CN101691572A - 苏云金芽胞杆菌的增效蛋白基因bell及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物基因工程技术领域。公开了一种来自于苏云金芽胞杆菌的增效蛋白基因bel1的分离、克隆及增效蛋白Bel1在生物杀虫剂中的应用。从苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT-1520菌株中分离得到一个新的增效蛋白基因bel1，该基因编码产物为一种新的增效蛋白Bel1；该蛋白对鳞翅目昆虫的杀虫晶体蛋白Cry1Ac具有很强的杀虫增效活性；本发明制备的重组蛋白的杀虫活性是出发菌株杀虫蛋白活性的5.7倍。本发明还包括重组苏云金芽胞杆菌增效蛋白bel1基因工程菌的制备，该工程菌已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M208245。

Description

苏云金芽胞杆菌的增效蛋白基因bel1及应用
技术领域
本发明属农业微生物学应用技术领域。具体涉及一种苏云金芽胞杆菌增效蛋白基因的分离、克隆以及它的编码的蛋白在微生物杀虫剂中的应用，本发明还涉及基因工程菌的制备。与微生物基因工程和生物农药技术领域有关。
涉及本发明的生物材料样品即苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)BMB0187保藏在中国典型培养物保藏中心(英文简称：CCTCC)；保藏单位地址：中国湖北省武汉市武汉大学内；保藏编号：CCTCCNO：M208245；分类命名：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)BMB0187。
背景技术
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在于各种生态环境中的革兰氏阳性杆状细菌。该物种最大的特点就是在其生长周期中能形成内生芽胞的休眠体，并且在其芽胞形成的同时能产生对许多昆虫具有特异毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)组成的伴胞晶体。这些杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf H E，Crickmore N，Rie J V，Lereclus D，BaumJ，Feitelson J，Zeigler D R，Dean D H.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.MicrobiolMol Biol Rev，62：775-806)。由于苏云金芽胞杆菌对多种昆虫都有很高的杀虫活性，而且具有对环境和人蓄无损害等优点，因此被广泛地应用于生物农药的开发。目前，基于苏云金芽胞杆菌开发的生物杀虫剂已经成为最成功的一种生物农药，占到了整个生物农药行业90％以上的市场，广泛地应用于农业、林业和仓储等害虫的防治。同时人们也不断将苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因转入植物中，构建转基因植物，用于农业害虫的防治。
苏云金芽胞杆菌杀虫剂最初都是使用筛选的野生型菌株进行生产。尽管苏云金芽胞杆菌有诸多优点，但是在田间应用时也存在防效不稳定、残效期短、杀虫速度慢、对某些目标害虫不敏感等问题。随着分子生物学的发展，人们逐渐利用基因工程的手段对野生型菌株进行遗传改造，来提高原有菌株的杀虫活性，延长其残效期等。然而，随着苏云金芽胞杆菌杀虫剂应用的不断推广和使用强度的不断增强，目标害虫的抗性现象也不断被科学家所发现。这些因素严重制约了苏云金芽胞杆菌杀虫剂产品的应用和推广，威胁着整个行业的快速发展。解决这一问题的有效途之一就是寻找新的杀虫增效因子，用以显著提高原有菌株的杀虫活性，并延缓或克服昆虫对其产生的抗性。
近年来，寻找新的杀虫增效因子一直是苏云金芽胞杆菌应用研究领域中最为活跃的部分之一。Hilder等利用丝氨酸蛋白酶抑制剂使苏云金芽胞杆菌产生的杀虫晶体蛋白的杀虫活性提高20倍以上(Hilder VA，Gatehouse AMR，Sheerman SE，Barrer RF，Boulter D.1987.A novel 4 mechanism of insect resistanceengineered into tobacco.Nature 330：160-163.)；Regev等发现几丁质酶(chitinase)可以通过降解昆虫围食膜的几丁质层而大幅提高Bt杀虫晶体蛋白的杀虫活性(Regev A，Keller M，Strizhov N.1996.Synergisticactivity of a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin and a bacterial endochitinase against Spodoptera littoralislarvae.Appl Environ Microbiol 62：3581-3586.)。此后，越来越多的协同增效因子被发现，如双效菌素ZwittermicinA，伴侣蛋白P20，溶细菌毒素Cyt，钙粘蛋白片段CR12-MPED等(Pardo-L′opezL，Mu~noz-GarayC，Porta H，Rodr′1gguez-Almaz′an C，Sober′on M，Bravo A.2008.Strategies to improve the insecticidal activity ofCry toxins from Bacillus thuringiensis.Peptides.In press)。这些研究结果提供许多策略去提高苏云金芽胞杆菌菌株的杀虫活性，或者能够很好地延缓或克服昆虫对其产生的抗性，然而对于苏云金芽胞杆菌杀虫剂产业和基于Bt的转基因植物领域的应用还有相当的距离。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从苏云金芽胞杆菌中分离并克隆一种新型的增效蛋白基因，证实了该增效蛋白Bel1具有提高杀虫晶体蛋白杀虫活性的功能，并揭示该增效蛋白(基因)在农业杀虫微生物和转基因微生物或转基因植物中的应用前景。本发明还涉及苏云金芽胞杆菌基因工程菌的制备及应用。
本发明是这样实现的：
申请人从拥有自主知识产权的苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki，serotype H3ab)YBT-1520(本申请人自己的授权发明专利，中国发明专利号：ZL 95106749.40)菌株中分离得到一个新的增效蛋白基因，申请人将这个基因命名为bel1。经过测序发现该增效蛋白基因bel1的编码区由2202个碱基组成，它具有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。序列分析发现本发明的bel1基因编码的增效蛋白Bel1是由734个氨基酸残基组成，其具有如序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，分子量大小约为85kDa。通过原核超量表达和室内生物测定证实本发明的基因bel1在微生物中表达的Bel1蛋白，能够显著提高杀鳞翅目昆虫的杀虫晶体蛋白Cry1Ac的杀虫活性。申请人通过构建含有增效蛋白Bel1的苏云金芽胞杆菌基因工程菌，揭示了该蛋白在农业害虫棉铃虫的防治方面的具有很好的应用价值。
本发明提供的上述基因序列是一种新的增效蛋白基因，该基因可以应用于转化微生物和植物，使之表达出增效蛋白Bel1，使受体生物表现出该蛋白具有的显著提高杀虫晶体蛋白杀虫活性的特性，可用于克服或延缓害虫对微生物杀虫剂的抗药性问题，在农业害虫的生物防治方面具有广泛的应用价值。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》的描述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明分离和克隆的苏云金芽胞杆菌增效蛋白基因的核苷酸序列及编码序列；
图1：是本发明实施例构建的克隆载体pUC19-bel1的构建图；
图2：是本发明实施例中超量表达载体pEMB0184的构建图；
图3：是本发明克隆的增效蛋白基因bel1的原核超量表达与纯化的SDS-PAGE电泳分析；
M：蛋白质分子量标准；
1：BL21/pGEX-6p-1菌株未诱导对照的菌体总蛋白；
2：BL21/pGEX-6p-1菌株1.0mmol/L的IPTG诱导3h的菌体总蛋白；
3：BL21/pEMB0184菌株未诱导的菌体总蛋白；
4：BL21/pEMB0184菌株1.0mmol/L的IPTG诱导3h的菌体总蛋白；
5：从BL21/pEMB0184诱导培养物中亲和层析纯化的GST-bel1蛋白；
6：从BL21/pGEX-6p-1诱导培养物中亲和层析纯化的GST蛋白。
图4：是本发明实施例中增效蛋白Bel1与杀虫晶体蛋白不同浓度配比生物测定结果分析之一；
图5：是本发明实施例中增效蛋白Bel1与杀虫晶体蛋白不同浓度配比生物测定结果分析之二；
图6：含有增效蛋白基因bel1穿梭表达载体pBMB0186的构建路线图；
图7：增效蛋白Bel1和杀虫晶体蛋白Cry1Ac10共表达载体pBMB0187的构建图；
图8：增效蛋白基因bel1在苏云金芽胞杆菌BMB171中表达的SDS-PAGE电泳分析。
M：蛋白质分子量标准；
1：BMB171菌株36h培养物的菌体总蛋白；
2：BMB0187菌株36h培养物的菌体总蛋白。
具体实施方案
以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均参考《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，北京，科学出版社，2002年)。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
实施例1苏云金芽胞杆菌YBT-1520中增效蛋白基因bel1的克隆
本发明以苏云金芽胞杆菌YBT-1520(本申请人自己的授权发明专利，中国发明专利号：ZL95106749.40)作为增效蛋白基因bel1的来源菌株，同时可参考文献：孙明，刘子铎，喻子牛.2000.苏云金芽胞杆菌YBT-1520杀虫晶体蛋白基因的属性.微生物学报40：365-371。该菌株血清型为H3ab，能形成典型的菱形晶体，主要的晶体蛋白成分的分子量约为130千道尔顿(kDa)，对鳞翅目昆虫棉铃虫和小菜蛾等具有特异的高毒性。目前，该菌株的全基因组序列已经由申请人所在课题组测序完成，但没有登录。
1.苏云金芽胞杆菌YBT-1520总DNA的抽提
将苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株用接种环通过无菌操作方法接种于5mL的常用LB液体培养基中(配方：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，pH 7.0-7.2)，置于30℃、200rpm的摇床中培养过夜；然后通过无菌操作将50μL的YBT-1520培养物转移至5mL的新鲜LB液体培养基中，同样条件下培养至对数生长期；然后于5000rpm，3min离心收集菌体，用STE缓冲液(配方：10mM Tris-HCl，pH＝8.0，50mM NaCl，1mM乙二胺四乙酸(EDTA))1mL洗涤一次，加100μL溶液I(配方：50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)和10μL溶菌酶(50mg/mL)，37℃作用30min以上；加入200μL2％十二烷基磺酸钠(SDS)于50℃-60℃水浴30min；加入200μL 5mol/L NaCl混和，加入500μL苯酚/氯仿/异戊醇(按体积比：25∶24∶1)，离心12000rpm，5min，吸取上清液，重复抽提1-2次；将上层DNA溶液转移至1.5ml离心管，加入等体积95％乙醇，室温静置5min后离心12000rpm，5min，取沉淀用200μL 70％乙醇洗涤一次，冷冻抽干后溶于50μLTE溶液中。
2.PCR扩增获得bel1基因的DNA片段
根据YBT-1520的全基因组中的序列信息，设计了一对特异性引物用来扩增目标基因bel1(引物序列为：上游belP1：5’-GCCGGATCCATGTATACAATGTTTTTCCTC-3’，下游belP2：5’-GGCGAATTCTTATTCATTATATAAGCTATC-3’)。以事先准备好的苏云金芽胞杆菌的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应的体系和程序如下：
25μL反应体系包含：2.5μL 10×PCR反应缓冲液，1μL dNTP(各2.5mM)，0.5μL特异性上游引物P1(20mM)，0.5μL特异性下游引物P2(20mM)，0.2μL模板(上述YBT-1520的总DNA)，0.25μL ExTaq酶，加灭菌去离子水至25μL。PCR反应参数和程序为：94℃，5min，1个循环；94℃，1min，52℃，1min，72℃，2.5min，30个循环；72℃，10min，1个循环。
3.bel1基因的序列测定和序列分析
PCR产物通过PCR产物回收试剂盒(购自Omega生物技术公司)纯化回收后通过T/A克隆连接到T载体pMD19-T上(购自TaKaRa生物技术公司)，得到含有bel1全长基因的重组质粒pUC19-bel1(见图1)，之后将该重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α，并涂布氨苄青霉素抗性平板(Ampr，终浓度为100ug/ml)。将抗性平板置于37℃培养箱中培养12h-16h，待转化子长到一定大小以后，以belP1和belP2为引物，以转化子的菌落菌体为模板，通过PCR扩增对转化子进行筛选。将筛选到的阳性转化子用5ml的液体LB培养基活化培养，然后取1ml的过夜培养物送样测序(由Invitrogen公司完成)。测序结果具有如序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，申请人将该基因命名为bel1基因(基因命名以斜体小写表示)。通过软件分析预测此段编码序列可编码一个由734个氨基酸组成的蛋白质，预测其分子量为85kDa，申请人将其命名为增效蛋白Bel1(蛋白命名以正体大写表示)。
实施例2苏云金芽胞杆菌增效蛋白Bel1的超量表达，纯化和增效活性
1.苏云金芽胞杆菌增效蛋白Bel1原核超量表达载体的构建
将实施例1中获得的含有bel1全长基因的重组质粒pUC19-bel1经BamHI和EcoRI双酶切，同时将表达载体pGEX-6p-1进行相同的双酶切。上述载体和外源的酶切产物通过0.8％的琼脂糖凝胶分离后，切下目标片段并通过DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega生物技术公司)纯化回收。之后将两者通过T4连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，即TaKaRa)连接，从而获得了含有bel1全长ORF的重组表达质粒pEMB0184(见图2)。将该重组表达质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α(购自Tiangen公司)，并抽提质粒分别进行BamHI和EcoRI双酶切验证，酶切片段大小与预期大小一致，进一步的测序结果表明bel1全长ORF片段被正确地插入了到了表达载体pGEX-6p-1中。
2.苏云金芽胞杆菌增效蛋白Bel1原核超量表达，纯化与定量分析
为了得到大量的增效蛋白Bel1，申请人将上述携带有增效蛋白bel1全长编码基因的重组表达质粒pEMB0184转化到大肠杆菌BL21(DE3)(购自Tiangen公司)，得到了重组菌BL21/pEMB0184。将该重组菌株接种于5mL LB液体培养基中(另外附加终浓度为100μg/mL氨苄青霉素)，过夜活化。以1∶100(体积比)转接至50mLLB液体培养基中，置于37℃摇床培养至OD600为0.5-0.8左右以后，加入1.0mmol/L的异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(即IPTG，购自sigma公司)于37℃诱导培养3h。之后12000rpm离心30sec收集菌体，分别用0.5％NaCl和灭菌去离子水洗涤菌体三遍后，按照菌体∶灭菌去离子水＝1∶5的体积比重新混匀菌体，加入等体积的2×上样缓冲液(2×上样缓冲液配方：100mm/l Tris-Cl(pH6.8)，200mm/L二硫苏糖醇，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)，混匀后，沸水浴中处理3-5min，12000rpm离心5min，以上清液进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳操作步骤参见Laemmli描述的方法(Laemmli，UK.1970.Cleavageof structural proteins duringthe assembly of the head ofbacteriophage T4.Nature 227：680-685)。结果如图3所示，与空载体对照菌株BL21/pGEX-6P-1相比，本实施例的BL21/pEMB0184表达了一条特异蛋白带，如图3泳道4所示。与蛋白分子量标准比对，估算该特异性蛋白其分子量为113kDa，与预计的融合增效蛋白GST-Bel1分子量大小吻合。证明本发明的增效蛋白Bel1在大肠杆菌中得到了成功的表达。
将上述重组菌BL21/pEMB0184的3h诱导培养物经过12000rpm离心30sec收集菌体，利用超声波(技术参数：功率400W，破碎30秒，间歇30秒)将细胞破碎后12000rpm离心15min取上清。然后将上清液过亲和层析柱(购自Novagen公司)提纯该特异蛋白GST-Bel1。具体的纯化步骤按照试剂盒GST·BindTM(购自Novagen公司)操作说明书进行。对最终的纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3泳道5所示，提纯的蛋白与BL21/pEMB0184中表达的特异性蛋白条带大小一致(如图3泳道4所示)，说明本发明提纯的特异蛋白就是融合增效蛋白GST-Bel1。之后，用Bradford染色法(具体方法参考文献：Bradford M M.1976.A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem 72：248-254.)测定了纯化的蛋白溶液的含量，结果表明纯化的增效蛋白溶液浓度为98.86μg/mL。
3.杀虫晶体蛋白Cry1Ac10的提纯和定量分析
将携带杀虫晶体蛋白基因cry1Ac10的苏云金芽胞杆菌重组菌BMB871(菌株来源见文献：吴岚，孙明，喻子牛，利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430构建含cry1Ac10基因的解离载体，微生物学报，2000，40：264-269.)菌株在ICPM培养基(配方：蛋白胨0.6％，葡萄糖0.5％，CaCO30.1％，MgSO40.05％，KH2PO40.05％，pH7.0-7.2)中培养48h-52h后，取发酵液按照常规的复红染色制作镜片，经光学显微镜观察，待90％以上的芽孢脱落后，将发酵液于12000rpm，4℃离心10min收集胞晶混合物，之后分别用1mol/mL NaCl和蒸馏水洗三遍，然后加入适量50mmol/mLNa2CO3(3％β-巯基乙醇，pH＝9.5)，充分混匀，37℃水浴60min，12000rpm，4℃离心15min去沉淀，上清中加入二十分之一体积的4mol/mL NaAC-HAc(pH4.0)，冰上静置30min；12000rpm，4℃冷冻离心10min，收集沉淀物，用去离子水清洗3遍，最后将沉淀溶于50mmol/mLNa2CO3(pH9.5)中，即为提纯后杀虫晶体蛋白溶液。
同样地用Bradford染色法测定了纯化的杀虫晶体蛋白Cry1Ac10蛋白溶液的含量，结果表明本发明纯化的Cry1Ac10蛋白溶液浓度为748.1μg/mL。
4.增效蛋白Bel1对杀虫晶体蛋白Cry1Ac10杀虫的增效活性的测定
以棉铃虫(Helicoverpa armigera)初孵幼虫为对象测定了本发明制备的增效蛋白Bel1对杀虫晶体蛋白Cry1AC10杀虫的增效活性。具体的生物测定程序按照标准测定程序(参见文献：沈鞠群等.苏云金杆菌制剂的标准化程序和方法，生物防治通报，1990(增刊)：12-16)进行。每个样品的生物测定重复3次，并计算出LC50。
为了检测增效蛋白Bel1对杀虫晶体蛋白Cry1Ac10杀虫的增效活性，申请人设计了下列两个实验。
在第一个实验中申请人首先固定了杀虫晶体蛋白的Cry1Ac10在饲料中的最终使用浓度为3μg/mL，将不同浓度的的增效蛋白Bel1溶液与之混合后加入到饲料中进行生测。共设置了5个浓度梯度，增效蛋白Bel1与杀虫晶体蛋白Cry1Ac10的比例分别为(质量比)0∶15，1；15；2∶15，4∶15，8∶15，设单独的Cry1Ac10也即0∶15组为对照。结果如图4所示，对照组中单加3μg/mL的Cry1Ac10可以引起的死亡率为34.2％，而当加入了0.2的μg/ml增效蛋白Bel1后，其致死率急剧上升到了65.3％。当增效蛋白Bel1的浓度继续增加以后，死亡率也跟着上升到了76.2％。以上结果说明该增效蛋白有明显的增强杀虫晶体蛋白Cry1Ac10杀虫毒性的作用，而且在该增效效果随着增效蛋白Bel1浓度的增加而提高。
在第二个试验中申请人固定了增效蛋白Bel1在饲料中的最终使用浓度为0.2μg/mL，将不同浓度的的杀虫晶体蛋白Cry1Ac10溶液与之混合后加入到饲料中进行生测。共设置了4个浓度梯度，增效蛋白Bel1与杀虫晶体蛋白Cry1Ac10的比例(按质量比计)分别为1∶0，1；15；1∶30，1∶60，设单加Cry1Ac10组为对照。结果如图5所示，我们可以明显看出，在所用的4个浓度比例下，增效蛋白Bel1与Cry1AC10混合使用组的供试昆虫的死亡率明显高于没有添加增效蛋白的Cry1Ac10各浓度组的死亡率。以上结果进一步说明该增效蛋白具有明显的增强杀虫晶体蛋白Cry1Ac10杀虫毒性的作用。
实施例3利用增效蛋白Bel1构建苏云金芽胞杆菌高效杀虫基因工程菌
在实施例2中申请人证明了体外纯化的增效蛋白Bel1具有明显的增强杀虫晶体蛋白Cry1Ac10杀虫毒性的作用，本实施例利用了该蛋白的这一特性，构建出了一株高效杀虫的苏云金芽胞杆菌基因重组菌。具体制备步骤如下：
1.含增效蛋白Bel1的大肠杆菌-苏云金芽胞杆菌穿梭表达载体的构建
为了让增效蛋白基因bel1能够在苏云金芽胞杆菌中表达，申请人采用重叠延伸的方法(即SOE法，具体方法和原理可以参考：J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)在其编码区的起始密码子前加上了该基因自身的启动子。构建路线如图6所示，由于片段太长，采取了分段扩增的办法对启动子和基因的编码区进行连接。首先根据YBT-1520基因组上基因bel1上游启动子序列设计一对引物，p1：5’-TGCGGATCCCGTTAAGTTTCTC-3’，p2：5’-AACAAGTAACCTTTTCATAAGTTACCTCCATCTCTT-3’。再根据重组质粒pUC19-bel1上基因bel1的序列，设计另一对引物，p3：5’-CTGTGGTAAGTTATTATCGCCGTACGCGC-3’；p4：5’-GGATCAACTAGAGCTCTTGC-3’。以以本发明的来源菌株苏云金芽胞杆菌YBT-1520的总DNA为模板，用本实施例设计的引物p1和p2扩增出了基因bel1的启动子900bp左右的片段，该片段3’端带有基因bel1基因编码区的第1-20个碱基；以质粒pUC19-bel1的DNA为模板，用引物p3和p4扩增出了基因bel1的编码区片段的1-1400个碱基的区域bel1-1，该片段5’端带有bel1的启动子片段末端的20个碱基。纯化两个扩增产物后，将两个DNA片段混在一起作为模板，用引物p1和p4进行第2轮PCR扩增，扩增得到了大约为2.2kb左右的片段，即为基因pro-bel1-1。最后经过测序证明启动子pro与基因bel1基因的bel1-1部分编码区连接正确。
将得到的pro-bel1-1基因片段经BamHI和SacI酶切后，插入到大肠杆菌-苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT304(载体来源见：Arantes O and Lereclus D.1991.Construction ofcloning vectors for Bacillus thuringiensis.Gene 108：115-119)相应的多克隆位点中，获得了重组质粒，申请人将该重组质粒命名为pBMB0185，经酶切验证与预计片段大小相符。
为了获得完整的bel1基因，用设计的另一对特异性引物p5：5’-GCAAGAGCTCTAGTTGATCC-3’和p6：5’-CTGCCGAATTCTGAGAAGGT-3’，以pUC19-bel1的DNA为模板，扩增出了bel1基因剩余的800bp左右的片段bel1-2。然后经SacI和EcoRI酶切后，插入到pBMB0185相应的多克隆位点中，从而获得了包含bel1基因完整的启动子和编码区的穿梭表达质粒pBMB0186，经酶切验证与预计片段大小相符。
2.增效蛋白Bel1和杀虫晶体蛋白Cry1Ac10共表达载体的构建
为了利用增效蛋白Bel1具有增强杀虫晶体蛋白Cry1Ac10杀虫毒性的特性，申请人将增效蛋白Bel1和杀虫晶体蛋白Cry1Ac10在苏云金芽胞杆菌BMB171(菌株来源见文献：李林，杨超，刘子铎，李阜隶，喻子牛.2000.苏云金芽孢杆菌无晶体突变株的逐级升温筛选及其转化性能.微生物学报5：395-399.)中进行共表达。共表达载体的构建如图7所示。即，用Sph1单酶切从质粒pBMBBK-304(质粒来源见文献：孙明，吴岚，刘子铎，喻子牛.2000.利用苏云金芽胞杆菌非芽胞特异性的启动子表达cry1Ac10和cry1C基因.农业生物技术学报8：229-232.)中将完整的杀虫晶体蛋白基因cry1Ac10的启动子和编码区切下来，并插入到包含bel1基因完整的启动子和编码区的穿梭表达质粒pBMB00186的Sph1位点，得到了同时含有bel1基因和cry1Ac10基因的表达质粒，经酶切验证证明酶切产物与预计片段大小相符，说明构建正确，申请人将该重组质粒命名为pBMB0187。
3.增效蛋白基因bel1在苏云金芽胞杆菌BMB171中的表达
为了检测增效蛋白基因bel1是否能够在BMB171中正常表达，通过电转化的方法(吴岚，孙明，喻子牛.利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430构建含cry1Ac10基因的解离载体.微生物学报，2000，40：264-269.)将上述构建的共表达重组质粒pBMB0187转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中。通过抗性筛选和酶切验证得到了正确的转化子BMB0187。
将上述重组菌BMB0187在LB培养基(使用时加入终浓度为20μg/mL的红霉素)中过夜活化后，转移至ICPM培养基(使用时附加终浓度为20μg/mL的红霉素)中，培养至芽胞完全成熟脱落，收集菌体，分别用0.5％NaCl和灭菌去离子水洗涤三遍后，按照菌体∶灭菌去离子水＝1∶5的体积比重新混匀菌体，加入等体积的2倍上样缓冲液(配方同本说明书前面的描述)，混匀后，沸水浴中处理3-5min，12000rpm离心5min，以上清液进行SDS-PAGE电泳。其结果如图8所示，苏云金芽胞杆菌BMB0187能表达出和预计大小相同的特异性的蛋白质，与分子量标准对比，预测其分子量大小为85kDa，而阴性对照的苏云金芽胞杆菌BMB171中(只含有穿梭载体pHT304)则无此对应条带，说明增效蛋白基因bel1在苏云金芽胞杆菌BMB171中得到了表达。另外通过电子显微镜观察证明该重组菌能够很好地形成典型的菱形晶体，说明增效蛋白基因bel1在苏云金芽胞杆菌BMB171中的表达并不影响杀虫晶体蛋白Cry1Ac10的正常表达。以上结果证明成功获得了同时表达增效蛋白Bel1和杀虫晶体蛋白Cry1Ac10的基因工程菌，申请人将其命名为BMB0187。申请人制备的基因工程菌为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)BMB0187，于2008年12月4日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：M208245。
基因工程菌BMB0187的生物学及遗传学特性：
①生物学特性：菌体直杆状，营养体呈链状或单生，长3-5微米，宽1-1.2微米，革兰氏染色阳性，芽胞呈圆柱状或近椭圆，偏端生，芽胞囊不膨大，在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落圆形，边缘平滑，菌苔丰满呈蜡质状，生长温度10-45℃，最适pH6.8-7.4，兼性嫌氧，在含7％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长，在核糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和可溶性淀粉培养基中产酸，甲基红反应阳性，芽胞生长后期产生伴胞晶体，伴胞晶体呈菱形，大小不一。
②本发明是以苏云金芽胞杆菌无质粒突变菌株BMB171为出发菌株得到的基因工程菌，其鞭毛抗原血清型为H2，含有杀虫晶体蛋白基因cry1Ac10和增效蛋白基因bel1，伴胞晶体由130KDa晶体蛋白组成。经继代培养，辅助基因bel1能够在工程菌中稳定存在，表达正常，对受体菌的生长无重大影响。
4.含bel1基因的苏云金芽胞杆菌BMB0187对棉铃虫杀虫活性的室内生物测定
为了检测本发明构建的含bel1基因的苏云金芽胞杆菌BMB0187的杀虫活性，以棉铃虫H.armigera初孵幼虫为对象测定了该工程及其出发菌株的的杀虫效果。将本发明制备的菌株BMB0187和只含有Cry1Ac10的重组菌BMB871在常用的LB液体培养基(使用时加入终浓度为20μg/mL的红霉素)中过夜活化后，然后按照体积比为1∶100的接种量转移至30ml的ICPM培养基(使用时加入终浓度为20μg/mL的红霉素)中，培养至芽胞即将成熟脱落的阶段，收集菌体，用灭菌去离子水洗涤一遍后，获得伴胞晶体混合物，按照标准测定程序(见：沈鞠群等，苏云金杆菌制剂的标准化程序和方法，生物防治通报，1990，(增刊)：12-16)进行生物测定。每个样品的生物测定重复3次，并通过专业统计软件DPS(参考文献：唐启义，冯明光.DPS数据处理系统。北京：中国农业出版社.1997)计算出LC50。结果如表1所示，从表1中对应浓度的死亡率和计算出的LC50可以看出，导入了bel1基因的重组菌BMB0187对棉铃虫的杀虫毒力明显比未导入bel1基因的出发菌株BMB871强，而且相对增效倍速达到了5.7倍。
表1含bel1基因的重组菌BMB0187与对照菌株BMB871对棉铃虫的杀虫活性
Figure G2008102367185D0000091
上述结果说明本发明制备的苏云金芽胞杆菌BMB0187的杀虫活性比只含有Cry1Ac10的出发菌株BMB871的杀虫活性提高了近5倍。本发明的应用前景显示，利用本发明的菌剂防治棉铃虫，在达到相同杀虫效果的同时可以大大减少Bt农药的使用量，从而可以节约大量的生产成本。另外，由于Bel1蛋白本身来自于苏云金芽胞杆菌，不存在转基因生物安全问题，展示本发明的bel1基因在苏云金芽胞杆菌基因工程菌构建方面具有良好的应用价值。
序列表
<110>华中农业大学
<120>苏云金芽胞杆菌增效蛋白基因bel1的克隆与工程菌制备及应用
<130>
<141>2008-12-01
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2202
<212>DNA
<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(2202)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2202)
<223>
<400>1
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Met Tyr Thr Met Phe Phe Leu lle Gly Asn Ile His Leu His Ala Asp
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        515                 520                 525
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    530                 535                 540
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Lys Leu Val Asn Glu Thr Ile Gln Phe Leu Gly Leu Gly Asp Asp Gln
545                 550                 555                 560
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Ile Thr Thr Lys Thr Pro His Ser Tyr Tyr Ala Gly Glu Lys Tyr Ala
            580                 585                 590
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Met Glu Gly Thr Asn Val Thr Ile Val Lys Asp Ile Ile Pro Leu Lys
    610                 615                 620
gag gga tat aga att aaa atc tat cat gat gaa ata aaa aaa cga tta    1920
Glu Gly Tyr Arg Ile Lys Ile Tyr His Asp Glu Ile Lys Lys Arg Leu
625                 630                 635                 640
act agt aaa gct act att att aat cct atg aat aaa atg aat gaa ttt    1968
Thr Ser Lys Ala Thr Ile Ile Asn Pro Met Asn Lys Met Asn Glu Phe
                645                 650                 655
ata ata aca aaa tgg gga ttg aaa aat act tct ttg caa aat aat cca    2016
Ile Ile Thr Lys Trp Gly Leu Lys Asn Thr Ser Leu Gln Asn Asn Pro
            660                 665                 670
gaa gaa aat ctt ata caa aga att gat gaa gaa atg gaa gcg att ata    2064
Glu Glu Asn Leu Ile Gln Arg Ile Asp Glu Glu Met Glu Ala Ile Ile
        675                 680                 685
ggt aat cag ttt tta aaa gag ata cca atg caa aaa tta gaa atg aaa    2112
Gly Asn Gln Phe Leu Lys Glu Ile Pro Met Gln Lys Leu Glu Met Lys
    690                 695                 700
aag aat gtg tgg atg gca ata aat atg tta tca gaa cca caa aaa ata    2160
Lys Asn Val Trp Met Ala Ile Asn Met Leu Ser Glu Pro Gln Lys Ile
705                 710                 715                 720
acg tat atg aat aaa tat aaa gat agc tta tat aat gaa taa    2202
Thr Tyr Met Asn Lys Tyr Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu
                725                 730
<210>2
<211>733
<212>PRT
<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400>2
Met Tyr Thr Met Phe Phe Leu Ile Gly Asn Ile His Leu His Ala Asp
1               5                   10                  15
Glu Arg Ile Asn Ala Lys Lys Ile Thr Ser Leu Glu Glu Pro Thr Trp
            20                  25                  30
Ile Phe Gln Ala Gly Ile Ser Lys Gly Lys Tyr His Asp Arg Gln Asp
        35                  40                  45
Leu Gly Phe Ile Leu Lys Arg Asn Thr Pro Leu Lys Val Arg Gln Thr
    50                  55                  60
Asn Pro Asn Phe Lys Asp Lys Leu Thr Leu Arg Leu Leu Ser Asn Asp
65                  70                  75                  80
Ser Lys Asn Glu Lys Ser Ile Gln Val Gly Asn Glu Trp Val Thr Ile
                85                  90                  95
Gln Gly Asp Thr Ser Leu Val Pro Phe Ile Asp Thr Pro Tyr Gly Glu
            100                 105                 110
Glu His Ala Val Leu Glu Tyr Gln Val Gly Asn Glu Ser Ala Thr Asn
        115                 120                 125
Pro Leu Pro Ile Tyr Lys Gln Gln Gly Ser Val Ser Gln Phe Phe Ser
    130                 135                 140
Thr Trp Asp Gln Phe Asp Gly Glu Tyr Ala Leu Leu Gln Gly Glu Ser
145                 150                 155                 160
Phe Gln Leu Phe Val Pro Lys Lys Asp Lys Glu Leu Val Arg Ser Leu
                165                 170                 175
Lys Asp Phe Gln Ser Leu Asp Glu Leu Ile Ala Tyr Tyr Glu Asp Ile
            180                 185                 190
Phe Val Met Tyr Asp Ser Ile Ile Gly Leu Asp Gly Ser Thr Phe Glu
        195                 200                 205
Asn Lys Lys Ser Gln Asn Arg Tyr Phe Leu Lys Ala Asp Ile Ser Gly
    210                 215                 220
Ala Gly Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Asn Trp Thr Ala Asn Ser Thr Asp
225                 230                 235                 240
Ser Thr Lys Met Trp Leu Asp Lys Leu Ser Trp Gly Thr Leu His Glu
                245                 250                 255
Ile Ala His Gly Tyr Gln Ala Gly Phe Asp Asn Gln Gly Ile Phe Thr
            260                 265                 270
Gly Glu Val Ser Asn Asn Leu Phe Gly Val Gln Tyr Gln Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Tyr Gly Lys Lys Ala Asp Gln Val Gly Trp Leu Phe Asn Phe Gly Lys
    290                 295                 300
Lys Glu Gln Val Glu Arg Asn Leu Tyr Asn Ala Leu Met Lys Glu Asn
305                 310                 315                 320
Lys Asn Tyr Asp Asp Leu Asp Leu Arg Gln Lys Leu Ile Leu Leu Thr
                325                 330                 335
Met Ala Lys Gln Lys Ala Gly Asp Glu Ala Phe Ala Lys Met Tyr Gln
            340                 345                 350
Gly Tyr Arg Lys Leu Ala Ser Asn Ala Ala Phe Lys Lys Gly Asp His
        355                 360                 365
Ser Leu Pro Asp Leu Met Asn Gln Tyr Tyr Ser Glu Asn Gly Gln Val
    370                 375                 380
Asp Phe Thr Pro Val Phe Glu Arg Trp Gly Phe Lys Leu Asn His Lys
385                 390                 395                 400
Gln Ile Glu Met Asn Arg Ala Lys Gly Phe Pro Ala Val Thr Ser Leu
                405                 410                 415
Ala Tyr Ile Val Pro Glu Ser Gln Leu Ala Lys Ala Arg Ala Ile Val
            420                 425                 430
Asp Pro Asp Ile Pro Ile Asn Ser Asn Phe Glu Ile Val Thr Asn Gln
        435                 440                 445
Gln Ile Ala Pro Leu Gly Leu Lys Gly Asn Leu His Ile His Leu Asn
    450                 455                 460
Thr Asn Glu Ile Asp Thr Leu Lys Gly Gly Lys Ile Lys Leu Lys Glu
465                 470                 475                 480
Gly Asn Thr Val Ile Gln Glu Lys Thr Ile Glu Thr Thr Asp Ile Asn
                485                 490                 495
Leu Gln Asp Val Pro Asn Gly Val Tyr Thr Val Glu Ile Ser Gly Gly
            500                 505                 510
Lys Thr Asn Ser Met Tyr His Phe Ser Ser Tyr Tyr Ala Tyr Val Lys
        515                 520                 525
Glu Lys Asp Asn Ser Leu Lys Ile Asp Ile Asn Glu Met Lys Val Ser
    530                 535                 540
Lys Leu Val Asn Glu Thr Ile Gln Phe Leu Gly Leu Gly Asp Asp Gln
545                 550                 555                 560
Phe Ala Val Leu Asn Thr Asp Leu Glu Gln Asn Arg Ala Ile Phe Thr
                565                 570                 575
Ile Thr Thr Lys Thr Pro His Ser Tyr Tyr Ala Gly Glu Lys Tyr Ala
            580                 585                 590
Ser Ile Glu Val Phe Asn Glu Lys Gly Glu Lys Ile Tyr Thr Lys Glu
        595                 600                 605
Met Glu Gly Thr Asn Val Thr Ile Val Lys Asp Ile Ile Pro Leu Lys
    610                 615                 620
Glu Gly Tyr Arg Ile Lys Ile Tyr His Asp Glu Ile Lys Lys Arg Leu
625                 630                 635                 640
Thr Ser Lys Ala Thr Ile Ile Asn Pro Met Asn Lys Met Asn Glu Phe
                645                 650                 655
Ile Ile Thr Lys Trp Gly Leu Lys Asn Thr Ser Leu Gln Asn Asn Pro
            660                 665                 670
Glu Glu Asn Leu Ile Gln Arg Ile Asp Glu Glu Met Glu Ala Ile Ile
        675                 680                 685
Gly Asn Gln Phe Leu Lys Glu Ile Pro Met Gln Lys Leu Glu Met Lys
    690                 695                 700
Lys Asn Val Trp Met Ala Ile Asn Met Leu Ser Glu Pro Gln Lys Ile
705                 710                 715                 720
Thr Tyr Met Asn Lys Tyr Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu
                725                 730

Claims (6)

1.一种分离克隆的苏云金芽胞杆菌增效蛋白bel1基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。
2.一种分离克隆的苏云金芽胞杆菌增效蛋白Bel11的编码基因，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
3.一株重组苏云金芽胞杆菌增效蛋白bell基因的工程菌，该工程菌是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)BMB0187，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M208245。
4.权利要求2所述的编码基因作为蛋白在制备微生物杀虫剂中的应用。
5.权利要求2所述的编码基因作为蛋白在转基因微生物或转基因植物中的应用。
6.权利要求3所述的工程菌BMB0187在制备微生物杀虫剂中的应用。
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