CN101709325A - 一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法及其配用的试剂盒和其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种定标测定5’-核苷酸酶的方法及其配用的试剂盒和其用途，本发明用5’-核苷酸酶脱脱氢酶法检测试剂盒确定5’-核苷酸酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以标准品的活性为参照，定量测定生物样本中5’-核苷酸酶的活性。本发明优点在于解决了Trinder氏法的缺陷，提高了精确度，减少了仪器误差以及增强了5’-核苷酸酶正常参考范围数据的可比性且通过测定5’-核苷酸酶的活性用于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤等疾病的诊断等，适合在医院中进行推广使用。

Description

一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法及其配用的试剂盒和其用途

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种定标测定5’-核苷酸酶的方法及其配用的试剂盒和其用途。

背景技术

现有技术中用Trinder氏法定量测定5’-核苷酸酶活性在临床化学检验上较为普遍，但是，Trinder氏法缺点在于没能使用一种公认的标准法测定的5’-核苷酸酶标准品，从而造成测试精确度下降、不同实验室应用不同生化分析仪引起的仪器误差，此外还是5’-核苷酸酶正常参考范围数据混乱、不可比拟性的主要原因。

5’-核苷酸酶脱氢酶法应用5’-核苷酸酶解5’-次黄嘌呤核苷酸生成次黄嘌呤核苷和氨，氨和α-酮戊二酸以及还原性辅酶在谷氨酸脱脱氢酶的作用下反应生成谷氨酸及辅酶，在340nm处检测NADH的消耗速率来测定5’-核苷酸酶活性通过制定氨标准曲线，可定量5’-核苷酸酶活性，5’-核苷酸酶活性定义为在5’-核苷酸酶脱氢酶法条件下37℃每分钟产生一个μmol氨所需5’-核苷酸酶的量，其原理反应方程式如下：

但是5’-核苷酸酶脱氢酶法可定量测定5’-核苷酸酶活性，但此法易受外源性氨的干扰，不适于临床生化检验。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，而提供一种在Trinder氏法中加入5’-核苷酸酶标准品，用5’-核苷酸酶脱氢酶法确定5’-核苷酸酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以5’-核苷酸酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中5’-核苷酸酶活性，从而保证精确度高，测定速度快，且减少了仪器误差以及增强了5’-核苷酸酶正常参考范围数据的可比性的定标测定5’-核苷酸酶活性的方法。

本发明的另一个目的是提供用以实现定标测定5’-核苷酸酶活性的方法的配用的试剂盒。

本发明的第三个目的是一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法配用的试剂盒的用途，主要是用于提供5’-核苷酸酶的活性测定用于急性肝损伤及残留病变的诊断以及协助慢性肝病及肝纤维化的诊断。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是：包括以下步骤：

步骤一是确定5’-核苷酸酶标准品的活性；

步骤二是再通过5’-核苷酸酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物；

步骤三是以连续监测醌化合物在546nm处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中5’-核苷酸酶的活性。

采取的措施还包括：

在上述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法中，所述的步骤一中具体操作为将5’-核苷酸酶样本与试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入试剂RII，在340nm处连续120秒定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物5’-次黄嘌呤核苷酸，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有5’-核苷酸酶标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出5’-核苷酸酶标准品活性。

在上述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法中，所述的试剂RI包括10mol/L的5’-次黄嘌呤核苷酸、0.015mol/L的a-酮戊二酸、0.30×10^-3mol/L的还原型辅酶I二钠盐以及0.10mol/L的且pH值为7.20的磷酸缓冲液，所述的试剂RII为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶。

在上述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法中，所述的5’-核苷酸酶样本为8μL，试剂I为150μL，试剂II为75μL，5’-核苷酸酶样本与试剂I同时加入，在第180秒加入试剂II，且温度反应温度控制37℃。

在上述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法中，所述的波长的主波长为560nmnm，副波长为700nm。

在上述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法中，所述的步骤三中的计算按以下公式进行计算：

测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)，

$\mathrm{\ΔA}/\min =\frac{(\mathrm{\Δ}{A}_1/\min +\mathrm{\Δ}{A}_2/\min +....................\mathrm{\Δ}{A}_t/\min )}{t}$

ΔA₁/min代表测试时间第1min吸光度变化率

ΔA₂/min代表测试时间第2min吸光度变化率

………………………………………

ΔA_t/min代表测试时间第tmin吸光度变化率

t为测试时间

样本5’-核苷酸酶活性＝(ΔA_X/ΔA_C)×Ec

其中：ΔA_X＝样本ΔA/min

      ΔA_C＝标准品ΔA/min

      Ec＝5’-核苷酸酶标准品的活性。

一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法配用的试剂盒，所述的试剂盒由以下成分组成：包括试剂R1、试剂R2、5’-核苷酸酶标准品、5’-核苷酸酶质控血清以及533测试/盒，所述的试剂R1包括80mol/L的甘氨酸缓冲液、2mol/L的N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、0.5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0.8KU/L的黄嘌呤氧化酶以及0.6KU/L的过氧化物酶，所述的试剂R2包括10mol/L的5’-次黄嘌呤核苷酸以及2mol/L的4-氨基安替比林，所述的5’-核苷酸酶标准品为人源基因重组蛋白，5’-核苷酸酶异常血清为人源基因重组蛋白和人血清。

在上述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法及其配用的试剂盒中，所述的试剂盒包含试剂R1为80ml/1瓶×2，试剂R2为80ml/1瓶，5’-核苷酸酶标准品1ml/1瓶，5’-核苷酸酶异常血清2ml/1瓶。

一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法及其配用的试剂盒的用途中，该测定用于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤等疾病的诊断。

在上述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法及其配用的试剂盒的用途中，所依据的原理反应方程式如下：

与现有技术相比，本发明的优点在于用5’-核苷酸酶脱氢酶法确定5’-核苷酸酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以5’-核苷酸酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中5’-核苷酸酶活性，本发明解决了Trinder氏法的缺陷，提高了测试精确度、减少了仪器误差和增强了5’-核苷酸酶正常参考范围数据的可比性，也方便了通过测定5’-核苷酸酶的活性用于判断该测定用于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤等疾病的诊断，适合在医院中进行推广使用。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

1、5’-核苷酸酶标准品和其活性的确定

(1)5’-核苷酸酶标准品活性0-100U/L人源基因重组5’-核苷酸酶

(2)5’-核苷酸酶标准品活性的确定

试剂组成：

试剂RI：包括10mol/L的5’-次黄嘌呤核苷酸、0.015mol/L的a-酮戊二酸、0.30×10^-3mol/L的还原型辅酶I二钠盐、以及0.10mol/L的且pH值为7.20的磷酸缓冲液；

试剂RII：为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶。

生物样本：0-100U/L人源基因重组5’-核苷酸酶

试验参数及操作步骤：

样本8μL，试剂I150μL，试剂II75μL；

反应温度37℃

空白时间：开始第-60秒，结束第-10秒

反应时间：开始第180S，结束第300S

波长：主波长560nm  副波长700nm

测试仪：贝克曼LX20全自动生化分析仪

5’-核苷酸酶活性(U/L)定义为在5’-核苷酸酶脱氢酶法条件下37℃每分钟产生一个μmol氨所需5’-核苷酸酶的量，参照5’-核苷酸酶脱氢酶法，具体操作为将8μL的5’-核苷酸酶样本与150μL的试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入20μL的试剂RII，在340nm处连续120秒定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物5’-次黄嘌呤核苷酸，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有5’-核苷酸酶标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出5’-核苷酸酶标准品活性(U/L)。

测定用的试剂盒中，试剂盒由以下成分组成：包括试剂R180ml/1瓶×2、试剂R280ml/1瓶、5’-核苷酸酶标准品1ml/1瓶、5’-核苷酸酶异常血清2ml/1瓶以及533测试/盒，

试剂R1：包括80mol/L的甘氨酸缓冲液、2mol/L的N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、0.5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0.8KU/L的黄嘌呤氧化酶以及0.6KU/L的过氧化物酶；

试剂R2：包括10mol/L的5’-次黄嘌呤核苷酸以及2mol/L的4-氨基安替比林以及；

5’-核苷酸酶标准品：人源基因重组蛋白；

5’-核苷酸酶异常血清：人源基因重组蛋白和人血清。

试剂配置：

5’-核苷酸酶试剂为液体试剂，可直接上机使用。

5’-核苷酸酶标准品和5’-核苷酸酶质控血清是冻干品，需要用一定蒸馏水溶解方可使用。

试剂的稳定与贮存期

试剂30℃下可避光保存一周，室温18～19℃下一月，2～8℃一年，严禁冷冻。溶化后的5’-核苷酸酶质控血清30℃下可至少保存二周，2～8℃或冷冻保存期更长。

试验参数与操作步骤：

温度              37℃

波长              546nm

比色杯光径        1.0cm

测试方法          速率法

反应方向          正

予孵育            0.005ml样品+0.18mlR1(或依比例混匀)

予孵育时间        5分钟

启动反应          加0.09ml R2(或依比例混匀)

样品/试剂         1∶54

延迟时间          8分钟

测试时间       2分钟

空白参照       水

总反应时间     10分钟

测试仪  HITACHI 7100全自动生化分析仪

2、样本5’-核苷酸酶活性的测定：

参照Trinder氏法用5’-核苷酸酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中的5’-核苷酸酶活性，应用5’-核苷酸酶偶联嘌呤核苷磷酸化酶，黄嘌呤氧化酶和过氧化物酶反应连续检测法，5’-核苷酸酶酶解腺苷脱氨产生次黄苷；再通过偶联嘌呤核苷磷酸化酶的作用，生成次黄嘌呤；后者在黄嘌呤氧化酶氧化下生成尿酸和过氧化氢，最后在过氧化物酶的作用下过氧化氢再与N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐以及4-氨基安替比林(4-AA)反应，生成紫红色的有色醌化合物，并通过动态测量有色醌546nm处吸光度上升的速度来测算5’-核苷酸酶的活性，一个单位5’-核苷酸酶活性(U/L)定义为在条件37℃下每分钟将1μmol5’-次黄嘌呤核苷酸酶解成为次黄嘌呤核苷，所依据的原理是：

(2.3)计算：

测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)，

$\mathrm{\ΔA}/\min =\frac{(\mathrm{\Δ}{A}_1/\min +\mathrm{\Δ}{A}_2/\min +.................\mathrm{\Δ}{A}_t/\min )}{t}$

ΔA₁/min代表测试时间第1min吸光度变化率

ΔA₂/min代表测试时间第2min吸光度变化率

………………………………………

ΔA_t/min代表测试时间第tmin吸光度变化率

t为测试时间

样本5’-核苷酸酶活性＝(ΔA_X/ΔA_C)×Ec

其中：ΔA_X＝样本ΔA/min

      ΔA_C＝标准品ΔA/min

      Ec＝5’-核苷酸酶标准品的活性

注意事项：

1.试剂和样品用量可因仪器不同，按比例增减。

2.若样品5’-核苷酸酶＞100U/L，须用生理盐水稀释样品，结果乘以稀释倍数。

3.如保存不当，试剂发现有浑浊时，应弃用。

试剂性能：

线性范围：0～100U/L，(r²＞0.995)

精密度：批内CV≤6.0％；批间CV≤10.0％；

特异性：血清、30mg/d胆红素、200mg/dl血红蛋白、500mg/dl甘油三酯和4mg/dl抗坏血酸对本法无干扰。

灵敏度：试剂检测下限≤2.0U/L

参考值：

正常人血清5’-核苷酸酶活性参考值范围在0～11U/L，根据自身实验条件自行订定正常人血清5’-核苷酸酶活性范围。

依据上面的原理5’-核苷酸酶活性的测定具有多种用途，5’-核苷酸酶将腺苷脱氨产生次黄苷和氨，5’-核苷酸酶广泛存在人体各组织中，尤以小肠、肝、脾最多，血液细胞内酶活性为血清中的40~70陪，故测定时应避免溶血。血清5’-核苷酸酶的正常参考值为0～11U/L。5’-核苷酸酶异常增高见于：

1、5’-核苷酸酶活性增高常见于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤，其活性增高可达2～6倍，且与病情严重程度呈正相关。

2、5’-核苷酸酶是诊断肝肿瘤非常灵敏的酶学指标。在病变早期，当肝功能、肝扫描和有关肝病检查阴性时本酶活性已明显增高，对于AFP阴性病例，其与AFP互补诊断肝癌的阳性率可达94％。

3、特异性高，能协助判断碱性磷酸酶(ALP)增设是肝胆系统疾病，还是骨髓系统疾病(如骨癌、骨肉瘤、骨转移癌、佝偻病等)，ALP在肝胆系统疾病和骨骼系统疾病时均可增高。除5-NT除肝胆系统疾病增高外，骨骼系统疾病一般均不升高。

4、有助于鉴别诊断肝细胞性黄疸和阻塞性黄疸，后者5’-核苷酸酶明显高于前者。

5、5’-核苷酸酶已作为肝功能常规项目检查进入临床，将能使临床医生更全面地了解患者肝脏情况，提高其临床应用价值。

本发明的优点在于用5’-核苷酸酶脱氢酶法确定5’-核苷酸酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以5’-核苷酸酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中5’-核苷酸酶活性，本发明解决了Trinder氏法的缺陷，提高了测试精确度、减少了仪器误差和增强了5’-核苷酸酶正常参考范围数据的可比性，也方便了通过测定5’-核苷酸酶的活性用于判断该测定用于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤等疾病的诊断等，适合在医院中进行推广使用。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神所定义的范围。

Claims (10)

1.一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是：包括以下步骤：

步骤一是确定5’-核苷酸酶标准品的活性；

步骤二是再通过5’-核苷酸酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物；

步骤三是以连续监测醌化合物在546nm处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中5’-核苷酸酶的活性。

2.根据权利要求1所述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是：所述的步骤一中具体操作为将5’-核苷酸酶样本与试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入试剂RII，在340nm处连续120秒定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物5’-次黄嘌呤核苷酸，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有5’-核苷酸酶标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出5’-核苷酸酶标准品活性。

3.根据权利要求2所述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是：所述的试剂RI包括10mol/L的5’-次黄嘌呤核苷酸、0.015mol/L的a-酮戊二酸、0.30×10^-3mol/L的还原型辅酶I二钠盐以及0.10mol/L的且pH值为7.20的磷酸缓冲液，所述的试剂RII为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶。

4.根据权利要求3所述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是：所述的5’-核苷酸酶样本为8μL，试剂I为150μL，试剂II为75μL，5’-核苷酸酶样本与试剂I同时加入，在第180秒加入试剂II，且温度反应温度控制37℃。

5.根据权利要求4所述的定标测定5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是：所述的波长的主波长为560nm nm，副波长为700nm。

6.根据权利要求5所述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是：所述的步骤三中的计算按以下公式进行计算：

测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)，

$\mathrm{\ΔA}/\min =\frac{(\mathrm{\Δ}{A}_1/\min +\mathrm{\Δ}{A}_2/\min +\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\mathrm{\Δ}{A}_t/\min )}{t}$

ΔA₁/min代表测试时间第1min吸光度变化率

ΔA₂/min代表测试时间第2min吸光度变化率

.................................

ΔA_t/min代表测试时间第tmin吸光度变化率

t为测试时间

样本5’-核苷酸酶活性＝(ΔA_×/ΔA_C)×Ec

其中：ΔA_X＝样本ΔA/min

ΔA_C＝标准品ΔA/min

Ec＝5’-核苷酸酶标准品的活性。

7.一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法配用的试剂盒，其特征是：所述的试剂盒由以下成分组成：包括试剂R1、试剂R2、5’-核苷酸酶标准品、5’-核苷酸酶质控血清以及533测试/盒，所述的试剂R1包括80mol/L的甘氨酸缓冲液、2mol/L的N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、0.5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0.8KU/L的黄嘌呤氧化酶以及0.6KU/L的过氧化物酶，所述的试剂R2包括10mol/L的5’-次黄嘌呤核苷酸以及2mol/L的4-氨基安替比林，所述的5’-核苷酸酶标准品为人源基因重组蛋白，5’-核苷酸酶异常血清为人源基因重组蛋白和人血清。

8.根据权利要求7所述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法配用的试剂盒，其特征是：所述的试剂盒包含试剂R1为80ml/l瓶×2，试剂R2为80ml/l瓶，5’-核苷酸酶标准品1ml/l瓶，5’-核苷酸酶异常血清2ml/l瓶。

9.一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法配用的试剂盒的用途，其特征是：该测定用于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤等疾病的诊断。

10.根据权利要求9所述的一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法配用的试剂盒的用途，其特征是：所依据的原理反应方程式如下：