CN101721687B - 胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物及其制备方法和应用。其特征是：胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物是由富含Ca²⁺的羟基磷灰石纳米粒子和胰岛素组成。本发明的胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物制备方法为：将磷酸氢二铵溶液与硝酸钙溶液混合反应形成羟基磷灰石纳米粒子；将羟基磷灰石纳米粒子混悬于氯化钙溶液中形成混悬液，再加入胰岛素溶液进行搅拌，使羟基磷灰石纳米粒子吸附钙离子和胰岛素分子形成纳米复合物，最后离心弃去上清液，所得沉淀经冷冻干燥后即得胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物。它可用于胰岛素的口服给药或埋植给药系统。

Description

胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病是一种世界范围的疾病，是一种由代谢内分泌失调引起的糖代谢紊乱的疾病。目前，糖尿病的发病率正在逐年增加，成为继心血管疾病和癌症之后的第三大致死性疾病。胰岛素是I型和中重度II型糖尿病患者日常治疗中不可缺少的药物。但胰岛素是一种多肽类生物活性药物，在体内易被蛋白酶所破坏，半衰期短，所以市售的胰岛素制剂多数为注射剂。目前临床上大多采用在餐前动脉和肌肉注射以及静脉点滴的方法补充胰岛素，一天几次，给患者造成极大的痛苦和不便。如果可以采用口服给药或者延长胰岛素作用时间来减少用药次数将是减轻病人痛苦的有效手段。

以一定的亚微粒载体系统传递胰岛素，可避免胰岛素被胃肠道蛋白酶降解，提高其在胃肠道内的稳定性，并有利于肠黏膜对胰岛素的摄取和转运，此外还可以起到缓释作用，延长药物作用时间。目前，作为口服胰岛素载体的主要是高分子材料和脂质体。高分子材料中包括天然高分子(主要是多糖)和合成高分子。天然高分子具有无毒、可降解等优点；合成高分子可通过改变聚合物单体的比例和聚合条件来调节聚合物的降解性能，改善药物的释放性能；脂质体具有类似的细胞膜结构，可以和小肠黏膜的细胞膜相互作用，使药物得以吸收。但是这些制剂还存在着稳定性差、包封率低、载药量小、免疫反应、突释等很多问题，目前均处于研究之中。

随着材料研究的发展，一些无机纳米材料开始进入药物载体应用的领域，为药物传递系统的开发开拓了新的空间。羟基磷灰石是最常见的一种生物活性材料，与其它生物材料显著不同之处在于它具有与人体相似的无机成分，是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机成分，含有人体组织必需的钙和磷元素，且不含其它有害元素，其生物相容性及活性良好，对人体无毒副作用。此外，羟基磷灰石对生物活性物质具有很好的亲和力，常用作生物活性物质的分离提纯材料，并可保持生物物质的活性。

以往制备的羟基磷灰石粒径较大，在微米以上，近年来采用多种方法合成的羟基磷灰石纳米粒子具有溶解度较高、表面能较大、生物活性好等优点。将羟基磷灰石纳米粒子的这些性质应用于药剂领域，发现其适合作为蛋白多肽类药物载体，可以有以下几方面作用：一方面它可以吸附胃肠道各种酶类，使游离酶减少，从而保护蛋白多肽类药物；另一方面它和蛋白多肽类药物之间的作用力使药物有一定的缓释效果；此外它比表面积大、生物相容性好。但也存在一些不足之处，如药物包封率低(一般在50％左右)、载药量小，这些缺点限制了羟基磷灰石纳米粒子在药剂学中的应用。

发明内容

本发明的目的在于：针对胰岛素难以透过肠粘膜屏障、易被胃肠道酶类降解；胰岛素溶液作用时间短等问题，提供一种胰岛素制剂，即主要是胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物，该复合物具有包封率高的特点。

本发明的胰岛素制剂由羟基磷灰石纳米粒子和胰岛素两者组成复合物，其中的羟基磷灰石是在吸附氯化钙中的钙离子后，再进一步吸附胰岛素。

本发明的胰岛素制剂的制备方法，包括：将羟基磷灰石纳米粒子投放于氯化钙溶液中，超声，使其吸附一定量的钙离子，然后加入胰岛素溶液混合，离心，弃去上清液，沉淀进行冷冻干燥，即得胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物。

其中的羟基磷灰石纳米粒子制备方法可参考文献，也可用以下方法制备：用去离子水配制0.01～1.0mol/L的磷酸氢二铵溶液和0.01～1.0mol/L的硝酸钙溶液，并用氨水将两溶液的pH值均调至10～12；在20～80℃下，按1～2∶1～2体积比将磷酸氢二铵溶液滴加入硝酸钙溶液中，滴完后维持搅拌1～4h；将混合液抽滤，所得沉淀用去离子水洗涤至中性，再用乙醇洗涤沉淀物，抽滤，烘干，即得羟基磷灰石纳米粒子。

研究发现，当采用一般的羟基磷灰石纳米粒子吸附胰岛素时，胰岛素的包封率偏低，但在制备过程中另外添加钙离子后，包封率增加明显，且载药量也随之提高。如表1对比了在是否添加钙离子的情况下(其他因素固定不变)，胰岛素羟基磷灰石纳米粒子的包封率和载药量的差别，其中胰岛素和羟基磷灰石纳米粒子的比例均为重量比。

表1.不同药载比时是否添加钙离子对包封率和载药量的影响

从表1可以看出：

不加钙离子时，包封率随载体比例的增加而增加。这是由于：在相同含药量的情况下，载体数量越多，提供的吸附位点就越多，包封率就越高。但当药/载比达到1∶100时，胰岛素的包封率都未达到90％。说明仅靠提高载体比例来提高胰岛素利用率的方法是有限的，同时带来的问题是由于大量使用载体而导致的载药量下降。

在上述各比例的胰岛素/羟基磷灰石纳米粒子混悬液中，如果使羟基磷灰石纳米粒子首先吸附一定量的钙离子，则此时包封率和药/载比关系不大(仅1/3.75和1/5时包封率低于90％)，大部分均超过90％，说明钙离子的加入，使羟基磷灰石纳米粒子吸附胰岛素的能力显著增强，从而提高了胰岛素的利用率。随之而来的是较高的载药量，这样就避免了以牺牲载药量来保证包封率的方法。

钙离子的加入之所以显著提高包封率，我们推测原因可能是：由于同离子效应，羟基磷灰石纳米粒子表面会优先吸附钙离子，使羟基磷灰石表面带正电荷；而胰岛素的等电点为5.35～5.45，pH在等电点以上时胰岛素带负电，由于正负电荷的吸引作用，从而显著促进羟基磷灰石纳米粒子对胰岛素的吸附。

高的包封率意味着在制备过程中胰岛素的利用率高，而损耗很少，这对于价格昂贵的胰岛素具有重要的意义。因此，本发明中在羟基磷灰石纳米粒子中添加钙离子，使其成为富含钙离子的羟基磷灰石纳米粒子，以提高其对胰岛素的吸附能力。

表1也反映了载药量的变化情况。可以观察到：载药量随载体比例的增加而逐渐减少；在相同药载比的情况下，加入钙离子组的载药量高于不加钙离子的组，并且载体比例越低，载药量增加的现象越明显。

本发明中，为保证提高胰岛素的利用率，使其包封率超过90％，并考虑到载药量不低于1％，在加入钙离子的情况下，胰岛素∶羟基磷灰石的比例优选为1∶7.5～1∶75。

研究中发现，当固定制备过程中其他因素不变，仅改变胰岛素∶氯化钙的比例(w∶w)，则羟基磷灰石纳米粒子对胰岛素的包封率和载药量有所不同，表2是当固定胰岛素∶羟基磷灰石的重量比为1∶7.5时的实验结果。

表2.钙离子的量对包封率和载药量的影响

从表2可以看出，在胰岛素/羟基磷灰石纳米粒子两者的比例维持在1∶7.5时，不加入钙离子，复合物的包封率仅为47.53％；加入钙离子后，包封率显著增加；当钙离子量加到足够多后，随着钙离子用量的增加，包封率又有下降趋势，当胰岛素∶氯化钙(w∶w)达到1∶16.65时，包封率已低于90％，推测其原因为：当胰岛素用量不变，随着钙离子用量的增加，胰岛素与羟基磷灰石纳米粒子混合液中钙离子浓度增加，使得吸附环境中的离子强度增加，这样反而抑制了胰岛素和富含钙离子的羟基磷灰石纳米粒子间的电荷吸附作用，从而使得包封率下降。根据上表实验结果，本发明中优选胰岛素∶氯化钙(w∶w)为1∶0.555～1∶12.5。

研究还发现，当加入胰岛素溶液后，调pH至5.8～10.0时效果最好。表3是当固定胰岛素∶羟基磷灰石的重量比为1∶7.5时的实验结果：

表3pH值对包封率和载药量的影响

从表3可以看出，当pH值从4.71升至5.81时，包封率和载药量显著升高，而当pH值大于5.81后，包封率超过90％。根据上表的实验结果，并考虑到更高的碱性条件可能会影响胰岛素的活性，本发明中混合液的pH范围优选为5.8～10.0。

本发明中的胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物可以通过调节胰岛素与羟基磷灰石纳米粒子的比例来调节胰岛素的释放。

体外释放试验：

按胰岛素∶羟基磷灰石纳米粒子的比例分别为1∶7.5、1∶12.5、1∶17.5、1∶25制备胰岛素羟基磷灰石纳米复合物；按含有胰岛素2mg的量分别称取相应量的纳米复合物，分别投放于25mL蒸馏水中，在37℃，100rpm下搅拌，1.5h后分别取200μL混悬液，12000rpm离心5min后，上清液用高效液相方法测得游离胰岛素浓度，计算胰岛素的释放率。结果见表4。

表4.不同胰岛素∶羟基磷灰石纳米粒子比例对胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物释放的影响

胰岛素∶羟基磷灰石纳米粒子(重量比)              释放率

1∶7.5                                          64.39％

1∶12.5                                         40.23％

1∶17.5                                         27.50％

1∶25                                           18.60％

从表4可见，随着羟基磷灰石纳米粒子比例的增加，对胰岛素释放的抑制作用也逐渐增强。所以，胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物可以通过调节胰岛素与羟基磷灰石纳米粒子的比例(重量比)来调节胰岛素的释放速度。

由本发明所制备的胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物可作为口服胰岛素或体内埋植胰岛素使用。

本发明的优点在于：在使羟基磷灰石纳米粒子首先吸附一定量的钙离子后，并且制备时调节至适合pH的情况下，即使在载体很少的情况下，也可使药物包封率达到90％以上，明显优于一般的高分子材料和脂质体。一方面大大提高了胰岛素的利用率，减少其损耗，降低成本。另一方面载体用量明显减少，也可避免由于载体本身引发的体内不良反应。

本发明的优点还在于：在使羟基磷灰石纳米粒子首先吸附一定量的钙离子后，并且制备时调节至适合pH的情况下，所制备的胰岛素羟基磷灰石纳米粒子的载药量明显高于不添加钙离子的羟基磷灰石纳米粒子。且载体量越少，此现象越明显。说明在上述制备条件下，富含钙离子的羟基磷灰石纳米粒子对胰岛素具有更高的亲和力。

本发明的优点还在于：可以调节胰岛素与羟基磷灰石纳米粒的比例，从而改变胰岛素的释放速度，从而满足胰岛素不同的释放度要求。

本发明的优点还在于：整体制备工艺简单，条件温和，可避免胰岛素在制备过程中失活。

本发明的优点还在于：羟基磷灰石纳米粒子埋植体内后可生物降解为磷酸根离子和钙离子，此为人体必需物质，极大程度避免了由于载体不能被生物降解或降解产物具有毒副作用给人体带来的安全隐患。

本发明的优点还在于：由于羟基磷灰石纳米粒子作为载体材料可吸附胃肠道内各种酶类，使游离酶减少，从而对胰岛素有保护作用。

所以，以羟基磷灰石纳米粒子作为载体制备的胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物可促进胰岛素的口服吸收，提高生物利用度。

附图说明

图1是胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物采用十二指肠给药后大鼠降血糖效果图

图2是胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物采用皮下注射给药后大鼠降血糖效果图

具体实施方式

实施例1

制备胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物

羟基磷灰石纳米粒子的制备方法：用去离子水配制0.1mol/L的磷酸氢二铵溶液和0.1mol/L的硝酸钙溶液，并用氨水将两溶液的pH值均调至11；在65℃下，按1∶1.67的体积比将磷酸氢二铵溶液滴加入硝酸钙溶液中，滴完后维持65℃剧烈搅拌2h；将混合液抽滤，所得沉淀用去离子水洗涤至中性，再用乙醇洗涤沉淀物，抽滤，烘干，即得羟基磷灰石纳米粒子。

配制浓度为1mg/ml的胰岛素溶液，用0.01mol/L的盐酸或0.01mol/L的氢氧化钠溶液控制pH为8。将羟基磷灰石纳米粒子按7.5mg/ml的浓度悬浮于50mmol/L的氯化钙溶液中，超声处理20分钟，形成羟基磷灰石纳米粒子混悬液。将胰岛素溶液与羟基磷灰石纳米粒子混悬液按体积比1∶1混合(羟基磷灰石纳米粒子/氯化钙重量比为1∶5.55)，室温搅拌2小时，12000rpm离心5分钟后，所得沉淀即为胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物。用高效液相方法测定上清液游离胰岛素浓度，计算得胰岛素包封率为94.85％，载药量11.23％。

实施例2

制备胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物

配制浓度为1mg/ml的胰岛素溶液，用0.01mol/L的盐酸或0.01mol/L的氢氧化钠溶液控制pH为8。将羟基磷灰石纳米粒子按20mg/ml的浓度悬浮于50mmol/L的氯化钙溶液中，超声处理20分钟，形成羟基磷灰石纳米粒子混悬液。将胰岛素溶液与羟基磷灰石纳米粒子混悬液按体积比1∶1混合，室温搅拌2小时，12000rpm离心5分钟后，所得沉淀即为胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物。用高效液相方法测定上清液游离胰岛素浓度，计算得胰岛素包封率为97.71％，载药量4.67％。

实施例3

制备胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物

配制浓度为1mg/ml的胰岛素溶液，用0.01mol/L的盐酸或0.01mol/L的氢氧化钠溶液控制pH为8。将羟基磷灰石纳米粒子按50mg/ml的浓度悬浮于50mmol/L的氯化钙溶液中，超声处理20分钟，形成羟基磷灰石纳米粒子混悬液。将胰岛素溶液与羟基磷灰石纳米粒子混悬液按体积比1∶1混合，室温搅拌2小时，12000rpm离心5分钟后，所得沉淀即为胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物。用高效液相方法测定上清液游离胰岛素浓度，计算得胰岛素包封率为97.38％，载药量1.91％。

实施例4

十二指肠给药测降糖效果试验

给药样品的制备：

胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物组：称取适量按实施例2和实施例3方法制备的胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物，分别悬浮于pH 7.4磷酸盐缓冲液中，超声处理20分钟，最终两个混悬液中胰岛素的浓度均为0.8mg/ml。

胰岛素溶液组：先用少量0.01mol/L盐酸溶解胰岛素后再用pH7.4磷酸盐缓冲液定容，得浓度为0.8mg/ml的胰岛素溶液。

空白载体组：将羟基磷灰石纳米粒子按16mg/ml的浓度悬浮于pH7.4磷酸盐缓冲液中，超声处理20分钟。

将16只正常大鼠分成4组，每组四只，体重200～250g，雌雄各半。采用十二指肠给药方式，按60U/kg的剂量将三组大鼠分别给予上述的胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物、胰岛素溶液、空白载体三种给药样品，利用葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化酶法)测定给药后血糖浓度经时变化。

十二指肠给药方法：大鼠禁食8小时后，用乙醚麻醉，沿腹白线切开，在十二指肠处注射给药样品，粘合注射口，缝合伤口；在给药后0、0.5、1、1.5、2、4、6、8小时于大鼠眼底静脉丛取血100ul，离心后，取血清测定血清葡萄糖浓度。

血糖测定方法：采用酶-苯酚分光光度法。取等量0.1％苯酚溶液和酶试液，两试液混匀即为酶酚混合液。测定血糖时，分别在受试管、标准管和空白管中加入15ul血清、葡萄糖和去离子水，再加入1.5ml酶酚混合液，混匀，置37℃水浴15分钟，在分光光度计505nm处测定吸收度。血清葡萄糖含量(mmol·L^-1)＝A测/A标×5.55。以零时刻血糖浓度(C_O)为100％，计算各时间点血糖浓度(C_i)相对于与C_O的百分率，即血糖水平(％)。

记录各给药样品对大鼠的降糖作用，结果见表6。

表6.大鼠十二指肠给药后各给药组的降血糖效果

从表6看出，当十二指肠给药后，空白载体组和胰岛素溶液组均无降血糖作用，且血糖有增高的现象，这是由于十二指肠给药手术后，大鼠应激反应升高血糖；至后期血糖水平的下降可能和试验时间较长、大鼠一直未进食有关；而胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物组在给药后0.5小时血糖开始降低，血糖持续下降，维持至少6-8h。且药物/载体比例不同时，制备出的纳米复合物对大鼠的降血糖效果也有差别：胰岛素/羟基磷灰石纳米粒子重量比为1∶50所制备的纳米复合物与重量比为1∶20所制备的纳米复合物比较，前者在给药后4h内的降血糖作用稍弱，血糖水平下降较为平缓；但4h后，其血糖下降程度大于后者。推测其原因可能是由于载体比例增大后，对药物的吸附作用相对较强，药物释放较为平缓，作用时间也相对延长。

实施例5

试验组样品为按胰岛素/羟基磷灰石纳米粒子(重量比)分别为1∶50、1∶75制备出的纳米复合物的混悬液；对照组为胰岛素溶液；空白组为羟基磷灰石纳米粒子混悬液。

给药样品的准备：

a)胰岛素∶羟基磷灰石纳米粒子为1∶50的纳米复合物组：

称取适量按胰岛素∶羟基磷灰石纳米粒子为1∶50制备的胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物，悬浮于去离子水中，使最终混悬液中胰岛素的浓度为20ug/ml，超声处理20分钟。

b)胰岛素∶羟基磷灰石纳米粒子为1∶75的纳米复合物组：

称取适量按胰岛素∶羟基磷灰石纳米粒子为1∶75制备的胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物，悬浮于去离子水中，使最终混悬液中胰岛素的浓度为20ug/ml，超声处理20分钟。

c)胰岛素溶液组：

先用少量0.01mol/L的盐酸溶液溶解胰岛素，再用0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6～8，并用去离子水定容，最后得浓度为20ug/ml的胰岛素溶液。

d)空白载体组：

将羟基磷灰石纳米粒子按2mg/ml的浓度悬浮于去离子水中，超声处理20分钟。

将16只正常大鼠分成4组，每组4只，雌雄各半，体重200～250g。采用皮下注射给药方式，按1U/kg的剂量将四组大鼠分别给予上述的a)、b)、c)、d)四种给药样品。在给药后0、0.5、1、1.5、2、4、6、8小时于大鼠眼底静脉丛取血100ul，离心后，取血清测定血清葡萄糖浓度。血糖测定方法按实施例1中血糖测定方法操作，并计算各时间点血糖浓度(C_i)相对于C₀的百分率(即降糖百分率)。记录各给药样品对大鼠的降糖作用见表7。

表7.皮下注射给药后对大鼠的降血糖效果

从表7可以看出：空白载体组无降血糖作用；溶液组降糖迅速，1小时后血糖降至最低，然后呈回升趋势；胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物的降糖效果随载体比例的不同而不同。当胰岛素∶羟基磷灰石纳米粒为1∶50时，降糖效果比胰岛素溶液组强，持续时间相对延长，生物利用度提高，降糖作用较为平缓；当胰岛素∶羟基磷灰石纳米粒为1∶75时，降糖效果比胰岛素溶液弱，但降糖作用非常平缓，没有突释。载体比例不同，载体对药物的结合能力不同。若载体比例越高，对药物的吸附作用越强，药物游离出来的过程就越缓慢。此外，羟基磷灰石纳米粒子可促进药物的吸收，从而提高了生物利用度。

Claims (6)

1.一种胰岛素制剂，其特征是：由富含钙离子的羟基磷灰石纳米粒子和胰岛素组成复合物，由以下方法制备：将羟基磷灰石纳米粒子投放于氯化钙溶液中，超声，形成富含钙离子的羟基磷灰石纳米混悬液，加入胰岛素溶液混合，离心，弃去上清液，沉淀进行冷冻干燥，即得胰岛素-羟基磷灰石纳米复合物，其中胰岛素∶氯化钙的重量比是1∶0.555～1∶12.5。

2.权利要求1的胰岛素制剂，其包封率大于90％。

3.权利要求1的胰岛素制剂，其载药量大于1％。

4.权利要求1的胰岛素制剂，其中胰岛素和羟基磷灰石纳米粒子的重量比为1∶7.5～1∶75。

5.权利要求1的胰岛素制剂，其中制备时加入胰岛素溶液后还包括调pH至5.8～10.0。

6.权利要求1的胰岛素制剂，其特征是在于用于制备胰岛素的口服给药系统或体内埋植系统。

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