CN101130575B - 带有水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法 - Google Patents
带有水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法。本发明的纳米粒由壳聚糖季铵盐与带电荷的药物通过静电作用生成,同时,共价连接在季铵盐上的亲水性聚合物在粒子表面形成水化层包衣。其按如下步骤制备:将亲水性聚合物活化后,与壳聚糖季铵盐溶液共价结合形成共聚物,纯化后再加入带负电荷的药物溶液,即得纳米粒。亲水性聚合物修饰度可达到90%,自然分布于离子表面而形成包衣结构。其可用作药物载体。与现有技术相比,该纳米粒具有更好的生物稳定性、生物相容性及长循环特性。该制备工艺过程简单、易控、无需使用有毒试剂。
Description
技术领域
本发明属壳聚糖季铵盐技术领域,具体涉及一种带有水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
壳聚糖具有生物相容性好、生物黏附性强、可生物降解等优点,且来源广泛,可作为药物载体和医用辅料。但壳聚糖在生理条件下溶解性较差,pH中性条件下易发生沉淀。因此,一些壳聚糖衍生物被合成并用作壳聚糖的替代物。如:N-羧甲基壳聚糖(R.A.A.Muzzarelli,F.Tanfani,M.Emanuellli,et al.Carbohydrate Research,1982,107:199-214),O-羧甲基壳聚糖(R.A.A.Muzzarelli,Carbohydrate Polymer,1988,8:1-21),壳聚糖季铵盐(Z.Jia,D.Shen,W.Xu,Carbohydrate Research,2001,333:1-16)等。其中,壳聚糖季铵盐为一种已被广泛研究的壳聚糖衍生物,全pH范围内,其均具有良好的溶解性,且带正电荷易吸附药物。但壳聚糖季铵盐阳离子性导致其可与血液或胃肠道细胞细胞膜上带负电的蛋白质结合,产生细胞毒性(D.Fischer,et al.Biomaterials,2003,24:1121-1131),因此,它的生物相容性受到质疑,给药途径受到限制。为了克服现有的壳聚糖季铵盐纳米粒的不足,研究者尝试制备了一种带有水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒,亲水聚合物修饰程度为34%,生物相容性有所提高。
发明内容
本发明所需解决的技术问题之一是提供具有更高亲水化合物修饰度的壳聚糖季铵盐获得;本发明所需解决的技术问题之二是提供一种具有更高亲水化合物修饰程度的壳聚糖季铵盐的制备方法;本发明所需解决的技术问题之三是提供具有更高亲水化合物修饰度的壳聚糖季铵盐纳米粒;本发明所需解决的技术问题之四是提供一种具有更高亲水化合物修饰程度的壳聚糖季铵盐纳米粒的制备方法;本发明所需解决的技术问题之五是提供一种具有更高亲水化合物修饰程度的壳聚糖季铵盐纳米粒的应用,以克服现有技术的不足和缺陷。
本发明构思如下:
壳聚糖季铵盐是壳聚糖的衍生物,由壳聚糖和甲基丙烯酸氧乙基三甲基氯化铵反应制备,壳聚糖的氨基被取代。亲水性聚合物的活性酯在温和条件下即可以和壳聚糖季铵盐链上的剩余氨基反应,生成共聚物。由于两次修饰都发生在氨基上,所以通过控制原料投料比,可以得到不同季铵盐化程度和不同亲水聚合物接枝率的一系列共聚物。通过控制材料的投料比,制备得具有更高亲水化合物修饰程度的壳聚糖季铵盐纳米粒子,亲水聚合物修饰程度可达50~90%,由不同亲水聚合物修饰程度的共聚物所制得的纳米粒具有不同的表面性质,其抗溶血、抑酶等作用都与亲水聚合物修饰程度成正相关。
本发明提供的亲水聚合物-壳聚糖季铵盐共聚物,其结构式如下:
其中m大于1的整数,n=40~150的整数,自由氨基的亲水聚合物修饰度为50~90%。
所述的亲水性聚合物为聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙二醇-氧乙烯共聚物中的一种或一种以上的混合物。
所述的亲水性聚合物的分子量为2000-5000。
一种亲水聚合物-壳聚糖季铵盐共聚物的制备方法如下:
将壳聚糖季铵盐溶于蒸馏水中,于室温、搅拌条件下加入亲水性聚合物活性酯的二甲基亚砜溶液,两者投料比1∶4~1∶6,w/w,反应10~24小时,纯化,得共聚物水溶液。
其中所述的亲水性聚合物为聚乙二醇,聚氧乙烯,聚乙二醇-氧乙烯共聚物中的一种或一种以上。其中优选聚乙二醇2000。
所述的亲水性聚合物活性酯为聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯、聚乙二醇羧甲基琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯和单甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亚胺酯中的一种或一种以上。其中优选单甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亚胺酯。
所述的亲水性聚合物活性酯溶液的浓度为5%~7.5%,w/v。如其用量低于5%,则接枝率偏低。
步骤中投料比为1∶4~1∶6(w/w),太低则接枝率偏低,太高则亲水聚合物量过量,体系中存在过多未反应的亲水聚合物。
步骤中反应时间为10~24h,时间过短则反应不完全。优选12h-18h。
一种水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒,其组成按重量百分比计:亲水聚合物-壳聚糖季铵盐共聚物为85~95%,药物为5~15%。
所述的水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒,其直径为200~300nm。
一种水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒制备方法如下:
将药物溶液加至亲水聚合物-壳聚糖季铵盐共聚物溶液中,其中药物溶液pH高于药物等电点,两者投料比为8∶1~15∶1,w/w,搅拌1~10min,即可生成水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒。
所述的亲水聚合物-壳聚糖季铵盐共聚物,其修饰度为50%~90%。
步骤中投料比为8∶1~15∶1,w/w,太低时无法生成纳米粒,太高时亦无法生成纳米粒。优选投料比为10∶1-12∶1。
步骤中搅拌时间为1~10min,时间过短则反应不完全。优选2min-5min。
所述的药物可包载至少如下的活性成分中的一种:
(1)蛋白质和多肽:胰岛素、血红蛋白、白蛋白、细胞色素、干扰素、抗原、抗体、红细胞生成素、生长激素、白介素、集落刺激因子等条件生长因子等。
(2)疫苗:单独或与至少一种抗原结合。
(3)核酸:RNA、DNA、低聚核苷酸和多核苷酸。
(4)上述各种活性成分的混合物。
壳聚糖季铵盐共聚物抗溶血试验:
大鼠断头取血,2000rpm离心10min,弃去上清液,生理盐水洗涤沉淀。稀释沉淀,计数得红细胞数浓度为5.0×109个/ml。
取浓度为1mg/ml的聚二乙醇化壳聚糖季铵盐共聚物溶液(pH 7.4)1ml与20μl红细胞混悬液混合,37℃培养1h,阳性对照为Triton-X溶液。12000rpm离心30min,541nm处测定吸光值。与阳性对照比较,计算得溶血百分比。数据如表1所示:
表1不同聚乙二醇化修饰度的壳聚糖季铵盐抗溶血百分比
a与修饰度为34%的聚合物相比。
经t-Test检验,p值均小于0.05,表明与修饰度为34%的聚乙二醇化壳聚糖季铵盐共聚物相比,修饰度为70%和90%的聚乙二醇化壳聚糖季铵盐共聚物的溶血程度显著降低。
壳聚糖季铵盐共聚物抑酶试验:
称取1g蛋白质底物,溶于100ml 0.065mol/L盐酸溶液中。另外称取胃蛋白酶0.02g溶于20ml 0.065mol/L盐酸溶液中。
量取不同修饰度的聚乙二醇化壳聚糖季铵盐共聚物溶液各2ml,与2ml酶溶液混合,室温培养10min后,各取1ml置于37℃水浴中保温5min。各管加入5ml底物溶液,摇匀,计时,37℃水浴中保温10min后,加入5ml 5%三氯乙酸溶液,摇匀,终止反应。待沉淀完全后,过滤,取滤液于275nm处测定吸光度。每个样品重复三次试验。计算抑酶率。数据如表2所示:
表2不同聚乙二醇化修饰度的壳聚糖季铵盐胃蛋白酶抑制率
a与修饰度为40%的聚合物相比。
经t-Test检验,p值均小于0.01,表明与修饰度为40%的聚乙二醇化壳聚糖季铵盐共聚物相比,修饰度为50%、70%和90%的聚乙二醇化壳聚糖季铵盐共聚物的抑酶率极显著提高。
本发明的有益效果如下:
(1)本发明的纳米粒,具有更高的亲水聚合物修饰度,可达50~90%。经过具有柔韧性和亲水性的高分子的修饰,可在纳米粒表面形成更为致密的亲水包衣,更好地屏蔽壳聚糖季铵盐的电荷,提高聚合物的生物相容性。
(2)本发明的纳米粒,更为致密的亲水包衣具有空间位阻效应,口服可以有效地抑制酶类降解药物。
(3)本发明的纳米粒粒径较小,具有靶向性,可提高胞内药物浓度减轻药物的不良反应。
(4)本发明中亲水聚合物包衣纳米粒,作用于血液,可以减少红细胞破裂溶血,减少血液内调理蛋白的吸附,降低网状内皮系统的摄取,提高药物的生物利用度。
(5)本发明在制备过程中未引入有机试剂,且无须高能量,利于保持药物的生物活性,同时,制备方法工艺安全,简单有效,符合环保要求,可通过调整投料比得到不同属性的纳米粒,适用性广泛。
附图说明
图1纳米粒透射电镜图。其中A实施例15:纳米粒聚乙二醇修饰度为90%;B实施例13:纳米粒聚乙二醇修饰度为50%。
具体实施方式
通过下面的具体实施例可进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1:将壳聚糖季铵盐水溶液与单甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液于室温混合,投料比为1∶4,搅拌24小时,纯化,得修饰度为50%的壳聚糖季铵盐水溶液。对胃蛋白酶的抑制率达到35.6%。
实施例2:将壳聚糖季铵盐水溶液与单甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液于室温混合,投料比为1∶5,搅拌24小时,纯化,得修饰度为70%的壳聚糖季铵盐水溶液。对胃蛋白酶的抑制率达到51.1%。
实施例3:将壳聚糖季铵盐水溶液与单甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液于室温混合,投料比为1∶6,搅拌24小时,纯化,得修饰度为90%的壳聚糖季铵盐水溶液。对胃蛋白酶的抑制率达到63.5%。
实施例4:将壳聚糖季铵盐水溶液与单甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液于室温混合,投料比为1∶6,搅拌10小时,纯化,得修饰度为85%的壳聚糖季铵盐水溶液。
实施例5:将壳聚糖季铵盐水溶液与单甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液于室温混合,投料比为1∶6,搅拌12小时,纯化,得修饰度为88%的壳聚糖季铵盐水溶液。
实施例6:将壳聚糖季铵盐水溶液与单甲氧基聚乙二醇2000羧甲基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液于室温混合,投料比为1∶6,搅拌18小时,纯化,得修饰度为89%的壳聚糖季铵盐水溶液。
实施例7:将壳聚糖季铵盐水溶液与聚氧乙烯-聚乙二醇羧甲基琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液于室温混合,投料比为1∶6,搅拌18小时,纯化,得修饰度为80%的壳聚糖季铵盐水溶液。
实施例8:将壳聚糖季铵盐水溶液与单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液于室温混合,投料比为1∶6,搅拌18小时,纯化,得修饰度为85%的壳聚糖季铵盐水溶液。
实施例9:量取实施例1中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与1mg/ml的胰岛素溶液按8∶1混合,搅拌10分钟后即可生成纳米粒,包封率为80%。
实施例10:量取实施例1中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与1mg/ml的胰岛素溶液按10∶1混合,搅拌10分钟后即可生成纳米粒,包封率为88%。
实施例11:量取实施例1中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与1mg/ml的胰岛素溶液按15∶1混合,搅拌10分钟后即可生成纳米粒,包封率为90%。
实施例12:量取实施例1中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与1mg/ml的胰岛素溶液按15∶1混合,搅拌1分钟后即可生成纳米粒,包封率为85%。
实施例13:量取实施例1中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与1mg/ml的胰岛素溶液按15∶1混合,搅拌5分钟后即可生成纳米粒,包封率为89%。
实施例14:量取实施例2中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与1mg/ml的胰岛素溶液按10∶1混合,搅拌2分钟后即可生成纳米粒,包封率为68%。
实施例15:量取实施例3中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与1mg/ml的胰岛素溶液按10∶1混合,搅拌5分钟后即可生成纳米粒子,包封率为59%。
实施例16:量取实施例1中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与1mg/ml的牛血清白蛋白溶液按15∶1混合,搅拌5分钟后即可生成纳米粒,包封率为82%。
实施例17:量取实施例2中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与1mg/ml的牛血清白蛋白溶液按15∶1混合,搅拌5分钟后即可生成纳米粒,包封率为66%。
实施例18:量取实施例1中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与0.5mg/ml的DNA溶液按10∶1混合,搅拌5分钟后即可生成纳米粒,包封率为81%。
实施例19:量取实施例1中共聚物溶液1ml,用pH 7.4的磷酸缓冲液稀释到2ml,与0.5mg/ml的DNA溶液按15∶1混合,搅拌5分钟后即可生成纳米粒,包封率为89%。
Claims (8)
2.根据权利要求1所述的共聚物,其特征在于所述的亲水性聚合物的分子量为2000-5000。
3.一种如权利要求1所述的亲水聚合物-壳聚糖季铵盐共聚物的制备方法,其特征在于具体步骤如下:
将壳聚糖季铵盐溶于蒸馏水中,于室温搅拌条件下加入亲水性聚合物活性酯的二甲基亚砜溶液,两者的投料比1∶4~1∶6,w/w,反应10~24小时,纯化,得共聚物水溶液;其中,所述的亲水性聚合物活性酯为单甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亚胺酯。
4.根据权利要求3所述的共聚物的制备方法,其特征在于所述的亲水性聚合物活性酯溶液浓度为5%~7.5%,w/v。
5.根据权利要求3所述的共聚物的制备方法,其特征在于反应时间为12h-18h。
6.一种水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒,其特征在于组成为:按重量百分比计,如权利要求1所述的亲水聚合物-壳聚糖季铵盐共聚物为85~95%,药物为5~15%,粒径为200~300nm。
7.根据权利要求6所述的水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒,其特征在于所述药物包载至少如下活性成分中的一种:
(1)蛋白质和多肽:胰岛素、血红蛋白、白蛋白、细胞色素、干扰素、抗原、抗体、红细胞生成素、生长激素、白介素或集落刺激因子;
(2)疫苗:单独或与至少一种抗原结合;
(3)核酸:RNA、DNA、低聚核苷酸或多核苷酸。
8.一种如权利要求6或7所述的水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒的制备方法,其特征在于具体步骤如下:
将药物溶液加至亲水聚合物-壳聚糖季铵盐共聚物溶液中,其中药物溶液pH高于药物等电点,两者的投料比为8∶1~15∶1,w/w,搅拌1~10min,即可生成水化层包衣的壳聚糖季铵盐纳米粒。
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