CN101701221A

CN101701221A - 水稻矮杆卷叶突变体(cdl)基因及其应用

Info

Publication number: CN101701221A
Application number: CN200910228680A
Authority: CN
Inventors: 栾维江; 孙宗修; 王振英; 胡国成; 彭永康
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2009-11-25
Filing date: 2009-11-25
Publication date: 2010-05-05
Anticipated expiration: 2029-11-25
Also published as: CN101701221B

Abstract

本发明涉及水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，其所对应的野生型OsCD1基因的序列为SEQ ID No.2。本发明在构建的插入突变体库中发现一个矮杆卷叶突变体，该基因(cd1)揭示了该突变性状是由CSLD亚家族基因控制的。在本研究中，突变体所表现出的性状严重影响了水稻的生长和发育，不但在植株的形态建成受到了抑制，而且其叶绿素含量降低，结实率大大下降，籽粒不饱满，制约了农艺性状的发育。因此，本发明的矮杆卷叶突变体(cd1)基因为制备抗旱、抗病、抗倒伏方面提供了可靠的理论依据，特别是可利用基因工程方法改变植株的形状，调控植株的形态，在园艺观赏植物中有重要的利用价值。

Description

水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因及其应用

本专利得到国家自然科学基金(No.30871328)及国家转基因重大专项(2008ZX08009-003)的资助。

技术领域

本发明属于水稻整体生长发育情况改进技术领域，涉及影响水稻整体生长发育的卷叶矮杆突变体(curl leaf and dwarf 1，cd1)基因及其应用。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物，在我国的农业生产与粮食安全方面占有举足轻重的地位。随着粮食需求不断增加和耕地面积持续减少，提高水稻单产越来越受到重视，高产和超高产一直是水稻研究的主题。20世纪50-60年代半矮杆基因的发现和利用使水稻产量提高了20％～30％，实现了水稻产量的第一次飞跃；70-80年代，野败种质的发现和利用使杂种优势利用取得了较大的突破，但一段时间以来我国水稻育种矮杆基因单一化问题越来越严重，水稻育种矮杆资源的创新工作相对迟缓，已成为影响水稻育成品种产量进一步提高的重要因素之一。因此，发掘研究和利用新的水稻育种矮杆资源，增加水稻矮源的多样性，避免矮杆品种遗传基础过于狭窄，有很重要的意义。

由于其较小的基因组、密集的遗传和物理图谱、成熟的遗传转化方法及其与其它作物广泛的共线性，水稻已公认为禾谷类作物的模式植物。随着水稻全基因组高质量的、精确的图位序列的完成，水稻功能基因组学将成为以后研究的重点。国际上在植物功能基因组研究方面已成规模，许多研究机构正在致力于构建功能基因组研究技术平台，以争取为大规模功能基因组研究打下坚实的基础。由于水稻在农业生产中的重要地位及在商业方面的应用前景，因此水稻功能基因组研究在国际上的竞争非常激烈，我们利用构建的突变体库获得相关突变体，克隆控制水稻重要农艺性状的功能基因，为水稻的育种及品种改良提供基础，并为水稻分子育种设计提供理论依据。

植物细胞壁是植物细胞区别于动物细胞的主要特征之一，其主要成分为纤维素、半纤维素及果胶等多糖类物质。对维持细胞的一定形态、增强细胞的机械强度有很重要作用，并且还参与细胞的许多生理活动。细胞壁由胞间层、初生壁和次生壁三部分组成。胞间层主要成分为果胶，有助于将相邻细胞粘连在一起，并可缓冲细胞间的挤压。初生壁主要成分为纤维素、半纤维素，并有结构蛋白存在。具有较大的可塑性，既可使细胞保持一定形状，又能随细胞生长而延展。次生壁主要成分为纤维素，并常有木质存在。通常较厚，而且坚硬，使细胞壁具有很大的机械强度。

从某种程度上说，细胞壁的功能决定了细胞的形状和大小，因此探明细胞壁的合成途径，进而揭示细胞壁的生理功能对于理解植物的形态及其发育具有重要的意义。在细胞壁的合成所涉及的基因网络中，半纤维素和果胶是在高尔基体中合成的，负责这两种多糖合成的基因定位于高尔基体中。纤维素是在质膜上合成的，负责纤维素合成的基因定位于质膜上。已有报道证明编码纤维素合成酶催化亚基(CESA)基因含有3-6个跨膜结构域(Arioli et al.，1998；Fagard et al.，2000；Holland et al.，2000；Taylor et al.，2000)。另外，植物中含有一类类似纤维素合成酶基因(cellulose synthase-like，CSLs)，序列分析发现这些基因编码的蛋白中含有一个共同的与糖基转移有关的基序“D，D，D，QXXRW”，其氨基酸序列与CESA序列有较大程度的相似性(Richmond，2000；Richmond and Somerville，2000)。植物基因组中的CSLs分为CSLA，CSLB，CSLC，CSLD，CSLE，CSLF，CSLH及CSLJ几类亚家族。(http://cellwall.stanford.edu；Keegstra and Walton，2006；Fincher，2009)。虽从比较基因组学及生物信息学上对这些基因的序列特点进行了分析，但目前这几类亚家族的功能还不甚明确。已有资料报道CLSA亚家族与甘露糖的合成有关(Liepman et al.，2005)。在拟南芥中报道CLSD与根毛的发育和花粉管的形成有关(Bernal et al.，2008)。水稻中也克隆出一个CSLD亚家族基因，功能分析表明其负责根毛的形成和发育(kim et al.2007)。另外在水稻中用比较基因组方法揭示CSLF亚家族可能与葡聚糖的合成有关(Burton et al.2006)。现在已用生物信息学方法在水稻基因组在发现37个CSL基因(Hazenet al.2002)，但这些基因的明确功能缺乏具体实验证据，仅停留在基于基因序列的预测上。

本发明从构建的水稻Ac/Ds插入突变体库中获得一个影响水稻整体生长发育的卷叶矮杆突变体(curl leaf and dwarf 1，cd1)，该突变体表现矮杆，叶片变短变窄并向内卷曲成半圆柱状，幼穗发育不良导致结实率大大降低，与野生型相比，叶绿素含量下降导致叶片功能早衰。遗传分析发现该突变性状是由隐性单基因控制的，我们用图位克隆方法分离出了控制该突变性状的基因，发现其野生型基因是一个CSLD亚家族基因。同时我们用RNA干涉的方法对该基因进行了功能互补研究，特异性干涉该基因可以引起上述所描述的突变体的性状，互补了原来的表型。

发明内容

本发明的目的在于提供水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因及其应用。本发明的上述目的是通过如下的方法予以实现：

水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

本发明所述水稻矮杆卷叶突变体对应野生型的氨基酸序列为SEQ ID No.3。

本发明进一步公开了水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因在增强作物对不良环境的抗性方面的应用。特别是水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因在抗旱、抗病、抗倒伏方面的应用。同时本发明也公开了水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因在控植株的形态、改变植株的形状方面的应用。

本发明在构建的插入突变体库中发现一个矮杆卷叶突变体，它少了植株的整体生长量。基因克隆揭示了该突变性状是由CSLD亚家族基因控制的。本发明在实验中设计了LM65和LM66两个分子标记，1929个突变个体在这两个标记处表现共分离，没有重组个体。59kb区段内序列分析表明共有9个独立的ORF。对这9个独立ORF进行预测分析，选取与目标性状相关的ORF进行测序，在PBZ1、CSLD、FB2及CBP中，CSLD基因中有一个8bp的插入，8bp插入位于该基因第一个外显子距离ATG起始密码子397bp处。其余几个基因中都没有突变位点。该8bp的插入片段造成了OsCD1编码框的移码，从而在第一个外显子中产生了终止密码子TGA，提前终止了氨基酸编码。

本发明发现的水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因，其突变体所表现出的性状严重影响了水稻的生长和发育，不但在植株的形态建成受到了抑制，而且其叶绿素含量降低，结实率大大下降，籽粒不饱满，制约了农艺性状的发育。

本发明的水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因可以用基因工程或遗传工程方法增强作物对不良环境的抗性，如提高作用的抗旱、抗病、抗倒伏能力。也可以用该基因调控植株的形态建成，选育我们所需要的有利于产量提高的株型。另外，我们可利用基因工程方法改变植株的形状，这在园艺观赏植物中有重要的利用价值。

附图说明：

图1为矮杆卷叶突变体的表型；注：M为cd1突变体，WT为野生型。其中A为：突变体的表型；B为：突变体与野生型株高与穗长比较；C为：突变体与野生型各节间长度比较；D为：突变体与野生型叶片宽度比较。

图2：突变体与野生型植株叶绿素含量。注：M为突变体，WT为野生型，Chla代表叶绿a，Chlb代表叶绿b。

图3：OsCD1基因图位克隆。注A：OsCD1基因的精细定位；粗横线代表染色体，短竖线代表染色体上的分子标记，CEN为着丝粒，LM6～LM66为分子标记名称，OSJNBa0027H05和OSJNBb0092G12为水稻第12染色体上的BAC克隆。B：突变体cd1基因中的8bp的插入位点；三角表示8bp插入序列，位于距离起始密码子ATG397bp处；横箭头表示引物的位置，竖箭头表示插入的8bp造成移码，产生一个终止密码子；实心方框表示OsCD1基因的两个外显子，空心的方框表示该基因的内含子。C：突变体cd1基因8bp插入位点PCR检测；M表示突变体，WT表示野生型，Ladder表示DNA分子量Mark。D：目的基因在突变体及野生型中的表达。

图4：RNAi载体的构建A：RNAi载体的构建策略；B：构建好的pRNAI-CSLD转化载体；C：pRNAI-CSLD转化载体酶切鉴定，提取质粒用BamHI和SacI双酶切后经1％琼脂糖凝胶分离。注：粗横线表示要扩增的目的片段，横箭头所示为扩增引物，竖箭头所示相应酶切位点，1-12为挑取的不同单克隆，Ladder为DL2000DNA分子量Mark。

图5：RNAi转基因植株的表型。注：WT为野生型日本睛品种，RNAi为T1代转基因植株，M为原始突变体。

图6：OsCD1氨基酸序列的同源比对A：不同植物CSLD蛋白的同源比对；B：不同CSLD蛋白的进化树。注：方框表示CSLD亚家族成员最保守的氨基酸区域，星号表示“D，D，D，QXXRW”基序的保守氨基酸。括号内表示该蛋白质登录号。

具体实施方式：

为了更充分的解释本发明的实施，提供水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因的制备实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中所用的原料均有市售。

实施例1

一、材料和方法

1.材料

突变体来源于本实验室所构建的A c/Ds插入突变体库(Luan et al.，2008)¹⁵，为日本晴(Oryza sativa L.ssp.Japonica cv.Nipponbare)背景。突变体与龙特莆(Oryza sativaL.ssp.Indica cv.Nipponbare)组配杂交组合，产生F1代，F1代自交产生F2代分离群体。

所有材料种植于中国水稻研究所试验田。

2.方法

2.1水稻基因组DNA的微量提取

采用简易CTAB法提取。具体步骤如下：

1)取约300mg新鲜的水稻嫩叶用液氮速冻后研磨成粉末，迅速转移至1.5mL Enpdoff管中；

2)加入650μL经65℃预热的CTAB抽提缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.0，20mMEDTA，1.4M NaCl，2.0％CTAB，1％PVP)，65℃水浴40min，每隔10min摇动混匀；

3)加入等体积的氯仿异戊醇混合液(含76∶4∶20的氯仿∶异戊醇∶乙醇(V/V))，摇动混匀3min，静置3min；

4)10000rpm离心8min，小心转移上清于另一洁净的1.5mL离心管中；

5)加入0.8倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置片刻出现白色絮状沉淀；

6)10000rpm离心5min，弃上清收集沉淀；

7)加入800μL75％的乙醇洗涤沉淀；

8)12000rpm离心3min后弃上清；

9)超净台上吹干沉淀后加入200μL TE(pH8.0)溶解备用。

2.2水稻植株总RNA的提取

植株总RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，具体步骤如下：

1)约1g植株叶片在液氮中研磨匀桨后，迅速转移100mg于事先预冷的用DEPC处理过的1.5mL离心管；

2)加入1mLTRIzol提取液振荡混匀；

3)室温静置5分钟后，加入0.2mL的氯仿，摇动混匀3分钟后，室温放置15min；

4)在12,000×g条件下，4℃离心15min，转移上清至RNA专用1.5mL离心管；

5)加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀后于室温静置10min；

6)12,000×g，4℃离心10min沉淀RNA；

7)弃上清，加入1mL 75％酒精洗涤沉淀两次；

8)空气中自然干燥后加入20μL DPEC处理的ddH2O溶解保存于-70℃冰箱备用。

2.3 OsCD1基因的定位及克隆

OsCD1目的基因用F2分离群体定位，植株生长40天后，突变性状表现明显，取突变体植株叶片提取基因组DNA进行基因定位。首先取200个F2突变体植株进行粗定位，在水稻12个连锁群上大约每隔约20cM选取多态性较好的分子标记，用40个突变体植株进行连锁分析，找到与OsCD1连锁的分子标记后，用200个突变体植株进一步验证。验证正确后，上大群体进行染色体步移，进一步精细定位目的基因。定位所用的分子标记如表1所示，共用1929个F2突变体植株将OsCD1定位于59kb区段内，在这个小区段内预测共有9个完整的ORF，对9个ORF进行基因结构分析大概预测相应功能，选择与本研究突变体性状有关的ORF进行测序分析，确定候选基因。

表1：定位引物及序列

2.4.1RNA干涉(RNAi)载体的构建

由于突变体幼穗发育异常，结实率很低，因此我们用RNA干涉方法进行基因功能互补。在克隆的OsCD1基因中选取特异DNA片段设计引物进行PCR扩增，在引物上设计相应酶切位点与载体上相应酶切位点连接。RNAi正向片段设计BamHI和KpnI位点，所用引物为GGATCCGATGAGAGCGCCGAGTTCGT-3’和ICDSLR1：5’-ACTAGGTACCCTTCATGGAGT GCACCACGG-3’。反向片段设计SacI和SpeI酶切位点，所用引物为：ICDSLF2：5’-TATCGAGCTC GATGAGAGCGCCGAGTTCGT-3’和ICDSLR2：5’-TGCCACTAGT CTTCATGGAGTGCACCACGG-3’红色划线序列为相应酶切位点序列。PCR扩增得到相应产物经凝胶纯化回收后连接到空载体pRNAI中。连接成功的载体经酶切鉴定出正确的克隆后保存备用。

2.4.2干涉片段的PCR扩增

特异性片段用上述引物进行特异性扩增，扩增条件为：1min/95℃；30cycles(30sec/94℃，30sec/58℃，1min/72℃)；5min/72℃。反应体系如下(总体积50μL)：

DNA 10-30ng

10×Buffer(含20mM Mg2+) 5μL

dNTP(2.5mM) 0.2mM

SEF 0.2μM

SER 0.2μM

ExTaq酶(TaKaRa) 1U

ddH2O补至 50μL

扩增后的片段用琼脂糖凝胶电泳纯化回收后备用。

2.4.3酶切与连接

将扩增好的PCR片段和载体分别用相应的酶酶切后，回收相应的片段和骨架载体进行连接，先将正向片段与pRNAI空载体连接，然后再将反向片段与第一步连接好的中间载体连接，连接好的载体进行酶切验证，鉴定出连接正确的克隆。酶切条件为37℃水浴过夜，连接条件为16℃水浴过夜。反应体系如下：

酶切反应(50μL)：

DNA片段或质粒DNA 15μL

10×酶切Buffer 5μL

相应酶1 2μL

相应酶2 2μL

ddH2O补至 50μL

连接反应(10μL)：

DNA片段 5μL

载体骨架 3μL

10×T4连接Buffer 1μL

T4 DNA连接酶 1μL

ddH2O补至 50μL

2.4突变体中插入片段PCR分析

基因组DNA从40天大小野生型及突变体植株叶片中提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增鉴定突变体中的插入片段，扩增引物为：LM80F：5’-ACATCTCCGGGACGATATTC-3’和LM80R：5’-TTGCACGACATGTTCCCCGA-3’。扩增后的PCR产物用5％的琼脂糖凝胶电泳检测。扩增条件为：1min/95℃；30cycles(30sec/94℃，30sec/58℃，30sec/72℃)；5min/72℃。反应体系如下(总体积20μL)：

DNA 10-30ng

10×Buffer(含20mM Mg2+) 2μL

dNTP(2.5mM) 0.2mM

LM80F 0.2μM

LM80R 0.2μM

ExTaq酶(TaKaRa) 1U

ddH2O补至 20μL

2.5OsCD1基因在野生型及突变体中的表达分析

总RNA从40天大小的植株根中分离后用DNase I(Invitrogen，USA)处理消化基因组DNA。1μg的总RNA用M-MLV反转录酶(TaKaRa，Dalian，China)反转录合成cDNA。反转录程序如下(总体积20μL)：

总RNA 1μg

10μM Oligo(dT) 5μL

70℃变性10min

dNTP(10mM) 1μL

RNA酶抑制剂(TaKaRa) 1U

M-MLV反转录酶(200U/μL) 0.6μL

ddH2O补至 20μL

1h/42℃；15min/70℃。后保存于-20℃冰箱中备用。

合成的cDNA用OsCD1基因的特异引物进行PCR反应扩增，以水稻OsActin1做内参相对分析Hd1-3基因的表达。OsCD1基因表达特异引物序列为：CSLDF3：5’-ATCGGCGTGATCTCCTGCTTCTAC-3’和CSLDR：5’-GAAACTGAACTCGACACCACTACAC-3’OsActin1内参引物序列为：ActinF：5’-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3和ActinR：5’-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3’。

PCR扩增条件如下：

对于OsCD1：2min/95℃；35cycles(30sec/94℃，30sec/59℃，1min/72℃)；5min/72℃。

对于OsActin1：1min/95℃；26cycles(30sec/94℃，30sec/60℃，30sec/72℃)；5min/72℃。

反应体系如下(总体积20μL)：

cDNA 1μL

10×PCR Buffer(含20mM Mg2+) 2μL

dNTP(2.5mM) 0.2mM

CSLDF3/ActinF 0.2μM

CSLDR/ActinR 0.2μM

ExTaq酶(TaKaRa) 1U

ddH2O补至 20μL

2.6叶绿素含量的测定

田间取抽穗初期的水稻主茎剑叶，剪取叶片中段约0.2g样品(剪成小段)放入10mL80％丙酮中，48小时后分别测定645和663nm处样品的吸光值，并且按下列公式计算叶绿素含量，重复3次。

叶绿素a(Chla)＝(12.71A663-2.59A645)×(V/W)×1000

叶绿素b(Chlb)＝(22.88A645-4.67A663)×(V/W)×1000

叶绿素总含量＝(8.04A663+20.29A645)×(V/W)×1000

2.7外源基因转化

构建好的RNAi载体转入农杆菌，用农杆菌介导的基因转化将外源基因转入水稻品种日本晴中，具体方法如Hiei所述(Hiei et al.，1994)。

二、实验结果

3.1矮杆卷叶突变体的发现及表型分析

矮杆卷叶突变体来自于构建的Ac/Ds插入突变体库(Luan et al.2008)，在Ds1亲本系与Ac-20的杂交的F2代苗期喷施Basta后，41株Basta抗性的植株生长成熟，表型正常。随机播种41个单株中的7个单株种子产生F3株系，7个株系中有一个株系LF3224出现矮杆卷叶突变体，总共40株中有8株表现矮杆卷叶表型。单株收获其野生型种子及突变体种子(F4)，随机播种3个野生型株系，有2个株系分离出矮杆卷叶突变体，而所有突变体种子后代均表现稳定的矮杆卷叶表型(图1A)，表明了突变性状可以稳定遗传到后代，突变体定名为cd1。

cd1突变体最明显的两个表型特征是植株表现矮化和叶片高度卷曲，株高约为野生型的一半(图1B)，平均株高为45cm，各节间长度明显缩短(图1C)；茎叶之间的夹角增大，叶片表现散开状；叶片窄细(图1D)，剑叶宽平均仅0.6cm，叶片从叶缘向内卷曲，成半圆柱形；突变体穗长变短(图1B)，育性差，结实率低，种子变得瘦小细长，不饱满。因此，总体来看，突变体的总的生长量降低。

3.2突变体与野生型叶绿含量分析

由于突变体的整体生长受到抑制，结实率很低，叶片颜色也比野生型浅，因此我们分析了突变体与野生型在抽穗初期叶绿素含量的差异，田间随机取植株主茎叶片，剪取叶片中断约0.2g放入80％丙酮中，48小时后，测定波长在645nm和663nm处样品的吸光值，做3次重复。结果发现突变体叶绿素a及叶绿素b的含量均低于野生型对应叶绿素的含量(图2)，这可能影响了突变体在灌浆期光合同化物的供应，从而表现籽粒不饱满。

3.3矮杆卷叶突变体遗传分析

为了分析cd1突变体的遗传规律，我们配制了杂交组合，以cd1突变体为母本，以龙特莆为父本，F1植株表现为野生型性状，F2代植株出现性状分离，在总共1118株F2植株中，有274株表现出预期的突变性状，844株为野生型植株。卡平方测验概率值位于0.5-0.75之间(表2)，因此野生型和突变体符合3∶1的分离比，表明该突变性状由隐性单基因控制。

表2 F2代突变体的分离比与卡平方检验

3.4OsCD1基因的图位克隆

为了克隆突变体cd1位点，本发明人配制杂交组合获得F2分离群体，并从F2群体中选取纯合隐性突变体进行连锁分析。首先用200个突变体进行粗定位，找到水稻第12染色体上的LM24和LM9与目标性状连锁，将cd1位点定位于约4700kb的区段内(图3A)。之后扩大群体，并在LM24和LM9之间设计更多分子标记进行染色体步移，将cd1位点定位于LM30与LM58之间约59kb区段内，步移在此区段内共用1929个突变个体，其中LM30位点处有3个重组个体，LM58处有2个重组个体。这两个标记分别位于水稻OSJNBa0027H05和OSJNBb0092G12BAC克隆中。为了更进一步逼近目的基因，本发明又设计了LM65和LM66两个分子标记，1929个突变个体在这两个标记处表现共分离，没有重组个体。59kb区段内序列分析表明共有9个独立的ORF。对这9个独立ORF进行预测分析，选取与目标性状相关的ORF进行测序，在PBZ1、CSLD、FB2及CBP中，CSLD基因中有一个8bp的插入，8bp插入位于该基因第一个外显子距离ATG起始密码子397bp处。其余几个基因中都没有突变位点。该8bp的插入片段造成了OsCD1编码框的移码，从而在第一个外显子中产生了终止密码子TGA，提前终止了氨基酸编码(图3B)。

为了检测8bp的插入位点，在其两测设计特异引物LM80F和LM80R，以突变体和野生型基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用5％琼脂糖凝胶分离，结果发现突变体的扩增产物略大于野生型扩增产物，表明在突变体中的确插入了一个小片段(图3C)。同时，为了分析CD1在突变体与野生型中的表达情况，以进一步验证所克隆目的基因的正确性，RNA从40天大小的植株的根中提取，反转录成cDNA后用OsCD1特异引物CSLDF3和CSLDR(引物位置如图3B所示)进行RT-PCR扩增，结果表明目的基因在野生型中正常表达，但在突变体中没有表达(图3D)，说明在突变体中由于8bp的插入影响了目的基因的正常转录。

3.5OsCD1基因的功能互补

3.5.1RNAi载体的构建

RNAi载体构建思路如图4A所示，从OsCD1基因中扩增特异目的片段，用不同的酶切位点将该目的片段反向连入空载体pRNAI中，两个反向的目的片段中间含有一个GUS基因片段充当内含子，从而可以形成RNA干涉所起作用的结构。连接好的载体转化大肠杆菌，提取质粒后用BamHI和SacI进行酶切鉴定，若连接正确，用这两个酶可以切出约1.6kb的目的片段(图4C)，从图中可以看出1、2、5、9号为阳性克隆。构建好的转化载体pRNAI-CSLD如图4B所示。

3.5.2转基因植株的获得及表型互补

为了验证OsCD1基因是否能互补突变体所表现出的目标性状，我们构建了RNA干涉载体，用农杆菌介导的遗传转化将其导入野生型日本睛中，共获得了84株T0代转基因植株，移入田间成熟后单株收种。随机从84个T1代株系中种植20个株系，有2个株系中出现了预期的突变性状，转基因植株表现矮杆卷叶，与突变体性状相似，但结实率略高于突变体(图5)。RNAi转基因植株成功互补了突变体的表型性状。

3.2OsCD1氨基酸序列分析及其同源比对

野生型中功能的OsCD1有两个外显子，一个内含子，编码1215个氨基酸的蛋白质。突变体由于8bp的插入产生了移码，移码的结果在OsCD1翻译到第183个氨基酸时产生一个终止密码子，使正常OsCD1翻译提前终止，不能形成正常有功能的蛋白质。序列分析表明OsCD1编码一个类似纤维素合成酶基因，是CSLD亚家族中的一个成员，含有该亚家族中典型的“D，D，D，QXXRW”保守基序(图6A方框中星号所示)。与其它已知植物中的CSLD蛋白具有较高的同源性，在同源进化树上与高粱(Sorghum bicolor)的CSLD的相似程度最高，与拟南芥ATCSLD5的同源性也较高(图6B)，表明该亚家族在多糖合成上的保守性。

实施例2

三、克隆的目的基因的应用前景预测

多糖在植物细胞发育中有重要作用，主要有纤维素、半纤维素及果胶等多聚糖。一方面，这些多聚糖在是细胞形态建成中的组成部分；另一方面，它们在细胞生存的环境及生理上具有重要的作用。这些多聚糖的合成和代谢途径是很复杂的，目前已知糖基转移酶(glycosyl transferases，GTs)在多糖合成中起重要的作用，编码此酶的基因是一个超家族，其中CSLDs是其中的一个亚家族，在已有的报道中，CSLDs亚家族中功能上还不甚明确，在拟南芥中与木聚糖及同型聚半乳糖醛酸的合成有关，影响茎的发育。在水稻中报道OsCSLD1与根毛的发育有关。本研究在构建的插入突变体库中发现一个矮杆卷叶突变体，减少了植株的整体生长量。基因克隆揭示了该突变性状是由CSLD亚家族基因控制的。在本研究中，突变体所表现出的性状严重影响了水稻的生长和发育，不但在植株的形态建成受到了抑制，而且其叶绿素含量降低，结实率大大下降，籽粒不饱满，制约了农艺性状的发育。

多糖是构成细胞壁的主要成分，在植物不同部位及不同发育时期的细胞壁在结构和成分上有所不同。例如，由分生组织细胞刚分裂形成的幼嫩组织，其细胞壁仅有很薄的一层胞间层，随着细胞的生长和成熟，初生壁层开始形成。具有输导功能的木质部导管及管胞的细胞壁木质层加厚。另外，主要起机械支持功能的木纤维，细胞壁完全木质化。位于植物体外表面的表皮细胞，细胞壁的表面往往有角质及蜡质存在，有利于减少水分散失，防止机械损伤和病原体的入侵，与植物的抗逆密切相关。主要由脂类物质组成的花粉壁，对花粉有良好的保护作用，花粉壁上可能含有的类抗原物质，与花粉粒所停落的柱头是否相适合有关。稻麦茎秆表皮的硅质细胞，因细胞壁内积累大量硅酸盐而变得坚硬，与增强茎秆强度和抗倒伏有关。这些功能对于作用品种的改良具有重要的作用，我们可以用基因工程或遗传工程方法增强作物对不良环境的抗性，如提高作用的抗旱、抗病、抗倒伏能力。也可以用该基因调控植株的形态建成，选育我们所需要的有利于产量提高的株型。另外，我们可利用基因工程方法改变植株的形状，这在园艺观赏植物中有重要的利用价值。

四、参考文献

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序列表(SEQ ID)

<110>天津师范大学

<120>水稻矮杆卷叶突变体(cd1)基因及其应用

<160>3

<210>1

<211>4382bp

<212>DNA

<213>基因序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(4382)

<400>1

actcatcgat cccctcctcc attcacatga gagatcctcg agatccctat aatttctccc 60

ccaattcgtc gcggccaatc cttcccccga gctcgagctg atcggcgtga gctttttctc 120

gccggagttg agctgagccc ggcggttttc gggtgtggat ttgagcttga gctgaagtga 180

agtgagcttg tggttttgag gtgatttgtg ggggatgtcg cggcggctgt cgttgccggc 240

gggggcgccg gtgacggtgg cggtgtcgcc ggtgcggagc ccggggggtg acgcggtggt 300

gaggaggggg agcgggctga cgtcccccgt gccgaggcac tcgctcgggt cgtccaccgc 360

cacgctgcag gtgtcgccgg tgaggcggag cggcgggagt aggtacctcg gcgcgtcgag 420

ggatggcggc gccgatgaga gcgccgagtt cgtgcactac accgtgcaca tcccgcccac 480

gcccgaccgg gcgacggcgt ccgtggcgag cgaggcggag gcggcggcgg aggccgagga 540

ggtgcaccgg ccgcagcgga gctacatctc cgggacgata ttcaccgggg ggctcaactg 600

cgccacgcgc ggccaccggg ccacgtgctc aacttctccg gcgagggcgg cgccaccgcc 660

gcctccaggg cggcggcgtc ggggaacatg tcgtgcaaga tgcgcgggtg cgacatgccc 720

gcgttcctca acggcggccg cccgccgtgc gactgcgggt tcatgatctg caaggagtgc 780

tacgcggagt gcgccgcggg caactgcccc ggttgcaagg aggccttctc cgcgggctcc 840

gacaccgacg aatccgactc cgtcaccgac gacgacgacg acgaggccgt ctcctcctcc 900

gaggagaggg accagctgcc gctgacatcc atggcgagga aattttccgt ggtgcactcc 960

atgaaggtcc ccggcgccgc cgccaacggc aacggcaagc cggccgagtt cgaccacgcc 1020

cgctggctct tcgagaccaa gggcacctat ggctacggca acgctctctg gcccaaggac 1080

ggccacgccc atagcggcgc cggcttcgtc gccgccgacg agccccccaa cttcggtgcc 1140

cgctgccgcc gccccctcac cagaaaaacc agcgtctccc aagccattct cagcccctac 1200

aggtaccaaa tcctcctcaa aatttgaaca atttcaacaa attttaccaa atttgagcaa 1260

attggttagc attttgaggt ggatttgttt ttgattaggt tgaattttga acaatttcaa 1320

caaaatttac caagttggtt agcattttga ggtggatttg tttttgatta ggttgaattt 1380

tgaacaattt caacaaattt taccaaattt gagcaaattt gttagcattt tgaggtggat 1440

ttgtttttga ttaggttgtt gattgcgatt cggctggtgg cgctggggtt cttcctcgcg 1500

tggaggattc ggcatccgaa tccggaggcg gtgtggctgt gggcgatgtc ggtggcgtgc 1560

gaggtgtggt tcgccttctc atggctgctc gacagcctcc ccaagctctg ccccgtccac 1620

cgcgccgccg acctcgccgt cctcgccgag cggttcgagt cgccgacggc gcgcaacccc 1680

aagggccgct ccgacctccc cgggatcgac gtgttcgtca ccagcgccga cccggagaag 1740

gagccgccgc tggtcaccgc caacaccatc ctctccatcc tcgccgcgga ctaccccgtc 1800

gagaagctcg cttgctacct ctccgacgac ggcggcgcgc tgctgtcgtt cgaggcgctc 1860

gccgagacgg ccagcttcgc gcgcacgtgg gtgccattct gccgcaagca cggcgtcgag 1920

ccgcggtgcc ccgaggcgta tttcggccag aagagggact tcctcaagaa caaggtgcgc 1980

gtcgacttcg tccgcgagag gcggaaggtg aagcgcgagt acgacgagtt caaggtgcgg 2040

gtgaactcgc tccccgaggc gatccggcgg cgctccgacg cgtacaacgc cggcgaggaa 2100

ctgcgcgcca ggaggcggca gcaggaggag gccgccgccg cggctgccgc cggcaacggc 2160

gagcttggag cggcggcggt cgagaccgcc gccgtgaagg ccacgtggat gtcggacggc 2220

tcgcactggc cggggacgtg gacgtgcccc gcggcggacc acgcccgcgg cgaccacgcc 2280

gggatcatcc aggcgatgct ggcgccgccg acctcggagc cggtgatggg aggcgaggcg 2340

gcggagtgcg gcgggctgat cgacaccacg ggcgtggacg tccgcctccc gatgctggtg 2400

tacgtgtcgc gggagaagcg cccgggctac gatcacaaca agaaggccgg cgccatgaac 2460

gcgctggtgc ggacgagcgc catcatgtcg aacgggccct tcatcctcaa cctcgactgc 2520

gaccactacg tgcacaactc gtcggcgctc cgggagggga tgtgcttcat gctcgaccgc 2580

ggcggcgacc gcgtgtgctt cgtccagttc ccgcagcggt tcgagggcgt cgaccccagc 2640

gaccggtacg ccaaccacaa cctcgtcttc ttcgacgtgt ccatgcgcgc catggacggg 2700

cttcagggcc ccatgtacgt cggcaccggc tgcgtcttcc gccgcaccgc gctgtacggc 2760

ttcagcccgc cccgcgccac cgagcaccat ggctggctcg gccgcaggaa gatcaagctg 2820

ttcctcacca agaagaagag catgggcaag aagacggaca gggccgagga cgacaccgag 2880

atgatgctgc cgccgatcga ggacgacgac ggcggcgccg acattgaggc ctcggctatg 2940

ctaccgaagc ggttcggcgg gtcggcgacg ttcgtggcgt cgatacccgt ggcggagtac 3000

cagggtcggc tgctgcagga cacccccggg tgccaccacg gccgccctgc gggcgcgctc 3060

gctgtgccgc gcgagccgct cgacgcggcg acggtggcgg aggccatcgg cgtgatctcc 3120

tgcttctacg aggagaagac ggagtggggg cggcgcatcg ggtggatcta cggctccgtc 3180

accgaggacg tggtcaccgg ctaccggatg cacaaccgcg ggtggcgctc cgtctactgc 3240

gtgacgccgc ggcgcgacgc gttccgcggc acggcgccga tcaacctcac cgaccgcctc 3300

caccaggtgc tccggtgggc gacgggctcc gtcgagatct tcttctcccg caacaacgcc 3360

ctcttcgcct cgccgcggat gaagctgctg cagcgcgtcg cctacttcaa cgccgggatg 3420

taccccttca cctccgtgtt cctcctcgcc tactgcctcc tcccggccgt ctccctcttc 3480

tccggcaagt tcatcgtgca gcgactcagc gccaccttcc tcgccttcct cctcgtcatc 3540

accctcaccc tctgcctcct cgccctgctc gagatcaagt ggtccgggat cacgctccac 3600

gagtggtggc gcaacgagca gttctgggtg atcggcggca ccagcgcgca cccggccgcc 3660

gtgctgcagg gcctactcaa ggtgatcgcc ggcgtggaca tctccttcac gctgacctcc 3720

aagccgggga acggcggcgg cgatggcggg gtcggcggcg aggggaacga cgacgaggcg 3780

ttcgcggagc tgtacgaggt gaggtggagc tacctgatgg tgccgccggt gacgatcatg 3840

atggtgaacg cggtggcgat cgcggtggcg gcggcgagga cgctgtacag cgagttcccg 3900

cagtggagca agctgctcgg cggcgccttc ttcagcttct gggtgctgtg ccacctctac 3960

ccgttcgcca agggcctcct cggccgccgc ggccgcgtgc ccaccatcgt cttcgtctgg 4020

tcgggcctca tctccatgat catctccctc ctctgggtct acatcaaccc gcccgccggc 4080

gcccgggagc gcatcggcgg cggcggattc agcttcccat agccgaagaa gaagaagaag 4140

aagaaagaag ttatttatca gtagtgtagt ggtgtcgagt tcagtttctt gaagctctga 4200

actttctgaa gctcacatga aggagtgctt gcttcatggg gcgtgttgtc aaattcagtt 4260

cagtaaaagt acttttaccg aagtattagg tgtgattaag cgattgtttg tgtatcaatt 4320

aagttacttg tgattaattg atactgatta tgtatcaaat attggagaca tgtcatatga 4380

tt 4382

<210>2

<211>4374bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>基因序列

<222>(1)..(4374)

<400>2

actcatcgat cccctcctcc attcacatga gagatcctcg agatccctat aatttctccc 60

ccaattcgtc gcggccaatc cttcccccga gctcgagctg atcggcgtga gctttttctc 120

gccggagttg agctgagccc ggcggttttc gggtgtggat ttgagcttga gctgaagtga 180

agtgagcttg tggttttgag gtgatttgtg ggggatgtcg cggcggctgt cgttgccggc 240

gggggcgccg gtgacggtgg cggtgtcgcc ggtgcggagc ccggggggtg acgcggtggt 300

gaggaggggg agcgggctga cgtcccccgt gccgaggcac tcgctcgggt cgtccaccgc 360

cacgctgcag gtgtcgccgg tgaggcggag cggcgggagt aggtacctcg gcgcgtcgag 420

ggatggcggc gccgatgaga gcgccgagtt cgtgcactac accgtgcaca tcccgcccac 480

gcccgaccgg gcgacggcgt ccgtggcgag cgaggcggag gcggcggcgg aggccgagga 540

ggtgcaccgg ccgcagcgga gctacatctc cgggacgata ttcaccgggg ggctcaactg 600

cgccacgcgc ggccacgtgc tcaacttctc cggcgagggc ggcgccaccg ccgcctccag 660

ggcggcggcg tcggggaaca tgtcgtgcaa gatgcgcggg tgcgacatgc ccgcgttcct 720

caacggcggc cgcccgccgt gcgactgcgg gttcatgatc tgcaaggagt gctacgcgga 780

gtgcgccgcg ggcaactgcc ccggttgcaa ggaggccttc tccgcgggct ccgacaccga 840

cgaatccgac tccgtcaccg acgacgacga cgacgaggcc gtctcctcct ccgaggagag 900

ggaccagctg ccgctgacat ccatggcgag gaaattttcc gtggtgcact ccatgaaggt 960

ccccggcgcc gccgccaacg gcaacggcaa gccggccgag ttcgaccacg cccgctggct 1020

cttcgagacc aagggcacct atggctacgg caacgctctc tggcccaagg acggccacgc 1080

ccatagcggc gccggcttcg tcgccgccga cgagcccccc aacttcggtg cccgctgccg 1140

ccgccccctc accagaaaaa ccagcgtctc ccaagccatt ctcagcccct acaggtacca 1200

aatcctcctc aaaatttgaa caatttcaac aaattttacc aaatttgagc aaattggtta 1260

gcattttgag gtggatttgt ttttgattag gttgaatttt gaacaatttc aacaaaattt 1320

accaagttgg ttagcatttt gaggtggatt tgtttttgat taggttgaat tttgaacaat 1380

ttcaacaaat tttaccaaat ttgagcaaat ttgttagcat tttgaggtgg atttgttttt 1440

gattaggttg ttgattgcga ttcggctggt ggcgctgggg ttcttcctcg cgtggaggat 1500

tcggcatccg aatccggagg cggtgtggct gtgggcgatg tcggtggcgt gcgaggtgtg 1560

gttcgccttc tcatggctgc tcgacagcct ccccaagctc tgccccgtcc accgcgccgc 1620

cgacctcgcc gtcctcgccg agcggttcga gtcgccgacg gcgcgcaacc ccaagggccg 1680

ctccgacctc cccgggatcg acgtgttcgt caccagcgcc gacccggaga aggagccgcc 1740

gctggtcacc gccaacacca tcctctccat cctcgccgcg gactaccccg tcgagaagct 1800

cgcttgctac ctctccgacg acggcggcgc gctgctgtcg ttcgaggcgc tcgccgagac 1860

ggccagcttc gcgcgcacgt gggtgccatt ctgccgcaag cacggcgtcg agccgcggtg 1920

ccccgaggcg tatttcggcc agaagaggga cttcctcaag aacaaggtgc gcgtcgactt 1980

cgtccgcgag aggcggaagg tgaagcgcga gtacgacgag ttcaaggtgc gggtgaactc 2040

gctccccgag gcgatccggc ggcgctccga cgcgtacaac gccggcgagg aactgcgcgc 2100

caggaggcgg cagcaggagg aggccgccgc cgcggctgcc gccggcaacg gcgagcttgg 2160

agcggcggcg gtcgagaccg ccgccgtgaa ggccacgtgg atgtcggacg gctcgcactg 2220

gccggggacg tggacgtgcc ccgcggcgga ccacgcccgc ggcgaccacg ccgggatcat 2280

ccaggcgatg ctggcgccgc cgacctcgga gccggtgatg ggaggcgagg cggcggagtg 2340

cggcgggctg atcgacacca cgggcgtgga cgtccgcctc ccgatgctgg tgtacgtgtc 2400

gcgggagaag cgcccgggct acgatcacaa caagaaggcc ggcgccatga acgcgctggt 2460

gcggacgagc gccatcatgt cgaacgggcc cttcatcctc aacctcgact gcgaccacta 2520

cgtgcacaac tcgtcggcgc tccgggaggg gatgtgcttc atgctcgacc gcggcggcga 2580

ccgcgtgtgc ttcgtccagt tcccgcagcg gttcgagggc gtcgacccca gcgaccggta 2640

cgccaaccac aacctcgtct tcttcgacgt gtccatgcgc gccatggacg ggcttcaggg 2700

ccccatgtac gtcggcaccg gctgcgtctt ccgccgcacc gcgctgtacg gcttcagccc 2760

gccccgcgcc accgagcacc atggctggct cggccgcagg aagatcaagc tgttcctcac 2820

caagaagaag agcatgggca agaagacgga cagggccgag gacgacaccg agatgatgct 2880

gccgccgatc gaggacgacg acggcggcgc cgacattgag gcctcggcta tgctaccgaa 2940

gcggttcggc gggtcggcga cgttcgtggc gtcgataccc gtggcggagt accagggtcg 3000

gctgctgcag gacacccccg ggtgccacca cggccgccct gcgggcgcgc tcgctgtgcc 3060

gcgcgagccg ctcgacgcgg cgacggtggc ggaggccatc ggcgtgatct cctgcttcta 3120

cgaggagaag acggagtggg ggcggcgcat cgggtggatc tacggctccg tcaccgagga 3180

cgtggtcacc ggctaccgga tgcacaaccg cgggtggcgc tccgtctact gcgtgacgcc 3240

gcggcgcgac gcgttccgcg gcacggcgcc gatcaacctc accgaccgcc tccaccaggt 3300

gctccggtgg gcgacgggct ccgtcgagat cttcttctcc cgcaacaacg ccctcttcgc 3360

ctcgccgcgg atgaagctgc tgcagcgcgt cgcctacttc aacgccggga tgtacccctt 3420

cacctccgtg ttcctcctcg cctactgcct cctcccggcc gtctccctct tctccggcaa 3480

gttcatcgtg cagcgactca gcgccacctt cctcgccttc ctcctcgtca tcaccctcac 3540

cctctgcctc ctcgccctgc tcgagatcaa gtggtccggg atcacgctcc acgagtggtg 3600

gcgcaacgag cagttctggg tgatcggcgg caccagcgcg cacccggccg ccgtgctgca 3660

gggcctactc aaggtgatcg ccggcgtgga catctccttc acgctgacct ccaagccggg 3720

gaacggcggc ggcgatggcg gggtcggcgg cgaggggaac gacgacgagg cgttcgcgga 3780

gctgtacgag gtgaggtgga gctacctgat ggtgccgccg gtgacgatca tgatggtgaa 3840

cgcggtggcg atcgcggtgg cggcggcgag gacgctgtac agcgagttcc cgcagtggag 3900

caagctgctc ggcggcgcct tcttcagctt ctgggtgctg tgccacctct acccgttcgc 3960

caagggcctc ctcggccgcc gcggccgcgt gcccaccatc gtcttcgtct ggtcgggcct 4020

catctccatg atcatctccc tcctctgggt ctacatcaac ccgcccgccg gcgcccggga 4080

gcgcatcggc ggcggcggat tcagcttccc atagccgaag aagaagaaga agaagaaaga 4140

agttatttat cagtagtgta gtggtgtcga gttcagtttc ttgaagctct gaactttctg 4200

aagctcacat gaaggagtgc ttgcttcatg gggcgtgttg tcaaattcag ttcagtaaaa 4260

gtacttttac cgaagtatta ggtgtgatta agcgattgtt tgtgtatcaa ttaagttact 4320

tgtgattaat tgatactgat tatgtatcaa atattggaga catgtcatat gatt 4374

<210>3

<211>1215bp

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<222>(1)..(1215)

<400>3

Met Ser Arg Arg Leu Ser Leu Pro Ala Gly Ala Pro Val Thr Val Ala

1 5 10 15

Val Ser Pro Val Arg Ser Pro Gly Gly Asp Ala Val Val Arg Arg Gly

20 25 30

Ser Gly Leu Thr Ser Pro Val Pro Arg His Ser Leu Gly Ser Ser Thr

35 40 45

Ala Thr Leu Gln Val Ser Pro Val Arg Arg Ser Gly Gly Ser Arg Tyr

50 55 60

Leu Gly Ala Ser Arg Asp Gly Gly Ala Asp Glu Ser Ala Glu Phe Val

65 70 75 80

His Tyr Thr Val His Ile Pro Pro Thr Pro Asp Arg Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Val Ala Ser Glu Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ala Glu Glu Val His Arg

100 105 110

Pro Gln Arg Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Ile Phe Thr Gly Gly Leu Asn

115 120 125

Cys Ala Thr Arg Gly His Val Leu Asn Phe Ser Gly Glu Gly Gly Ala

130 135 140

Thr Ala Ala Ser Arg Ala Ala Ala Ser Gly Asn Met Ser Cys Lys Met

145 150 155 160

Arg Gly Cys Asp Met Pro Ala Phe Leu Asn Gly Gly Arg Pro Pro Cys

165 170 175

Asp Cys Gly Phe Met Ile Cys Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Cys Ala Ala

180 185 190

Gly Asn Cys Pro Gly Cys Lys Glu Ala Phe Ser Ala Gly Ser Asp Thr

195 200 205

Asp Glu Ser Asp Ser Val Thr Asp Asp Asp Asp Asp Glu Ala Val Ser

210 215 220

Ser Ser Glu Glu Arg Asp Gln Leu Pro Leu Thr Ser Met Ala Arg Lys

225 230 235 240

Phe Ser Val Val His Ser Met Lys Val Pro Gly Ala Ala Ala Asn Gly

245 250 255

Asn Gly Lys Pro Ala Glu Phe Asp His Ala Arg Trp Leu Phe Glu Thr

260 265 270

Lys Gly Thr Tyr Gly Tyr Gly Asn Ala Leu Trp Pro Lys Asp Gly His

275 280 285

Ala His Ser Gly Ala Gly Phe Val Ala Ala Asp Glu Pro Pro Asn Phe

290 295 300

Gly Ala Arg Cys Arg Arg Pro Leu Thr Arg Lys Thr Ser Val Ser Gln

305 310 315 320

Ala Ile Leu Ser Pro Tyr Arg Leu Leu Ile Ala Ile Arg Leu Val Ala

325 330 335

Leu Gly Phe Phe Leu Ala Trp Arg Ile Arg His Pro Asn Pro Glu Ala

340 345 350

Val Trp Leu Trp Ala Met Ser Val Ala Cys Glu Val Trp Phe Ala Phe

355 360 365

Ser Trp Leu Leu Asp Ser Leu Pro Lys Leu Cys Pro Val His Arg Ala

370 375 380

Ala Asp Leu Ala Val Leu Ala Glu Arg Phe Glu Ser Pro Thr Ala Arg

385 390 395 400

Asn Pro Lys Gly Arg Ser Asp Leu Pro Gly Ile Asp Val Phe Val Thr

405 410 415

Ser Ala Asp Pro Glu Lys Glu Pro Pro Leu Val Thr Ala Asn Thr Ile

420 425 430

Leu Ser Ile Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Val Glu Lys Leu Ala Cys Tyr

435 440 445

Leu Ser Asp Asp Gly Gly Ala Leu Leu Ser Phe Glu Ala Leu Ala Glu

450 455 460

Thr Ala Ser Phe Ala Arg Thr Trp Val Pro Phe Cys Arg Lys His Gly

465 470 475 480

Val Glu Pro Arg Cys Pro Glu Ala Tyr Phe Gly Gln Lys Arg Asp Phe

485 490 495

Leu Lys Asn Lys Val Arg Val Asp Phe Val Arg Glu Arg Arg Lys Val

500 505 510

Lys Arg Glu Tyr Asp Glu Phe Lys Val Arg Val Asn Ser Leu Pro Glu

515 520 525

Ala Ile Arg Arg Arg Ser Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Glu Glu Leu Arg

530 535 540

Ala Arg Arg Arg Gln Gln Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly

545 550 555 560

Asn Gly Glu Leu Gly Ala Ala Ala Val Glu Thr Ala Ala Val Lys Ala

565 570 575

Thr Trp Met Ser Asp Gly Ser His Trp Pro Gly Thr Trp Thr Cys Pro

580 585 590

Ala Ala Asp His Ala Arg Gly Asp His Ala Gly Ile Ile Gln Ala Met

595 600 605

Leu Ala Pro Pro Thr Ser Glu Pro Val Met Gly Gly Glu Ala Ala Glu

610 615 620

Cys Gly Gly Leu Ile Asp Thr Thr Gly Val Asp Val Arg Leu Pro Met

625 630 635 640

Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro Gly Tyr Asp His Asn Lys

645 650 655

Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Val Arg Thr Ser Ala Ile Met Ser

660 665 670

Asn Gly Pro Phe Ile Leu Asn Leu Asp Cys Asp His Tyr Val His Asn

675 680 685

Ser Ser Ala Leu Arg Glu Gly Met Cys Phe Met Leu Asp Arg Gly Gly

690 695 700

Asp Arg Val Cys Phe Val Gln Phe Pro Gln Arg Phe Glu Gly Val Asp

705 710 715 720

Pro Ser Asp Arg Tyr Ala Asn His Asn Leu Val Phe Phe Asp Val Ser

725 730 735

Met Arg Ala Met Asp Gly Leu Gln Gly Pro Met Tyr Val Gly Thr Gly

740 745 750

Cys Val Phe Arg Arg Thr Ala Leu Tyr Gly Phe Ser Pro Pro Arg Ala

755 760 765

Thr Glu His His Gly Trp Leu Gly Arg Arg Lys Ile Lys Leu Phe Leu

770 775 780

Thr Lys Lys Lys Ser Met Gly Lys Lys Thr Asp Arg Ala Glu Asp Asp

785 790 795 800

Thr Glu Met Met Leu Pro Pro Ile Glu Asp Asp Asp Gly Gly Ala Asp

805 810 815

Ile Glu Ala Ser Ala Met Leu Pro Lys Arg Phe Gly Gly Ser Ala Thr

820 825 830

Phe Val Ala Ser Ile Pro Val Ala Glu Tyr Gln Gly Arg Leu Leu Gln

835 840 845

Asp Thr Pro Gly Cys His His Gly Arg Pro Ala Gly Ala Leu Ala Val

850 855 860

Pro Arg Glu Pro Leu Asp Ala Ala Thr Val Ala Glu Ala Ile Gly Val

865 870 875 880

Ile Ser Cys Phe Tyr Glu Glu Lys Thr Glu Trp Gly Arg Arg Ile Gly

885 890 895

Trp Ile Tyr Gly Ser Val Thr Glu Asp Val Val Thr Gly Tyr Arg Met

900 905 910

His Asn Arg Gly Trp Arg Ser Val Tyr Cys Val Thr Pro Arg Arg Asp

915 920 925

Ala Phe Arg Gly Thr Ala Pro Ile Asn Leu Thr Asp Arg Leu His Gln

930 935 940

Val Leu Arg Trp Ala Thr Gly Ser Val Glu Ile Phe Phe Ser Arg Asn

945 950 955 960

Asn Ala Leu Phe Ala Ser Pro Arg Met Lys Leu Leu Gln Arg Val Ala

965 970 975

Tyr Phe Asn Ala Gly Met Tyr Pro Phe Thr Ser Val Phe Leu Leu Ala

980 985 990

Tyr Cys Leu Leu Pro Ala Val Ser Leu Phe Ser Gly Lys Leu Ile Val

995 1000 1005

Gln Arg Leu Ser Ala Thr Phe Leu Ala Phe Leu Leu Val Ile Thr

1010 1015 1020

Leu Thr Leu Cys Leu Leu Ala Leu Leu Glu Ile Lys Trp Ser Gly

1025 1030 1035

Ile Thr Leu His Glu Trp Trp Arg Asn Glu Gln Phe Trp Val Ile

1040 1045 1050

Gly Gly Thr Ser Ala His Pro Ala Ala Val Leu Gln Gly Leu Leu

1055 1060 1065

Lys Val Ile Ala Gly Val Asp Ile Ser Phe Ile Ala Asp Leu Gln

1070 1075 1080

Ala Gly Glu Arg Arg Arg Arg Trp Arg Gly Arg Arg Arg Gly Glu

1085 1090 1095

Arg Arg Arg Gly Val Arg Gly Ala Val Arg Gly Glu Val Glu Leu

1100 1105 1110

Pro Asp Gly Ala Ala Gly Asp Asp His Asp Gly Glu Arg Gly Gly

1115 1120 1125

Asp Arg Gly Gly Gly Gly Glu Asp Ala Val Gln Arg Val Pro Ala

1130 1135 1140

Val Glu Gln Ala Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gln Leu Leu Gly Ala

1145 1150 1155

Val Pro Pro Leu Pro Val Arg Gln Gly Pro Pro Arg Pro Pro Arg

1160 1165 1170

Pro Arg Ala His His Arg Leu Arg Leu Val Gly Pro His Leu His

1175 1180 1185

Asp His Leu Pro Pro Leu Gly Leu His Gln Pro Ala Arg Arg Arg

1190 1195 1200

Pro Gly Ala His Arg Arg Arg Arg Ile Gln Leu Pro

1205 1210 1215

Claims

1.水稻矮杆卷叶突变体(cdl)基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，其所对应的野生型OsCDl基因的序列为SEQ ID No.2。

2.权利要求1所述水稻矮杆卷叶突变体(cdl)基因其所对应的野生型OsCDl基因氨基酸序列为SEQ ID No.3。

3.权利要求1或2所述的水稻矮杆卷叶突变体(cdl)基因在制备增强作物对不良环境的抗性方面的应用。

4.要求1或2所述的水稻矮杆卷叶突变体(cdl)基因在制备抗旱、抗病、抗倒伏方面的应用。

5.权利要求1或2所述的水稻矮杆卷叶突变体(cdl)基因在制备控制植株的形态、改变植株的形状方面的应用。