CN101245322A - 一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸生产强度的方法 - Google Patents
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Abstract
一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸生产强度的方法，属于辅因子代谢调控策略优化发酵过程技术领域。本发明通过改变辅因子NADH调控碳代谢流加强丙酮酸生产强度，采用分子手段，将来源于乳酸乳球菌(L.lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的工业菌株Torulosis glabrata CCTCC NO：M 202019中，获得了一株NADH氧化酶过量表达的重组菌PdnoxE CCTCC NO：M 208022，与出发菌株相比，菌体干重、葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度分别提高了168％、44.9％和12％。本发明对工业上许多重要发酵产品(如有机酸、氨基酸等)生产菌种的改良可能具有普遍的适用意义。
Description
技术领域
一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸生产强度的方法，涉及一种通过辅因子NADH调控碳代谢流加强丙酮酸的生产强度，属于辅因子代谢调控策略优化发酵过程技术领域。通过研究辅因子NADH对代谢流流向及相应的代谢通量的影响，实现加强丙酮酸生产强度。
背景技术
丙酮酸又称2-氧代丙酸(2-Oxopropanic acid)、α-酮基丙酸(α-Ketopropionicacid)或乙酰基甲酸(Acetylformic acid)，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。
丙酮酸是生物体的重要中间代谢产物，由于其被广泛应用于化工、制药、农用化学品和营养保健品等行业，因此近年来世界上对其商业需求不断增长。
丙酮酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类。化学合成法主要有：酒石酸法、乳酸乙酯空气氧化法、羟基丙酮法、电化学合成法、乳酸催化氧化法。发酵法生产丙酮酸真正取得突破是1989年日本的研究人员选育出一系列丙酮酸产量超过50g/L的球拟酵母菌株。特别是中国江南大学选育的烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素4种维生素的营养缺陷型T.glabrata CCTCC NO：M202019，是发酵法生产丙酮酸的首选菌株，该菌株已申请中国专利，专利号为ZL 02113142.2。
辅因子工程所涉及到的辅因子主要有：ATP/ADP/AMP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+、辅酶A及其衍生物、维生素和微量元素。目前研究主要集中在调节ATP/ADP/AMP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+和辅酶A及其衍生物等辅因子在细胞内的形式和含量对代谢途径及代谢流量的影响。
1998年，荷兰Delft大学Hugenholtz J研究小组在乳酸乳球菌(Streptococcuslactis)中过量表达来源于变异链球菌(Streptococcus mutans)编码NADH氧化酶的nox-2基因，导致重组菌葡萄糖代谢速度加快和关键节点碳代谢流重新分布；Heux S等在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，过量表达来源于乳酸菌(Lactococcus lactis)编码产生H2O-NADH氧化酶的noxE基因，导致胞内NADH和NADH/NAD+分别下降5和6倍，而葡萄糖消耗增加10％。
在调控微生物细胞NADH和NAD+浓度及其比率对碳代谢组学和通量组学上已开展较多的研究工作。但对调控微生物细胞内NADH/NAD+加强目标代谢产物的生产强度的研究，则鲜见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过辅因子NADH调控碳代谢流加强丙酮酸生产强度的方法。通过研究辅因子NADH对代谢流流向及相应的代谢通量的影响，达到加强丙酮酸生产强度的目的。
本发明的技术方案：
一株产丙酮酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母Pdnox E，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208022。
一种光滑球拟酵母PdnoxE CCTCC NO：M 208022的构建方法，运用分子手段，以乳酸乳球菌NZ 9000基因组为模板，PCR扩增得到目的基因noxE片段，目的基因noxE经限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切消化后，浓缩纯化，将noxE基因定向克隆到表达质粒pYX212中，得到重组酵母表达质粒；将重组酵母表达质粒用电击转化的方法，转入受体菌Torulopsis glabrata CCTCC NO：M202019，在MM培养基中进行筛选，得到NADH氧化酶过量表达的重组菌PdnoxE CCTCC NO：M 208022。NADH氧化酶的过量表达，将NADH氧化途径从大量形成ATP的氧化磷酸化途径转向形成水的NADH氧化酶途径，保证了高酵解速度所需的高NAD+水平和低ATP水平。从而解除了NAD+浓度不足对糖酵解途径关键酶活性的限制以及减轻了高水平ATP对糖酵解关键酶活性的变构抑制，加强了丙酮酸的生产强度。
一种通过辅因子NADH调控碳代谢流加强丙酮酸生产强度的方法，采用光滑球拟酵母PdnoxE CCTCC NO：M 208022为出发菌株，经种子培养和液体发酵生产丙酮酸；
种子培养：种子培养基以g/L計：葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，调pH 5.5；培养条件：温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间为20-24h；
液体发酵培养：发酵培养基以g/L計：葡萄糖100，乙酸钠6，NH4Cl 7，KH2PO4 5，MgSO4·7H2O 0.8，CaCO3 40，微量元素液10mL，维生素液10mL，pH5.0；发酵条件：将种子液以10％的接种量分别转入发酵培养基于30℃、200rpm条件下培养，发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕，补加50g/L葡萄糖继续发酵20h，使丙酮酸浓度提高；
所用微量元素液为：CaCl2·2H2O 2g，FeSO4·7H2O 2g，ZnCl2 0.5g，MnCl2·4H2O 12g，CuSO4·5H2O 0.05g，2mol/L HCl溶解后定容至1L；
所用维生素液为：烟酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40mg，生物素4mg，核黄素10mg，自来水定容至1L。
CCTCC NO：M 208022菌株的NADH氧化酶活性为34.8U/mg protein，与菌株Torulopsis glabrata CCTCC NO：M202019相比，菌体干重、葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度分别提高了168％、44.9％和12％；发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕，补加50g/L葡萄糖继续发酵20h，使丙酮酸浓度提高到67.2g/L。
菌种和质粒：光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC NO：M202019，其为烟酸、生物素、硫胺素、盐酸吡哆醇4种维生素营养缺陷型菌株，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，主要用于发酵生产丙酮酸，已进行保藏。酵母表达质粒pYX212为大肠杆菌—酵母之间的穿梭载体，在大肠杆菌中选择标记为ampr，而在酵母中选择标记为尿嘧啶缺陷型互补，酵母表达质粒pYX212已在【中国生物工程杂志2006，26(1)：38～41】公开，由江南大学沈微老师赠送。
斜面和种子培养基：葡萄糖30g，蛋白胨10g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂20g(斜面用)，pH5.5，自来水定容至1L。
基本培养基(MM)：葡萄糖100g，NH4Cl 7g，KH2PO4 5g，MgSO4·7H2O 0.8g，CaCO3 40g(摇瓶时添加)，微量元素液10mL，维生素液10mL，pH5.0，自来水定容至1L。在MM培养基中加入6g乙酸钠即为发酵培养基，加入60mg尿嘧啶为补充培养基(CM)，在CM培养基中加入0.5g 5-氟乳清酸(5-FOA)即为5-FOA培养基。
细胞干重的测定：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于660nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。
丙酮酸和α-酮戊二酸浓度的测定：高效液相色谱(HPLC)。
仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差折光检测器和工作站)。
色谱条件：色谱柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm；流动相：0.1％H3PO4；流速：1mL/min；柱温：28℃；进样量：10μL；紫外检测器波长：215nm。
样品制备：5mL发酵液在10000rpm下离心10min，取上清液移入试管中以备测丙酮酸和残糖时用。测丙酮酸时，取1mL上清液移入50mL容量瓶中，去离子水定容至刻线，经0.45μm滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。
本发明的有益效果：获得了一株NADH氧化酶活性为34.8U/mg protein的重组菌CCTCC NO：M 208022，与出发菌株CCTCC NO：M202019相比，菌体干重、葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度分别提高了168％、44.9％和12％。发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕，补加50g/L葡萄糖继续发酵20h则使丙酮酸浓度提高到67.2g/L。
生物材料样品保藏
一株产丙酮酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母Pdnox E，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2008年1月27日，保藏编号为CCTCC NO：M 208022。
具体实施方式
实施例1 乳酸乳球菌noxE基因的扩增与表达质粒的构建
以乳酸乳球菌NZ9000基因组为模板，PCR扩增得到目的基因noxE片段，琼脂糖电泳得到约1.5kb的特异条带。目的基因noxE经限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切消化后，浓缩纯化，将noxE基因定向克隆到表达质粒pYX212中，得到重组酵母表达质粒。重组酵母表达质粒转化感受态细胞JM109并涂布含氨苄青霉素的LB平板进行扩增。
实施例2 重组菌的构建与鉴定
由于重组质粒上带有Ura3基因，电击转化受体菌T.glabrata(Ura-)，得到能在不添加尿嘧啶的基础培养基上正常生长的重组菌PdnoxE CCTCC NO：M208022。在酶活测定中发现，重组菌中NADH氧化酶的比活力为34.8U/mg蛋白，而在出发菌株CCTCC NO：M202019中难以检测到NADH氧化酶的活性。
实施例3 重组菌与对照菌对照发酵实验
如下表所示，两菌相比较：(1)重组菌PdnoxE CCTCC NO：M 208022 36h葡萄糖消耗完毕，而出发菌株CCTCC NO：M202019进行到48h时发酵液中残存5.34g/L葡萄糖；(2)重组菌葡萄糖的消耗速度为2.57g/L/h，比出发菌株提高了44.9％(1.78g/L/h)；(3)重组菌发酵36h时丙酮酸产量为31.4g/L，此时出发菌株丙酮酸产量仅为28.3g/L，继续发酵至48h，出发菌株丙酮酸产量增加到37.3g/L，但重组菌的丙酮酸产量并不随着发酵时间的延长而增加；(4)重组菌的丙酮酸生产强度为0.872g/L/h，是出发菌株的1.12倍(0.778g/L/h)；(5)重组菌发酵周期为36h，而出发菌株发酵周期为50h。
实施例4 过量表达NADH氧化酶对NADH代谢的影响
如下表所示，NADH氧化酶的过量表达，使NADH含量降低了18.1％(与对照菌株比较)，NAD+含量增加了11.1％，导致NADH/NAD+比率降低了26.3％，胞内ATP含量下降15.8％。
Claims (4)
1、一株产丙酮酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母Pdnox E，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208022。
2、一种光滑球拟酵母Pdnox E CCTCC NO：M 208022的构建方法，其特征是运用分子手段，以乳酸乳球菌NZ 9000基因组为模板，PCR扩增得到目的基因noxE片段，目的基因noxE经限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切消化后，浓缩纯化，将noxE基因定向克隆到表达质粒pYX212中，得到重组酵母表达质粒；将重组酵母表达质粒用电击转化的方法，转入受体菌Torulopsis glabrataCCTCC NO：M202019，在MM培养基中进行筛选，得到NADH氧化酶过量表达的重组菌PdnoxE CCTCC NO：M 208022。
3、一种通过辅因子NADH调控碳代谢流加强丙酮酸生产强度的方法，其特征是采用光滑球拟酵母PdnoxE CCTCC NO：M 208022为出发菌株，经种子培养和液体发酵生产丙酮酸；
种子培养：种子培养基以g/L計：葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，调pH 5.5；培养条件：温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间为20-24h；
液体发酵培养：发酵培养基以g/L計：葡萄糖100，乙酸钠6，NH4Cl 7，KH2PO4 5，MgSO4·7H2O 0.8，CaCO3 40，微量元素液10mL，维生素液10mL，pH5.0；发酵条件：将种子液以10％的接种量分别转入发酵培养基于30℃、200rpm条件下培养，发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕，补加50g/L葡萄糖继续发酵20h，使丙酮酸浓度提高；
所用微量元素液为：CaCl2·2H2O 2g，FeSO4·7H2O 2g，ZnCl2 0.5g，MnCl2·4H2O 12g，CuSO4·5H2O 0.05g，2mol/L HCl溶解后定容至1L；
所用维生素液为：烟酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40mg，生物素4mg，核黄素10mg，自来水定容至1L。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征是CCTCC NO：M 208022菌株的NADH氧化酶活性为34.8U/mg protein，与工业菌株Torulopsis glabrata CCTCCNO：M202019相比，菌体干重、葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度分别提高了168％、44.9％和12％；发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕，补加50g/L葡萄糖继续发酵20h，使丙酮酸浓度提高到67.2g/L。
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