CN103265515B

CN103265515B - 窄叶鲜卑花酸甲及其立体异构体、应用

Info

Publication number: CN103265515B
Application number: CN201310165535.XA
Authority: CN
Inventors: 何兰; 梁国兴; 王彩芳; 龚兵; 李敏锋
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-05-08
Also published as: CN103265515A

Abstract

本发明涉及化合物领域，具体地，涉及窄叶鲜卑花酸甲及其立体异构体、应用。本发明提供了如通式（1）所示的化合物：其中，X为H、NH₄ ⁺、碱金属离子、C_1-5的烷基、C_1-5的羟基烷基，C2及C4分别为R及S构型，或S及S构型，或S及R构型。具有抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖分化和降脂减肥的作用，提供了可用于肥胖症以及肥胖引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合症等疾病的药物以及与上述疾病有关的医药和保健品用途。

Description

窄叶鲜卑花酸甲及其立体异构体、应用

技术领域

本发明涉及化合物领域，具体地，涉及窄叶鲜卑花酸甲及其立体异构体、应用。

背景技术

肥胖症是一种慢性疾病，在世界范围内其发病率在逐年上升。肥胖症与许多重大疾病如高血压、糖尿病、心脑血管疾病、癌症、睡眠呼吸暂停综合症等有密切关系，特别是当肥胖指数BMI超过40以后，其死亡率会急剧增加。

肥胖是脂肪细胞过多或多大所致，一般情况下，脂肪细胞到了青春期后就不再增加。一个成年人体内大约有300亿个白色脂肪，功能是将能量以脂肪细胞的形式储存起来，每个脂肪细胞中，都含有三酸甘油脂，俗称脂肪球，脂肪球量变大，脂肪细胞体积就扩增，造成肥胖。前脂肪细胞3T3-L1能特异性地诱导分化成成熟的脂肪细胞，是研究功能性成分对体外脂肪细胞增殖分化过程的重要的细胞模型。

窄叶鲜卑花（Sibiraea angustata(Rehd.)Hand.-Mazz）为蔷薇科鲜卑花属植物，为藏族民间常用药物，其叶和嫩枝入药，又名柳茶，具有清胃热、助消化、调节脂代谢的功效以及其提取物具有抗氧化作用。

本发明人对窄叶鲜卑花进行提取以及溶剂萃取，得到有效部位提取物，对有效部位提取物通过硅胶色谱法反复纯化，得到具有抑制前脂肪细胞增殖分化的一个活性化合物，又经1D NMR、2D NMR、ESI-MS、HR-ESI-MS及X-ray单晶衍射技术确定其立体化学结构，该结构为前人未报道的结构新颖的单萜酸化合物窄叶鲜卑花酸甲，本发明人并通过合成的方法制备了具通式（1）的窄叶鲜卑花酸甲及其立体异构体及其其衍生物，通式（1）化合物具有抑制前脂肪细胞增殖分化的活性，因此可用于肥胖症以及由肥胖引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合症等疾病的预防和治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抑制前脂肪细胞增殖分化活性的化合物窄叶鲜卑花酸甲及其立体异构体。

本发明的另一目的是提供窄叶鲜卑花酸甲及其异构体及其衍生物用于预防和治疗肥胖症以及由肥胖引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合症等疾病的药物以及与上述疾病有关的医药和保健品用途。

本发明制备的窄叶鲜卑花酸甲及其异构体及其衍生物，其通式如下：

其中，X为H、NH₄ ⁺、碱金属离子、C_1-5的烷基、C_1-5的羟基烷基，C2及C4分别为R及S构型，或R及R构型，或S及S构型，或S及R构型。碱金属离子为Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Li⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ca²⁺或Zn²⁺。

其中，化合物窄叶鲜卑花酸甲（(2R,4S)-2-(2-methylprop-1-enyl)

-tetrahydro-2H-pyran-4-carboxylic acid），C2及C4分别为R及S构型，其结构如式（2）：

式（2）主要来源于窄叶鲜卑花（Sibiraea angustata(Rehd.)Hand.-Mazz），其可以是窄叶鲜卑花任一部位，即可以是根、茎、叶、花、果实、种子，也可以是混合部位，优选地上部分。

根据本发明具体实施方式，式（2）化合物的提取方法包括以下步骤：

（1）取干燥粉碎的窄叶鲜卑花叶和嫩枝，用热水(可以用甲醇（10-70%）水溶液、乙醇（10-70%）溶液、丙酮（10-70%）溶液)回流提取，减压浓缩除去溶剂得半流体状浸膏；

（2）半流体状浸膏加水分散后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯进行萃取，浓缩萃取液，得石油醚浸膏、二氯甲烷浸膏及乙酸乙酯浸膏；

（3）对乙酸乙酯浸膏经硅胶柱色谱，采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得A、B及C三部分浸膏。对B浸膏再次经硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯（10：1至1：1，体积比）洗脱，得化合物（2）粗品。化合物（2）粗品经反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱（洗脱用甲醇（10%-70%）水溶液梯度洗脱），得纯品化合物（2）。化合物（2），白色晶状固体，可溶于氯仿、丙酮、甲醇、乙醇，分子量为184，可以用分子式C₁₀H₁₆O₃表示，命名为窄叶鲜卑花酸甲。

根据本发明，通式（1）化合物的具体合成步骤如下：

（1）将三乙酰化葡萄糖烯和甲醇钠（或者乙醇钠、氢氧化钠），加入溶剂（甲醇、乙醇或丙酮）中，反应温度-4℃至100℃下，搅拌，反应时间30min至12h，停止反应，蒸去溶剂，残留物用硅胶柱色谱纯化，得产物葡萄糖烯（2-（羟甲基）-3，4-二氢-2H-吡喃-3，4-二醇）。

（2）将步骤（1）中产物葡萄糖烯溶于溶剂（氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙腈或丙酮）中，加入吡啶或浓硫酸，再加入乙酸或乙酸酐，反应温度-4℃至100℃下，搅拌，反应时间30min至24h，停止反应，真空除去溶剂，残留物用硅胶柱色谱纯化，得产物二乙酰化葡萄糖烯。

（3）将步骤（2）中产物二乙酰化葡萄糖烯和吡啶，在氮气保护下，加入无水乙腈中，再加入PhOCSCl，反应温度-4℃至100℃下，搅拌，反应时间30min至24h，停止反应，蒸去溶剂，残留物用硅胶柱色谱纯化，得产物2-乙酸酯甲基-3–苯基硫代甲酸基氧基-4乙酰氧基-3,4-二氢吡喃。

（4）将步骤（3）中产物2-乙酸酯甲基-3–苯基硫代甲酸基氧基-4乙酰氧基-3,4-二氢吡喃与三丁基氢化锡和偶氮二异丁腈（AIBN）在无水甲苯（苯或者二氯甲烷）溶剂中搅拌，加热回流2至6个小时，停止反应，除去溶剂，残留物用乙酸乙酯萃取，用食盐水洗涤，水洗，干燥，再次减压除去溶剂。残渣经硅胶柱色谱纯化，得产物2-（乙酰氧基甲基）-4-乙酰氧基-3,4-二氢吡喃。

（5）将步骤（4）中产物2-（乙酰氧基甲基）-4-乙酰氧基-3,4-二氢吡喃和甲醇钠（或者乙醇钠、氢氧化钠），加入溶剂（甲醇、乙醇或丙酮）中，反应温度-4℃至100℃下，搅拌，反应时间30min至12h，停止反应，真空除去溶剂，残留物用硅胶柱色谱纯化，得产物2-（羟甲基）-3,4-二氢吡喃-4-醇。

（6）将步骤（5）中产物2-（羟甲基）-3,4-二氢吡喃-4-醇，加Pd/C催化剂，在甲醇或者乙醇溶液中，25-55℃条件下，搅拌4-12个小时。停止反应，用硅藻土过滤，除去不溶物，除去溶剂，即可得到产物2-（羟甲基）-四氢吡喃-4-醇。

（7）将步骤（6）中产物2-（羟甲基）-四氢吡喃-4-醇溶于N，N-二甲基甲酰胺中，依次加入TBSCl及咪唑（三乙胺或者吡啶），混合物在室温下搅拌6-12个小时，用浓盐水洗涤，后用乙酸乙酯萃取，再用水洗，无水硫酸钠干燥，氯仿/甲醇=30:1柱层析分离，得到无色液体产物2-（（叔丁基二甲基甲硅烷氧基）甲基）-四氢吡喃-4-醇。

（8）将步骤（7）中产物（2R，4S）-2-（（叔丁基二甲基甲硅烷氧基）甲基）-四氢吡喃-4-醇溶于二氯甲烷（三氯甲烷或者四氢呋喃）中，冰水浴下加入三乙胺或者吡啶，充分搅拌条件下，滴入苯甲酰氯溶液。恢复至室温，搅拌过夜。停止反应，经柱层析，得到无色液体产物2-（（叔丁基二甲基甲硅烷氧基）甲基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯。

（9）将步骤（8）中产物2-（（叔丁基二甲基甲硅烷氧基）甲基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯与四丁基氟化铵在四氢呋喃或者乙醚溶液中混合搅拌，温度控制在25-45℃，反应时间0.5-4小时，停止反应，过滤除去不溶物，真空除去溶剂，残渣经硅胶柱层析分离，得到产物2-（羟甲基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯。

（10）将步骤（9）中产物2-（羟甲基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯从醇氧化到醛，可以通过Dess-martin氧化反应、Swern氧化反应或者PCC氧化反应实现。Dess-martin氧化，步骤（9）中产物于Dess-martin试剂混合，25-40℃条件下，搅拌4-8小时，用硅藻土过滤，除去不溶物，残留液旋干柱层析分离得到纯品2-甲酰基-四氢吡喃-4-苯甲酸酯。Swern氧化利用二甲基亚砜（DMSO）做氧化剂和有机碱（如三乙胺，吡啶）在低温（-70℃）下与草酰氯反应，再将步骤（9）中产物2-（羟甲基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯注射到反应体系中，搅拌2-4个小时，停止反应，水洗，乙酸乙酯洗，干燥，柱层析分离得到纯品2-甲酰基-四氢吡喃-4-苯甲酸酯。PCC氧化，步骤（9）中产物于PCC试剂混合，25-40℃条件下，搅拌4-8小时，用硅藻土过滤，除去不溶物，除去溶剂残渣经硅胶柱层析分离得到产物2-甲酰基-四氢吡喃-4-苯甲酸酯。

（11）无水无氧条件下，将三苯基异丙基溴化磷，在-60℃下与正丁基锂反应两个小时，升温到室温，再加入步骤（10）中产物2-甲酰基-四氢吡喃-4-苯甲酸酯，混合液搅拌过夜。停止搅拌，静置，过滤除去不溶物三苯氧膦。除去溶剂，残渣经硅胶柱层析分离，得产物2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯。

（12）步骤（11）中产物2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯与氢氧化钠或者氢氧化钾在乙醇或者甲醇中搅拌，室温至40℃之间，搅拌2至4个小时,过滤除去不溶物，除去溶剂，残渣经硅胶柱层析，得到产物2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-醇

（13）将步骤（12）中产物2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-醇在二氯甲烷或者四氢呋喃中与对甲苯磺酰氯，加入NaH或者氢氧化钠，常温搅拌4至8小时，过滤除去不溶物，除去溶剂，经硅胶柱层析分离得到产物2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-对甲苯磺酸酯。

（14）步骤（13）中产物2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-对甲苯磺酸酯与四丁基氢化铵、氰化钠或者氰化钾在无水乙腈或者甲苯中加热回流，反应持续8至12个小时，柱层析分离得到产物2-（2-甲基丙-1-烯基）-4-氰基-四氢吡喃。

（15）步骤（14）中产物2-（2-甲基丙-1-烯基）-4-氰基-四氢吡喃在氢氧化钠、氢氧化钾或者氢化钠的乙醇（或者甲醇）溶液中搅拌回流8至12个小时，得到产物2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-羧酸（窄叶鲜卑花酸甲或乙或丙或丁）。

本发明的特点是:提供了一种全合成窄叶鲜卑酸甲及其异构体及其衍生物的方法；还提供了从窄叶鲜卑花中提取窄叶鲜卑花酸甲的方法；化合物（2）及其异构体及其衍生物（见通式（1）），具有抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖分化和降脂减肥的作用，提供了可用于肥胖症以及肥胖引起的的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合症等疾病的药物以及与上述疾病有关的医药和保健品用途。

附图说明

图1所示是化合物（2）的¹H NMR谱，（400MHz，CD₃OD）δ。

图2所示是化合物（2）的¹³C NMR谱，（100MHz，CD₃OD）δ。

图3所示是化合物（2）的HSQC谱。

图4所示化合物（2）的HMBC谱。

图5所示化合物（2）的NOESY谱。

图6所示化合物（2）的HR-ESI-MS谱。

图7所示化合物（2）的X-ray单晶衍射图

图8所示是化合物（2）对前脂肪细胞3T3-L1的早期克隆增殖分化抑制作用。

图9显示油红O染色法研究化合物（2）处对前脂肪细胞3T3-L1的分化抑制（490nm处吸光度值）。

具体实施方式

实施例1窄叶鲜卑花酸甲的制备

取干燥粉碎的窄叶鲜卑花叶和嫩枝10kg，用热水(可以用甲醇（20-100%）水溶液、乙醇（20-100%）溶液、丙酮（20-100%）溶液)回流提取，减压浓缩除去溶剂得1.15kg半流体状浸膏。

半流体状浸膏加水（1L）分散后，依次用石油醚（3×1L）、二氯甲烷（3×1L）、乙酸乙酯（3×1L）进行萃取，浓缩萃取液，得石油醚浸膏（150g）二氯甲烷浸膏（420g）、乙酸乙酯浸膏（210g）。

对乙酸乙酯浸膏（100g）经硅胶柱色谱,采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得A（36g）、B（44g）、C（8g）三部分浸膏。对B浸膏经硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯（10：1至1：1，体积比）洗脱，并反复重复此步骤，得化合物（2）粗品（0.8g）。化合物（2）粗品经反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱（洗脱用甲醇（50%-90%）水溶液梯度洗脱），得纯品化合物（2）（55mg），其收率为0.00055%。化合物（2），白色晶状固体，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯及氯仿，[α]_D ²⁰，分子量为184，可以用分子式C₁₀H₁₆O₃表示，经查阅2007版Scifinder系统，该化合物为新化合物，命名为窄叶鲜卑花酸甲（(2R,4S)-2-(2-methylprop-1-enyl)-tetrahydro-2H-pyran-4-carboxylic acid）。化合物（2）采用1D NMR、2D NMR、ESI-MS、HR-ESI-MS以及X-ray单晶衍射（见附图1-7）等方法确定其立体分子结构，其¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ4.10(1H,td,J=9.6,2.0Hz,H-2β),1.40(1H,dd,J=12.0,12.7Hz,H-3α),1.82(1H,m,H-3β),2.62(1H,tt,J=12.0,4.0Hz,H-4β),1.82(1H,m,H-5β),1.61(1H,dq,J=12.8Hz,4.6Hz,H-5α),4.00(1H,ddd，J=12.0，8.0，1.2Hz，H-6α)，3.53(1H,td，J=12.0，2.0Hz,H-6β)，5.15(1H,brd，J=8.0Hz，H-7)，1.73(3H,d，J=1.0Hz，H-9)，1.70(3H,d，J=1.1Hz，H-10)；¹³CNMR(100MHz,CD₃OD)δ75.4（C-2）,35.7（C-3）,41.6（C-4）,29.5（C-5）,68.0（C-6）,126.7（C-7）,137.2（C-8）,25.8（C-9）,18.5（C-10）,178.2（C-11）。

实施例2窄叶鲜卑花酸甲及窄叶鲜卑花酸乙的制备

（1）往500ml单口瓶中加入27.2g（2R，3S，4R）-3,4,6-三-O-乙酰基-D-己烯糖和0.54g甲醇钠，加入200ml甲醇溶液，室温下充分搅拌2h。充分反应后，过滤除去固体，除去溶剂，残留物用柱层析分离（CHCl₃/MeOH=10:1）得无色液体产1-1（14.3g）。

化合物1-1（（2S，3R，4S）-2-（羟甲基）-3,4-二羟基–3,4-二氢吡喃）：IR(KBr)(cm^-1)υ3480,3020,2958,1632,1100,985;¹H NMR(400MHz,Acetone)δ6.31(dd,J=6.0,1.0Hz,1H),4.72(d,J=4.7Hz,1H),4.68(dd,J=6.0,2.1Hz,1H),4.43(d,J=5.3Hz,1H),4.19(s,1H),4.08(t,J=6.0Hz,1H),3.88(ddd,J=11.8,5.0,2.9Hz,1H),3.85-3.78(m,1H),3.77-3.71(m,1H),3.67(dt,J=14.4,7.2Hz,1H);¹³C NMR(101MHz,Acetone)δ143.35,103.80,78.89,70.06,69.35,61.29;TOF MS(EI)m/z[M]+146.

（2）将步骤（1）中4.3g产物1-1溶于50ml的无水二氯甲烷中，加入2.37ml的吡啶，冰水浴条件下，再将5.56ml的乙酸酐用二氯甲烷稀释并逐滴滴加到上述混合液中。全部滴加完毕后，恢复至室温，搅拌过夜。反应停止后，除去溶剂，残渣用200-300目硅胶柱层析分离，洗脱体系采用石油醚：乙酸乙酯=5:1，分离得到无色液体产物1-2（6.0g，26mmol），产率88%。

化合物1-2（（2R，3S，4R）-2-乙酸酯甲基-3–羟基-4乙酰氧基-3,4-二氢吡喃）：m.p.68-69℃；IR(KBr)(cm^-1)υ3564,3105,2870,1720,1226,859；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ6.43(d,J=6.1Hz,1H),5.33(d,J=5.0Hz,1H),4.91(dd,J=7.7,6.1Hz,1H),4.81(dd,J=6.1,3.0Hz,1H),4.34(dd,J=12.2,6.2Hz,1H),4.24-4.15(m,1H),4.09(dd,J=12.3,2.5Hz,2H),2.08(s,3H),2.05(s,3H);¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ170.00,169.39,142.39,103.80,73.43,70.16,63.95,61.55,20.67,20.44;HRMS(TOF MSESI):m/z:calcd for C₁₀H₁₄O₆Na[M+Na]⁺253.0688,found:253.0689。

（3）氮气保护下，将步骤（2）中4.6g产物1-2和4.8ml吡啶溶于无水乙腈中，在搅拌条件下，加入氯化硫代甲酸苯酯，室温下继续搅拌2小时。反应停止后，用乙腈稀释，依次用1M HCl溶液、饱和NaHCO3、NaCl洗涤，无水硫酸钠干燥，除去溶剂。残渣用柱层析分离，洗脱用石油醚/乙酸乙酯=5:1，得淡黄色液体产物1-3（6.58g，88%）。

化合物1-3（（2R，3S，4R）-2-乙酸酯甲基-3–苯基硫代甲酸基氧基-4乙酰氧基-3,4-二氢吡喃）：m.p.203-205℃；IR(KBr)(cm^-1)υ3080,3040,2865,1612,1530,1170；¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.43(t,J=7.8Hz,2H),7.30(dd,J=15.9,8.5Hz,1H),7.11(d,J=7.8Hz,2H),6.54(d,J=6.2Hz,1H),5.79(t,J=5.4Hz,1H),5.52(t,J=4.1Hz,1H),4.96(dd,J=6.1,3.7Hz,1H),4.57-4.47(m,2H),4.28(q,J=5.8Hz,1H),2.11(s,3H),2.08(s,3H);¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ194.10,170.51,170.09,153.41,145.80,129.63,126.81,121.74,98.47,76.18,73.21,66.13,61.05,21.06,20.90;MS ESI m/z[M+Na]⁺389.1。

（4）将步骤（3）中产物1-3(4.28g)和偶氮二异丁腈(AIBN,0.70g)溶于无水甲苯中，氮气保护下，室温搅拌。将Bu₃SnH(5.5ml)缓慢注射到混合液中，升温到80-85℃条件下，加热回流3小时。反应停止后，经柱层析分离，得到白色固体产物1-4(1.77g,产率90%)。

化合物1-4（（2R，4R）-2-（乙酰氧基甲基）-4-乙酰氧基-3,4-二氢吡喃）：IR(KBr)(cm^-1)υ3105,3024,2958,1657,1219,935；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ6.51(d,J=6.2Hz,1H),5.35-5.22(m,1H),4.77(ddd,J=6.2,2.6,1.0Hz,1H),4.29(ddd,J=12.5,6.2,2.9Hz,1H),4.22(dd,J=11.7,6.7Hz,1H),4.12(dd,J=11.7,3.2Hz,1H),2.19(ddd,J=8.0,6.0,1.6Hz,1H),2.04(s,3H),2.00(s,3H),1.80-1.69(m,1H);¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ169.96,145.80,100.89,71.52,64.54,63.92,29.08,20.78,20.43;HRMS(TOFMS ES+):m/z:calcd for C₁₀H₁₄O₅Na[M+Na]⁺237.0742,found:237.0742。

（5）往500ml单口瓶中加入步骤（4）中2.14g产物1-4和0.054g甲醇钠，加入200ml甲醇溶液，室温下充分搅拌2小时。充分反应后，过滤，将滤液除去溶剂，残留物用柱层析分离（CHCl₃/MeOH=20:1）得到无色液体产物1-5（1.27g，98%）。

化合物1-5（（2R，4R）-2-（羟甲基）-3,4-二氢吡喃-4-醇）：IR(KBr)(cm^-1)υ3495,3021,2936,1590,1311,875；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ6.30(d,J=6.2Hz,1H),4.74(dt,J=5.8,3.1Hz,2H),4.64(dt,J=6.2,1.8Hz,1H),4.30-4.19(m,1H),3.92-3.76(m,1H),3.56-3.39(m,2H),1.99(dd,J=12.9,6.5Hz,1H),1.46(ddd,J=12.8,11.6,9.5Hz,1H);¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ143.21,106.93,75.46,63.47,60.99,34.12;TOF MS(EI)m/z[M+H]⁺130。

（6）将步骤（5）中1.30g产物1-6和0.065g10%的钯碳投入两口瓶中，通入氢气，注射50ml甲醇作为溶剂，水浴加热，控制在40-45℃之间反应4-5个小时。用硅藻土抽滤除去不溶物，得无色液体产物1-6（1.28g），产率97%。

化合物1-6（（2R，4S）-2-（羟甲基）-四氢吡喃-4-醇：IR(KBr)(cm^-1)υ.3487,2956,2843,1465,1100,734；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ4.71(s,1H),4.57(s,1H),3.84(ddd,J=11.5,4.7,1.4Hz,1H),3.63-3.49(m,1H),3.36(t,J=8.3Hz,2H),3.31-3.25(m,1H),3.25-3.17(m,1H),1.78(ddd,J=12.2,4.3,2.0Hz,1H),1.70(ddd,J=12.5,4.4,2.0Hz,1H),1.25(ddd,J=23.5,12.5,4.8Hz,1H),0.99(dd,J=23.3,11.3Hz,1H);¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ76.86,66.26,65.08,64.55,38.01,35.73;HRMS(TOF MSES+):m/z:calcd for C₆H₁₂O₃Na[M+Na]⁺155.0680,found:155.0680。

（7）将步骤（6）中产物1-6（0.264g）溶于50ml N，N-二甲基甲酰胺中，依次加入1.1当量TBSCl、2当量的咪唑，混合物在室温下搅拌8个小时。加入250ml浓盐水，后用乙酸乙酯萃取，再用水洗，无水硫酸钠干燥，柱层析（氯仿/甲醇=30:1）分离，得到无色液体产物1-7（4.42g），产率90%。

化合物1-7（（2R，4S）-2-（（叔丁基二甲基甲硅烷氧基）甲基）-四氢吡喃-4-醇）：IR(KBr)(cm^-1)υ3537,2974,1390,1274,1235,1103,936；¹H NMR(400MHz,MeOD)δ3.89(ddd,J=11.6,4.7,1.3Hz,1H),3.65(ddd,J=15.7,11.0,4.7Hz,2H),3.54(ddd,J=15.3,10.7,5.1Hz,1H),3.37-3.25(m,2H),1.87-1.83(m,1H),1.76(ddd,J=12.6,4.3,2.0Hz,1H),1.36(ddd,J=23.7,12.5,4.9Hz,1H),1.11(dd,J=23.4,11.4Hz,1H),0.83(s,9H),-0.00(s,3H),-0.00(s,3H);¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ78.34,68.49,67.61,66.93,38.66,36.54,26.41,19.21,-5.14,-5.17;HRMS(TOF MS ES+):m/z:calcd forC₁₃H₃₀O₂Si[M+Na]⁺246.2015,found:246.2018。

（8）将步骤（7）中产物1-7（0.5g）溶于50ml的无水二氯甲烷中，冰水浴中冷却至0℃，加入5.6ml三乙胺，充分搅拌条件下，将0.309g的苯甲酰氯溶于5ml-10ml的二氯甲烷中，并滴加到上述混合溶液中。恢复至室温，搅拌过夜。常规处理之后，柱层析（石油醚：乙酸乙酯=20:1），得到无色液体产物1-8（0.63g,产率89%)。

化合物1-8（（2R，4S）-2-（（叔丁基二甲基甲硅烷氧基）甲基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯）：IR(KBr)(cm^-1)υ3022,2978,1728,1693,1395,1270；¹H NMR(400MHz,Acetone)δ7.94(d,J=7.5Hz,2H),7.55(t,J=7.4Hz,1H),7.43(t,J=7.7Hz,2H),5.13-5.00(m,1H),5.12-5.01(m,1H),3.95(ddd,J=11.7,4.8,1.2Hz,1H),3.64(dd,J=10.6,5.2Hz,1H),3.54(dd,J=10.6,4.9Hz,1H),3.50-3.45(m,1H),3.43(ddd,J=6.9,5.7,1.8Hz,1H),2.15-2.03(m,1H),2.00-1.93(m,1H),1.60(ddd,J=23.9,12.3,4.9Hz,1H),1.39(q,J=11.5Hz,1H),0.82(s,9H),-0.00(s,6H);¹³C NMR(101MHz,Acetone)δ206.01,166.06,133.85,131.56,130.06,129.36,77.46,71.87,67.13,66.05,35.08,32.97,26.30,18.91,-5.08,-5.10;TOF MS(EI)m/z[M+H]⁺350.8。

（9）往200ml四丁基氟化铵（TBAF）的THF溶液中滴加1滴冰醋酸，再将该TBAF溶液加入到产物1-8的四氢呋喃溶液中。室温条件下搅拌1小时，真空除去溶剂，经柱层析（石油醚/乙酸乙酯=2:1），分离得到无色液体产物1-9（0.224g，产率95%）。

化合物1-9（（2R，4S）-2-（羟甲基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯）：IR(KBr)(cm^-1)υ3498,3021,2965,1726,1638,1267；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.94(d,J=7.8Hz,2H),7.63(t,J=7.4Hz,1H),7.50(t,J=7.6Hz,2H),5.12-5.01(m,1H),4.72(t,J=5.3Hz,1H),3.94(dd,J=11.5,4.3Hz,1H),3.50-3.29(m,4H),2.04(dd,J=13.0,3.1Hz,1H),1.99-1.89(m,1H),1.58(qd,J=12.1,4.8Hz,1H),1.41-1.26(m,1H);¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ165.51,133.72,130.40,129.55,129.14,76.92,71.34,65.11,64.72,34.40,32.19;TOF MS(EI)m/z[M+H]⁺236.0。

（10）将步骤（9）中产物1-9（2.36g）与Dess-Martin试剂(6.36g)一起投入250ml无水二氯甲烷中，室温下搅拌过夜。过滤除去不溶物，真空除去溶剂，残渣用200-300目硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=5:1）分离，得到无色液体产物1-10（2.05g，产率88%）。

化合物1-10（（2R，4S）-2-甲酰基-四氢吡喃-4-苯甲酸酯）：IR(KBr)(cm^-1)υ3020,2954,2838,2720,1272,72；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.67(s,1H),8.02(d,J=7.8Hz,2H),7.57(t,J=7.4Hz,1H),7.45(t,J=7.7Hz,2H),5.27-5.18(m,1H),4.26-4.20(dt,J=12,3.56Hz,1H),4.00(dd,J=10.9,3.0Hz,1H),3.67(td,J=11.7,2.4Hz,1H),2.40(d,J=12.7Hz,1H),2.15-2.07(m,1H),1.89-1.77(m,1H),1.68(dd,J=23.2,10.7Hz,1H);¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ200.00,165.71,133.17,130.02,129.61,128.42,79.57,77.41,77.09,76.77,69.57,65.23,31.85,31.43;TOF MS(EI)m/z[M+H]⁺。

（11）严格无水无氧条件下，往两口瓶中加入0.335g三苯基异丙基溴化磷，再注射20ml无水四氢呋喃，使其充分溶解，降温至-60℃，注入0.078g的正丁基锂，反应两个小时，升温到室温，加入步骤（10）中产物1-10（0.2g），搅拌过夜。停止反应，过滤。除去溶剂，残渣经硅胶柱层析（石油醚:乙酸乙酯=50:1）分离，得到无色液体产物1-11（0.2g，产率90%）。

化合物1-11（（2R，4S）-2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-苯甲酸酯）：IR(KBr)(cm^-1)υ3018,2822,1730,1219,1152,720；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.97(d,J=7.4Hz,2H),7.49(t,J=7.4Hz,1H),7.37(t,J=7.7Hz,2H),5.19-5.01(m,2H),4.07(dd,J=14.3,5.4Hz,1H),4.02(dd,J=11.9,3.8Hz,1H),3.52(t,J=1.2Hz,1H),2.03-1.93(m,2H),1.76-1.67(m,1H),1.66(s,3H),1.64(s,3H),1.50(dd,J=23.4,11.5Hz,1H);¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.90,134.60,132.95,130.39,129.57,128.83,128.33,72.37,70.64,65.61,37.97,31.79,21.26,14.22;TOF MS(ESI)m/z[M+H]⁺261.2。

（12）将步骤（11）中0.26g产物1-11投入到氢氧化钠的乙醇溶液中，室温下，搅拌5个小时，过滤除掉不溶固体，滤液旋除溶剂，用乙酸乙酯溶解，再以1M稀盐酸、碳酸氢钠溶液、饱和食盐水依次洗涤，用无水硫酸钠干燥，柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯=5:1）得到无色液体产物1-12（0.15g，产率98%）。

化合物1-12（（2R，4S）-2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-醇）：IR(KBr)(cm^-1)υ3543,2974,2820,1274,1103,735；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.10(t,J=6.5Hz,1H),3.98-3.88(m,2H),3.70(ddt,J=16.6,11.1,5.6Hz,1H),3.37(dt,J=19.1,9.7Hz,1H),1.85-1.74(m,2H),1.65(d,J=6.5Hz,3H),1.60(d,J=6.6Hz,3H),1.52-1.34(m,1H),1.23(dt,J=18.2,11.1Hz,1H);¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ135.88,125.27,73.31,67.7165.7141.6135.3525.5718.27;TOF MS(ESI)m/z[M+H]⁺157.0。

（13）将步骤（12）中0.156g产物1-12加入100ml单口瓶中，再加入50ml无水二氯甲烷，0.21g对甲苯磺酰氯，0.012g NaH。混合液常温搅拌4h，过滤除去不溶物，滤液旋干，用乙酸乙酯溶解，柱层析分离，得到无色液体产物1-13（0.28g，产率90%）。

化合物1-13：（（2R，4S）-2-（2-甲基丙-1-烯基）-四氢吡喃-4-对甲苯磺酸酯）：IR(KBr)(cm^-1)υ3034,2974,2818,1630,1365,1173。

（14）将步骤（13）中0.310g产物1-13和0.537g四丁基氰化铵加入到装有50ml无水乙腈的100ml单口瓶中，加热回流12小时。常规处理之后，用柱层析（石油醚/乙酸乙酯=4:1）分离，得到无色液体产物1-14（0.149g，产率90%）。

化合物1-14（（2R，4R）-2-（2-甲基丙-1-烯基）-4-氰基-四氢吡喃）：IR(KBr)(cm^-1)υ.3012,2818,2212,1367,1298,834。

（15）往100ml单口瓶中加入0.165g（2R，4R）-2-（2-甲基丙-1-烯基）-4-氰基-四氢吡喃，0.06g NaOH和50ml无水乙腈，加热回流12小时，过滤除去不溶物，滤液减压蒸馏，旋干。用石油醚/乙酸乙酯=4:1柱层析分离，得到目标产物化合物2（0.07g，产率35%）和1-15（0.06g，产率30%）。

化合物2（（2R，4S）-2-（2-甲基丙-1-烯基）-4-羧基-四氢吡喃）：白色针状晶体，mp=83-84℃，薄层层析(PE/EtOAc=1/1)Rf=0.21。IR(KBr)(cm^-1)υ3516,3010,1725,1367,935,834；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.47(s,0H),5.19(d,J=7.9Hz,1H),4.10(dd,J=11.5,3.8Hz,1H),4.04(t,J=9.5Hz,1H),3.58-3.45(m,1H),2.64(tt,J=12.1,3.7Hz,1H),1.88(t,J=13.7Hz,3H),1.75(s,3H),1.71(s,3H),1.54(dd,J=24.6,12.4Hz,1H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ180.60,136.41,125.18,73.87,66.89,40.61,33.88,27.77,25.69,18.43；HRMS(TOF MS ES+):m/z C₁₀H₁₆O₃Na⁺[M+Na]⁺207.1040。

化合物1-15（2R，4R）-2-（2-甲基丙-1-烯基）-4-羧基-四氢吡喃）：白色晶体，mp=83-84℃，薄层层析(PE/EtOAc=1/1)Rf=0.20。IR(KBr)(cm^-1)υ3516,3010,1725,1367,935,834；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.47(s,0H),5.19(d,J=7.9Hz,1H),4.10(dd,J=11.5,3.8Hz,1H),4.04(t,J=9.5Hz,1H),3.58-3.45(m,1H),2.64(tt,J=12.1,3.7Hz,1H),1.88(t,J=13.7Hz,3H),1.75(s,3H),1.71(s,3H),1.54(dd,J=24.6,12.4Hz,1H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ180.60,136.41,125.18,73.87,66.89,40.61,33.88,27.77,25.69,18.43；HRMS(TOF MS ES+):m/z C₁₀H₁₆O₃Na⁺[M+Na]⁺207.1037。

实施例3窄叶鲜卑花酸丙及窄叶鲜卑花酸丁的制备

窄叶鲜卑花酸丙及窄叶鲜卑花酸丁的合成路线

窄叶鲜卑花酸丙及窄叶鲜卑花酸丁的制备，起始反应物为（2S，3S，4R）-3，4，6-三-O-乙酰基-D-己烯糖，其余步骤（详见“窄叶鲜卑花酸丙及窄叶鲜卑花酸丁的合成路线”）同例2，经过15步反应，并经硅胶柱色谱分离，获得目标产物窄叶鲜卑花酸丙(产物C，产率37%)和窄叶鲜卑花酸丁(产物D，产率36%)。

窄叶鲜卑花酸丙（（2S，4R）-2-（2-甲基丙-1-烯基）-4-羧基-四氢吡喃）：白色针晶，mp=℃，薄层层析(PE/EtOAc=1/1)Rf=0.21。IR(KBr)(cm^-1)υ3516,3010,1725,1367,935,834；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.47(s,0H),5.19(d,J=7.9Hz,1H),4.10(dd,J=11.5,3.8Hz,1H),4.04(t,J=9.5Hz,1H),3.58-3.45(m,1H),2.64(tt,J=12.1,3.7Hz,1H),1.88(t,J=13.7Hz,3H),1.75(s,3H),1.71(s,3H),1.54(dd,J=24.6,12.4Hz,1H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ180.60,136.41,125.18,73.87,66.89,40.61,33.88,27.77,25.69,18.43；HRMS(TOF MS ES+):m/z C₁₀H₁₆O₃Na⁺[M+Na]⁺207.1040。

窄叶鲜卑花酸丁：白色晶状固体，（2S，4S）-2-（2-甲基丙-1-烯基）-4-羧基-四氢吡喃）mp=83-84℃，薄层层析(PE/EtOAc=1/1)Rf=0.20。IR(KBr)(cm^-1)υ3516,3010,1725,1367,935,834；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.47(s,0H),5.19(d,J=7.9Hz,1H),4.10(dd,J=11.5,3.8Hz,1H),4.04(t,J=9.5Hz,1H),3.58-3.45(m,1H),2.64(tt,J=12.1,3.7Hz,1H),1.88(t,J=13.7Hz,3H),1.75(s,3H),1.71(s,3H),1.54(dd,J=24.6,12.4Hz,1H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ180.60,136.41,125.18,73.87,66.89,40.61,33.88,27.77,25.69,18.43；HRMS(TOF MS ES+):m/z C₁₀H₁₆O₃Na⁺[M+Na]⁺207.1037。

实施例4 对前脂肪细胞3T3-L1的生长抑制

前脂肪细胞3T3-L1按5×10⁴个／mL的密度接种到6孔培养板，在含有10％小牛血清的高糖DMEM培养基37℃、5％CO₂孵箱中培养。24h后弃去培养液，其中3孔孔加入100μL含有不同质量浓度的化合物（2）的培养液（100～1200μg/mL），以不含有样品的高糖DMEM为空白对照，温箱孵育72h。除去培养液后，加入含有0.5mg/mL MTT的DMEM10培养基孵4h，再加入100μL的0.1g/mL SDS(含0.1mol/LHCl)溶液过夜，以完全溶解出MTT紫色结晶产物。用酶标仪在570nm处（以630nm为参考波长）测定光密度值。实验重复3次。以药物浓度的对数与细胞存活率进行直线回归并求出IC₅₀（半数抑制浓度，即细胞存活率为50%时所需药物浓度）。

从图8可知，化合物（2）对3T3-L1前脂肪细胞有明显生长抑制作用。随着化合物（2）浓度的升高(100～800μg/mL)，其抑制细胞生长的能力增强，剂量效应关系显著，细胞存活率从约100%降至20%。当提取物质量浓度介于900～1200μg/mL时，细胞存活率基本不变。经计算，化合物（2）对3T3-L1前脂肪细胞生长抑制的IC50为198.0μg/mL。试验结果表明化合物（2）对Swiss小鼠前脂肪细胞3T3-L1有明显的生长抑制作用，呈现显著剂量效应。

实施例5 化合物（2）前脂肪细胞3T3-L1的分化抑制

将3T3-L1细胞接种到24孔培养板，设对照组和化合物（2）组。不含样品的DMEM培养液为空白对照，化合物（2）的浓度为12.5、25.0、50μmol／L。在含有lO％小牛血清的高糖DMEM培养基37℃、5％CO2孵箱中培养，待细胞达到70％融合时开始加分化培养基，其中含有胰岛素O．25μmol／L、甲状腺素0．2nmol／L、地塞米松O．25μmol／L、IBMX O．5nmol／L。每48小时换液1次，至诱导分化的第12天，将细胞用油红O染色，提取油红O染液，在分光光度计490nm波长处测及吸光度(A)值。

红O染色试验结果（图9）显示，分化的第12天，与对照组比较，经化合物（2）处理的各组脂肪细胞3T3-L1中产生的甘油三酯（TG）均低于对照组。说明化合物（2）能明显抑制前脂肪细胞的分化，且其抑制作用呈现显著剂量效应。

Claims

1.窄叶鲜卑花酸甲，其特征在于，其结构如式(2),其中C2及C4分别为R及S构型

2.权利要求1所述的窄叶鲜卑花酸甲在制备用于预防和治疗肥胖症以及由肥胖引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合症的药物及保健品中的应用。