CN101717455A

CN101717455A - 一种类肝素多糖的制备方法

Info

Publication number: CN101717455A
Application number: CN200910273257A
Authority: CN
Inventors: 杨建红; 伍康; 张秋花; 杜予民
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2029-12-15
Also published as: CN101717455B

Abstract

本发明公开了一种类肝素多糖的制备方法，由甲壳素经磷酸处理、6位选择性氧化反应、脱乙酰反应、磺化反应和/或硫酸酯化反应后制得类肝素多糖，其硫酸基取代度为0.3～1.35，分子量为0.40×10⁴～1.5×10⁴。本发明重复性好，所制备的类肝素多糖结构与肝素较接近，且具有较高的抗凝血活性，有望替代肝素用作抗凝血药物。

Description

一种类肝素多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种类肝素多糖的制备方法，特别是涉及一种以甲壳素为原料制备与肝素结构相近的高分子化合物——类肝素多糖的制备方法，属于医用高分子领域。

背景技术

心脑血管疾病是世界卫生组织公布的死亡率最高的三大疾病之一，使用抗凝血药物是心脑血管疾病的主要治疗方法。肝素作为常用的抗凝血药物，已经临床使用70多年。但在临床中大约有2.6％的肝素使用者发生自发性出血事故，另外肝素价格昂贵，还存在着来源于动物，易在制备过程中受污染等问题，所以寻找可替代肝素抗凝血药物一直是研究热点。

甲壳素是仅次于纤维素的生物合成量第二丰富的天然多糖，它是N-乙酰基-D-葡胺糖通过β-(1，4)糖苷键连接而成的直链状多糖，壳聚糖是甲壳素脱乙酰产物，也是自然界中唯一发现的聚阳离子的天然多糖。甲壳素/壳聚糖有着与肝素相似的糖链结构，并易于发生与肝素同型的化学修饰，并且具有无毒、生物相容性、生物可降解性等特殊性质，故在抗凝血材料应用的研究中受到广泛关注。目前向甲壳素/壳聚糖中引入硫酸基团是研究类肝素多糖制备的常用方法。然而，由于肝素中还含有2位乙酰基和6位羧基等基团，向壳聚糖中单纯的引入硫酸基团不能最大程度模拟肝素，也有在甲壳素或壳聚糖的6位或2位引入羧甲基基团，但羧甲基基团体积较大影响了其功能的发挥，此外在以甲壳素/壳聚糖为原料的类肝素的制备中目前也不考虑2位乙酰基含量的影响，所制得的类肝素产物在结构上和肝素相差太大，因而其抗凝血活性也难以和肝素相媲美。时至今日，以甲壳素/壳聚糖为原料来最大限度模拟肝素以期获得最佳性能依然是一个十分重要的研究领域。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术难以得到结构和肝素较为接近，且具有较高抗凝血活性的类肝素多糖的不足，提供一种类肝素多糖的制备方法。

实现本发明目的的技术方案是：一种类肝素多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)磷酸处理：将甲壳素与60wt％～90wt％的磷酸按质量比为1∶10～30的比例混合，室温下搅拌至甲壳素完全溶解，接着在搅拌条件下将该溶液加入到水中，水的质量为甲壳素质量的30～200倍，沉淀后离心分离，再用水洗涤沉淀至中性得到酸处理产物；

(2)6位选择性氧化反应：将酸处理产物分散于水中，水的质量为甲壳素质量的20～50倍，冰浴条件下加入2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基和NaBr固体，2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基和NaBr固体的质量分别为甲壳素质量的0.5％～2％和10％～45％，搅拌至完全溶解后加入3wt％～10wt％的NaClO溶液，NaClO溶液的质量为甲壳素质量的8～30倍，反应过程中使溶液的pH值稳定在9.5～10.8，反应0.5～1小时，然后加入甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇，甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇的质量为NaClO溶液质量的0.05～0.3倍，调节体系pH值至中性，然后将溶液透析或超滤净化，再减压蒸馏浓缩，用甲醇、乙醇、丙酮或乙醚沉淀，将沉淀物真空干燥得到6位选择性氧化反应产物；

(3)脱乙酰反应：将6位选择性氧化反应产物分散在NaOH的乙醇-水溶液中，该NaOH的乙醇-水溶液中NaOH的浓度为10wt％～35wt％，乙醇与水的体积比为4～8∶1，该NaOH的乙醇-水溶液的质量为甲壳素质量的10～30倍，然后在50～70℃搅拌反应0.5～2小时，反应结束后过滤，将产物用水溶解后再调节体系pH值至中性，透析或超滤净化，减压蒸馏浓缩，用甲醇、乙醇、丙酮或乙醚沉淀，真空干燥得到脱乙酰反应产物；

(4)将脱乙酰反应产物经磺化反应或硫酸酯化反应得到类肝素多糖，所述磺化反应的具体方法为：将脱乙酰反应产物溶解于水中，水的质量为甲壳素质量的10～100倍，接着加入三甲胺-三氧化硫复合物和Na₂CO₃，三甲胺-三氧化硫复合物和Na₂CO₃的加入量分别为甲壳素糖残基物质的量的3～10倍和2.5～5.0倍，于40～65℃恒温搅拌反应8～16小时，然后将反应液经透析或超滤净化，减压蒸馏浓缩，用甲醇、乙醇、丙酮或乙醚沉淀，真空干燥得到类肝素多糖；所述硫酸酯化反应的方法为：将脱乙酰反应产物分散于DMF、DMSO或甲酰胺中，DMF、DMSO或甲酰胺的质量为甲壳素质量的10～50倍，在40～60℃搅拌0.5～2小时，然后加入三氧化硫吡啶复合物，三氧化硫吡啶复合物与脱乙酰反应产物糖残基的物质的量之比为1～4∶1，搅拌反应3～6小时，将反应液经冰水冷却，再用1wt％～10wt％的碱溶液中和，然后将反应液透析或超滤净化，减压蒸馏浓缩，用甲醇、乙醇、丙酮或乙醚沉淀，真空干燥得到类肝素多糖；

将上述步骤(4)中磺化反应的最终产物分散于DMF、DMSO或甲酰胺中，DMF、DMSO或甲酰胺的质量为甲壳素质量的10～50倍，在40～60℃搅拌至磺化反应产物完全溶解，然后加入三氧化硫吡啶复合物，三氧化硫吡啶复合物与磺化反应产物糖残基的物质的量之比为1～4∶1，搅拌反应3～6小时，将反应液经冰水冷却，再用1wt％～10wt％的碱溶液中和，然后将反应液透析或超滤净化，减压蒸馏浓缩，用甲醇、乙醇、丙酮或乙醚沉淀，真空干燥得到类肝素多糖。

上述步骤(2)反应过程中是用NaOH、KOH、Na₂CO₃或K₂CO₃调节溶液的pH值使其稳定在9.5～10.8。

上述步骤(2)和(3)中是用盐酸、磷酸、乙酸、丙酸、或0.5wt％～20wt％稀硫酸调节体系pH值至中性。

所述1wt％～10wt％碱溶液中的碱为KOH、NaOH、Na₂CO₃、K₂CO₃或氨水。

本发明以甲壳素为原料，首先通过浓酸处理破坏甲壳素的结晶区得到无定形甲壳素，然后利用2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基(Tempo)/NaBr/NaClO体系氧化6位羟基为羧基，并通过控制反应条件获得合适氧化度；再在醇水体系利用碱脱去部分乙酰基，控制乙酰基的含量，最后可以仅通过磺化反应或硫酸酯化反应在多糖引入硫酸基，也可通过磺化反应后再硫酸酯化反应来引入硫酸基，经过以上步骤反应控制了多糖6位羧基、2位乙酰基及硫酸基的含量和比例，使单位糖链电荷密度等和肝素类似，从而获得与肝素结构比较接近的类肝素多糖。采用本发明方法获得的类肝素多糖的分子量为0.40×10⁴～1.5×10⁴，硫酸基取代度为0.30～1.35。本发明的制备方法条件易于控制，重复性好，产物纯度高，抗凝血活性好，有望作为药物应用。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

以下实施例中所用百分比浓度均为质量百分比浓度。

实施例1：

将20g甲壳素粉末(通常采用市售甲壳素即可，本发明实施例中是采用60目、脱乙酰度9％的甲壳素)分散到200ml浓度为85％的磷酸中，搅拌，待甲壳素全部溶解后，将此溶液加入到4000ml蒸馏水中，边加边快速搅拌，沉淀出白色胶状甲壳素后离心分离除去水分，用蒸馏水洗涤至中性，得到酸处理产物。将酸处理产物分散于1000ml蒸馏水中，冰水浴条件下，搅拌，加入240mg Tempo和8g NaBr，使Tempo和NaBr完全溶解，接着加入480ml 4％的NaClO溶液，持续滴加0.5M的NaOH溶液使反应过程中溶液的pH值稳定在10.8，反应1h，再加入50ml乙醇，用2M乙酸调pH值至中性后溶液超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，将沉淀真空干燥得到6位选择性氧化反应产物。将6位选择性氧化反应产物分散于含有480ml乙醇、120ml水和58g NaOH的溶液中，在60℃恒温搅拌下反应0.5h，反应结束后过滤，固体用蒸馏水溶解后用2M乙酸调节pH值到中性，超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到脱乙酰产物。将脱乙酰产物分散于300ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在60℃搅拌0.5h，加入52g SO₃-Py复合物，反应4h，用冰水冷却，2％NaOH溶液中和后超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到产品。对该产品进行IR和NMR表征，证实产品为类肝素多糖，该多糖的其中一个片段结构见附图。

IR：COONa，1415cm^-1，1620cm^-1，强；S＝O，1245cm^-1，强；C-O-S，803cm^-1；¹³C NMR：C＝O，δ175.0ppm(COONa)，δ174.1ppm(CH₃CO)，C₆与SO₃Na相连，δ70.4ppm，C₂与NHSO₃Na相连，60.2ppm。纯度＞99.5％。

实施例2：

将5g甲壳素粉末(60目，脱乙酰度15％)分散到90ml 65％磷酸中，搅拌至甲壳素全部溶解后，将此溶液加入到300ml蒸馏水中，边加边快速搅拌，沉淀出白色胶状甲壳素后离心分离去水分，用蒸馏水洗涤沉淀至中性，得到酸处理产物。将此酸处理产物分散于150ml蒸馏水中，冰水浴条件下，搅拌，加入75mg Tempo和1.5g NaBr，使Tempo和NaBr完全溶解，接着加入40ml 10％的NaClO溶液，持续滴加2M的KOH溶液使反应过程中溶液的pH值稳定在9.6，反应0.5h，再加入10ml甲醇，用4M的HCl调pH值至中性后溶液超滤净化，减压蒸馏浓缩，丙酮沉淀，真空干燥得到6位选择性氧化反应产物。将6位选择性氧化反应产物分散于含有100ml乙醇、20ml水和25g NaOH的溶液中，在65℃恒温搅拌反应1h，过滤，固体用蒸馏水溶解后用4M的HCl调节pH值至中性，超滤净化，减压蒸馏浓缩，丙酮沉淀，真空干燥得到脱乙酰产物。将脱乙酰产物分散于200ml DMF(也可以采用DMSO或甲酰胺)中，在45℃搅拌0.5h，加入7g SO₃-Py复合物，反应6h，用冰水冷却，5％ Na₂CO₃溶液中和后超滤净化，减压蒸馏浓缩，丙酮沉淀，真空干燥得到最终产品。按与实施例1相同的方法对产品进行表征，证实其为类肝素多糖。

IR：COONa，1417cm^-1，1621cm^-1，强；S＝O，1225cm^-1，强；C-O-S，805cm^-1；¹³C NMR：C＝O，δ175.3ppm(COONa)，δ174.0ppm(CH₃CO)，C₆与SO₃Na相连，δ70.8ppm，C₂与NHSO₃Na相连，60.0ppm。纯度＞99.5％。

实施例3：

将2g甲壳素粉末(60目，脱乙酰度15％)分散到38ml 70wt％磷酸中，搅拌至甲壳素全部溶解后，将此溶液加入到200ml蒸馏水中，边加边快速搅拌，沉淀出白色胶状甲壳素后离心分离去水分，用蒸馏水洗涤至中性，得到酸处理产物。将酸处理产物分散于50ml蒸馏水中，冰水浴条件下，搅拌，加入16mg Tempo和0.8g NaBr，使Tempo和NaBr完全溶解，接着加入16ml 8％的NaClO溶液，持续滴加2M的Na₂CO₃溶液使反应过程中溶液的pH值为10.0，反应0.5h，再加入4.5ml乙醇，用3M磷酸调pH值至中性后溶液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，无水甲醇沉淀，真空干燥得到6位选择性氧化反应产物。将6位选择性氧化反应产物分散于含有35ml乙醇、5ml水和11gNaOH的溶液中，在55℃搅拌反应0.5h，过滤，固体用蒸馏水溶解后用3M磷酸调pH值为中性，溶液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，无水甲醇沉淀，真空干燥得到脱乙酰产物。将脱乙酰产物溶解在180ml蒸馏水中，加入9.0g三甲胺-三氧化硫(Me₃N-SO₃)复合物和5.0g Na₂CO₃，在65℃反应8h，反应液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，无水甲醇沉淀，真空干燥得到最终产品。按与实施例1相同的方法对产品进行表征，证实其为类肝素多糖。

IR：COONa，1420cm^-1，1618cm^-1，强；S＝O，1245cm^-1，强；N-SO₂，705cm^-1，877cm^-1；¹³C NMR：C＝O，δ174.7ppm(COONa)，δ175.8ppm(CH₃CO)，C₂与NHSO₃Na相连，59.4ppm。纯度＞99.5％。

实施例4：

将10g甲壳素粉末(0.05083，60目，脱乙酰度15％)分散到100ml 85％磷酸中，搅拌至甲壳素全部溶解后，将此溶液加入到1500ml蒸馏水中，边加边快速搅拌，沉淀出白色胶状甲壳素后离心分离去水分，用蒸馏水洗涤沉淀至中性，得到酸处理产物。将此酸处理产物分散于400ml蒸馏水中，冰水浴条件下，搅拌，加入100mg Tempo和4.0g NaBr，使Tempo和NaBr完全溶解，接着加入104ml 5％的NaClO溶液，持续滴加1M的K₂CO₃使反应过程中溶液的pH值稳定在10.5，反应0.5h，再加入20ml正丙醇(或者用20mL异丙醇代替正丙醇)，用5M丙酸调pH值至中性后溶液超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醚沉淀，真空干燥得到6位选择性氧化反应产物。将6位选择性氧化反应产物分散于含有200ml乙醇、40ml水和45gNaOH的溶液中，在60℃搅拌反应0.5h，过滤，固体用蒸馏水溶解后用5M丙酸调pH值为中性，溶液超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醚沉淀，真空干燥得到脱乙酰产物。将脱乙酰产物溶解在180ml蒸馏水中，加入25g Me₃N-SO₃复合物和25g Na₂CO₃，在45℃反应16h，反应液超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醚沉淀，真空干燥得到磺化产物。将磺化反应产物分散于200ml DMSO中，在60℃搅拌2h，加入27g SO₃-Py复合物，反应4h，用冰水冷却，4％NaOH溶液中和后超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醚沉淀，真空干燥得到最终产品。按与实施例1相同的方法对产品进行表征，证实其为类肝素多糖。

IR：COONa，1421cm^-1，1620cm^-1，强；S＝O，1206cm^-1，强；N-SO₂，707cm^-1，878cm^-1；¹³C NMR：C＝O，δ175.0ppm(COONa)，δ175.7ppm(CH₃CO)，C₂与NHSO₃Na相连，59.6ppm。纯度＞99.5％。

实施例5：

将2g甲壳素粉末(60目，脱乙酰度9％)分散到38ml 70％磷酸中，搅拌至甲壳素全部溶解后，将此溶液加入到200ml蒸馏水中，边加边快速搅拌，沉淀出白色胶状甲壳素后离心分离去水分，用蒸馏水洗涤至中性，得到酸处理产物。将此酸处理产物分散于80ml蒸馏水中，冰水浴条件下，搅拌，加入24mg Tempo和0.8gNaBr，使Tempo和NaBr完全溶解，接着加入24ml 4％的NaClO溶液，持续滴加0.5M的KOH溶液使反应过程中溶液的pH值为10.5，反应0.5h，再加入5ml乙醇，用5％硫酸调pH值至中性后将溶液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，丙酮沉淀，真空干燥得到6位选择性氧化反应产物。将6位选择性氧化反应产物分散于含有35ml乙醇、5ml水和8.5gNaOH的溶液中，在60℃搅拌反应1h，过滤，固体用蒸馏水溶解后用5％硫酸调pH值为中性，溶液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到脱乙酰产物。将脱乙酰产物溶解在150ml蒸馏水中，加入8.0g Me₃N-SO₃复合物和4g Na₂CO₃，在65℃反应12h，反应液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化产物。将磺化反应产物分散于80ml甲酰胺(FA)溶液中，在60℃搅拌0.5h，加入6g SO₃-Py复合物，反应4h，用冰水冷却，6％ K₂CO₃溶液中和后超滤净化，减压蒸馏浓缩，丙酮沉淀，真空干燥得到最终产品。按与实施例1相同的方法对产品进行表征，证实其为类肝素多糖。

IR：S＝O，1226cm^-1，强；C-O-S，802cm^-1，较强；S-O，1047cm^-1；COOH，1745cm^-1；¹³C NMR：C＝O，δ170-175ppm(COONa，CH₃CO，COOH)；C₂与NHSO₃Na相连，62.8ppm；C₆与SO₃Na相连，70.6ppm；C₃与SO₃Na相连，73.9ppm。纯度＞99.5％。

实施例6：

将2g甲壳素粉末(60目，脱乙酰度15％)分散到40ml 65％磷酸中，搅拌至甲壳素全部溶解后，将此溶液加入到200ml蒸馏水中，边加边快速搅拌，沉淀出白色胶状甲壳素后离心分离去水分，用蒸馏水洗涤至中性，得到酸处理产物。将此酸处理产物分散于80ml蒸馏水中，冰水浴条件下，搅拌，加入24mg Tempo和0.8g NaBr，混合均匀，接着加入24ml 8％的NaClO溶液，持续滴加2M的Na₂CO₃溶液使反应过程中溶液的pH值稳定在10.5，反应1h，再加入5ml甲醇，用6M乙酸调pH值至中性后将溶液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到6位选择性氧化反应产物。将6位选择性氧化反应产物分散于含有35ml乙醇、5ml水和8.5gNaOH的溶液中，在60℃搅拌反应2h，过滤，固体用蒸馏水溶解后用6M乙酸调pH值为中性，溶液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，丙酮沉淀，真空干燥得到脱乙酰产物。将脱乙酰产物溶解在150ml蒸馏水中，加入8.0gMe₃N-SO₃复合物和3.5g Na₂CO₃，在65℃反应14h，反应液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到磺化产物。将磺化反应产物分散于80ml DMF溶液中，在60℃搅拌0.5h，加入6g SO₃-Py复合物，反应4h，用冰水冷却，3％KOH溶液中和后超滤净化，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到最终产品。按与实施例1相同的方法对产品进行表征，证实其为类肝素多糖。

IR：S＝O，1243cm^-1，强；C-O-S，805cm^-1，较强；S-O，1046cm^-1；COOH，1742cm^-1；¹³C NMR：C＝O，δ170-175ppm(COONa，CH₃CO，COOH)；C₂与NHSO₃Na相连，62.5ppm；C₆与SO₃Na相连，70.9ppm；C₃与SO₃Na相连，73.8ppm。纯度＞99.5％。

实施例7：

将2克甲壳素粉末(60目，脱乙酰度9％)分散到35ml 85％磷酸中，搅拌，待甲壳素全部溶解后。将此溶液加入到200ml蒸馏水中，边加边快速搅拌，沉淀出白色胶状甲壳素后离心分离去水分，用蒸馏水洗涤至中性，加入80ml蒸馏水，冰水浴条件下，搅拌，加入24mg Tempo，0.8g NaBr，混合均匀，接着加入24ml 4％的NaClO溶液，持续滴加1M的NaOH溶液控制pH值为10.5，反应0.5h，再加入5ml乙醇，用10％硫酸调pH值至中性后将溶液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，无水乙醇沉淀，真空干燥得到6位选择性氧化反应产物。将6位选择性氧化反应产物分散于含有35ml乙醇、5ml水和8.5gNaOH的溶液中，在60℃搅拌反应2h，过滤，固体用蒸馏水溶解后用10％硫酸调pH值为中性，溶液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，真空干燥得到脱乙酰产物。将脱乙酰产物溶解在150ml蒸馏水中，加入8.0g Me₃N-SO₃复合物和5g Na₂CO₃，在65℃反应16h，反应液对蒸馏水透析72h，减压蒸馏浓缩，无水乙醇沉淀，真空干燥得到磺化产物。将磺化反应产物分散于80ml DMSO溶液中，在60℃搅拌0.5h，加入6g SO₃-Py复合物，反应4h，用冰水冷却，10％氨水溶液中和后超滤净化，减压蒸馏浓缩，无水乙醇沉淀，真空干燥得到最终产品。按与实施例1相同的方法对产品进行表征，证实其为类肝素多糖。

IR：S＝O，1246cm^-1，强；C-O-S，806cm^-1，较强；S-O，1045cm^-1；COOH，1745cm^-1；¹³C NMR：C＝O，δ170-175ppm(COONa，CH₃CO，COOH)；C₂与NHSO₃Na相连，62.8ppm；C₆与SO₃Na相连，70.9ppm；C₃与SO₃Na相连，74.1ppm。纯度＞99.5％。

采用GPC、元素分析及中国药典标准方法测试本发明实施例1～7所得类肝素多糖的分子结构参数和抗凝血活性，结果列于表1。

表1类肝素多糖的分子结构参数和抗凝血活性

Claims

1.一种类肝素多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的类肝素多糖的制备方法，其特征在于：将步骤(4)中磺化反应的最终产物分散于DMF、DMSO或甲酰胺中，DMF、DMSO或甲酰胺的质量为甲壳素质量的10～50倍，在40～60℃搅拌0.5～2小时，然后加入三氧化硫吡啶复合物，三氧化硫吡啶复合物与磺化反应产物糖残基的物质的量之比为1～4∶1，搅拌反应3～6小时，将反应液经冰水冷却，再用1wt％～10wt％的碱溶液中和，然后将反应液透析或超滤净化，减压蒸馏浓缩，用甲醇、乙醇、丙酮或乙醚沉淀，真空干燥得到类肝素多糖。

3.根据权利要求1所述的类肝素多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)反应过程中是用NaOH、KOH、Na₂CO₃或K₂CO₃调节溶液的pH值使其稳定在9.5～10.8。

4.根据权利要求1所述的类肝素多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中是用盐酸、磷酸、乙酸、丙酸、或0.5wt％～20wt％稀硫酸调节体系pH值至中性。

5.根据权利要求1或2所述的类肝素多糖的制备方法，其特征在于：所述1wt％～10wt％碱溶液中的碱为KOH、NaOH、Na₂CO₃、K₂CO₃或氨水。