CN101736004A - 一种获得高纯度淀粉样多肽Aβ(1-40)的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体涉及一种获得高纯度淀粉样多肽Aβ_(1-40)的方法。目前，淀粉样多肽多为利用化学合成的手段获得，本发明首次采用生物工程方法表达可溶性的淀粉样多肽。本发明以smt3-polyQ基因为基础，构建表达质粒，转入大肠杆菌工程菌培养，收集菌体。菌体超声破菌、离心后用Ni柱纯化，经过superdex G-75分离纯化和除盐处理得到纯度达95％以上的融合蛋白。然后利用SUMO蛋白酶酶切，后经过镍柱分离纯化，再经过superdex G-75分离纯化和除盐处理可以得到野生型淀粉样多肽Aβ_(1-40)。

Description

一种获得高纯度淀粉样多肽Aβ(1-40)的方法

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白工程领域，涉及一种获得高纯度淀粉样多肽Aβ_(1-40)的方法。

背景技术

淀粉样多肽(amyloid beta peptide简称Aβ)Aβ是AD患者脑中老年斑的主要组成成分，在AD的发病机理的研究中占据着中心地位。Aβ是由其前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经分泌酶(secretase)切割产生的。

正常情况下，APP首先被α-分泌酶酶解后释放出一个大的可溶性胞外结构域APPα(soluble APPα，sAPPα)和一个跨膜片断C-83。然后，C-83再经γ-分泌酶裂解产生一个可溶性的小肽p3，我们称之为非Aβ途径(non-Aβpathway)。APP也可先在β-分泌酶的作用下产生一个可溶性的胞外分泌片断APPβ(soluble APPβ，sAPPβ)以及一个羧基末端片断(C-terminal fragment，CTFβ，又称C99)。然后γ-分泌酶作用于C99的N-端产生Aβ和一个APP胞内结构域(APP intracellular domain，AID)(Mattson MP.Cellular actionsof β-amyloid precursor protein and its soluble and fibrillogenicderivatives[J].Physiol Rev 1997，77(4)：1081-1132.)。我们将这条APP的裂解途径称为Aβ途径(Aβpathway)。但是由于γ-分泌酶切割位点的不同，导致了多种异构体的产生，其中最常见的当属Aβ_1-40和Aβ_1-42，前者是体液中可溶性Aβ的主要成分，而后者则是老年斑中沉积态Aβ的主要组分(Masters CL，Simms G，Weinman NA，Multhaup G，McDonald BL，Beyreuther K.Amyloid plaquecore protein in Alzheimer’s disease and Down syndrome[J].Proc Natl AcadSci U S A 1985，82(12)：4245-4249.)。Aβ_1-42相对于Aβ_1-40在C-端多出2个疏水性氨基酸：Ile41和Ala42。但是，Aβ-42比Aβ-40更容易聚集，神经毒性也更为剧烈(Dahlgren KN，Manelli AM，Stine WB，Jr.，Baker LK，KrafftGA，LaDu MJ.Oligomeric and fibrillar species of amyloid-β peptidesdifferentially affect neuronal viability[J].J Biol Chem 2002，277(35)：32046-32053；Bitan G，Kirkitadze MD，Lomakin A，Vollers SS，Benedek GB，Teplow DB.Amyloid beta protein(Aβ)assembly：Aβ40and Aβ42oligomerizethrough distinct pathways[J].Proc Natl Acad Sci U S A 2003，100(1)：330-335.；Murakami K，Irie K，Morimoto A，Ohigashi H，Shindo M，Nagao M，Shimizu T，Shirasawa T.Neurotoxicity and physicochemical properties ofAβmutant peptides from cerebral amyloid angiopathy：implication for thepathogenesis of cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer’s disease[J].J Biol Chem 2003，278(46)：46179-46187.)。虽然有许多证据表明Aβ在阿尔茨海默病的发病机理中起着非常重要的作用，但是到目前为止，Aβ的毒理机制还不是很清楚。为了更好的研究淀粉样多肽Aβ在阿尔茨海默病的发病机理中的作用，这就需要首先能获得高纯度的Aβ蛋白用于实验研究。到目前为止，各种文献显示实验中所用淀粉样多肽都是利用化学合成的手段获得，以下为淀粉样多肽的化学合成价格：

amyloid beta peptide 1-40，0.5mg，$248.30

amyloid beta peptide 1-42，0.5mg，$552.00

amyloid beta peptide 1-28，0.5mg，$173.20

正是由于高昂的价格使得很多科学研究望而止步，目前，尚无获得野生型的淀粉样多肽amyloid beta_(1-40)的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作比较简单，成本低，产率较高，纯度高的野生型淀粉样多肽Aβ_(1-40制备方法。

本发明提供了一种获得高纯度淀粉样多肽Aβ_(1-40)的方法，该方法依次包括以下步骤：

(1)将淀粉样多肽Aβ_(1-40)的核苷酸编码序列构建至表达载体中，并转化至大肠杆菌工程菌中；

(2)将(1)得到的工程菌接种于2YT培养液，常规培养7～12小时，然后用2YT稀释100倍后继续在37℃下扩大培养3～4小时，在OD₆₀₀＝0.8-0.9加入终浓度为约1mmol/l(例如1-1.1mmol)的IPTG，然后继续诱导培养8～10小时，离心收集菌体；

(3)菌体破菌，离心，过柱，除盐，得到融合蛋白；

(4)利用SUMO蛋白酶在4℃-8℃酶切，酶切混合物经过柱纯化，除盐处理，即可得到野生型淀粉样多肽Aβ_(1-40)。

本发明的方法中，步骤(1)中可以采用大肠杆菌作为工程菌表达淀粉样多肽Aβ_(1-40)。

本发明的方法中，表达载体可以是pET-28b(+)质粒，工程菌可以是大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的方法中，步骤(2)诱导培养可以采用加入IPTG至浓度1mM的方法。

本发明的方法中，可以以smt3作为融合蛋白的融合标签。

本发明的方法中，步骤(3)中可以采用静态酶切。

本发明的方法中，步骤(3)或者步骤(4)中过柱可以是先镍柱纯化，然后经过琼脂糖G-75纯化。

本发明的方法中，步骤(3)或者步骤(4)中除盐可以是用琼脂糖G-25进行除盐。

本发明的方法中，“淀粉样多肽Aβ_(1-40)核苷酸编码序列”是指编码具有淀粉样多肽Aβ_(1-40)(GENEBANK序列号是NP_000475)的核苷酸序列，如序列中开放阅读框位置核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于开放阅读框位置核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与开放阅读框位置核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出上述序列。

在本发明中，术语“淀粉样多肽Aβ_(1-40)”指具有淀粉样多肽Aβ_(1-40)活性的如(GENEBANK序列号是NP_000475.)的多肽。该术语还包括具有与上述蛋白具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括淀粉样多肽Aβ_(1-40)的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式还包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、淀粉样多肽Aβ_(1-40)核苷酸的融合蛋白、以及利用抗淀粉样多肽Aβ_(1-40)核苷酸血清获得的多肽或蛋白。

PET系列的商用载体是比较广谱的，本发明的方法中采用的表达载体和菌株可以采用该领域常用的表达载体和宿主菌。

把目标序列装入载体并转化菌株可以采用常规的方法。例如，在目标序列5‘和3’加入载体上已有的酶切位点，从而将编码序列插入载体的多克隆位点处。转化可采用热激转化。

本发明中，将表达淀粉样多肽Aβ_(1-40)的工程菌接种于2YT培养，可以采用常规的条件。2YT培养液可以采用常规的配方，例如：含有1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl(质量百分比)。

本发明的方法中，SUMO蛋白酶可以通过将蛋白酶cDNA序列构建到pET-28b(+)载体中然后利用E.coli BL21(DE3)工程菌表达蛋白，收集的菌体破菌离心后上清液利用镍柱纯化可以获得高纯度的SUMO protease。SUMOprotease质粒由Department of biophysics and biochemistry，Texas A&MUniversity，Pingwei Li教授惠赠。

本发明中，“静态酶切”是指常规酶切方法。

本发明中，纯化可以采用过镍柱和琼脂糖G-25再除盐。

本发明的实施例中，可以将表达淀粉样多肽Aβ_(1-40)的工程菌接种于2YT(含30μg/mL卡那霉素)培养液，37℃下快速振荡培养7～12小时，再用新鲜2YT(含30μg/mL卡那霉素)按1∶100比例稀释后，继续在37℃下扩大培养3～4小时。在此时间范围内，当A₆₀₀＝0.8-0.9时，加入ITPG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)至终浓度1.0mM，继续培养约8～10小时，离心收集菌体。

上述菌体超声破菌，离心后，上清液通过Ni-NTA亲和柱纯化，然后通过分子筛柱进一步分离纯化提高融合蛋白纯度，之后在4℃条件下加入适量的SUMOprotease酶切8小时左右，再利用镍柱和分子筛柱对酶切混合物进行分离纯化即可得到高纯度的Aβ_(1-40蛋白。

本发明的表达载体是pET-28b(+)质粒；工程菌是大肠杆菌BL21(DE3)；通过对蛋白与镍树脂结合后上柱的流出液进行SDS-PAGE分析检验蛋白与树脂的结合效果。

本发明用镍柱和分子筛柱分离纯化蛋白，利用本实验自己表达纯化得到的SUMO protease切除融合标签，最后通过分子筛柱在碱性洗脱液的条件下分离得到高纯度的Aβ_(1-40蛋白，收集目标蛋白经SDS-PAGE检验纯度可达95％以上。

本发明用生物工程方法表达Aβ_(1-40蛋白，镍柱和分子筛柱分离纯化、自制酶切割除去融合标签、得了高纯度的目标蛋白，纯度可达95％以上。本发明方法操作简单，与现有广泛采用的固相合成方法相比，成本大大降低；与之前利用甾酮立体异构酶(ketosteroid isomerase，KSI)作为融合标签在pET-31b载体中表达得到融合蛋白，然后通过CNBr裂解融合蛋白的方法相比，此法蛋白在上清液中，而KSI-Aβ_(1-40融合蛋白却在包涵体中，所以纯化更加容易；并且KSI-Aβ_(1-40融合蛋白的切割使用CNBr，所以此法相对安全一些；再者此法可以真正获得野生型的Aβ_(1-40，而不是突变体。所以，此方法的建立解决了淀粉样多肽Aβ在阿尔茨海默病的发病机理研究中的又一重大瓶颈，具有重要的意义。

具体实施方式

用大肠杆菌BL21(DE3)(瑞典Uppsala的Pharmacia生物技术公司提供)作为培养工程菌。

用构建在PET28b(+)载体上smt3-polyQ质粒作为模板，在EcoR I和xhoI双酶切下得到含有EcoR I和xho I双酶切位点的大片段，然后用PCR方法将保存在pGEX-4T-2载体上的Aβ_(1-40)的基因进行扩增，并且通过三次PCR将小片段基因序列扩增至融合标签smt3中间的EcoR I酶切位点，然后通过连接构建成表达质粒。

将表达质粒转入BL21(DE3)中，小规模培养后，与甘油溶液(65％(V/V)甘油，0.1M MgSO₄，25mM Tris-HCl，pH 8.0)1∶1混合均匀，制成甘油菌，-70℃长期保存。发酵前，将含表达质粒的BL21(DE3)从-80℃取出，接入新鲜2YT含(30μg/mL卡那霉素)中，37℃培养快速振荡(250rpm)培养9小时，按1∶100转接后于30℃继续扩大培养至A₆₀₀＝0.8-1.0，加入IPTG至终浓度1.0mM，继续培养9小时，4℃离心收集菌体。

菌体沉淀重悬于1×native纯化缓冲液(50mmol/l Na-Pi，500mmol/lNaCl，pH 8.0)中，加入适量的PMSF(苯甲磺酰氟化物)和DNA酶，加溶菌酶(1.5mg/g湿菌体)消化约1小时，然后在冰浴中超声破菌，随后高速离心，收集上清液。然后上清液于Ni-NTA树脂在4℃条件下低速搅拌结合2h，随后上柱，利用20倍柱床体积的native漂洗缓冲液(5mmol/l imidazole，50mmol/l Na-Pi，500mmol/l NaCl)漂洗洗脱杂蛋白，然后利用洗脱缓冲液(150mmol/l imidazole，50mmol/l Na-Pi，500mmol/l NaCl)洗脱目的蛋白。这样初步纯化后纯度可以达到80％左右，再利用superdex G-75分子筛柱在FPLC(快速液相色谱)上进一步分离纯化，收集有效组分后经G-25柱除盐处理即可以获得高纯度的smt3-Aβ_(1-40融合蛋白，融合蛋白在适量SUMO蛋白酶(Pingwei Li，Kathryn E Huey-Tubman，The structure of a polyQ-anti-polyQcomplex reveals binding according to a linear lattice model.NATURESTRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY.2007，14：381-387)在4℃条件下酶切过夜(酶切效率可以到达95％以上)，再利用镍柱分离切割混合物得到一定纯度的切割下来的Aβ_(1-40(包括单体形态和聚集物形态)，各种形态的Aβ混合物经superdex G-75分离，洗脱缓冲液选用50mmol/l NaOH溶液可以分离得到单体形态的Aβ_(1-40蛋白。

本发明中，所用较重要材料试剂来源如下：

融合表达体系的质粒载体pET-28b(+)，smt3-Aβ_1-40质粒，SUMO protease质粒由Department of biophysics and biochemistry，Texas A&M University，Pingwei Li教授惠赠，

E.coli BL21(DE3)菌株，pGEX-4T-2质粒购自Pharmacia Biotech公司(Uppsala，Sweden)。

Xho I，EcoR I限制性内切酶，T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司(Ipswich，MA，USA)。Pfu DNA聚合酶，dNTP，溶菌酶(lysozyme)，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalctoside，IPTG)，蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，卡那霉素以及琼脂糖购自上海生工公司(Sangon，Shanghai，China)。

胰蛋白胨(tryptone)及酵母提取物(yeast extract)购自Oxoid公司(Basingstoke，Hampshire，England)。

Ni-NTA树脂，抽质粒试剂盒(

Spin Miniprep Kit)以及胶回收试剂盒(

Gel Extraction Kit)购自Qiagen公司(Venlo，TheNetherlands)。

溴化氰(CNBr)购于Merck公司。

Superdex G-75，Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱购自Pharmacia Biotech公司(Uppsala，Sweden)。

其它试剂均为分析纯，所有溶液都用二次蒸馏水配制。

Claims (8)

1.一种获得高纯度淀粉样多肽Aβ_(1-40)的方法，其特征是，该方法依次包括以下步骤：

(1)将淀粉样多肽A β_(1-40)的核苷酸编码序列构建至表达载体中，并转化至大肠杆菌工程菌中；

(2)将(1)得到的工程菌接种于2YT培养液，常规培养7～12小时，然后用2YT稀释100倍后继续在37℃下扩大培养3～4小时，在OD₆₀₀＝0.8-0.9加入终浓度为1mM的IPTG，然后继续诱导培养8～10小时，离心收集菌体；

(3)菌体破菌，离心，过柱，除盐，得到融合蛋白；

(4)利用SUMO蛋白酶在4℃-8℃酶切，酶切混合物经过柱纯化，除盐处理，即可得到野生型淀粉样多肽Aβ_(1-40)。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤(1)中采用大肠杆菌作为工程菌表达淀粉样多肽Aβ_(1-40)。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述的工程菌是大肠杆菌BL21(DE3)，相应的表达载体是pET-28b(+)质粒。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤(2)诱导培养采用加入IPTG至浓度1mM的方法。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，以smt3作为融合蛋白的融合标签。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤(3)中采用静态酶切。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤(3)或者步骤(4)中过柱是先镍柱纯化，然后经过琼脂糖G-75纯化。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤(3)或者步骤(4)中除盐是用琼脂糖G-25进行除盐。