CN111944777A

CN111944777A - 一种抗逆性植物相关蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN111944777A
Application number: CN202010806435.0A
Authority: CN
Inventors: 李朝炜; 魏景芳; 朱昀; 刘颖
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-08-14
Also published as: CN111944777B

Abstract

本发明涉及一种抗逆性植物相关蛋白及其编码基因和应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或其同源序列，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或其同源序列，所述应用为用于培育抗逆性植物中的应用。通过在拟南芥的突变体中意外地发现DRE2基因，该基因虽然具有At1g65450转录本，但却无双受精的作用；将其克隆转入植物中，发现具有该基因的植物具有抗逆性，通过实验发现DRE2蛋白在植物生长发育及逆境反应的信号通路中具有重要作用，将为探究高等植物抵抗逆境胁迫的机制提供新的研究思路；为At1g65450基因的作用的研究和探索提供了新的思路。

Description

一种抗逆性植物相关蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及技术生物技术领域，尤其是一种抗逆性植物相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)具有植株体积小、种子多并易获得、生长周期短、自花授粉、易于对其进行诱导突变和基因转化、已完成基因组测序并拥有丰富的研究资源等多种优势，因此，作为模式生物早已成为生物学研究的理想材料，被誉为“植物界中的果蝇”。

植物在整个生长发育过程中，会受到来自生物以及非生物等逆境胁迫的共同作用，为了更好地适应并抵御来自外界的恶劣环境，植物体便在生长发育过程中合成并储存非生命活动所必需的物质即次生代谢产物。次生代谢产物是联系生物与非生物，植物与外界环境的重要桥梁，因此，也是植物生长发育的重要组成部分。植物的次生代谢产物种类与功能多种多样，这些不同种类的次生代谢产物起到了信号传递、系统防御及药用活性等多种功能。

木质素是一种由苯丙氨酸衍生的，在植物体内高度聚合的复杂生物大分子有机化合物，是构成次生壁的组分之一，存在于植物的木质结构中。木质素广泛存在于根茎、种皮、叶柄等结构中，在植物中具有重要的生物功能：增强了细胞的机械强度以及耐受能力，并为植物抵抗各种不良环境的侵袭以及运输生长发育所必需的水分提供了保障。细胞在正常的生长机制下只有少数细胞会积累大量的木质素，但在在植物体受到外界刺激或者损伤的情况下可以诱导木质素的积累，因此，木质素的生物合成机制以及从分子水平调控木质素的含量的研究一直是国内外关注的热门问题，在实际生产中具有重大现实意义和产业应用前景。

花青素（Anthocyanidin）植物次生代谢产物中占有极为重要的地位，其作为天然存在于植物体内的一种多羟基酚类物质，起到了保护植物自身免受外界不良环境侵扰的作用，提高植物在应对逆境胁迫环境下的适应能力。此外，花青素作为一种天然色素，具有安全有效、且种类数量繁多等优势。并且大量的研究显示，花青素除却具有高效的抗氧化功能外，还具有抗突变、缓解视觉疲劳、延缓神经系统衰老、保护心脑血管系统、抵御紫外线损伤保护皮肤、增强免疫力、缓解过敏症状、增强血液循环等多种药用功效。

综上所述，合成次生代谢物是植物在生长发育中应对不良环境的一种适应性表现，而植物对逆境胁迫的反应机制一直是生物学研究的热点领域，如果能够开发一种增强其特定次级代谢性能的植物，将会为探究高等植物抵抗逆境胁迫的机制提供新的研究思路。

发明内容

针对上述目的，本发明的目的是提供一种抗逆性植物相关蛋白及其编码及其和应用，从而为探究高等植物抵抗逆境胁迫的机制提供新的研究思路。

本发明一方面提供一种抗逆性植物相关蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示或其同源序列；所述同源序列与原序列的同源性为95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1%或以上、99.2%或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、或99.9%或以上。

在本发明的优选实施例中，所述抗逆性植物为抗旱和/或耐冷相关植物。

本发明的又一方面提供一种上述抗逆性植物相关蛋白的编码基因，该基因发现于拟南芥突变体中，命名为dre-D，其编码的蛋白命名为DRE2，基因命名为DRE2基因，该基因在突变体基因组上的插入位点为在At1g65440及At1g65450之间。

在本发明的优选实施例中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或其同源序列。

优选地，所述同源序列与原序列的同源性为95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1%或以上、99.2%或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、或99.9%或以上。

本发明的再一方面提供一种上述基因在用于培育抗逆性植物中的应用。

本发明的又一方面提供一种抗逆性植物的培育方法，包括将含有抗逆性植物相关蛋白的编码基因的重组表达载体导入植物细胞，得到抗逆性植物，所述抗逆性植物相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或其同源序列。

优选地，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞活植物组织。

在本发明的优选实施例中，所述方法包括将抗逆性植物相关蛋白的编码基因转入载体中，得到重组载体，再将所述重组载体导入农杆菌中，得到重组农杆菌，再将其导入植物细胞，得到抗逆性植物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述抗逆性植物相关蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或其同源序列。

在本发明的又一个具体实时方式中，所述抗逆性植物为抗旱和/或耐冷相关植物。

本发明的有益效果是：At1g65450基因包含三种转录本的可变剪切方式，却和现有技术报道的作用不同，现有技术中报道称其基因产物可以挽救glc突变体的不育缺陷（ThePlant Cell, 2012,24: 3264–3277），具有双受精相关的功能，但推测是不同剪切方式的翻译产物共同联合起作用的；并且基因组数据库中推测其与BAHD酰基转移酶具有同源性。

本发明的发明人在拟南芥的突变体中意外地发现DRE2基因，该基因虽然具有At1g65450转录本，但却无双受精的作用；将其克隆转入植物中，发现具有该基因的植物具有抗逆性，通过实验发现DRE2蛋白参与调节拟南芥木质素、花青素等次生代谢物合成的相关途径，影响了木质素和花青素的含量及其稳态调节，并在植物生长发育及逆境反应的信号通路中具有重要作用，将为探究高等植物抵抗逆境胁迫的机制提供新的研究思路；为At1g65450基因的作用的研究和探索提供了新的思路。

附图说明

构成说明书的一部分的附图描述了本发明的实施例，并且连同描述一起用于解释本发明的原理。

参照附图，根据下面的详细描述，可以更加清楚地理解本发明，其中：

图1为本发明实施例1中的生长26天后的dre-D与野生型植株表型；

图2为本发明实施例1中的生长52天后的dre-D与野生型植株表型；

图3为本发明实施例1中dre-D突变体基因组上的插入位点图；

图4为本发明实施例1中的dre-D的DRE2基因在不同生长阶段的表达量；

图5为本发明实施例2中的生长35天后的不同株系拟南芥的表型；

图6为本发明实施例2中生长15天后不同株系拟南芥中DRE2基因相对表达量；

图7为本发明实施例2中生长45天后不同株系拟南芥中DRE2基因相对表达量；

图8为本发明实施例3中干旱胁迫之后不同株系拟南芥的表型差异；

图9为本发明实施例4中的对照组中不同拟南芥株系茎的石蜡切片图；

图10为本发明实施例4中的干旱处理组不同拟南芥株系茎的石蜡切片图；

图11为本发明实施例5中的干旱胁迫前后不同株系拟南芥茎的木质素含量；

图12为本发明实施例5中的干旱胁迫前后不同株系拟南芥C4H基因相对表达量；

图13为本发明实施例5中的干旱胁迫前后不同株系拟南芥PAL1基因相对表达量；

图14为本发明实施例6中的低温胁迫前后不同株系拟南芥花青素含量；

图15为本发明实施例6中的低温胁迫前后不同株系拟南芥DFR基因相对表达量；

图16为本发明实施例6中的低温胁迫前后不同株系拟南芥UF3GT基因相对表达量。

具体实施方式

现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。

以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。

对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。

除非特别指明，本文中的“Mutant”或“缺失突变体”均指“DRE2基因缺失突变体”。

除非特别指明，本文中的“DRE2基因超表达体”或“OE”或“超表达株系”均指“DRE2基因超表达纯合株系”。

除非特别指明，本文中的“dre-D”均指“拟南芥dre-D突变体”。

除非特别指明，本文中的“DRE2”均指“DRE2基因”。

除非特别指明，本文中的“DRE2”均指“DRE2蛋白”。

实施例1：DRE2蛋白及其编码基因的发现

构建拟南芥的T-DNA插入突变体库，发现了一个抽薹延迟、薹的直径略增粗、抗旱性增强的拟南芥突变体（命名为dre-D）。在营养生长阶段，dre-D与野生型均没有显著区别。抽薹前后差异开始出现，dre-D和WT照片分别如图1、图2所示，从图1和图2可以看出，虽然莲座叶大小没有显著区别，但是dre-D的抽薹时间明显晚于WT。

然后，通hiTAIL-PCR技术检测了T-DNA在该突变体基因组上的插入位点，发现其插入在At1g65440及At1g65450之间，具体如图3所示。再利用实时荧光定量PCR（其所用的引物如下述表1所示）等实验证实dre-D当中T-DNA插入造成了位点附近At1g65450的其中一个转录本的表达量，结果如图4所示。该基因有三个不同的转录本，本突变体是第2个转录本的表达量明显升高。

表1 荧光定量PCR引物

引物名称	序列
		<i>65450.2-</i>F	CTTCAGAGTTTGCCCAAAGATG(SEQ ID NO:3)
<i>65450.2-</i>R	GGTACTTAGATCCTTGAGATCCC(SEQ ID NO:4)
		<i>ubc21</i>-F	GACCGCTCTTATCAAAGGACC(SEQ ID NO:5)
<i>ubc21</i>-R	ACACAGACTGAAGCGTCCAAGC(SEQ ID NO:6)

图4显示DRE2在突变体dre-D体内的表达量在生长早期与野生型差异不大；当野生型进入抽薹阶段时，DRE2的表达量开始明显呈下降趋势，而此时dre-D体内DRE2的表达量则开始明显上升。正是在这个阶段，dre-D与野生型开始呈现不同的表型。

此外分别通过荧光定量PCR的方法检测了dre-D体内T-DNA插入基因组位置前后共计10KB范围内的7个基因（分别为At1g65420、At1g65430、At1g65440、At1g65450、At1g65470、At1g65480、At1g65490），除DRE2（即At1g65450的转录本）之外，其余几个基因在dre-D体内的表达量均与野生型无明显差异。

基于上述步骤，发现一个来源于拟南芥的，具有未被报道的功能蛋白，将其命名为DRE2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1（MGSSYQESPP LLLEDLKVTI KESTLIFPSEETSERKSMFL SNVDQILNFD VQTVHFFRPN KEFPPEMVSE KLRKALVKLM DAYEFLAGRL RVDPSSGRLDVDCNGAGAGF VTAASDYTLE ELGDLVYPNP AFAQLVTSQL QSLPKDDQPL FVFQEERKKK SKVLSV）所示。将编码DRE2蛋白的基因命名为DRE2基因，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2（ACAAACTTCACTCAAAACCTAATTAACTTAGAGAGAAAGAGAGAGAGAGAAGGGTTGCAAAATGGGTTCTTCGTACCAAGAATCTCCACCGTTGCTTCTTGAAGATCTTAAGGTTACGATCAAAGAATCAACACTCATTTTCCCATCTGAAGAAACCAGCGAGAGAAAATCCATGTTCTTATCCAACGTCGACCAAATTCTCAACTTTGACGTTCAAACAGTTCATTTCTTCCGACCTAACAAGGAGTTTCCACCGGAGATGGTCTCGGAGAAGCTGAGAAAGGCGTTGGTGAAACTCATGGACGCTTATGAGTTCTTGGCCGGGAGACTCCGCGTGGATCCTAGCTCTGGACGGCTTGATGTTGACTGTAACGGTGCTGGAGCTGGCTTTGTGACGGCGGCGAGTGACTACACGTTGGAGGAACTTGGAGATTTGGTTTATCCAAATCCAGCTTTTGCTCAATTGGTTACAAGTCAGCTTCAGAGTTTGCCCAAAGATGATCAACCCTTGTTTGTCTTTCAGGAAGAAAGAAAAAAAAAATCAAAAGTTTTGAGTGTATAAACACAAAGAAGCTTCCTTAGAATCAAAAAAATTTCGAACATGTTCACAATAAATTTTGTGAACTTTTAGCTATTTTGCAACCTCGAGGGAGGGATCTCAAGGATCTAAGTACCATCATGATATTTATAGAAATCTAGTTTATATAGGTCATTAGTCGAGGACCATGTGGGTAAAATAGAATAAAAACTTGTTTCTTCTATAGAGTCCAAGTATTAATCGGAGTTTTGTGTGAGATCCTCCGTATTCAAAATATAAATGTTT）所示。

实施例2：抗逆性植物（DRE2基因超表达植物）的培育

为进一步确定该突变体的表型及功能，构建载体并通过转基因获得了DRE2基因超表达植物。

一、重组质粒的构建

1．提取拟南芥的总RNA并反转录为cDNA。

2．以步骤1得到的cDNA为模板，用DRE2F和DRE2R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

DRE2F:5’-GAATTCGAGAGAAGGGTTGCAAAATG-3’(SEQ ID NO:7)

DRE2R:5’-AGATCTGCTTCTTTGTGTGTATACACTC-3’(SEQ ID NO:8)

3．用限制性内切酶EcoRI和BglII双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4．用限制性内切酶EcoRI和BglII双酶切pCAMBIA1390载体，回收载体骨架。

5．将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA1390-DRE2。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA1390-DRE2进行结构描述如下：在pCAMBIA1390载体的EcoRI和BglII酶切位点之间插入了DRE2基因的编码序列的双链DNA分子。

二、DRE2基因超表达植物的获得

1．将所述重组质粒pCAMBIA1390-DRE2导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

2．培养野生型拟南芥植株，待主薹抽薹至10-15cm时，主薹进入花期，待主薹上形成1-2个以上的长角果，此时花蕾状态最好，可作为农杆菌转化的材料。在农杆菌转化前将长角果、已完全开放的花蕾、以及露白的花蕾剪去（露白的花蕾一般已经完成受精），留下幼嫩的花蕾作为转化的受体材料。

3．取步骤1得到的重组农杆菌，在YEP液体培养基中培养过夜，至OD600nm=0.8-1.0，重悬于转化介质中，至OD600为0.8左右。转化介质为1/2×MS大量；1×MS微量；1×MS铁盐；1×MS有机；5%蔗糖；MES(0.5 g/L)；6-BA(44 nM)；用1M的KOH调至pH 5.7。在刚刚调整好菌体重悬浓度的转化介质中，加入Sillwet-77至终浓度0.03%，混匀后倒入适宜大小的小烧杯中。随后立即将步骤2中整理好的拟南芥的花盆倒扣在烧杯上，并使整个花序浸入转化介质中，但莲座叶不要浸入。浸泡5min后，取出植株，将其侧卧在干净的托盘中，并用黑色塑料袋覆盖，避光恢复培养24h。弃去塑料袋，将拟南芥扶正，随后继续正常培养至种子成熟，收获的种子即为T₁代植株。

4．将种子播种在含有25-50mg/mL潮霉素抗性的MS培养基上，光照培养8-10天之后即可分辨出拟南芥的抗性苗。其主要特点是下胚轴较长，叶子为绿色，能长出两片正常的真叶；阴性苗的主要表现是子叶可正常长出，但真叶不能正常生长，胚根也极短即停止生长，同时有些阴性苗还没有正常萌发就已经停止生长。筛选出阳性植株，并移栽20-30株至土中培养，分别自交获得T₂代种子，单株收获种子，其再长成的植株即为T₂代植株的不同株系。

5、T₂代种子萌发后分别利用潮霉素抗性进行鉴定，选取抗性苗：不抗苗的比例为3:1的株系，进行幼苗的移栽及培养，即选取单拷贝的T₂代植株，进行后续纯合体的筛选、分析。

6、T₂代植株再分别单株收获种子，每个株系均选取适量单株种子进行萌发后的潮霉素抗性鉴定，全部为抗性苗的即为单拷贝纯合体转基因植株（又称DRE2基因超表达纯合株系，又称DRE2基因超表达体(OE)，在后续试验中简称为OE，可作为生理及功能试验的材料。

三、缺失突变体植株的获得

从拟南芥的突变体库中购买相关突变体并筛选到一个DRE2基因不表达的缺失突变株系：SAIL_342_B04。随后以dre-D、DRE2基因超表达纯合系（简称OE）、DRE2基因缺失突变体（简称Mutant）及野生型（WT）进行生理及功能试验。

四、DRE2基因超表达植株及突变体植株的表型鉴定

选取同样在设置温度为22℃，光周期为16h光照/8h黑暗的条件下，在植物光照培养箱中正常培养至培养至35d的DRE2基因超表达体（OE）、缺失突变体(Mumant)、dre-D以及野生型（WT）的不同株系拟南芥，观察其生长情况，结果如图5所示。结果显示，在相同的培养条件下，超表达体（OE）、dre-D植株相比野生型（WT）及缺失突变体（Mumant），均表现出一定程度的抽薹延迟的现象。

同时选取在相同培养条件下的拟南芥超表达体（OE）、dre-D以及野生型（WT）不同株系，分别在生长至15d幼苗时期和45d抽薹开花时期的两个不同时期，剪取相同部位的莲座叶，提取总RNA，并进行qPCR分析，结果分别如图6、图7所示。结果显示对处于营养生长阶段（15d左右）的拟南芥幼苗和抽薹开花之后处于生殖生长阶段的（45d左右）的植株，在幼苗阶段（15d左右），超表达株系与dre-D株系的拟南芥中，DRE2基因的表达量均比野生型株系明显增高；并且在抽薹开花之后（45d左右），超表达株系与dre-D株系中，DRE2基因的表达量与野生型相比差异更为明显。至此可以确定DRE2基因的过量表达会导致拟南芥植株出现一定程度的抽薹延迟。

实施例3：不同植株抗旱性的分析

选取相同培养条件下，20d大小且生长状态基本一致的不同类型拟南芥植株，进行干旱胁迫10d左右，不同株系拟南芥生长状态如图8所示，其中每列三盆为同一株系。结果可见，在一定程度的干旱处理下，不同植株对干旱的耐受能力不同。经干旱胁迫处理之后，超表达体（OE）和dre-D株系的生长状态比WT、Mumant的生长状态更好，结果显示过量表达DRE2可在一定程度上提高拟南芥植株的抗旱能力。

实施例4：DRE2基因对植物木质素合成及积累的影响

一、木质素分布情况的差异分析

在相同培养条件下，选取50d左右大小生长状态基本一致的不同拟南芥材料，分为对照和干旱两组，对照组依旧正常培养，干旱组在胁迫条件下处理10-15d。干旱组的处理方法为，待花盆内的营养土干透24-48h之后，适当浇少量水并每天三次观察植株状态，保持植株基本正常的状态，避免其因过于缺水而叶片全部萎蔫甚至死亡。随后再待其盆土干透24-48h后，适当少量浇水。整个干旱处理过程，视植株的状态进行10-15d。除此之外，温度、光照等培养条件与对照组完全一致。干旱处理过程结束之后，与对照组一同取材。取材时每株植株从主薹基部向上剪取4cm的茎，分别进行固定、包埋及石蜡切片及间苯三酚染色。观察结果如图9、图10所示。

由图9可知，对比不同株系拟南芥茎的石蜡横切片图，分析不同材料茎的木质化程度的差异，结果显示DRE2过表达体OE以及dre-D的茎较WT与Mumant略粗。具体来看，几种材料茎的皮层厚度差异不明显；维管束的木质部、韧皮纤维以及维管束间显微等细胞壁加厚的区域，即木质素主要积累的区域，OE及dre-D较WT和Mutant略有增加，但细胞大小及细胞壁厚度的差异不明显。

由图10的结果可知，不同株系拟南芥在经过一定程度的干旱胁迫之后，整体上看，茎的维管束数量较对照组的数量均有增加，并且木质化部位的间苯三酚着色加深，这表明在干旱胁迫之后，植株木质素的合成与积累量有明显的增加。此外，经一定程度的干旱胁迫处理，OE及dre-D的茎与WT、Mumant茎的粗度的差异更为明显。具体来看，几种材料茎的皮层及木质化部位次生细胞壁厚度的差异均不明显，OE和dre-D茎的直径较粗的原因主要是髓部的细胞增多。此外OE及dre-D维管束间纤维的数目增加更多，这表明过量表达DRE2基因，参与并促进了维管束的形成或木质素的积累。

二、干旱胁迫前后不同株系拟南芥木质素含量变化

具体取材方法同上述，但取材时每株植株从主薹基部向上剪取10cm的茎，分别进行木质素的提取和含量检测。测定结果如图11所示。

结果可见，dre-D与OE的茎的木质素相对含量均比WT、Mumant的木质素含量有一定程度的增加，表明DRE2参与了木质素合成相关途径的调控，其过量表达会提高植株茎中的木质素的含量，这可能是dre-D与OE较WT、Mumant更为耐受干旱胁迫的原因之一。图11显示，不同拟南芥植株在干旱胁迫之后木质素的含量均有所上升，但WT与Mumant株系中木质素的增加程度要高于OE与dre-D株系。由以上结果可见，过量表达的DRE2基因参与并促进了拟南芥木质素的合成与积累，并且增强了植株对干旱胁迫环境的耐受度。

三、调控木质素合成相关基因表达量qPCR分析

为了进一步明确DRE2基因在植株木质素合成与修饰，以及抵御干旱等逆境胁迫反应途径中的调控作用，设计实验，分别对干旱胁迫处理组与对照组的拟南芥木质素苯丙酸合成途径中的两个关键酶C4H、PAL1的表达量进行检测。

具体处理及取材方法为：在相同培养条件下，选取45d左右大小生长状态基本一致的不同拟南芥材料，分为对照和干旱两组，对照组依旧正常培养，干旱组在胁迫条件下处理7-10d。干旱组的处理方法为，待花盆内的营养土干透24-36h之后，适当浇少量水并每天三次观察植株状态，保持植株基本正常的状态，避免其因过于缺水而叶片萎蔫甚至死亡。随后再待其盆土干透24-36h后，适当少量浇水。整个干旱胁迫处理过程，视植株的状态进行7-10d。除此之外，温度、光照等培养条件与对照组保持完全一致。干旱处理过程结束之后，与对照组一同取材。取材时每株植株剪取适量状态正常的成熟叶片，分别进行RNA的提取及qPCR分析，结果如图12-13所示。

通过对木质素合成修饰途径中的C4H、PAL1两个关键酶基因的相对表达量的分析，结果可得，在过量表达DRE2之后，C4H与PAL1基因的表达量，在OE、dre-D株系中均较另外两者出现不同程度的下调。结合木质素含量测定、表型分析以及石蜡切片结果，在DRE2基因过量表达的OE、dre-D株系中，并没有出现较WT和Mutant木质素含量下调，反而木质素的含量略有上升，说明DRE2基因确实参与了木质素合成相关途径的调控，具有促进拟南芥木质素的合成与积累的作用。结合图12-13的结果，在干旱胁迫组中各类型拟南芥植株，木质素合成相关的基因C4H与PAL1的相对表达量均较对照组有明显的的上生，但干旱胁迫导致WT与Mumant体内C4H与PAL1相对表达量较对照组的上升程度，要明显高于OE与dre-D的上升程度。综合干旱组与对照组，各植物材料的木质素的相对含量及变化程度的差异，可知DRE确实参与了木质素合成途径的调控，其过量表达可提高植物对干旱环境的耐受度，从而导致木质素合成途径中的一些基因对干旱胁迫的敏感度下降。

实施例6 DRE2基因对植物花青素合成及积累的影响

一、不同株系拟南芥花青素及低温胁迫前后的含量变化

选取40-45d左右生长状态基本一致的不同拟南芥株系，分为对照组和低温胁迫组，对照组继续正常培养，低温胁迫组持续4度低温处理5-7d后，分别取相同部位的莲座叶进行花青素含量的测定，结果如图14。

可见，未经低温胁迫的对照组中，与野生型株系和Mumant相比，DRE2超表达体OE与dre-D株系的花青素含量有一定程度的升高，表明过表达DRE2参与并促进了花青素的合成与积累。在低温胁迫组中，不同株系拟南芥的花青素含量均有一定程度的上升，并且WT与Mumant株系的花青素的增长量明显高于OE与dre-D株系的花青素增长量，说明DRE2基因产物也参与了植物应对逆境胁迫的反应，使得DRE2基因超表达体对于低温胁迫环境的敏感度下降。

二、调控花青素合成相关基因表达量qPCR分析

选取40-45d左右生长状态基本一致的不同拟南芥株系，分为对照组和低温胁迫组，低温胁迫组持续4度5-7d后，对低温胁迫前后不同拟南芥株系花青素合成相关的关键酶基因DFR、UF3GT进行qPCR分析，结果如图15-16所示。

结果显示，未经低温胁迫处理时，与WT相比，过量表达DRE2基因会使DFR、UF3GT基因在OE和dre-D株系中发生不同程度的上调，而在Mumant中则DFR、UF3GT基因的相对表达量较野生型下降，结合不同植株花青素含量的测定，可知DRE2基因确实参与了调节花青素的合成途径，从而影响了花青素的含量，并对DFR、UF3GT基因的表达也产生了影响。

此外，各类拟南芥植株在低温胁迫的条件下，与花青素合成直接相关的合成酶基因DFR、UF3GT的表达量与对照组相比均发生明显升高，但是OE与dre-D植株中DFR、UF3GT基因的增长程度与WT、Mumant相比升高较少。结合低温胁迫组与对照组不同植株花青素含量的测定，可以推断，DRE2基因参与了拟南芥花青素的合成途径，以及应对低温胁迫的信号调控网络，其过量表达可增强拟南芥植株的耐寒度，从而使花青素合成途径的一些关键基因对低温环境刺激的敏感度下降。

总之，通过对低温胁迫处理组及对照组的不同拟南芥植株花青素的含量测定，以及对花青素合成途径中关键酶基因DFR、UF3GT进行qPCR分析，结果显示，DRE2基因参与了次生代谢产物花青素的合成与代谢，其过量表达增加了植株花青素的积累量，也在一定程度上抵御了来自外界低温环境给植株带来的刺激和损伤，使得拟南芥花青素合成途径的一些关键基因在低温胁迫条件下的敏感度有所降低，这也是拟南芥抗逆性增强的一种表现。

综上，本发明的拟南芥dre-D突变体中发现的DRE2基因的植物具有抗逆性，并通过实验发现DRE2蛋白参与调节拟南芥木质素、花青素等次生代谢物合成的相关途径，影响了木质素和花青素的含量及其稳态调节，并在植物生长发育及逆境反应的信号通路中具有重要作用，将为探究高等植物抵抗逆境胁迫的机制提供新的研究思路；为At1g65450基因的作用的研究和探索提供了新的思路。

本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

序列表

<110> 河北科技大学

<120> 一种抗逆性植物相关蛋白及其编码基因和应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SEQ ID NO:1

<400> 1

Met Gly Ser Ser Tyr Gln Glu Ser Pro Pro Leu Leu Leu Glu Asp Leu

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Lys Glu Ser Thr Leu Ile Phe Pro Ser Glu Glu Thr

20 25 30

Ser Glu Arg Lys Ser Met Phe Leu Ser Asn Val Asp Gln Ile Leu Asn

35 40 45

Phe Asp Val Gln Thr Val His Phe Phe Arg Pro Asn Lys Glu Phe Pro

50 55 60

Pro Glu Met Val Ser Glu Lys Leu Arg Lys Ala Leu Val Lys Leu Met

65 70 75 80

Asp Ala Tyr Glu Phe Leu Ala Gly Arg Leu Arg Val Asp Pro Ser Ser

85 90 95

Gly Arg Leu Asp Val Asp Cys Asn Gly Ala Gly Ala Gly Phe Val Thr

100 105 110

Ala Ala Ser Asp Tyr Thr Leu Glu Glu Leu Gly Asp Leu Val Tyr Pro

115 120 125

Asn Pro Ala Phe Ala Gln Leu Val Thr Ser Gln Leu Gln Ser Leu Pro

130 135 140

Lys Asp Asp Gln Pro Leu Phe Val Phe Gln Glu Glu Arg Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Lys Val Leu Ser Val

165

<210> 2

<211> 823

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SEQ ID NO:2

<400> 2

acaaacttca ctcaaaacct aattaactta gagagaaaga gagagagaga agggttgcaa 60

aatgggttct tcgtaccaag aatctccacc gttgcttctt gaagatctta aggttacgat 120

caaagaatca acactcattt tcccatctga agaaaccagc gagagaaaat ccatgttctt 180

atccaacgtc gaccaaattc tcaactttga cgttcaaaca gttcatttct tccgacctaa 240

caaggagttt ccaccggaga tggtctcgga gaagctgaga aaggcgttgg tgaaactcat 300

ggacgcttat gagttcttgg ccgggagact ccgcgtggat cctagctctg gacggcttga 360

tgttgactgt aacggtgctg gagctggctt tgtgacggcg gcgagtgact acacgttgga 420

ggaacttgga gatttggttt atccaaatcc agcttttgct caattggtta caagtcagct 480

tcagagtttg cccaaagatg atcaaccctt gtttgtcttt caggaagaaa gaaaaaaaaa 540

atcaaaagtt ttgagtgtat aaacacaaag aagcttcctt agaatcaaaa aaatttcgaa 600

catgttcaca ataaattttg tgaactttta gctattttgc aacctcgagg gagggatctc 660

aaggatctaa gtaccatcat gatatttata gaaatctagt ttatataggt cattagtcga 720

ggaccatgtg ggtaaaatag aataaaaact tgtttcttct atagagtcca agtattaatc 780

ggagttttgt gtgagatcct ccgtattcaa aatataaatg ttt 823

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SEQ ID NO:3

<400> 3

cttcagagtt tgcccaaaga tg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SEQ ID NO:4

<400> 4

ggtacttaga tccttgagat ccc 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SEQ ID NO:5

<400> 5

gaccgctctt atcaaaggac c 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SEQ ID NO:6

<400> 6

acacagactg aagcgtccaa gc 22

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SEQ ID NO:7

<400> 7

gaattcgaga gaagggttgc aaaatg 26

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SEQ I D NO:8

<400> 8

agatctgctt ctttgtgtgt atacactc 28

Claims

1.一种抗逆性植物相关蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或其同源序列；所述同源序列与原序列的同源性为95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1%或以上、99.2%或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、或99.9%或以上。

2.根据权利要求1所述的抗逆性植物相关蛋白，其特征在于，所述抗逆性植物为抗旱和/或耐冷相关植物。

3.根据权利要求1或2所述的抗逆性植物相关蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或其同源序列；所述同源序列与原序列的同源性为95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1%或以上、99.2%或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、或99.9%或以上。

5.根据权利要求3或4所述的基因在用于培育抗逆性植物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗逆性植物为抗旱和/或耐冷相关植物。

7.一种抗逆性植物的培育方法，包括将含有抗逆性植物相关蛋白的编码基因的重组表达载体导入植物细胞，得到抗逆性植物，所述抗逆性植物相关蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示或其同源序列；所述同源序列与原序列的同源性为95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1%或以上、99.2%或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、或99.9%或以上。

8.根据权利要求7所述的抗逆性植物的培育方法，其特征在于，所述方法包括将抗逆性植物相关蛋白的编码基因转入载体中，得到重组载体，再将所述重组载体导入农杆菌中，得到重组农杆菌，再将其导入植物细胞，得到抗逆性植物。

9.根据权利要求7或8所述的抗逆性植物的培育方法，其特征在于，所述抗逆性植物相关蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或其同源序列；所述同源序列与原序列的同源性为95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1%或以上、99.2%或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、或99.9%或以上。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的抗逆性植物的培育方法，其特征在于，所述抗逆性植物为抗旱和/或耐冷相关植物。