CN101696443A - 一种pcr扩增中减少蒸发与非特异性反应的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PCR扩增反应中可减少非特异性扩增和大幅度减少蒸发的方法和装置，该方法对试管在PCR反应的全过程电控跟踪热盖升降，在低温退火时将热盖升起，在高温变性和中温延伸时将热盖下降并在热盖上施加一定的压力，以减少非特异性扩增，并在试管顶部与热盖接触区域装填充有DBE液体的液体压垫，以大幅度减少蒸发。装置主要包括热盖控制电机、丝杠螺杆传动机构、导向螺杆、固定盖、绝热垫、电阻加热板、压力传感器、压盖、液体压垫以及电控部分，热盖通过电动控制升降来完成对于试管顶部的压力施加和释放，可大幅度减少非特异性扩增和减少蒸发量。从而提高扩增效率和检测的精确度。

Description

一种PCR扩增中减少蒸发与非特异性反应的方法和装置

技术领域

本发明涉及PCR反应控制的方法和装置，尤其是PCR反应控制系统中减少蒸发和非特异性反应的方法和实现该方法的装置。

背景技术

PCR技术又称聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)技术，是一种在体外扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环N次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到2^N拷贝。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。

目前主流的PCR反应控制系统中，热盖系统的升降部分一般采用手动螺杆螺母进行调节，在试管集中于一侧的情况下，容易压偏，而且手动所施加的压力无法保证，从而导致较大的蒸发；采用电动升降的一般采用涡轮蜗杆机构，尺寸大，而且在压力较大时亦存在压偏的问题。而且由于无论手动或电动，在试管接触时均采用硬接触(金属材料)，由于试管尺寸不同，试管盖的形式不同(包括圆盖和平盖)，从而导致与试管接触部分较小(圆盖情况下尤其如此)，试管顶部的温度无法均匀，从而导致较大的蒸发，常规方式如附图2(a)所示，其中标号1为热盖与试管接触部分，2为试管。

同时，目前主流的PCR反应控制系统，无论手动或电动，均在PCR反应前热盖即开始升温加压，而且在PCR反应过程中，热盖一直加压、保温，由于试管顶部的热传导导致PCR反应的非特异性，为后级分析带来误差，甚至产生错误的检测分析结果。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的是，提供一种能大幅度减少蒸发和降低PCR反应非特异性的方法和装置。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种PCR扩增中减少蒸发与非特异性反应的方法，其特征在于，该方法对试管在PCR反应的全过程采用电控跟踪热盖升降，在低温退火时将热盖升起，在高温变性和中温延伸时将热盖下降并在热盖上施加一定的压力，以减少非特异性扩增，并在试管顶部与热盖接触区域装填充有DBE液体的液体压垫，以大幅度减少蒸发。

PCR反应前，热盖运动到试管的顶部位置，从而避免此时热盖对于试管的热传递导致PCR的非特异性反应，在PCR开始后热盖才开始下降并施加所加的压力。

实现上述PCR扩增中减少蒸发与非特异性反应方法的装置，其特征在于，该装置包括由电控板控制的电机，电机连接有丝杆，丝杆与丝杆配套螺母连接，丝杆配套螺母设置在与固定盖连接在一起的导向螺杆上，导向螺杆上安装有加压弹簧，固定盖通过绝热垫和电阻加热板和压盖连接，压盖上还设有液体压垫，所述的固定盖和压盖之间设有压力传感器，压力传感器与电控板连接。

本发明采用电控热盖跟踪试管的PCR反应过程，减少非特异性扩增，并通过与试管顶部接触区域安装填充DBE液体的液体压垫，能够大幅度减少蒸发，与试管接触区域通过液体压垫可提高温度均匀性到0.5℃以内，并通过液体压垫所产生的包裹作用大幅度减少蒸发，比常规仪器能减少蒸发量的80％以上，从而提高扩增效率和后级检测的精确度。

附图说明

图1是PCR扩增中减少蒸发与非特异性反应方法的装置示意图；

图2是本发明与常规热盖与试管顶部接触比较示意图；其中，图(a)为常规接触方式，图(b)为本发明接触方式；

图3是PCR过程控制流程图。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明

具体实施方式

按照本发明的技术方案，本发明给出了一种PCR扩增中减少蒸发与非特异性反应的方法，该方法对试管在PCR反应的全过程采用电控跟踪热盖升降，在低温退火时热盖升起，在高温变性和中温延伸时热盖下降并施加用户所定义的压力。

以下给出一种实现上述方法的PCR扩增中减少蒸发与非特异性反应装置的实施例，本发明不限于该实施例。

参照图1，PCR扩增中减少蒸发与非特异性反应装置包括由电控板12控制的电机1、电机1连接有丝杆2，丝杆2与丝杆配套螺母3连接，丝杆配套螺母3设置在与固定盖6连接在一起的导向螺杆4上，导向螺杆4上安装有加压弹簧5，固定盖6通过绝热垫7和电阻加热板8和压盖9连接，压盖9上还设有液体压垫10，所述的固定盖6和压盖9之间设有压力传感器11，压力传感器11与电控板12连接。

其中丝杆2和丝杆配套螺母3组成丝杠螺母直线运动机构，在升降电机1的控制下将旋转运动转变为丝杆配套螺母3的直线升降运动，通过导向螺杆4保障施加垂直的压力，不会因为试管排放位置的不同而造成压偏，通过加压弹簧5，丝杆配套螺母3将直线运动压力传输到固定盖6，导致固定盖6的升降，电阻加热板8通过绝热垫7防止热量向上传递，并固定到压盖9上，压盖9通过液体压垫10将压力传递到试管顶部，压力传感器11的信号通过信号线传输到电控板12，同时电机1也通过电源驱动线连接到电控板12，电控板12根据压力传感器11的反馈进行电机旋转的控制。

导向螺杆4为2-4个，保障压力垂直，防止压偏。

压力传感器11可以根据需要选择。

压盖9下粘结液体压垫10，可提高温度均匀性，并通过液体压垫所产生的包裹作用大幅度减少蒸发，试验结果表明，比常规仪器能减少蒸发量的80％以上。

在PCR反应过程中，动态的热盖压力和位置控制可降低PCR的非特异性反应，反应过程的控制见图3，图3是以一般PCR扩增试验流程为例，表示了热盖控制与PCR过程的互动控制。具体过程是：

(1)开机；

(2)热盖首先被提升至试管顶部；

(3)由用户进行PCR反应参数的配置；

(4)热盖温度压力及控制方式配置；然后

(5)热盖根据用户配置加热到预定温度；

(6)用户确认PCR反应开始；在PCR反应开始后，热盖开始加压，并根据压力传感器的反馈施加用户定义的压力(1-10kg)。

(7)此时热盖下降，并加压达到预定压力；然后

(8)进行PCR的常规反应前处理，如酶热启动；

(9)然后经历高温变性，此时热盖保持恒压；

(10)低温退火，此时热盖上升，泄压；

(11)中温延伸的过程，在此过程中，热盖保持恒压；

(12)循环数的判断，如果循环数达到要求，PCR反应结束，如果未达到循环数，则返回到步骤(9)。

根据用户的配置，可在步骤(9)和步骤(11)的阶段将热盖均匀加压，而在低温退火(10)的过程中，热盖释放压力，并根据压力传感器的反馈施加用户定义的压力(1-10kg)。具体是否释放用户可以合理配置，在PCR达到设定的循环数后，PCR反应结束。

为了防止试管放到一侧时可能出现压偏的情况，本实施例通过2-4个导向螺杆4的均匀设置，保障压力垂直，防止试管压偏。

上述图3仅为一般的PCR过程控制的举例，在具体的PCR反应过程中，热盖的位置和压力都是可以用户配置的。

在压盖9下表面粘结液体压垫10，可提高温度均匀性，并通过液体压垫10所产生的包裹作用大幅度减少蒸发，该液体压垫填充的液体为环保型高沸点溶剂MDBETM(MIXED DIBASIC ESTERS)，亦称DBE，是一种能生物降解的液体。

本发明与常规方式的对比见附图2，其中(b)为本发明的加压接触部分，其中(1)为压盖，(2)为液体压垫，(3)为试管。

本发明所述的PCR扩增电控热盖，在PCR反应前，使热盖运动到顶部位置，从而避免此时对于试管的热传递导致PCR的非特异性反应，在热盖升到设定温度和PCR反应开始后才开始下降并施加所定义的压力。

综上所述，本发明带来的有益效果在于：

(1)在压盖下粘结液体压垫，可提高温度均匀性，并通过液体压垫所产生的包裹作用大幅度减少蒸发，比常规仪器能减少蒸发量的80％以上。该液体压垫填充的液体为环保型高沸点溶剂MDBETM，无毒、无味、沸点高，属于环保材料。

(2)通过本发明特定的电控热盖升降控制方法，跟踪PCR反应过程进行升降，在低温退火时热盖升起，在高温变性和中温延伸时热盖下降并施加用户所定义的压力，从而降低了PCR的非特异性反应。

(3)蒸发量的大幅度减少和非特异性反应的降低保障了PCR扩增反应的准确性和效率，为PCR反应检测精度的提高奠定了基础。

Claims (6)

1.一种PCR扩增中减少蒸发与非特异性反应的方法，其特征在于，该方法对试管在PCR反应的全过程电控跟踪热盖升降，在低温退火时将热盖升起，在高温变性和中温延伸时将热盖下降并在热盖上施加一定的压力，以减少非特异性扩增，并在试管顶部与热盖接触区域装填充有DBE液体的液体压垫，以大幅度减少蒸发。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应前，热盖运动到试管的顶部位置，从而避免此时热盖对于试管的热传递导致PCR的非特异性反应，在PCR开始后热盖才开始下降并施加所加的压力。

3.实现权利要求1所述的PCR扩增中减少蒸发与非特异性反应方法的装置，其特征在于，该装置包括由电控板(12)控制的电机(1)，电机(1)连接有丝杆(2)，丝杆(2)与丝杆配套螺母(3)连接，丝杆配套螺母(3)设置在与固定盖(6)连接在一起的导向螺杆(4)上，导向螺杆(4)上安装有加压弹簧(5)，固定盖(6)通过绝热垫(7)和电阻加热板(8)和压盖(9)连接，压盖(9)上还设有液体压垫(10)，所述的固定盖(6)和压盖(9)之间设有压力传感器(11)，压力传感器(11)与电控板(12)连接。

4.如权利要求3所述的装置，其特征在于，所述的液体压垫(10)内填充有DBE液体。

5.如权利要求3所述的装置，其特征在于，所述的液体压垫(10)粘结在压盖(9)的下表面。

6.如权利要求3所述的装置，其特征在于，所述的导向螺杆(4)为2-4个。

Images