CN101726565B - 乳制品中微晶纤维素的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品质量安全检测技术领域。具体涉及应用透析处理、纤维素酶水解、还原糖测定的流程对乳制品中的微晶纤维素进行检测，并对乳制品中微晶纤维素含量进行定量。检测方法流程见附图。结果表明，透析处理可将牛奶中的还原糖水平降低98％以上，减少了牛奶中还原糖的本底值；纤维素酶在牛奶中活力稳定，可有效地水解微晶纤维素产生还原糖；通过测定水解前后还原糖水平的变化可准确地对牛奶中的微晶纤维素进行定性检测，其检测灵敏度可达0.5mg/ml以下。根据本发明总结的检验公式可对乳制品中的微晶纤维素进行大致定量，定量结果均在实际添加值的±20％以内。以上结果表明，使用本发明提供的纤维素酶法可有效地对乳制品中的微晶纤维素进行定性检测和大致定量，为乳制品尤其是巴氏杀菌乳的质量控制提供了新方法途径。

Description

乳制品中微晶纤维素的检测方法及其应用

一.技术领域

本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及乳制品中微晶纤维素的检测方法及其应用。

二.背景技术

微晶纤维素是由天然植物原料经稀酸水解成α-纤维素后，再经部分解聚后形成的结晶状纤维，其本质是葡萄糖单体通过β-1，4糖苷键结合形成的直链多糖，聚合度一般不超过400。微晶纤维素在制药和食品工业中被广泛使用。晶体颗粒大小为0.1-5μm的胶态微晶纤维素可分散在乳饮料中形成三维网状结构，在不影响乳饮料黏度和流变性前提下提高乳饮料的稳定性，使之获得与纯牛奶类似的口感并起到脂肪替代作用，因此常被用作含乳饮料的稳定剂和脂肪替代物。然而，一些不法厂商在巴氏杀菌乳等纯牛奶制品中也通过添加微晶纤维素的方法维持产品的口感和稳定性，从而弥补牛奶纯度和品质的缺陷。因此，建立乳制品尤其是巴氏杀菌乳中微晶纤维素的检测方法对乳制品质量控制具有重要的实践意义。

目前，包括各国药典、JECFA和FCC在内的所有标准中关于微晶纤维素检测和定量的唯一方法是使用硫酸重铬酸钾氧化-硫酸亚铁铵滴定的氧化还原滴定法。然而，这种方法主要适用于药品制剂中高纯度微晶纤维素的定量，乳制品成分复杂，其中多种还原性物质如还原酶类、巯基蛋白和乳糖等均可被硫酸重铬酸钾氧化而对微晶纤维素的测定产生干扰，因此，此方法由于特异性过低而不能用于乳制品中微晶纤维素的检测。目前，乳制品中微晶纤维素的检测方法尚为空白。

三.发明内容

本发明需要解决的问题是利用透析处理、纤维素酶水解加还原糖测定的方法流程，对乳制品尤其是巴氏杀菌乳中的微晶纤维素进行检测，从而弥补乳制品中微晶纤维素检测方法的空白，为乳品的质量控制和安全检测探索新的途径。

本发明中，我们从微晶纤维素的结构特征出发，利用特异性地作用于β-1，4糖苷键的纤维素酶对巴氏杀菌乳中的微晶纤维素进行水解，通过测定反应后牛奶中还原糖水平的变化检测微晶纤维素，为乳制品中微晶纤维素的检测探索了一种可靠、灵敏、便捷、安全的新方法。

本发明的技术方案包括：1.对牛奶等乳制品的透析处理，以降低其还原糖本底水平。2.牛奶中纤维素酶水解微晶纤维素的活力、纤维素酶最佳用量以及最佳酶反应时间的确定，建立纤维素酶法测定乳制品中微晶纤维素的方法流程，并考察方法的特异性和灵敏度。3.根据以上方法流程对模拟样品的测定结果，总结乳制品中微晶纤维素检测的判定标准和大致定量的经验公式。

1.将巴氏杀菌乳200mL于4℃对去离子水5000mL透析24h，沉淀蛋白后定容，使用碱性酒石酸铜法滴定分别测定透析前后的还原糖水平。结果表明，透析前后巴氏杀菌乳的还原糖水平(以葡萄糖计)分别为25.0mg/mL和0.4mg/mL。因此，通过透析可使牛奶中的还原糖降低了98％以上，基本去除了牛奶中还原糖的本底值，从而可达到增大取样量、提高检测灵敏度的目的。

2.将经透析处理的巴氏杀菌加入过量的乳微晶纤维素标准品和不同浓度的纤维素酶溶液，PH4.8、50℃水浴24h，在含10mL牛奶的酶反应体系中，不同浓度的纤维素酶水解过量微晶纤维素24h后产生还原糖的总量见附图1。由图中可见，在纤维素酶使用量从5mg到100mg之间时，酶量与还原糖的产生总量呈显著的线性关系，表明纤维素酶在牛奶中活力稳定。经计算，纤维素酶活力在此区间的平均值为139±10U。由于乳制品中加入微晶纤维素的量一般在1.5-3g/L之间，为了既保证牛奶中的微晶纤维素被充分水解，又结合成本上的考虑，因此确定最佳的纤维素酶使用量为50mg。

在含10mL透析后牛奶的反应体系中加入过量的乳微晶纤维素标准品和50mg纤维素酶，PH4.8、50℃水浴，反应体系中还原糖总量随时间变化曲线见附图2。在反应的最初24h内，还原糖的产生与时间基本呈线性关系，24h后还原糖生成速度显著降低。因此，确定24h为最佳反应时间。

在透析后的牛奶原奶中加入不同浓度的微晶纤维素标准品，使用上述最佳条件对之进行水解，即50mg纤维素酶，PH4.8、50℃水浴24h，使用碱性酒石酸铜法滴定测定水解前后还原糖水平的变化。纤维素酶作用后含不同浓度微晶纤维素的牛奶中还原糖水平的变化见表1(以5mL滤液中的还原糖毫克数表示)。由表中可见，当微晶纤维素含量在0.5mg/mL以上时，酶作用后牛奶中还原糖水平均显著性升高(P＜0.05)，因此，本方法的检出限可达到0.5mg/mL以下。不含微晶纤维素的牛奶加入50mg纤维素酶反应后，其还原糖水平与未加酶的牛奶相比无显著性变化(P＞0.05)，因此，本方法具有针对外源微晶纤维素的特异性。

表1纤维素酶作用后含不同浓度微晶纤维素的牛奶中还原糖的变化

反应结束后，含10mL牛奶的反应体系定容至50mL，测定每5mL滤液所含还原糖水平的变化。*：与未加酶的反应体系相比，还原糖水平显著性升高(P＜0.05)。结果均为6次平行实验的均数±标准差。

3.综合以上各浓度微晶纤维素的检测结果，乳制品中微晶纤维素检测的判定标准如下：按照本研究提供的方法，即将含10mL牛奶的酶反应体系定容至50mL并过滤，5mL滤液中的还原糖水平较未加酶的反应体系升高0.6mg以上即可判定微晶纤维素阳性(＞0.5mg/mL)；当微晶纤维素含量在1.5-5.0mg/mL之间时，我们总结了以下经验公式对微晶纤维素进行初步定量：

微晶纤维素含量(mg/mL)≈5mL滤液中还原糖升高的毫克数×1.5

使用以上方法流程对市售巴氏杀菌乳与人为添加或不添加微晶纤维素的模拟乳制品样品进行盲样检测，并根据上述判定标准和经验公式对样本中的微晶纤维素进行阴阳性判定和大致定量。结果表明，两种市售的巴氏杀菌乳和未添加微晶纤维素的原奶检测结果均呈阴性，添加了微晶纤维素的模拟乳制品样品检测结果均呈阳性；利用经验公式对呈阳性的模拟样品中微晶纤维素大致定量的数值均在实际添加值的±20％以内。以上结果表明本方法的实用性良好，检测结果与乳制品中微晶纤维素的实际添加情况吻合，可用于乳制品中微晶纤维素的定性检测和大致定量。

本发明的有益效果是：本发明是目前乳制品中微晶纤维素检测的唯一方法，弥补了乳制品尤其是巴氏杀菌乳中微晶纤维素检测手段的缺失，同时还具有成本较低、检测周期较短、操作方便等有益效果，本发明所述方法已在乳制品质量控制和质量安全检测中应用。

四.附图说明

图1纤维素酶法检测乳制品中微晶纤维素流程图。

图2含10mL牛奶的反应体系中纤维素酶用量与产生还原糖总量的关系曲线。反应条件为PH4.8、50℃水浴24h。

图3含10mL牛奶的反应体系中使用50mg纤维素酶时还原糖产生的时间曲线。反应条件为PH4.8、50℃。

五.具体实施方式

1.实验材料与试剂

纤维素酶购自美国Worthington公司；透析膜(截留分子量14000)购自美国Millipore公司；微晶纤维素标准品购自美国FMC公司；碱性酒石酸铜甲乙液、乙酸锌溶液、亚铁氰化钾溶液、葡萄糖标准溶液均按GB/T5009.7-2008配制；PBS缓冲液按GB/T601-2002配制；乙酸-乙酸钠缓冲液(5×，PH4.8)为乙酸钠4.92g加冰乙酸2.4mL加双蒸水定容至200mL。所有化学品均为分析纯。牛奶原奶采自南京卫岗养殖场。

2.透析前后牛奶原奶还原糖水平的变化

将牛奶原奶200mL于4℃对去离子水5000mL透析24h，每8h更换透析液。分别取透析前后的原奶各10mL，加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各10mL后，未透析原奶定容至250mL，透析后原奶定容至50mL。过滤除去蛋白沉淀，分别取滤液5mL加入10mL碱性酒石酸铜甲乙液1∶1混合液中，在沸腾状态下用葡萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，计算透析前后牛奶中还原糖(以葡萄糖计)的含量。

3.牛奶中纤维素酶水解微晶纤维素的活力测定

用PBS缓冲液将纤维素酶配制成浓度为100mg/mL的溶液。在10mL透析后的原奶中加入微晶纤维素标准品200mg和乙酸-乙酸钠缓冲液2mL后，分别添加纤维素酶溶液0、5、10、20、50、100μg，充分混匀，50℃水浴24h，按照前述方法沉淀蛋白后定容至50mL并过滤，测定每5mL滤液中的还原糖水平，并根据滤液总体积计算还原糖总量。根据酶用量和还原糖总量升高数值计算牛奶中纤维素酶水解微晶纤维素的活力，绘制含10mL原奶的反应体系中两者间变化的动力学曲线，确定最佳酶使用量。1酶活力单位定义为1g纤维素酶每分钟水解产生1μg还原糖。

4.最佳酶反应时间的确定

在5份各10mL透析后的原奶中加入微晶纤维素标准品200mg和乙酸-乙酸钠缓冲液2mL后，再加入纤维素酶50μg，充分混匀，50℃水浴，分别于反应4、8、24、48、72小时后取一管样品，按上述方法测定还原糖总量。

5.纤维素酶法测定牛奶中微晶纤维素的检测灵敏度和特异性

在各20mL透析后的原奶中加入乙酸-乙酸钠缓冲液4mL后，分别加入微晶纤维素标准品0、10、20、40、100mg，等分为两管，其中10mL再加入500μl纤维素酶溶液，另10mL不加酶，充分混匀，50℃水浴24h，沉淀蛋白后定容至50mL并过滤，按前述方法测定5mL滤液中的还原糖含量，探究检测的灵敏度和特异性。重复上述实验6次，计算每5mL滤液中还原糖的均数±标准差用以统计学分析，并总结根据还原糖变化估算微晶纤维素含量的经验公式。

6.市售巴氏杀菌乳与模拟乳制品样品中微晶纤维素的盲样检测

我们使用上述方法流程对2种市售巴氏杀菌乳和4份模拟牛奶样品(其中1份未加微晶纤维素，另两份分别加入微晶纤维素标准品1.7和3.1mg/mL)中的微晶纤维素进行盲样检测，根据本发明所总结的判定标准对样本中的微晶纤维素进行阴阳性判定，并使用经验公式对阳性样品中的微晶纤维素含量进行估算，并将检测结果与实际情况进行比对。

Claims (2)

1.一种乳制品中微晶纤维素的检测方法，其特征是由以下步骤构成：

(1)对含有微晶纤维素的巴氏杀菌乳200mL于4℃对去离子水500mL透析24h，沉淀蛋白后定容；

(2)将10mL上述经透析处理的巴氏杀菌乳加入50mg纤维素酶溶液，PH4.8，50℃水浴24h，对巴氏杀菌乳中存在的微晶纤维素进行水解；

(3)测定水解前后乳制品中还原糖水平的变化，对牛奶中的微晶纤维素进行定性检测和定量，乳制品中微晶纤维素的定量公式是：当微晶纤维素含量在1.5-5.0mg/mL之间时，每毫升乳制品中微晶纤维素的毫克数≈5mL滤液中还原糖升高的毫克数×1.5。

2.权利要求1所述乳制品中微晶纤维素的检测方法在乳制品质量安全检测中的应用。

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