CN101732441A - 一种预防肥胖症和降低高血脂的柳茶有效部位提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药领域，具体地，本发明涉及一种预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的柳茶有效部位提取物及其制备方法和用途。根据本发明的预防肥胖症，所述柳茶有效部位提取物通过包括以下步骤和方法获得：(1)清洗并粉碎；(2)以水浸提得到水提总浸膏；(3)以甲醇或乙醇溶解总浸膏；(4)以氯仿或二氯甲烷萃取；(5)然后用乙酸乙酯萃取被氯仿或二氯甲烷脱脂后的水溶液，减压浓缩得有效部位。本发明提供了柳茶提取物中能够预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的有效部位-乙酸乙酯浸膏，其可以抑制前体脂肪细胞增殖和分化，起到预防肥胖作用。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域，具体地，本发明涉及一种预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物及其制备方法和用途。
背景技术
随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，人类营养状况得到大幅度改善，肥胖和高胆固醇血症已成为影响人类健康的关键问题，寻找有效的预防和/或治疗肥胖和高胆固醇血症的中药有效成分已成为本领域关注的热点。
肥胖(obesity)是指长期能量摄入超过消耗，导致体内过多的能量以脂肪的形式储存，脂肪的聚集达到损害健康的程度。肥胖与许多重大疾病如糖尿病、心脑血管疾病、癌症、睡眠呼吸暂停综合症以及骨关节炎等相关。
高血脂症是一种全身性疾病，是指血中总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低。脂质不溶或微溶于水，必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在，因此，高血脂症通常为高脂蛋白血症，即血清脂蛋白浓度升高。目前已经公认高血脂症，包括高胆固醇血症(Hypercholesterolemia)、高甘油三脂血症(Hypertriglyceridemia)及二者都高的复合性高血脂症。
世界卫生组织已宣布肥胖是全球最大的慢性疾病。美国肥胖的流行比例最高，有35％的人口确定为肥胖。至少有9700万美国人，为超重或肥胖，从1960年以来这个数字在持续增长，趋势不会减慢。在欧洲，英国是肥胖增长率最高的国家之一，为18％。紧接着是法国和德国，在全世界总共有2.5亿以上的人口患有肥胖症。而且，肥胖与死亡率有关，在美国每年因肥胖而导致死亡的人数在300,000人。
加强对肥胖病因、发病机制及防治药物的研究已成为21世纪面临的最大公共卫生挑战之一。
在整体水平，能量吸收和能量消耗失衡导致肥胖，在细胞水平，肥胖是由脂肪细胞的数目增多和体积增大所致，脂肪细胞的增多是由于前脂肪细胞的不断增殖和分化所引起，脂肪细胞的体积反映了在特定细胞中脂质分解和合成之间的平衡。而肥胖和高血脂的共同特点是脂肪细胞数目过量增多，因此寻找一种能够抑制脂肪细胞增殖和分化的药物对于肥胖症的防治和降低高血脂将起到非常重要的作用。预防肥胖对于有肥胖倾向人群是十分必要的。
脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]是一种特殊独立的血浆脂蛋白。已发现在血栓性疾病、肾脏疾病、糖尿病患者的脂蛋白(a)血清水平明显高于一般人群，但目前故尚无确切降低脂蛋白(a)浓度的药物。因此寻找能够确切降低脂蛋白(a)浓度的药物实属当务之急。
柳茶为藏族民间常用药物，以蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花(Sibiraea angustata(Rehd.)Hand-Mazz.)或鲜卑花(Sibiraea laevigata(L.)Maxim.)的叶和嫩枝入药，具清胃热、助消化、调节脂代谢的功效。目前已有“柳茶水提取物对K562肿瘤细胞生长的影响”、“柳茶提取物免疫调节作用的实验研究”、“柳茶对小鼠抗氧化能力及免疫器官影响的实验观察”、“柳茶对CCl4肝损伤的保护作用及机理初探”和“柳茶调节脂类代谢作用的研究”等报道，但是还未见“预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物”的报道。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物。
本发明的再一目的是提供上述提取物的制备方法。
本发明的再一目的是提供上述预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物的用途。
根据本发明的预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的柳茶有效部位提取物通过包括以下步骤的方法获得，
1)清洗并粉碎柳茶原料；
2)以水浸提粉碎后的柳茶、并浓缩，得到柳茶水提总浸膏；
3)以甲醇或乙醇溶解所述柳茶水提总浸膏，并加水分散，得到醇溶液；
4)以氯仿或二氯甲烷萃取所述醇溶液；
5)用乙酸乙酯萃取被氯仿或二氯甲烷脱脂后的水溶液，所得乙酸乙酯萃取液即为所述能预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物。
根据本发明的柳茶有效部位提取物，其中，在步骤2)中，以水冷浸或热提方法浸提柳茶原料。
根据本发明的柳茶有效部位提取物，其中，在步骤2)中，水与柳茶原料的质量比为8∶1～15∶1。
根据本发明的柳茶有效部位提取物，其中，所述方法还包括浓缩所述乙酸乙酯萃取液得到浸膏的步骤。
根据本发明的预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物的制备方法包括以下步骤：
1)清洗并粉碎柳茶原料；
2)以水浸提粉碎后的柳茶、并浓缩，得到柳茶水提总浸膏；
3)以甲醇或乙醇溶解所述柳茶水提总浸膏，并加水分散，得到醇溶液；
4)以氯仿萃取所述醇溶液；
5)用乙酸乙酯萃取被氯仿脱脂后的水溶液，所得乙酸乙酯萃取液即为所述能预防肥胖症和降低高血脂的柳茶有效部位提取物。
根据本发明的方法，其中，在步骤2)中，以水冷浸或热提方法浸提柳茶原料。
根据本发明的方法，其中，在步骤2)中，水与柳茶原料的质量比为8∶1～15∶1。
本发明还提供了预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)药物，所述药物包括上述的预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物。
本发明还提供了上述柳茶有效部位提取物在制备用于预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的药物中的应用。
本发明的发明人通过涉及适当的提取方案找到了柳茶提取物中能够预防肥胖症和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的有效部位一乙酸乙酯萃取液或浸膏，其可以抑制前体脂肪细胞增殖和分化，起到预防肥胖和治疗高血脂症的作用，从而拓宽了柳茶提取物的医药用途，同时也提供了一种安全有效的预防肥胖症和和治疗高胆固醇血症(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)浓度，改善血液粘稠度)的药物。
附图说明
图1为MTT法检测柳茶乙酸乙酯提取物不同时间(A)和不同浓度(B)处理对3T3-L1前脂肪细胞的细胞增殖率的影响，DM：分化诱导培养基；SAA：柳茶乙酸乙酯提取物；SAA100：100mg/ml SAA。
图2流式细胞术检测柳茶乙酸乙酯提取物处理对3T3-L1前脂肪细胞的细胞周期的影响，GM：生长培养基；DM：分化诱导培养基；SAA：柳茶乙酸乙酯提取物；SAA100：100mg/ml SAA；SAA200：200mg/ml SAA。
图3油红O染色观察柳茶乙酸乙酯提取物处理对3T3-L1脂肪细胞分化的影响，DM：分化诱导培养基；GW9662：PPARγ抑制剂；SAA：柳茶乙酸乙酯提取物；SAA50：50mg/ml SAA；SAA100：100mg/ml SAA；SAA200：200mg/ml SAA。
图4半定量逆转录-聚合酶链反应(A)及实时定量逆转录-聚合酶链反应(从左至右依次为Con、Tro、SAA50、SAA100、SAA200)(B)检测柳茶乙酸乙酯提取物处理对3T3-L1脂肪细胞分化相关基因表达的影响，Con：空白对照；Tro：曲格列酮，PPARγ激动剂；SAA：柳茶乙酸乙酯提取物；SAA50：50mg/ml SAA；SAA100：100mg/ml SAA；SAA200：200mg/ml SAA；FAS：脂肪酸合成酶基因；PPARγ：过氧化物酶增殖物受体γ。
具体实施方式
实施例1、制备柳茶有效部位提取物
干燥或新鲜柳茶(蔷薇科植物窄叶鲜卑花(Sibiraea angustata(Rehd.)Hand.-Mazz.)或鲜卑花(Sibiraea laevigata(L.)Maxim.)为原料，清洗、粉碎后，分别用水冷浸和热提两种方法提取，水与原料的比例分别为8∶1～15∶1。
1、冷浸：室温下将粉碎的原料用水浸提，时间为12～24小时，过滤，滤渣再次在室温下浸提，时间为6～12小时，滤去残渣，合并两次滤液，滤液浓缩后得浸膏。
2、热提：将原料用水加热回流提取半小时到1小时，然后过滤，滤渣再次用水加热回流半小时，合并两次滤液，滤液浓缩后得浸膏。新鲜柳茶水提总浸膏的出膏率(8.0～8.5％)，干燥柳茶水提总浸膏的出膏率(10～11％)。
总浸膏用甲醇(或乙醇)溶解，加水分散(水∶醇＝8∶1)，然后用氯仿(或二氯甲烷)萃取5次(每次水∶氯仿＝3∶1v/v)，目的脱脂，除去无效成分，被氯仿脱脂后的水溶液进一步用乙酸乙酯萃取3～6次(每次水∶乙酸乙酯＝3∶1v/v)，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩后得乙酸乙酯有效部位浸膏(占总浸膏的4.8～5.0％)备用，弃去剩余的无效水溶性成分。
实施例2、柳茶乙酸乙酯提取物抑制前脂肪细胞的增殖与分化
1)MTT法检测前脂肪细胞的增殖：采用100mg/mL、200mg/mL实施例1制备的柳茶乙酸乙酯提取物分别处理3T3-L1前脂肪细胞，MTT结果显示，柳茶乙酸乙酯提取物对前脂肪细胞的增殖产生明显的抑制作用，并有明显的时间和剂量依赖效应，如图1所示。
2)流式细胞仪检测细胞周期：采用100mg/mL、200mg/mL实施例1制备的柳茶乙酸乙酯提取物分别处理3T3-L1前脂肪细胞，分别进行细胞周期检测，结果表明：柳茶乙酸乙酯提取物能阻止细胞进入S期，从而抑制前脂肪细胞的数目的增多，如图2所示。
3)油红染色检测脂肪细胞分化程度：诱导分化8天后，空白对照组细胞呈现典型的脂肪细胞表型，90％以上的细胞中富含较大脂滴，而在实施例1制备的柳茶乙酸乙酯提取物处理组，仅10％～20％的细胞出现较大脂滴，其油红着色明显较空白组淡，油红能与中性脂肪结合，这表明柳茶乙酸乙酯提取物处理的细胞的脂肪含量明显少于空白组。提示柳茶乙酸乙酯提取物能抑制细胞内脂质的积累，抑制细胞分化，如图3所示。
4)半定量逆转录-聚合酶链反应(sRT-PCR)及实时定量逆转录-聚合酶链反应(Realtime PCR)检测脂肪细胞分化相关基因：半定量RT-PCR结果分析表明，3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中加入实施例1制备的柳茶乙酸乙酯提取物，其靶基因(过氧化物酶增殖受体PPARγ等)mRNA表达量明显降低；同样，实时定量PCR结果分析表明，柳茶乙酸乙酯提取物可以降低脂肪细胞分化的相关基因的表达。
实施例3、柳茶乙酸乙酯提取物对不同生长时期小鼠的影响
A.对生长期小鼠的影响：
实验方法：4周龄昆明小鼠50只，体重12-15g，随机分为5组(空白对照，阳性药物对照组和3个实验药物剂量组)每组10只。除基础饲料外，3个实验组每天灌胃给予不同剂量的柳茶乙酸乙酯提取物的稀释液，剂量折合成人(50Kg)每天用药量(g/w)的80％、100％和120％给药；阳性药物对照组每天灌胃给予康尔瘦胶囊粉溶液，剂量计算同上；空白对照组每天灌饲与实验组相同体积的蒸馏水。饲养8天，每天称重一次。
实验结果显示，柳茶乙酸乙酯提取物对生长期小鼠的增重有明显的抑制作用，抑制效果呈剂量关系。
B.对肥胖型小鼠的影响：肥胖型小鼠40只，体重36-45g，随机分为4组，每组10只。除基础饲料外，实验组每天灌胃给予中等剂量的柳茶乙酸乙酯提取物稀释液，2个药品对照组每天分别灌胃给予康尔瘦及苗条霜胶囊粉溶液，空白对照组每天灌饲与实验组相同体积的蒸馏水。饲养8天，每天称重一次，结果如以下表1所示。
表1
注：I、II、III组是剂量依次增加的实验组
实验结果显示，柳茶乙酸乙酯提取物对肥胖型小鼠有明显的减重作用。
实施例4柳茶乙酸乙酯提取物对血脂异常患者作用初步观察
观察方法：将柳茶乙酸乙酯萃提取物与药用辅料混合，制备成颗粒，装1号胶囊，每粒相当生药10克。受试人群按每次2粒，每日3次，连续服用30天；观察期间保持平日的生活和饮食习惯。在观察前后各采静脉血1次，测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度胆固醇(HDL-C)和低密度胆固醇(LDL-C)；血脂异常严重、且经济条件允许者做全血分析，增项测定脂蛋白(a)[Lp(a)]、全血粘度(mpas)。
试验对象：志愿参加观察、年龄在31～71岁、患有高胆固醇血症的成年30名，其中女性11名。
观察结果：观察组30例中，TG降低者18例，TC降低者28例，HDL-C升高者24例，LDL-C降低者30例。3例测定脂蛋白(a)[Lp(a)]、全血粘度(mpas)者用药后Lp(a)含量显著下降，mpas值均恢复到正常值范围。
典型病例1：
| 性别 | 女 | 年龄 | 70 |
| 用药前血化验时间 | 2008-4-29 | 历史病历 | 高血脂 |
| 用量 | 2粒×3次/天 | 用药开始时间 | 2008-5-01 |
| 血化验时间 | 2008-6-10 | 化验项目 | 全血分析 |
用药前后血检验结果对比表
| 项目 | 用药前结果(29/04) | 参考值 | 用药后结果(10/06) | 说明 |
| 葡萄糖 | 5.37 | 3.85-6.05 | 5 |
| 项目 | 用药前结果(29/04) | 参考值 | 用药后结果(10/06) | 说明 |
| 甘油三脂(TG) | 5.35 | 0.38-1.61 | 5.2 | 降低 |
| 血清总胆固醇(TC) | 6.4 | 3.36-5.68 | 5.6 | 恢复正常值 |
| 高密度胆固醇(HDL-C) | 1.08 | 1.07-1.9 | 0.85 | |
| 低密度胆固醇(LDL-C) | 3.39 | 0-3.1 | 1.66 | |
| 载脂蛋白A1 | 1.31 | 1.22-1.61 | 1.3 | |
| 载脂蛋白B | 1.31 | 0.69-1.05 | 1.09 | |
| 脂蛋白(a) | 833 | 0-300 | 384 | 大幅度降低 |
| 全血粘度：低切 | 11.01 | 5.5-8.86 | 6.54 | 恢复正常值 |
| 全血粘度：中切 | 6.63 | 3.99-5.12 | 4.24 | 恢复正常值 |
| 全血粘度：高切 | 5.2 | 3.27-4.32 | 3.89 | 恢复正常值 |
| 血浆粘度 | 1.45 | 1.09-1.51 | 1.31 | |
| 红细胞压积 | 40 | 34-45 | 38 | |
| 全血还原粘度：低切 | 23.9 | 8.16-25.72 | 13.76 | |
| 全血还原粘度：中切 | 12.94 | 6.59-13.04 | 7.71 | |
| 全血还原粘度：高切 | 9.38 | 4.78-9.79 | 6.8 | |
| 红细胞聚集指数 | 2.12 | 1.55-2.73 | 1.68 | |
| 红细胞刚性指数 | 6.46 | 3.71-5.61 | 5.2 | 恢复正常值 |
| 红细胞变形指数 | 1 | 0.65-0.96 | 0.93 | 恢复正常值 |
| 红细胞电泳指数 | 5.29 | 4.35-6.29 | 4.42 |
| 项目 | 用药前结果(29/04) | 参考值 | 用药后结果(10/06) | 说明 |
| 血小板聚率(1) | 48 | 40-80 | 48 | |
| 血小板聚率(5) | 63 | 45-80 | 57 | |
| 血小板聚率M | 68 | 45-85 | 58 |
典型病例2：
| 性别 | 男 | 年龄 | 47 |
| 用药前血化验时间 | 2006-11-07 | 历史病历 | 高血脂 |
| 用量 | 2粒×3次/天 | 用药开始时间 | 2006-11-10 |
| 血化验时间 | 2006-12-11 | 化验项目 |
用药前后血检验结果对比表
| 项目 | 用药前结果(07/11) | 参考值 | 用药后结果(11/12) | 说明 |
| 甘油三脂(TG) | 3.5 | 0.38-1.61 | 3.0 | |
| 血清总胆固醇(TC) | 5.6 | 3.36-5.68 | 4.8 | |
| 高密度胆固醇(HDL-C) | 1.0 | 1.07-1.9 | 1.2 | |
| 低密度胆固醇(LDL-C) | 3.9 | 0-3.1 | 3.0 |
柳茶异常毒性检查
按2000年药典异常毒性检查法检查
1、昆明小鼠，每个药品五只；
2、供试品：实施例1制备柳茶有效部位提取物；
3、按照常规的急毒试验进行检测；
4、结果，正常饲养，观察48小时内未见死亡。
Claims (9)
1.一种预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的柳茶有效部位提取物，其特征在于，所述提取物通过包括以下步骤的方法获得，
1)清洗并粉碎柳茶原料；
2)以水浸提粉碎后的柳茶、并浓缩，得到柳茶水提总浸膏；
3)以甲醇或乙醇溶解所述柳茶水提总浸膏，并加水分散，得到含醇水溶液；
4)以氯仿或二氯甲烷萃取所述水溶液；
5)用乙酸乙酯萃取被氯仿或二氯甲烷脱脂后的水溶液，所得乙酸乙酯萃取液，减压浓缩即为所述能预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的柳茶有效部位提取物。
2.根据权利要求1所述的柳茶有效部位提取物，其特征在于，在步骤2)中，以水冷浸或热提方法浸提柳茶原料。
3.根据权利要求1所述的柳茶有效部位提取物，其特征在于，在步骤2)中，水与柳茶原料的质量比为8∶1～15∶1。
4.根据权利要求1所述的柳茶有效部位提取物，其特征在于，所述方法还包括浓缩所述乙酸乙酯萃取液得到浸膏的步骤。
5.一种预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的柳茶有效部位提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)清洗并粉碎柳茶原料；
2)以水浸提粉碎后的柳茶、并浓缩，得到柳茶水提总浸膏；
3)以甲醇或乙醇溶解所述柳茶水提总浸膏，并加水分散，得到醇溶液；
4)以氯仿萃取所述醇溶液；
5)用乙酸乙酯萃取被氯仿脱脂后的水溶液，所得乙酸乙酯萃取液，减压浓缩即为所述能预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的柳茶有效部位提取物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，以水冷浸或热提方法浸提柳茶原料。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，水与柳茶原料的质量比为8∶1～15∶1。
8.一种预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的柳茶有效部位提取物。
9.权利要求1所述的预防肥胖症和治疗高胆固醇血症的柳茶有效部位提取物在制备用于预防肥胖症，以及治疗高胆固醇血症的药物中的应用。
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