CN101703537A - 麻黄总多糖提取物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了麻黄总多糖提取物及其制备方法和医药用途。本发明麻黄总多糖为酸性总多糖；以葡萄糖计，所述酸性总多糖的重量百分比含量占麻黄总多糖提取物总重量的45％或45％以上；本发明通过大量的药理学实验发现，麻黄酸性总多糖提取物具有显著的免疫抑制活性，而且无毒、副作用，可以制成用作免疫抑制剂的药物或作为制备其他免疫抑制药物的原料药，用于治疗与免疫过度相关的各种疾病，包括过敏性哮喘、慢性肾炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、器官移植导致的机体排斥反应及其它免疫过度性相关疾病。

Description

麻黄总多糖提取物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明涉及一种中药有效部位提取物，尤其涉及麻黄总多糖提取物及其制备方法，本发明还涉及该麻黄总多糖提取物作为免疫抑制剂或用于治疗与免疫过度相关的各种疾病的医药用途，属于中药有效部位提取物领域。

背景技术

机体免疫系统稳定功能失调，免疫功能过度表达，将对自身组织产生免疫排斥反应，造成生理功能紊乱，导致各种组织损伤和病理损害，出现临床症状，称为自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎(全球发病率约0.1-1％，我国约0.32-0.36％)、系统性红斑狼疮(全球发病率约0.1-1％，我国约0.7％)、过敏性疾病(全球发病率约30％)、肾小球肾炎(我国发病率约0.2-4％)和自身免疫性溶血贫血等。这些疾病均具有发病率逐年升高，病情反复发作，难以治愈，而且缺少有效治疗药物的特点。此外，器官移植已成为现代医学治疗的重要手段，由于免疫系统对于被移植器官有排异作用，亦需要长期应用免疫抑制剂来抑制人体自身的免疫能力。以肾移植为例，自2000年以来，我国肾移植每年在以5000余例次递增，据2003年底统计数据表明，已累计完成肾移植5万多例次。随着人们对现代免疫性疾病认识的不断提高，以及大量的患者人群，临床亟待开发毒、副作用低，安全性高的免疫抑制药物。

从目前来看，临床上应用的免疫抑制剂主要为化学合成药物，应用过程中仍然存在毒副作用广泛且强烈、治疗对象和方案较局限的缺点，且大多缺乏选择性和特异性，对机体正常和异常的免疫反应均体现抑制作用，对初次免疫应答反应抑制作用较强，对再次免疫应答反应抑制作用较弱。这些化学合成药物的长期应用，易降低机体抵抗力而诱发感染、肿瘤、肝肾毒性、骨髓抑制、代谢紊乱、神经系统功能紊乱等，临床中常常因难以耐受而被迫停药。另外，昂贵的价格常使患者难以承担。能否从中药中开发出免疫抑制作用明确、毒副作用低、价格低廉的新药已成为国内外众多科技工作者关注的问题。

发明内容

本发明目的之一是提供一种具有确切的免疫抑制活性，无毒副作用的麻黄总多糖提取物；

本发明目的之二是提供一种制备上述麻黄总多糖的方法；

本发明目的之三是提供一种麻黄免疫抑制活性总多糖的化学特征及鉴别方法；

本发明目的之四是将上述麻黄总多糖可以直接制成各种剂型的免疫抑制剂或作为原料药与其他药物制成各种剂型的免疫抑制剂，用于免疫过度相关疾病的医药用途。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种麻黄总多糖提取物，以葡萄糖(C₆H₁₂O₆)计，所述酸性总多糖的重量百分比含量占提取物总重量的45％或45％以上；优选的，所述酸性总多糖的重量百分比含量占提取物总重量的60％或60％以上。

本发明所述麻黄原药材包括但不限于草麻黄(Ephedra sinica Stapf)、中麻黄(Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey.)或木贼麻黄(Ephedra equisetina Bge.)。

本发明的一个目的是提供一种制备上述麻黄总多糖提取物的方法，其包括以下步骤：

(1)将麻黄原药材切成寸段；(2)麻黄段加水煎煮或用稀醇回流提取，将煎煮液或提取液过滤，滤液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；(3)沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；(4)洗涤后的沉淀用蒸馏水复溶，透析；(5)将透析液冷冻干燥，得到粗多糖；(6)将粗多糖采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法，将酸性总多糖从麻黄粗多糖中分离出来，同时脱去粗多糖中的色素和蛋白质，即得麻黄总多糖。

为了达到更好的提取效果，优选的，步骤(2)中将麻黄段加5-10倍体积的蒸馏水煎煮2-4次，每次煎煮2-3h；或者是将麻黄段加5-10倍体积的稀醇回流提取2-4次，每次提取2-3h；步骤(2)中将滤液浓缩至药材0.2-1.0倍体积，加入80-95％乙醇醇沉，离心得沉淀；步骤(3)中将沉淀依次用2-4倍重量的无水乙醇，2-4倍重量的丙酮分别洗涤；步骤(4)中的沉淀以0.5-2倍重量的蒸馏水复溶，以分子量范围为3.0×10³-1.2×10⁴的透析袋流水透析10-48h。

步骤(2)中麻黄多糖的提取包括但不限于用水、稀甲醇、稀乙醇等小分子醇为提取溶媒；本发明所述的麻黄活性总多糖采用透析法除去小分子物质进行精制处理，包括但不限于选择分子量范围3.0×10³-1.2×10⁴规格的透析袋。

其中，步骤(6)中所述的弱酸弱碱型阴离子交换树脂和弱酸弱碱型阳离子交换树脂串联优选为但不限于包括将Amberlite FPA90C1和Amberlite IRC84串联在一起，该步骤可同时脱去总多糖中色素和蛋白质，得到具有免役抑制活性的麻黄酸性总多糖。

本发明进一步将从麻黄中分离出的麻黄总多糖提取物进行分离鉴定，共鉴定11种多糖单体，可以作为麻黄多糖的化学特征，所采用的鉴定技术为：对麻黄总多糖提取物依次采用DEAE-Sepharose F.F和DEAE-52离子交换色谱柱(洗脱相为0.1-1mol/L的NaCl溶液，收集液可以选择但不限于如下琼脂糖凝胶柱色谱做进一步纯化分离：Sephadex G50、Sephacryl S 100、Sephacryl 200、Sephacryl S300和SephacrylS400，洗脱相为0.1-1mol/L NaCl溶液)，分离纯化得到具有11种具有免疫抑制作用的麻黄多糖单体，分离纯化过程中采用高效液相-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)测定收集液的纯度。对获得的11种麻黄酸性多糖单体采用高效液相-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)测定分子量；运用高效毛细管电泳(HPCE)柱前衍生法(PMP)测得多糖单体中的单糖组成，包括：木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，构成麻黄多糖单体的以上单糖的摩尔比例分别为：

多糖单体1：6.8∶7.5∶1.0∶14.0∶13.7∶22.3∶10.2∶3.8；

多糖单体2：1.2∶4.1∶1.0∶5.1∶1.6∶17.3∶3.1∶2.2；

多糖单体3：1.5∶6.9∶1.0∶3.3∶5.2∶4.3∶1.3∶8.3；

多糖单体4：1.0∶2.7∶1.2∶5.5∶2.4∶5.0∶2.8∶9.1；

多糖单体5：1.0∶4.5∶1.0∶2.0∶0∶5.5∶1.5∶50.0；

多糖单体6：3.2∶6.5∶1.0∶15.3∶16.2∶8.7∶4.7∶6.7；

多糖单体7：5.0∶8.3∶2.5∶3.0∶1.0∶2.6∶0∶2.4；

多糖单体8：19.9∶17.6∶1.0∶3.1∶1.5∶13.7∶1.4∶0；

多糖单体9：1.0∶7.9∶0∶4.6∶1.7∶5.1∶1.5∶1.2；

多糖单体10：9.8∶16.4∶1.4∶8.4∶8.4∶28.8∶5.6∶1.0；

多糖单体11：2.1∶12.0∶1.0∶10.1∶2.3∶8.3∶1.3∶3.6；

上述11种多糖单体的分子量分别为1.21×108Da、1.84×108Da、1.43×108Da、3.34×108Da、2.37×107Da、1.41×108Da、2.20×108Da、8.77×107Da、1.46×108Da、3.41×108Da、8.07×107Da；麻黄多糖由于含有较大比例的呈酸性的葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组分，所以为酸性多糖。

现有技术中未见麻黄多糖免疫抑制活性的任何报道，本发明通过深入的化学、药理、药效学研究，确定麻黄酸性总多糖为免疫抑制活性部位，这与麻黄以往研究中生物碱类、挥发油类药效物质基础的研究是完全不同的。

本发明通过药理学实验表明，麻黄酸性总多糖具有显著的免疫抑制活性，而且无毒、副作用，可以制成用作免疫抑制剂的药物或作为制备其他免疫抑制药物的原料药，用于治疗与免疫过度相关的各种疾病，包括过敏性哮喘、慢性肾炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、器官移植导致的机体排斥反应及其它免疫过度性相关疾病。

本发明麻黄有效部位提取物含有1个有效部位群，能够有效治疗免疫性疾病；本发明麻黄有效部位提取物的制备工艺能适应工业化生产，为麻黄多糖的后续研究提供充足的原料，拓宽了麻黄多糖的应用范围。

本发明再一个目的是提供一种治疗与免疫过度相关的疾病的药物组合物，该药物组合物由有效量的麻黄总多糖提取物与药学上可接受的载体、赋型剂或稀释剂配合而成。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的麻黄总多糖提取物。

本发明麻黄总多糖提取物可以加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂后，以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是注射剂(粉针、冻干粉针、水针、输液等)、口服制剂(片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊或滴丸)等；其中，所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂、骨架材料等；所述的药学上可接受的载体是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

取草麻黄段约100kg，加5倍体积蒸馏水，煎煮提取3次，每次3h，滤过，合并滤液，浓缩至药材0.5倍体积，用95％乙醇调至含醇量为80％，静置过夜，2000rpm每分钟离心，沉淀依次用3倍量无水乙醇、丙酮洗涤，得沉淀物。取沉淀加0.5倍重量的蒸馏水复溶，装入分子量范围为3.0×10³-1.2×10⁴透析袋中流水透析48h，蒸馏水透析48h，将透析液冷冻干燥，得到粗多糖；经过弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂(Amberlite FPA90Cl+Amberlite IRC84)脱去总多糖中色素和蛋白质，得精制麻黄多糖3960g，出膏率为3.96％。用苯酚-硫酸法，在500nm处，对总多糖进行紫外分光光度法测定提取物中总多糖含量，以葡萄糖C₆H₁₂O₆计，含量为45wt％。

将上述麻黄总多糖依次采用DEAE-Sepharose F.F和DEAE-52离子交换色谱柱(洗脱相为0.1-1mol/L的NaCl溶液，收集液可以选择但不限于如下琼脂糖凝胶柱色谱做进一步纯化分离：Sephadex G50、Sephacryl S 100、Sephacryl 200、Sephacryl S300和Sephacryl S400，洗脱相为0.1-1mol/L NaCl溶液)，分离纯化得到具有11种具有免疫抑制作用的麻黄酸性纯多糖单体，分离纯化过程中采用高效液相-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)测定收集液的纯度。对获得的11种麻黄酸性多糖单体采用高效液相-蒸发光检测器(HPLC-ELSD)测定分子量；运用高效毛细管电泳(HPCE)柱前衍生法(PMP)测定多糖中单糖组成包括：木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，构成麻黄多糖单体的以上单糖的比例分别为：

多糖单体1：6.8∶7.5∶1.0∶14.0∶13.7∶22.3∶10.2∶3.8；

多糖单体2：1.2∶4.1∶1.0∶5.1∶1.6∶17.3∶3.1∶2.2；

多糖单体3：1.5∶6.9∶1.0∶3.3∶5.2∶4.3∶1.3∶8.3；

多糖单体4：1.0∶2.7∶1.2∶5.5∶2.4∶5.0∶2.8∶9.1；

多糖单体5：1.0∶4.5∶1.0∶2.0∶0∶5.5∶1.5∶50.0；

多糖单体6：3.2∶6.5∶1.0∶15.3∶16.2∶8.7∶4.7∶6.7；

多糖单体7：5.0∶8.3∶2.5∶3.0∶1.0∶2.6∶0∶2.4；

多糖单体8：19.9∶17.6∶1.0∶3.1∶1.5∶13.7∶1.4∶0；

多糖单体9：1.0∶7.9∶0∶4.6∶1.7∶5.1∶1.5∶1.2；

多糖单体10：9.8∶16.4∶1.4∶8.4∶8.4∶28.8∶5.6∶1.0；

多糖单体11：2.1∶12.0∶1.0∶10.1∶2.3∶8.3∶1.3∶3.6；

其中，上述11种多糖单体的分子量分别为1.21×108Da、1.84×108Da、1.43×108Da、3.34×108Da、2.37×107Da、1.41×108Da、2.20×108Da、8.77×107Da、1.46×108Da、3.41×108Da、8.07×107Da。

实施例2

中麻黄段约500g，加10倍体积蒸馏水，煎煮提取4次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩至药材1倍体积，用无水乙醇调至含醇量为85％，静置过夜，2000rpm每分钟离心，沉淀依次用4倍量无水乙醇、丙酮洗涤，得沉淀物。取沉淀加2倍重量的蒸馏水复溶，装入分子量范围为3.0×10³-1.2×10⁴透析袋中流水透析10h，蒸馏水透析10h；将透析液冷冻干燥，得到粗多糖；经过弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂(Amberlite FPA90C1+Amberlite IRC84)脱去总多糖中色素和蛋白质，得精制麻黄多糖22.7g，出膏率为4.54％。用苯酚-硫酸法，在500nm处，对总多糖进行紫外分光光度法测定提取物中总多糖含量，以葡萄糖C₆H₁₂0₆计为60％。

实施例3

木贼麻黄段约500g，加10倍体积的35％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，减压回收溶剂至药材0.2倍体积，用无水乙醇调至含醇量为90％，静置过夜，2000rpm离心，沉淀依次用2倍量无水乙醇、丙酮洗涤，得沉淀物.取沉淀加1倍重量的蒸馏水复溶，装入分子量范围为3.0×10³-1.2×10⁴透析袋中流水透析28h，蒸馏水透析28h；将透析液冷冻干燥，得到粗多糖；经过弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂(Amberlite FPA90Cl+Amberlite IRC84)脱去总多糖中色素和蛋白质，得精制麻黄多糖20.5g，出膏率为4.1％。用苯酚-硫酸法，在500nm处，对总多糖进行紫外分光光度法测定总多糖含量，以葡萄糖C₆H₁₂0₆计为48％。

实施例4制成输液剂

取实施例1所制备的提取物适量，加入适量增溶剂，研磨，再加入少量注射用水进行稀释，混匀，然后加入氯化钠适量，溶解后再加注射用水至规定量，滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例5制成口服液

取实施例1所制备的提取物适量，加入适量增溶剂，研磨，再加少量水稀释，混匀，然后加入矫味剂及防腐剂，加水至规定量，混匀，分装，灭菌，即得。

实施例6制成片剂

取实施例1所制备的提取物适量，加入稀释剂、崩解剂等辅料，混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包衣或喷薄膜衣即得。

试验例1麻黄总多糖提取物的急性毒性试验

一、试验材料

1.实验动物昆明种小鼠，雌雄各半，体重2O±2g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供；

2.供试药物：实施例1、实施例2和实施例3所制备的麻黄总多糖提取物；

二、试验方法

取健康小鼠20只，雌雄各半，每只按0.4mL/10g灌服有效部位(已达最大给药体积，最大给药浓度)，1日内连续灌服两次，间隔时间为6小时，连续观察14d内小鼠活动情况及死亡数量；

结果：麻黄活性总多糖经小鼠口服给药未测出LD₅₀，经最大给药量测定证明，小鼠口服给药最大给药量为17g/kg，相当临床成人用量的200倍，连续观察14d结果发现：所有小鼠无死亡；外观、体征、行为活动、精神状态、饮食、大小便等均未有异常改变；口、眼、鼻等处也无异常分泌物。

试验结论：麻黄总多糖提取物没有毒性。

试验例2麻黄中各类成分对正常小鼠单核细胞吞噬作用(碳粒廓清法)

为了筛选免疫抑制的有效组分，本发明采用常规免疫活性药效筛选的方法，对麻黄中各类成分，包括生物碱、挥发油、总多糖、非生物碱进行了药效筛选，上述成分可以采用常规或本发明方法获得。

一、试验材料

1.实验动物

昆明种小白鼠，体重(16～22)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

2.供试药物：实施例1、实施例2和实施例3所制备的麻黄总多糖提取物。

二、试验方法

昆明种小鼠50只随机分为5组，每组雌雄各半，即空白对照组，生物碱组，挥发油组，总多糖组，非生物碱组。每日腹腔注射多糖1次，连续7天。免疫抑制组于试验第1、3、5天皮下注射环磷酰胺30mg/kg，末次给药后24小时，按0.1mL/10g尾静脉注射稀释的印度墨汁(1％明胶稀释4倍)，于注入墨汁后2min和6min分别从眼静脉丛取血20uL，立即加入装有2mL 0.1％Na₂CO₃的试管中，以0.1％碳酸钠溶液做空白对照。于600nm比色，按下列公式测定光密度值。

廓清指数K＝(lgOD₁-lgOD₂)/(T₂-T₁)

吞噬指数α＝K^1/3×(体重/胸腺+脾重)

取脾、胸腺称湿重，脏器指数＝脏器质量×10/体重

统计方法：所有数据以mean±SD表示，组间比较用t检验。

药效筛选结果见表1。

表1麻黄中各类成分对正常小鼠单核细胞吞噬作用(碳粒廓清法)

挥发油组和多糖组与空白对照组比较差异显著(P＜0.05)，生物碱组和非生物碱组与空白对照组比较差异不显著(P＞0.05)。

结论：挥发油组、多糖组对正常小鼠单核细胞吞噬作用具有抑制作用；由于传统药物加工中，挥发性成分损失较大，挥发油发挥的作用因此大受影响，而多糖类成分在药材中所含的比例较大，通过以上筛选，对其开展深入免疫抑制研究是很有意义的。

试验例3麻黄总多糖提取物对二硝基氯苯所致迟发型超敏反应的影响试验

一、试验材料

1.供试药物：实施例1、实施例2和实施例3所制备的麻黄总多糖提取物；

2.阳性对照药物：地塞米松；

3.实验动物：昆明种小白鼠，体重(16～22)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

二、试验方法

取昆明小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组：正常对照组(只攻击不致敏)，溶媒组，地塞米松组，多糖低剂量组，多糖高剂量组。每只小鼠腹部去毛，范围1cm×2cm，以使致敏部位充分暴露，均匀涂布20uL 5％DNClB溶液(溶于丙酮∶橄榄油＝4∶1)中，以单独涂布丙酮橄榄油溶剂作为对照，每天1次连续致敏2天；第2次致敏5天后进行DTH反应：各组均腹腔注射给药，每日1次，致敏当天和诱导当天分别于致敏前和诱导前2h腹腔给药，连续给药5日后(正常对照组及溶媒组灌服等体积的蒸馏水)；将5％DNClB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)，进行攻击，正常对照组同样涂耳但未致敏；攻击后24h，脱颈椎致死(处死前禁食18h，称重)；用直径8mm的打孔器冲下圆形耳片，称重.

肿胀率＝(右耳-左耳)×100％/左耳

统计方法：所有数据mean±SD以表示，组间比较用t检验。

三、试验结果：

试验结果见表2。

表2麻黄总多糖提取物对二硝基氯苯所致迟发型超敏反应的影响试验

△表示与空白组比较，P＜0.05；△△表示与空白组比较，P＜0.01

*表示与模型对照组比较，P＜0.05；**表示与模型对照组比较，P＜0.01

结论：模型对照组和空白组相比，有极显著差异(P＜0.01)，说明造模成功；地塞米松组的肿胀率与模型对照组相比，有极显著差异(P＜0.01)；麻黄总多糖低剂量和高剂量组肿胀率与模型对照组相比，有显著差异(P＜0.05)且呈量效关系；表明麻黄总多糖对二硝基氯苯所致迟发型超敏反应有明显的抑制作用。

试验例4麻黄总多糖提取物对小鼠溶血素抗体生成(比色法)的影响试验

一、试验材料

1.供试药物：实施例1、实施例2和实施例3所制备的麻黄总多糖提取物；

2.实验动物：昆明种小白鼠，体重(16～22)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

二、试验方法

昆明种小鼠40只随机分为4组，雌雄各半，即空白对照组、模型对照组、多糖低剂量组，多糖高剂量组；每日腹腔注射多糖1次，连续14天；除空白对照组外，其余各组每只小鼠给8次药后腹腔注射绵羊红细胞悬液0.2mL/只(约4亿个细胞)进行免疫，用生理盐水将血清按1∶300比例稀释，将稀释后的小鼠血清1.0mL，绵羊红细胞0.5mL，加入试管中，再加入经生理盐水1∶10稀释的豚鼠血清1.0mL，空白对照以等体积生理盐水代替小鼠血清，置试管于37℃水浴10min，取出试管置于冰水浴中，以终止反应，冷却后离心。将离心后上清液1.0mL，都氏液3.0mL加入试管中，混匀后静止10min，在540nm处测定吸收度值；另在一试管中加入0.25mL绵羊红细胞和都氏液3.75mL测定绵羊红细胞半数溶血时的吸收度值。

半数溶血值HC₅₀＝样品吸收度值×血清稀释倍数/绵羊红细胞半数溶血时的吸收度值

统计方法：所有数据mean±SD表示，组间比较用t检验

三、试验结果见表3。

表3麻黄总多糖提取物对小鼠溶血素抗体生成(比色法)的影响

△表示与空白组比较，P＜0.05；△△表示与空白组比较，P＜0.01

*表示与模型对照组比较，P＜0.05；**表示与模型对照组比较，P＜0.01

试验结论：模型组与空白对照组比较，具有极显著差异(P＜0.01)，表明造模成功；麻黄总多糖低剂量与模型组比较具有显著差异(P＜0.05)，麻黄总多糖高剂量与模型组比较具有极显著差异(P＜0.01)；试验结果表明麻黄总多糖对绵羊红细胞所致溶血素生成具有一定抑制作用。

试验例511种麻黄多糖单体对刀豆蛋白A(ConA)引起的淋巴细胞增殖的影响试验

一、试验材料

供试药物：实施例1所分离的11种麻黄多糖单体；

实验动物：昆明种小白鼠，体重(18～22)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

脾细胞悬液：小鼠眼球放血，75％酒精消毒后，摘取脾脏，置于盛PBS液的培养皿中，研磨后过100目筛网，用PBS冲洗3次，每次用量10mL，1000rpm离心10min，弃上清液；加10mL 10％FCS-RPMI-1640培养液，混匀，血球细胞计数调浓度至1×10⁸个/mL。

二、试验方法

多糖20，100，500mg/L浓度组，环磷酰胺20mg/L各100uL/孔，加入96孔培养板，以RPMI-1640对照，每孔加细胞悬液100uL，再加入ConA使其终浓度为5μg/mL，置5％CO₂培养箱中37℃培养44小时；每孔加入5mg/mLMTT10uL，继续培养4小时，再加入二甲亚砜100uL，于微量振荡器上缓慢作用10min，在酶标仪上于492nm处测吸光度值。所得数据用mean±SD表示，t检验。

三、试验结果见表4

表411种麻黄多糖单体对刀豆蛋白A(ConA)引起的淋巴细胞增殖的影响

*表示与空白组比较，P＜0.05；**表示与空白组比较，P＜0.01。

结论：11种麻黄多糖单体高剂量对单纯ConA刺激产生的淋巴细胞增殖有显著抑制作用，具有体液免疫抑制作用。

试验例6麻黄总多糖提取物对过敏性哮喘大鼠的平喘作用

一、试验材料

1、供试药物：实施例1、实施例2和实施例3所制备的麻黄总多糖提取物；

2、实验动物：豚鼠，体重(180～220)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供

二、试验方法

取40只豚鼠随机分为4组，空白对照组、模型对照组、多糖低剂量组、多糖高剂量组。除正常组外，腹腔注射抗原液1mL(1mL生理盐水中含卵白蛋白100mg，氢氧化铝干粉100mg，灭活百日咳杆菌疫苗5×10⁹)致敏；各组从抗原注射后第2天起灌胃，每次1mL/10g，连续2周，对照组给予生理盐水；实验第13天，将大鼠放入10L半密闭玻璃罩内，以1％卵白蛋白液雾化吸入激发20分钟，记录引喘潜伏期；超过20分钟未出现哮喘的以20分钟计算。喘息指标为呼吸急促、节律不齐、瘫痪、死亡。

三、试验结果见表5

表5麻黄总多糖提取物对过敏性哮喘豚鼠的平喘作用

△表示与空白组比较，P＜0.05；△△表示与空白组比较，P＜0.01。

*表示与模型对照组比较，P＜0.05；**表示与模型对照组比较，P＜0.01。

结论：模型组与空白对照组比较，具有极显著差异(P＜0.01)，表明造模成功。麻黄总多糖低剂量与模型组比较具有显著差异(P＜0.05)，麻黄总多糖高剂量与模型组比较具有极显著差异(P＜0.01)，表明麻黄总多糖提取物对过敏性大鼠具有平喘作用。

试验例7麻黄总多糖提取物对肾毒血清型肾小球肾炎大鼠24h尿蛋白、血清总蛋白及白蛋白的影响试验

一、试验材料

1、供试药物：实施例1、实施例2和实施例3所制备的麻黄总多糖提取物；

2、实验动物：成年雄性SD大鼠，黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

二、试验方法

取70mg兔IgG溶于10mL生理盐水中，与60mL弗氏不完全佐剂混匀，制成乳剂，除空白对照组外每只大鼠给以1mL，皮下多点注射；预免疫后第7天和第8天，尾静脉注射稀释一倍的自制肾毒血清1mL/只，连续注射2天为致病免疫。

SD大鼠根据体重随机分为正常对照组、模型对照组、多糖低、高剂量组共4个组，每组10只.致病免疫后每天检测尿蛋白，当尿蛋白呈阳性之后，除空白对照组外，其余各组再根据24小时尿蛋白量和体重进行分组，共分为模型对照组、多糖低、高剂量组；麻黄多糖低、高剂量组按37mg/100g体重和111mg/100g体重ig，每日1次；空白对照组、模型对照组同样方式给以蒸馏水，连续给药4周；检测尿蛋白、血清总蛋白及白蛋白.

三、试验结果见表6。

表6麻黄总多糖提取物对肾毒血清型肾小球肾炎大鼠24h尿蛋白、血清总蛋白及白蛋白的影响

△表示与空白组比较，P＜0.05；△△表示与空白组比较，P＜0.01。

*表示与模型对照组比较，P＜0.05；**表示与模型对照组比较，P＜0.01。

结论：模型组与空白对照组比较，均具有极显著差异(P＜0.01)，表明造模成功；麻黄总多糖低剂量及高剂量组与模型组比较24h尿蛋白、血清总蛋白及白蛋白均具有显著差异(P＜0.01)，表明麻黄总多糖对肾毒血清型肾小球肾炎大鼠具有治疗作用。

Claims (10)

1.一种麻黄总多糖提取物，其特征在于：以葡萄糖计，所述麻黄总多糖的重量百分比含量占提取物总重量的45％或45％以上；优选的，所述麻黄总多糖的重量百分比含量占提取物总重量的60％或60％以上。

2.按照权利要求1所述的麻黄总多糖提取物，其特征在于：所述麻黄总多糖包含有11种多糖单体，分别由以下单糖按照不同的比例所组成：木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。

3.按照权利要求2所述的麻黄总多糖提取物，其特征在于，所述11种纯多糖的分离、鉴定方法包括以下内容：采用离子交换柱色谱和琼脂糖凝胶柱色谱分离纯化纯多糖；结合HPLC-ELSD检测多糖的纯度及分子量；运用高效毛细管电泳柱前衍生法测定多糖中的单糖；其中，所述的离子交换柱色谱优选为DEAE-Sepharose F.F和DEAE-52；所述的琼脂糖凝胶柱色谱优选为：Sephadex G50、Sephacryl S100、Sephacryl 200、Sephacryl S300和Sephacryl S400。

4.按照权利要求2所述的麻黄总多糖提取物，其特征在于：所述的11种纯多糖由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸分别按照以下(1)-(11)所述的摩尔比例所组成：

(1)：6.8∶7.5∶1.0∶14.0∶13.7∶22.3∶10.2∶3.8；

(2)：1.2∶4.1∶1.0∶5.1∶1.6∶17.3∶3.1∶2.2；

(3)：1.5∶6.9∶1.0∶3.3∶5.2∶4.3∶1.3∶8.3；

(4)：1.0∶2.7∶1.2∶5.5∶2.4∶5.0∶2.8∶9.1；

(5)：1.0∶4.5∶1.0∶2.0∶0∶5.5∶1.5∶50.0；

(6)：3.2∶6.5∶1.0∶15.3∶16.2∶8.7∶4.7∶6.7；

(7)：5.0∶8.3∶2.5∶3.0∶1.0∶2.6∶0∶2.4；

(8)：19.9∶17.6∶1.0∶3.1∶1.5∶13.7∶1.4∶0；

(9)：1.0∶7.9∶0∶4.6∶1.7∶5.1∶1.5∶1.2；

(10)：9.8∶16.4∶1.4∶8.4∶8.4∶28.8∶5.6∶1.0；

(11)：2.1∶12.0∶1.0∶10.1∶2.3∶8.3∶1.3∶3.6；

其中，11种多糖单体的分子量分别为1.21×108Da、1.84×108Da、1.43×108Da、3.34×108Da、2.37×107Da、1.41×108Da、2.20×108Da、8.77×107Da、1.46×108Da、3.41×108Da、8.07×107Da。

5.按照权利要求1-4任何一项所述的麻黄总多糖提取物，其特征在于，所述的麻黄包括草麻黄(Ephedra sinica Stapf)、中麻黄(Ephedra intermedia Schrenk etC.A.Mey.)或木贼麻黄(Ephedra equisetina Bge.)。

6.制备权利要求1-4任何一项所述麻黄总多糖提取物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将麻黄原药材切成寸段；(2)麻黄段加水煎煮或用稀醇回流提取，将煎煮液或提取液过滤，滤液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；(3)沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；(4)洗涤后的沉淀用蒸馏水复溶，透析；(5)将透析液冷冻干燥，得到粗多糖；(6)将粗多糖采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法，将酸性总多糖从麻黄粗多糖中分离出来，同时脱去粗多糖中的色素和蛋白质，即得麻黄总多糖。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中将麻黄段加5～10倍体积的蒸馏水煎煮2～4次，每次煎煮2～3h；或者是将麻黄段加5～10倍体积的稀醇回流提取2～4次，每次提取2～3h；所述稀醇是稀小分子醇，包括但不限于稀甲醇或稀乙醇。

8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中将滤液浓缩至药材0.2～1.0体积，加入80～95％乙醇醇沉，离心得沉淀；步骤(3)中将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；步骤(4)中的沉淀以0.5～2倍重量的蒸馏水复溶，以分子量范围为3.0×10³-1.2×10⁴的透析袋流水透析10～48h，蒸馏水透析10～48h；步骤(6)中采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法为优选但不限于采用Amberlite FPA90Cl与Amberlite IRC84串联法将中性多糖及酸性多糖按解离度的不同分离开来。

9.权利要求1-4任何一项所述麻黄总多糖提取物，其特征在于：将其制备成临床上接受的注射制剂或口服制剂；其中，所述的注射制剂包括注射剂、冻干粉针剂或输液剂；所述的口服制剂包括片剂、冲剂、缓释剂、软胶囊剂、胶囊剂或口服液。

10.权利要求1-4任何一项所述麻黄总多糖提取物在制备作为免疫抑制剂药物中的用途或用于制备用于治疗与免疫过度相关的各种疾病；所述的与免疫过度相关的各种疾病包括过敏性哮喘、慢性肾炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或器官移植导致的机体排斥反应。