工艺上保证了其药理作用的发挥。该复方药疗效确切、副作用少、复发率低、服用剂量小的，适用于片剂、胶囊剂、滴丸，为白癜风患者应用提供了方便。

Description

一种治疗白癜风的复方药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗白癜风的复方药物及其制备方法，属于民族医药学技术领域。

背景技术

白癜风是一种常见多发的色素性皮肤病，表现为局部或泛发性色素脱失。祖国医学很早就有关于本病的记载，公元601年隋代巢元方《诸病源候论》一书就已讲到：“白癜者，面及颈项身体皮肉变白，与肉色不同，亦不痛痒，谓之白癜。”白癜即现在的白癜风。白癜风在世界各地均有发生。发病率估计在1％左右。一般肤色浅的人发病率较低，肤色较深的人发病率较高。美国白人发病率为1％，丹麦为0.4％，日本为2％，而南印度高达4％。我国目前只有部分地区的资料，根据上海市11万人皮肤调查报告，白癜风占调查人数的0.54％。本病虽不影响患者正常生理活动，但影响美容，给病人造成的心理负担和精神痛苦仍是巨大的。因此，对本病的防治具有重要的意义。由于白癜风的发病机制尚不清楚，因此对白癜风的治疗仅停留在治标的阶段。目前对白癜风的治疗手段有限，总体上分为手术疗法和非手术疗法，非手术疗法包括光化学疗法、激素疗法、免疫抑制剂疗法和中药疗法；手术疗法包括自表皮移植、细胞移植、皮肤削磨等。采用光学疗法会对皮肤产生光毒性，易导致皮肤癌的发生；长期使用激素类药物或者免疫抑制剂等治疗会导致患者自身免疫和体液免疫下降等问题；手术疗法由于给病患带来痛苦、价格昂贵、要求技术条件高、成功率低等原因不能被广泛应用；中医中药治疗使用方便，应用范围广，不受部位、类型限制，维吾尔医药作为中华医药宝库中一枝奇葩，在对白癜风的发病机理上见解独特，在药物治疗上有特殊而显著的疗效。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种治疗白癜风的复方药物及其制备方法，该复方药是由维药补骨脂、驱虫斑鸠菊、高良姜、盒果藤四味药材为原料，加入药学上可接受的辅料，采用溶剂提取、浓缩、除杂等预处理和超微粉碎制成，该复方药是根据中医药理论，结合民族医药的特点，依据少数民族在长期的民间临床实践，采用简便合理的提取方法，使得每一味药材治疗白癜风的有效成分得以溶出，从提取工艺上保证了其药理作用的发挥。该复方药疗效确切、副作用少、复发率低、服用剂量小的，适用于片剂、胶囊剂、滴丸，为白癜风患者应用提供了方便。

本发明所述的一种治疗白癜风的复方药物，以制备1000g为基数，其中补骨脂5-30份，驱虫斑鸠菊8-25份，高良姜10-20份，盒果藤9-18份，辅料为淀粉、糊精、微晶纤维素、硬脂酸镁、聚维酮、羧甲基淀粉钠、甘油明胶、硬脂酸钠、植物油、甲基硅油、液体石蜡或虫胶6-29份制成。

所述的一种治疗白癜风的复方药物的制备方法，按下列步骤进行：

a、将经筛选好的补骨脂、高良姜、驱虫斑鸠菊药材混合粉碎至5-80目，用6-12倍量的溶剂提取1-4次，温度20℃-100℃，每次提取时间1-3小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，真空干燥或喷雾干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过60-120目药筛，备用；

b、采用常规的超微粉碎方法将盒果藤粉碎过200-400目的药筛，备用；

c、将步骤a和步骤b混合均匀，即得混合药粉；

d、将步骤c混合药粉与辅料充分混匀，按常规制药方法制成片剂、胶囊剂或滴丸即可。

步骤a提取溶剂为20-95％浓度的乙醇水溶液或水溶液。

本发明结合现代化的技术和方法，采用溶剂提取和超微粉碎技术，提高功效成分的提取率，使其符合药物在体内吸收、分布代谢的规律，提高药效。

本发明所述的一种治疗白癜风的复方药物，其特点为：组方独特，疗效确切、副作用少、制备工艺简单易行，具有通脉、理血，清除异常粘液质，促进皮肤着色，治疗白癜风之功效，适用于白癜风患者内服。

本发明所述的一种治疗白癜风的复方药物，其药理特性为：

所用补骨脂、驱虫斑鸠菊为主药，二者清除皮肤过盛或淤滞的异常粘液质，促进色素沉着，恢复皮肤颜色；补骨脂用于治疗白癜风已有很长的历史，研究发现，黑素细胞的迁移和黑素合成在白癜风复色过程中有重要作用。补骨脂对黑素细胞可溶性总蛋白合成和c-kit基因蛋白表达有促进作用。补骨脂酊剂在临床上用于白癜风的治疗，收到了良好的效果。目前，已将补骨脂提取物制成不同剂型对白癜风患者进行治疗，并且疗效显著。

驱虫斑鸠菊对白癜风的治疗作用，主要是通过抑制机体体液免疫和细胞免疫，降低机体对自身组织(如黑素细胞)的免疫反应，减少自身组织的损伤。此外，驱虫斑鸠菊对酪氨酸酶有激活作用，可提高皮肤对紫外线的敏感性，对酪氨酸酶活性和黑素生成量均呈剂量依赖性增强作用，它还直接补充局部微量元素，改善局部微循环。

高良姜、盒果藤燥湿祛寒，温胃消食，开通阻滞，作为辅助药，起到抗氧化、增强免疫功能的作用，间接治疗白癜风。

现代元素医学研究表明，铜、锌、铁、钙、镁、锰、锶、硒元素与白癜风发病相关性最大，而这几种元素又不同程度地分布于补骨脂、驱虫斑鸠菊、高良姜、盒果藤中，通过补充微量元素辅助治疗白癜风。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作详细说明：

实施例1(制备片剂，并以表的方式进行列举)

a、将经筛选好的补骨脂、高良姜、驱虫斑鸠菊药材混合粉碎至5目，用6倍量的水溶液提取1次，温度20℃，提取时间4小时，回收溶剂，浓缩，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过60目药筛，备用；

b、采用常规的超微粉碎方法将盒果藤粉碎过200目的药筛，备用；

c、将步骤a和步骤b混合均匀，即得混合药粉；

d、将步骤c混合药粉与辅料充分混匀，按常规制药方法制成片剂即可。

表1 制备0.5g的片剂

注：表中MCC，CMS-Na，PVP分别为微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，聚维酮。

实施例2(制备片剂，并以表的方式进行列举)

a、将经筛选好的补骨脂、高良姜、驱虫斑鸠菊药材混合粉碎至20目，用8倍量的20％浓度的乙醇水溶液2次，温度40℃，每次提取时间1.5小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，喷雾干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过80目药筛，备用；

b、采用常规的超微粉碎方法将盒果藤粉碎过250目的药筛，备用；

c、将步骤a和步骤b混合均匀，即得混合药粉；

d、将步骤c混合药粉与辅料充分混匀，按常规制药方法制成片剂即可见表。

表2制备0.4g的片剂

注：表中MCC，CMS-Na，PVP分别为微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，聚维酮。

实施例3(制备片剂，并以表的方式进行列举)

a、将经筛选好的补骨脂、高良姜、驱虫斑鸠菊药材混合粉碎至50目，用10倍量的40％浓度的乙醇水溶液提取3次，温度60℃，提取时间2小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过100目药筛，备用；

b、采用常规的超微粉碎方法将盒果藤粉碎过300目的药筛，备用；

c、将步骤a和步骤b混合均匀，即得混合药粉；

d、将步骤c混合药粉与辅料充分混匀，按常规制药方法制成片剂即可。

表3制备0.4g的片剂

注：表中MCC，CMS-Na，PVP分别为微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，聚维酮。

实施例4(制备片剂，并以表的方式进行列举)

a、将经筛选好的补骨脂、高良姜、驱虫斑鸠菊药材混合粉碎至80目，用12倍量的60％浓度的乙醇水溶液提取3次，温度80℃，每次提取时间2小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过120目药筛，备用；

b、采用常规的超微粉碎方法将盒果藤粉碎过350目的药筛，备用；

c、将步骤a和步骤b混合均匀，即得混合药粉；

d、将步骤c混合药粉与辅料充分混匀，按常规制药方法制成片剂即可。

表4制备0.4g的片剂

注：表中MCC，CMS-Na，PVP分别为微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，聚维酮。

实施例5(制备片剂，并以表的方式进行列举)

a、将经筛选好的补骨脂、高良姜、驱虫斑鸠菊药材混合粉碎至50目，用7倍量的80％浓度的乙醇水溶液提取4次，温度35℃，每次提取时间1小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，喷雾干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过120目药筛，备用；

b、采用常规的超微粉碎方法将盒果藤粉碎过400目的药筛，备用；

c、将步骤a和步骤b混合均匀，即得混合药粉；

d、将步骤c混合药粉与辅料充分混匀，按常规制药方法制成片剂即可。

表5制成0.3g的片剂

实施例6(制备片剂，并以表的方式进行列举)

a、将经筛选好的补骨脂、高良姜、驱虫斑鸠菊药材混合粉碎至70目，用9倍量的95％浓度的乙醇水溶液提取2次，温度100℃，每次提取时间1小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，真空干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过70目药筛，备用；

b、采用常规的超微粉碎方法将盒果藤粉碎过300目的药筛，备用；

c、将步骤a和步骤b混合均匀，即得混合药粉；

d、将步骤c混合药粉与辅料充分混匀，按常规制药方法制成片剂即可。

表6 制备0.3g的片剂

注：表中MCC，CMS-Na，PVP分别为微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，聚维酮。

实施例7(制备片剂，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例1，加入粘合剂，湿法制粒，整粒，以硬脂酸镁作为润滑剂，灌装成0号胶囊，胶囊重约0.3g。

表7

实施例8(制备胶囊，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例2，灌装成0号胶囊，胶囊重约0.3g。

表8

实施例9(制备胶囊，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例3，灌装成0号胶囊，胶囊重约0.3g。

表9

实施例10(制备胶囊，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例4，灌装成1号胶囊，胶囊重约0.25g。

表10

实施例11(制备胶囊，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例5，灌装成1号胶囊，胶囊重约0.25g。

表11

实施例12(制备胶囊，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例6，灌装成1号胶囊，胶囊重约0.25g。

表12

实施例13(制备滴丸，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例1，按常规制药方法制成滴丸。

表13

注：表中PEG为聚乙二醇。

实施例14(制备滴丸，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例2，按常规方法制成滴丸。

表14

注：表中PEG为聚乙二醇

实施例15(制备滴丸，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例3，按常规制药方法制成滴丸。

表15

注：表中PEG为聚乙二醇

实施例16(制备滴丸，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例4，按常规制药方法制成滴丸。

表16

实施例17(制备滴丸，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例5，按常规制药方法制成滴丸。

表17

实施例18(制备滴丸，并以表的方式进行列举)

制备方法同实施例6，按常规制药方法制成滴丸。

表18

实施例19：

1.实验材料

1.1实验动物

黑色豚鼠(250±20g)112只，雌雄各半。

1.2主要试剂

氢醌、过氧化氢、Dopa-氧化酶、鼠抗人酪氨酸酶单克隆抗体、DAB-H₂O₂、Elvision试剂

1.3主要实验仪器

光学显微镜(LEICA DM2500)、pH计(SartoriμsPB-10)、离心机(XYJ80-2)、全自动生化分析仪(Olympμs AM 400)、电子天平(JA1203)、生物组织摊烤片机(KZPG-1A)、生物组织包埋机(BMG-1)、切片机(RM2235)、粉碎机(ST-10B)、微波炉(Galanzwap700)、恒温水域锅(DK-8D)

2 方法

2.1试剂的配制 略

2.2给药：

治疗白癜风的复方药物高、中、低剂量的给药量分别为1160mg/kg、870mg/kg、580mg/kg。

阳性对照药给药剂量换算

白灵片人用量为12片每天，0.3g每片，即3600mg/70kg＝52mg/kg，折算到豚鼠的剂量＝5.42×52mg/kg＝282mg/kg·d

2.3具体试验方法

将上述112只黑色豚鼠，采用随机分组方案平均分为8组，每组雌雄各7只。脱去各组动物背部黑色毛5cm×5cm，将其中7组采用5％氢醌对黑色豚鼠进行皮肤脱色，第8组动物每天涂抹等量生理盐水，连续涂抹30天。

具体分组情况及实验方法如下：

①I组(高剂量组)

动物脱毛区涂抹5％氢醌，每次0.5ml，每天2次。采用氢醌脱色30天后，每只动物每天灌胃给复方药物混悬液1160mg/kg，连续观察给药30天。

②II组(中剂量组)

动物脱毛区涂抹5％氢醌0.5ml，每天2次。采用氢醌脱色30天后，每只动物每天灌胃给复方药物混悬液870mg/kg，连续观察给药30天。

③III组(低剂量组)

动物脱毛区涂抹5％氢醌0.5ml，每天2次。采用氢醌脱色30天后，每只动物每天灌胃给复方药物混悬液580mg/kg，连续观察给药30天。

④IV组(阳性药物对照组)

动物脱毛区涂抹5％氢醌0.5ml，每天2次。采用氢醌脱色30天后，每两只动物每天给白灵片564mg/kg，连续观察给药30天。

⑤V组(中剂量预防组)

动物脱毛区涂抹5％氢醌0.5ml，每天两次，连续涂抹30天。从氢醌脱色之日起，每只动物每天灌胃给复方药物混悬液870mg/kg，连续观察给药60天。

⑥VI组(自身恢复组)

动物脱毛区涂抹5％氢醌0.5ml，每天2次，连续涂抹30天。采用氢醌脱色30天后，动物不加任何药物干预，观察自身恢复情况，连续观察30天。

⑦VII组(模型组)

动物脱毛区涂抹5％氢醌0.5ml，每天两次，连续涂抹30天。采用氢醌脱色30天后，处死动物，观察各项指标。

⑧VIII组(正常对照组)

动物脱毛区涂抹生理盐水0.5ml，每天2次，连续涂抹30天。在其余各组开始药物干预开始，每只每天灌胃生理盐水2ml，连续观察给药30天。

以上各组动物每5天对受试区脱毛一次。

3.结果与分析

给药结束后，肉眼观察各组动物受试区皮肤颜色，处死动物，取皮肤组织，进行固定，石蜡包埋，切片后对黑素细胞进行Dopa-氧化酶染色和Lillie染色作豚鼠表皮黑素细胞(melanocyte，MC)数、含黑素颗粒基底细胞数、酪氨酸酶含量的观察。

3.1受试后肉眼观察动物受试区皮肤情况

3.1.1各氢醌脱色组动物受试区皮肤，较正常对照组动物受试区皮肤明显偏白。

3.1.2预防给药组动物皮肤，较其它氢醌脱色组动物受试区皮肤偏黑。

3.1.3自身恢复组动物皮肤，较其它氢醌脱色组动物受试区皮肤偏白。

3.1.4高、中、低给药剂量组、阳性对照药物组受试区皮肤肉眼观察无明显差别。

3.2表皮黑素细胞的观察

Dopa-氧化酶染色后，棕黑色染色为黑素细胞阳性。分别于光镜下测定每个高倍镜视野内各组MC数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中MC的平均数量。用SPSS软件对实验结果进行t检验统计学处理。

表1 表皮MC计数(x±s)

[注]*P＜0.05(与正常对照组比较)；△△P＜0.01(与模型组比较)；▲P＜0.05(与中剂量组比较)。

3.3含黑素颗粒的基底细胞计数

Lillie染色后，黑色素呈暗绿色为阳性，分别于光镜下测定各组含黑素颗粒的基底细胞数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中含黑素颗粒的基底细胞的平均数量。

表2 表皮含黑素颗粒基底细胞计数(x±s)

[注]**P＜0.01(与正常对照组比较)；△△P＜0.01(与模型组比较)。

3.4酪氨酸酶含量观察

酪氨酸酶阳性产物定位于细胞的细胞质内，显微镜下细胞内出现黄色或棕黄色颗粒、或团块状为阳性表达。采用二级计分法判定结果，阳性细胞计数＜5％为0分；5％-25％为1分；25％-50％为2分；50％-75％为3分；＞75％为4分。按染色强度分类：淡黄色1分；黄或深黄2分；褐或棕黄色3分。两者相加小于2分为阴性(-)，2-3分为阳性(+)，4-5分为中等阳性(2+)，6-7分为强阳性(3+)。各组动物皮肤之间的阳性率比较均采用Wilcoxon秩和检验，P≤0.05为差异有显著性差异。

表3 酪氨酸酶强度(x)

[注]**P＜0.01(与正常对照组组比较)；△△P＜0.01(与模型组比较)。

4讨论

正常MC定位于表皮基底层，黑素细胞起源于外胚层的神经嵴，在胚胎发育过程中通过间充质逐渐移行到表皮、毛囊、眼等处。黑素细胞的发育大致经历了神经嵴细胞、成黑素细胞和黑素细胞三个阶段。黑素细胞的数量或功能异常，将会引起许多色素性皮肤病，如白癜风。

有两种已知的机制可以导致黑素细胞的死亡：坏死和凋亡。坏死是外源性的细胞毒性因子引起的细胞破坏，以浸润的炎症细胞攻击细胞或组织为主要特征。细胞死亡的另一种方式是凋亡，或称为程序性死亡。凋亡是由细胞内部的一系列基因调控的重要机制，通过凋亡，多细胞生物能够控制局部细胞的数目。

白癜风的病因不明，有许多实验证据表明，特定的环境和化学物质对黑素细胞有选择性毒害作用，可能是白癜风发病的因素之一。苯酚和儿茶酚的芳香族和脂肪族产物，对体内外对黑素细胞有明显的毒性作用。本试验采用氢醌脱色法制造的白癜风动物模型，就是利用了苯酚和儿茶酚的芳香族对黑素细胞的选择性毒性，导致黑素细胞的坏死或者凋亡。

本试验采用一种治疗白癜风的复方药物治疗化学脱色所致的黑素细胞脱失的白癜风动物模型，通过治疗可以看出给药组动物皮肤受试区较未经药物治疗动物的黑素细胞明显增加，因此可以得出结论：该药可促进黑素细胞的生物修复或者生成。另外经药物治疗后，动物表皮基底层含黑素颗粒细胞较未经治疗组明显增多，表明该药可以促进黑素的生成。

在黑素细胞的黑素生物合成过程中，酪氨酸酶是黑素合成的关键酶，其活性决定着黑素合成的速度和产量。酪氨酸酶的表达定位于表皮基底部黑素细胞的细胞质，为黄或棕黄色颗粒，呈局部灶性或弥漫性分布。本试验显示与模型组动物受试区皮肤相比，高、中、低剂量给药组酪氨酸酶表达量明显增加，预防给药组动物皮肤受试区酪氨酸酶的表达含量同样高出模型组，说明这种治疗白癜风的复方药物对酪氨酸酶的表达有促进作用，可能是通过对酪氨酸酶表达的上调作用治疗白癜风。

实施例20

1实验材料

1.1实验动物

1.1.1家兔

成年健康新西兰兔8只(3.15±0.32kg)，雌雄各半。

1.1.2Wistar大鼠

Wistar大鼠16只(250±20g)，雌雄各半。

1.2细胞

A375黑素瘤细胞(购于中国科学研究院细胞库)

1.3主要试药与试剂

1.3.1试剂

DMEM培养液(GIBCO公司)、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT，美国Sigam公司)、小牛血清(杭州四季清生物公司)、二甲基亚砜(天津市光复化工研究所，070617)

1.3主要仪器

CO₂培养箱(MCO175)、酶标仪(550)、电子分析天平(Sartorius BS224S)、倒置显微镜(XT101)

2方法

2.1试剂的配制

2.1.1DMEM培养液

将一袋粉末状DMEM培养基溶于1000ml的超纯水中，按说明加入NaHCO₃3.7g，调节pH为7.2，超净工作台下蔡氏滤器过滤分装，然后加入灭活后的血清，使血清最终浓度为10％，同时加入青霉素、链霉素，使其终浓度分别为100U/ml，100μg/ml。

2.1.2 D-Hanker’s液的配制

NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na₂HPO₄·12H₂O 0.716g、KH₂PO₄0.06g、NaHCO₃ 0.35g、酚红0.01g

将上述试剂溶解于超纯水中，调pH至7.0-7.2，定容为1000ml。高压灭菌后，于超净台内加入滤过除菌的青霉素、链霉素，使其终浓度分别为100U/ml，100μg/ml，4℃冰箱保存待用。

2.1.3 MTT溶液

250mgMTT溶于50mlD-Hanker’s液中，无菌条件下过滤、分装。

2.1.4 血清的处理

将购买的小牛血清于恒温水浴锅中，56℃灭活30min。

2.2 实验方法

2.2.1 A375黑素瘤细胞的传代扩增

①新购细胞的换液

将新购买来的A375黑素瘤细胞，迅速置于超静工作台上，将培养瓶内的培养液轻轻倒出，然后向75cm细胞培养瓶内加入配制好的DMEM培养液后，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

②细胞的传代

观察细胞的生长，细胞长满至培养瓶底的80％时，进行传代。

向75cm²细胞培养瓶内加入0.5ml0.25％胰酶，轻轻摇晃，使液体充分浸润培养瓶内细胞，倒掉多余液体，迅速将培养瓶放置于培养箱中，3min后取出。然后显微镜下观察细胞，细胞蜷缩成团。

取出后立即加入含血清的DMEM培养液20ml，然后用无菌一次向注射器充分吹打，使细胞团分散，直至完全均匀。

然后将细胞悬液分装至两个新的75cm²细胞培养瓶，继续于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

③A375黑素瘤细胞的冻存

细胞传代至第三代后，取生长良好的细胞进行冻存。

(1)向75cm²细胞培养瓶内加入0.5ml 0.25％的胰酶，轻轻摇晃，使液体充分浸润培养瓶内细胞，倒掉多余液体，迅速将培养瓶放置于培养箱中，3min后取出。然后显微镜下观察细胞，细胞蜷缩成团。

(2)3min后将培养瓶取出，向瓶内加入20ml高糖完全DMEM培养液，然后用一次性注射器充分吹打，使细胞团分散，直至完全均匀。

(3)将吹打均匀的细胞悬液用1000μl移液枪吸取900μl，将吸取的细胞悬液置于冻存管后再加入100μl二甲基亚砜。

(4)将细胞冻存管无菌操作条件下标记、密封。

(5)将细胞冻存管放置于4℃冰箱中30min。

(6)于4℃冰箱中取出后置于-20℃冰箱中30min。

(7)于-20℃冰箱中取出后-80℃超低温冰箱中过夜。

(8)第二天置于液氮中冻存，并记录冻存日期与细胞品系。

2.2.2家兔含药血清的制备

①实验分组

将8只家兔分为给药组和空白对照组，每组雌雄各两只。

②家兔给药剂量

采用公式(mg/kg)dB＝dA*kB/kA(B：家兔 A：人)进行计算，得出家兔每公斤体重正常每日应用剂量为349mg，2.5kg家兔正常每日应用剂量为873mg。

采用家兔灌胃器，可容许的混悬浓度为25％。给药组动物每只每天灌胃给药30ml，家兔给药剂量相当于人用剂量的10倍。

③给药方法

给药组：每只家兔每天灌胃给药30ml，分两次给药。连续给药4天。

空白对照组：每只家兔每天灌胃生理盐水30ml，分两次给药。连续给药4天。

④血清的获得

上述各组动物于最后一次给药后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h静脉无菌取血，分离血清。

⑤血清的制备

将每只动物各个采血时段分离所得的血清经0.22μm微孔滤膜过滤，并且取各取血时段所得血清一部分，得到合并血清。然后每组取一雌一雄动物血清和一部分合并血清经56℃、30min灭活两只动物血清不做灭活处理。

2.2.3 家兔含药血清药效学评价

①取100μl传至第四代的A375黑素瘤细胞株悬液接种于96孔板内，其中第一列不接种，作为空白对照列。

②向细胞培养板内含细胞株的孔内分别加入各组动物各个取血时段分离的无菌灭活与未灭活血清40μl，每组血清加4个平行孔，同时设不加血清的A375黑素正常对照孔4个平行孔，每孔终体积140μl，正常对照孔加培养液加至140μl。

③将加样细胞37℃，5％CO₂培养72h。

④培养结束前4h加入MTT溶液(5mg/L)15μl，继续于37℃，5％CO₂培养箱中培养4h。

⑤终止培养后，弃去上清液，每孔加入100μl二甲基亚砜，沉淀充分溶解后，于酶标仪上测定各孔A值。

2.2.4大鼠含药血清的制备

①实验分组

将16只大鼠分为给药组和空白对照组，每组雌雄各半。

②大鼠给药剂量

采用公式(mg/kg)dB＝dA*kB/kA(B：大鼠 A：人)进行计算，得出大鼠每公斤体重正常每日应用剂量为674mg，300g大鼠正常每日应用剂量为202mg。

采用大鼠灌胃器，可容许的混悬浓度为15％。给药组动物每只每天灌胃给药10ml，大鼠给药剂量相当于临床人用剂量的7.5倍。

③给药方法

给药组：每只大鼠每天灌胃给药10ml，分两次给药。连续给药4天。

空白对照组：每只大鼠每天灌胃生理盐水10ml，分两次给药。连续给药4天。

④血清的获得

上述各组动物于最后一次给药后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h分别眼眦无菌取血，分离血清。

⑤血清的制备

将每只动物各个采血时段分离所得的血清合并后经0.22μm微孔滤膜过滤，然后每组血清的一部分经56℃、30min灭活处理，其余血清不做灭活处理。

2.2.5大鼠含药血清药效学评价

①取100μl传至第四代的A375黑素瘤细胞株悬液接种于96孔板内，其中第一列不接种，作为空白对照列。

②向细胞培养板内含细胞株的孔内分别加入各组动物各个取血时段分离的无菌灭活与未灭活合并血清40μl，每组血清加4个平行孔，同时设不加血清的A375黑素瘤细胞正常对照孔4个平行孔，每孔终体积140μl，正常对照孔加培养液加至140μl。

③将加样细胞37℃，5％CO₂ 培养72h。

④培养结束前4h加入MTT溶液(5mg/L)15μl，继续于37℃，5％CO₂培养箱中培养4h。

⑤终止培养后，弃去上清液，每孔加入100μl二甲基亚砜，沉淀充分溶解后，于酶标仪上测定各孔A值。

3结果

3.1家兔含药血清对A375黑素瘤细胞增殖的影响

表1家兔含药血清对A375黑素瘤细胞增殖的影响(x±s，n＝8)

[注]^△与I组比较p＜0.01；^▲与I组比较p＜0.05。

3.2大鼠含药血清对A375黑素瘤细胞增殖的影响

表2大鼠含药血清对A375黑素瘤细胞增殖的影响(x±s，n＝8)

[注]△p＜0.01(与I组比较)；▲p＜0.01(与I组比较)。

4讨论

通过本次试验，我们可以得出如下结论，以A375黑素瘤细胞为模型，采用血清药理学方法可以有效地评价治疗白癜风药物的药效。此次试验数据显示：(1)制备治疗白癜风复方药物的家兔含药血清，给药两小时后采血药物活性最强；(2)家兔含药血清不经灭活作用于细胞，活性强；(3)家兔、大鼠给药后得到的含药血清均对A375黑素瘤细胞的增殖有明显促进作用。

Claims (1)

1.一种治疗白癜风的复方药物，其特征在于以制备1000g为基数，其中补骨脂5-30份，驱虫斑鸠菊8-25份，高良姜10-20份，盒果藤9-18份，辅料为淀粉、糊精、微晶纤维素、硬脂酸镁、聚维酮、羧甲基淀粉钠、甘油明胶、硬脂酸钠、植物油、甲基硅油、液体石蜡或虫胶6-29份制成，具体操作按下列步骤进行：

a、将经筛选好的补骨脂、高良姜、驱虫斑鸠菊药材混合粉碎至5-80目，用6-12倍量的溶剂提取1-4次，温度20℃-100℃，每次提取时间1-3小时，合并提取液，回收溶剂，浓缩，真空干燥或喷雾干燥，即得干浸膏，粉碎成粉末，过60-120目药筛，备用，其中提取溶剂为20-95％浓度的乙醇水溶液或水溶液；

b、采用常规的超微粉碎方法将盒果藤粉碎过200-400目的药筛，备用；

c、将步骤a和步骤b混合均匀，即得混合药粉；

d、将步骤c混合药粉与辅料充分混匀，按常规制药方法制成片剂、胶囊剂或滴丸即可。