CN101691545B - 一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸合成速率的方法 - Google Patents

Abstract

一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸合成速率的方法，属于辅因子代谢调控策略优化发酵过程技术领域。本发明采用将来源于荚膜胞浆菌(Histoplasma capsulatum)中编码NADH选择性氧化酶AOX1基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T.glabrata中，获得了一株重组菌T.glabrata-AOX，其保藏编号是：CCTCC NO：M 209134。与对照菌株T.glabrataΔura3/pYX212比较，胞内NADH/NAD⁺、细胞浓度以及发酵周期分别降低了60.3％、20.3％和10.7％，而葡萄糖比消耗速率和丙酮酸比合成速率分别提高了34.7％和54.1％。结果表明，构建线粒体内非产能的NADH氧化途径，加速NADH氧化，能有效提高酵母细胞糖酵解速度及目标代谢产物的生产强度。

Description

一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸合成速率的方法

技术领域

本发明涉及一种在T.glabrata线粒体内过量表达来源于荚膜胞浆菌(H.capsulatum)中编码NADH选择性氧化酶的AOX1基因，从而实现加速NADH氧化，增加NAD⁺供给，提高T.glabrata对葡萄糖的消耗速率以及丙酮酸生产强度的方法，属于辅因子代谢调控策略优化发酵过程技术领域。

背景技术

提高糖酵解速度是所有以糖质原料为底物的工业发酵过程共同关心的问题，但糖酵解速率受其关键酶活性、细胞内NADH氧化途径及效率和ATP浓度等条件所控制，其中最为重要的影响因素是NADH氧化途径及其效率。因为NADH氧化途径及效率不仅影响糖酵解途径关键酶的反馈抑制物质ATP水平，同时影响糖酵解的底物NAD⁺水平，这两者的丰度最终影响糖酵解的关键酶活性。微生物细胞内NADH主要来源于糖酵解途径、三羧酸循环以及脂类的代谢。由于NADH/NAD⁺不能穿过线粒体膜，导致细胞质与线粒体中具有不同的氧化途径将NADH氧化为NAD⁺。在胞质中，NADH主要通过NADH脱氢酶、乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油脱氢酶等脱氢酶氧化成NAD⁺；而线粒体内的NADH主要通过电子传递链氧化成NAD⁺，相应地生成大量ATP。前期研究表明，光滑球拟酵母中高浓度的ATP抑制糖酵解关键酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性，在一定范围内降低胞内ATP含量能有效地提高糖酵解速度。而改变胞内NADH氧化途径是降低胞内ATP水平同时提供足量NAD⁺的一种有效策略。

发明内容

本发明目的是提供一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸合成速率的方法，将编码H.capsulatum中NADH选择性氧化酶的AOX1基因表达于T.glabrata中，构建一条异源NADH氧化途径。构建的NADH氧化途径能有效地将源于NADH的电子流从细胞色素途径中的泛醌处分流，绕过复合物III和IV，直接由选择性氧化酶作用生成水，避免电子通过电子传递链及F₀F₁-ATPase而大量合成ATP导致胞内能荷增加。实现了充分氧化NADH提供糖酵解途径前体NAD⁺而降低胞内ATP水平的目的，最终有效地提高糖酵解速率和丙酮酸生产强度。

本发明的技术方案：一株产丙酮酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)AOX，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M209134。

所述的光滑球拟酵母CCTCC NO：M 209134的构建方法，通过过量表达NADH选择性氧化酶的手段，根据NCBI网站发表的荚膜胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)中的NADH选择性氧化酶基因的序列，设计一对引物

S：5’-ATCGCCCCATGGTCAGCACTGCCATTACTAATACACCTCACTTCC-3’

A：5’-TACTCGGAGCTCGTTTTGTTTAAGCTGATGCAATTTTTTGCCG-3’；

用于从荚膜胞浆菌总DNA中扩增AOX1基因，然后将其插入穿梭质粒pYX212的TPI-promoter后的多克隆位点中，得到表达质粒pYX212-AOX1，转化T.glabrata CCTCC NO：M202019的尿嘧啶缺陷型菌株，获得重组菌光滑球拟酵母AOX。

所述T.glabrata CCTCC NO：M202019的尿嘧啶缺陷型菌株，即光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019，烟酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺素(B₁)、吡哆醇(Pdx)等四种维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为本研究室选育菌株，该菌种已申请中国专利，申请号为02113142.2，公开号为CN1392246A。

一种丙酮酸的生产方法，采用光滑球拟酵母CCTCC M 209134为生产菌株，经种子培养和液体发酵生产丙酮酸；

(1)种子培养

种子和斜面培养基g/L：葡萄糖30，蛋白胨10，KH₂PO₄1，MgSO₄·7H₂O0.5，琼脂20(斜面培养基)，pH 5.5；

培养条件：从新鲜斜面上接一环菌入种子培养基，500mL锥形瓶中种子培养基为50mL，温度为30℃，转速200r/min，培养时间为24h；

(2)液体发酵

液体发酵培养基g/L：葡萄糖100，(NH₄)₂SO₄7，KH₂PO₄5，MgSO₄·7H₂O 0.8，CH₃COONa 5，碳酸钙40，每升发酵培养基中添加：微量元素液10mL，维生素液10mL，pH 5.5；

培养条件：以体积比10％接种量将种子液接种于发酵培养基，摇瓶发酵：500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，温度为30℃，转速200r/min，发酵时间为56h；

微量元素液：CaCl₂·2H₂O 2g，FeSO₄·7H₂O 2g，ZnCl₂0.5g，MnCl₂·4H₂O 12g，CuSO₄·5H₂O 0.05g，2mL的2mol/L HCl溶解后定容至1L。

维生素液：烟酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40mg，生物素4mg，核黄素10mg，自来水定容至1L。

细胞干重的测定：取1mL菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL、2mol/L的盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于660nm处比色测OD值，1OD₆₆₀＝0.23g干菌体。

丙酮酸浓度的测定：高效液相色谱(HPLC)

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差折光检测器和工作站)。

色谱条件：

色谱柱：C18柱，5μm，4.6mm ×250mm

流动相：0.1％H₃PO₄

流速：1mL/min

柱温：28℃

进样量：10μL

紫外检测器波长：215nm

样品制备：5mL发酵液在10000rpm下离心10min，取上清液移入试管中以备测丙酮酸时用。测丙酮酸时，取1mL上清液移入50mL容量瓶中，去离子水定容至刻线，经0.45μm滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。

本发明的有益效果：本发明以高产丙酮酸的光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC NO：M202019为出发菌，利用分子手段构建了一株过量表达AOX1的重组菌光滑球拟酵母CCTCC NO：M 209134，其葡萄糖比消耗速率和丙酮酸比合成速率达到0.233h^-1和0.094^-1h。这一改变NADH氧化途径提高糖酵解速率的策略对于工业生物技术的意义在于，采用代谢工程的策略，通过修饰或调控微生物细胞的生理功能，能够有效地提高工业生物技术过程的效能。

生物材料样品保藏：光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)AOX，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 209134，保藏日期：2009年6月26日。

附图说明

图1重组质粒pYX212-AOX1及重组菌T.glabrata-AOX的验证。

(A)重组质粒pYX212-AOX1的酶切及PCR分析结果，泳道1：T.glabrataCCTCC NO：M 209134菌落PCR；泳道2：pYX212-AOX1/NcoI/SacI；泳道3：pYX212-AOX1；泳道4：pYX212；M：DNA Marker 1kb Ladder；

(B)SDS-PAGE全细胞蛋白电泳分析，泳道1：CON；泳道2：T.glabrataCCTCC NO：M 209134；M：蛋白质分子量标准(kDa)。

图2过量表达NADH选择性氧化酶对丙酮酸发酵的影响。

a-对照(T.glabrataΔura3/pYX212)，

b-重组菌株(T.glabrata CCTCC M 209134)。

具体实施方式

实施例1重组菌的构建及鉴定

以H.capsulatum基因组为模板，引物：

S：5’ATCGCCCCATGGTCAGCACTGCCATTACTAATACACCTCACTTCC-3’

A：5’TACTCGGAGCTCGTTTTGTTTAAGCTGATGCAATTTTTTGCCG-3’；

PCR扩增得到与文献报道大小相符的AOX1基因片段(约1700bp)，PCR反应采用50μL体系，具体如下：

ddH₂O                   33.5μL

10×PCR Buffer          5μL

MgCl₂(25mmol/L)         4μL

dNTPs(2mmol/L)          4μL

H.capsulatum基因组      1μL

AOX1-S(10μmol/L)       1μL

AOX1-A(10μmol/L)       1μL

Taq polymerase(5U/μL)  0.5μL

PCR反应条件：95℃5min；95℃50s，55℃50s，72℃90s，30个循环；72℃10min，12℃保温。

将PCR扩增出的片段插入质粒pYX212，获得含有AOX1基因的酵母表达质粒pYX212-AOX1(图1A，泳道3)。重组质粒pYX212-AOX1经双酶切分析(图1A，泳道2)，并进行DNA测序，结果证明AOX1基因正确插入了质粒pYX212中，并且在此过程中AOX1基因没有产生突变。将质粒pYX212-AOX1电击转化受体菌T.glabrata Δura3，得到一株能在MM平板正常生长的重组子，菌落PCR验证结果表明该重组子含有目的AOX1基因(图1A，泳道1)。将重组菌AOX进行SDS-PAGE全细胞蛋白电泳分析(以T.glabrata Δura3/pYX212为对照)发现，重组酵母在36kDa处出现明显的蛋白质特征条带(图1B，泳道2)，与文献报道的目标蛋白大小相符。

实施例2过量表达NADH选择性氧化酶对T.glabrata丙酮酸发酵的影响。

如图2所示，与出发菌株T.glabrataΔura3/pYX212相比，重组菌株T.glabrata CCTCC NO：M 209134胞内NADH/NAD⁺比率(0.31)下降了60.3％，而丙酮酸比合成速率提高了54.1％(0.094h^-1)。

Claims (4)

1.一株产丙酮酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)AOX，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 209134。

2.一株权利要求1所述的光滑球拟酵母CCTCC NO：M 209134的构建方法，其特征是通过过量表达NADH选择性氧化酶的手段，根据NCBI网站发表的荚膜胞浆菌(Histoplasma capsulatum)中的NADH选择性氧化酶基因的序列，设计一对引物：

S：5’ATCGCCCCATGGTCAGCACTGCCATTACTAATACACCTCACTTCC-3’

A：5’-TACTCGGAGCTCGTTTTGTTTAAGCTGATGCAATTTTTTGCCG-3’；

用于从荚膜胞浆菌总DNA中扩增AOX1基因，然后将其插入穿梭质粒pYX212的TPI-promoter后的多克隆位点中，得到表达质粒pYX212-AOX1，转化T.glabrata CCTCC NO：M202019的尿嘧啶缺陷型菌株，获得重组菌光滑球拟酵母AOX。

3.一种丙酮酸的生产方法，其特征是采用光滑球拟酵母CCTCC NO：M209134为生产菌株，经种子培养和液体发酵生产丙酮酸；

(1)种子培养

种子和斜面培养基g/L：葡萄糖30，蛋白胨10，KH₂PO₄1，MgSO₄·7H₂O0.5，斜面培养基另加琼脂20，pH 5.5；

培养条件：从新鲜斜面上接一环菌入种子培养基，500mL锥形瓶中种子培养基为50mL，温度为30℃，转速200r/min，培养时间为24h；

(2)液体发酵

液体发酵培养基g/L：葡萄糖100，(NH₄)₂SO₄7，KH₂PO₄5，MgSO₄·7H₂O 0.8，CH₃COONa 5，碳酸钙40，每升发酵培养基中添加：微量元素液10mL，维生素液10mL，pH 5.5；

培养条件：以体积比10％接种量将种子液接种于发酵培养基，摇瓶发酵：500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，温度为30℃，转速200r/min，发酵时间为56h；

微量元素液：CaCl₂·2H₂O 2g，FeSO₄·7H₂O 2g，ZnCl₂0.5g，MnCl₂·4H₂O 12g，CuSO₄·5H₂O 0.05g，2mL的2mol/L HCl溶解后定容至1L；

维生素液：烟酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40mg，生物素4mg，核黄素10mg，自来水定容至1L。

4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征是在摇瓶培养条件下，葡萄糖比消耗速率和丙酮酸比合成速率达到0.233h^-1和0.094h^-1。

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