CN1016750B - 脱水的植物种子类似物 - Google Patents

脱水的植物种子类似物

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Abstract

提供了用于形成脱水的植物种子类似物的方法和材料，通过缓慢或快速干燥除去部分水分使植物组织不再饱含水分，从而形成了脱水的植物种子的类似物。在第二个实施方案中，分生组织被包封在凝胶或聚合物中后进行脱水。在另一实施方案中，在包封到凝胶中之前对分生组织进行脱水。在凝胶囊中可以掺入防护剂。分生组织可以从例如体细胞胚、合子和种系源分离出。

Description

本申请是1986年1月7日申请的、申请号06/816889的共同所有和共同待批的专利申请的继续部分，后者又是1982年10月12日提出申请的、申请号433688的共同所有和共同待批的专利申请的继续部分。
本发明涉及农业和农作物生产领域，更具体地说，本发明是关于植物生殖单元的制造，这些植物生殖单元是基因型可以与亲本相同的植物种子类似物。
在农业生产中，传统的作物改良方法包括寻求表现出新的和有用的特性的植物品系或者对已有的品系进行精选和改良。这种探索已经从仅仅选择合乎需要的亲本植株发展到各自表现出所希望的特性的亲本之间的杂交，最终发展到纯合系之间的杂交，以使在随后的每一次杂交中产生相同的子一代。
传统的保持遗传同一性的方法已为人们所熟知，並且在文献中已有描述。例如，参阅R.W.Allard“Principles    of    Plant    Breeding”（John    Wiley    and    Sons，Inc.，1960）。保持纯种系以及为了获得子一代而反复地杂交既费时又耗费人力。
亲本的有性繁殖的另一个局限性是每株植物的产籽率低。这常常是由稠密的近交系表现的低活力而引起的。最后，只有非常有限数量的纯系可以被生产出来，而这导致了供选择的遗传特性库减少。
一般认为，通过亲本的无性繁殖可以克服上述某些困难。见W.C.Anderson    and    J.B.Carstens，“Tissue    Culture    Propagation    of    Broccoli，Brassica    oleracea （Italica Group），for use in F1Hybrid Seed Production，”J.Amer.Soc.Hort.Sci.，102（1），PP.69-73（1977）。这一方法通过有性繁殖避免了亲本遗传特性变化的问题。但是，在亲本中存在染色体特性分离时，产生子一代种子的有性杂交不能保证均匀的子一代。
曾提出可以用体细胞胚或移植到大田里生根的植物无性繁殖所希望的植物种。但这种方法需要精通组织培养试室工作的人员，需要移植到温室或苗圃，並且当充分适应气候时还要移植到大田里。与传统的播种方法相比，这种方法成本高且费时。
为了克服上述某些困难，已研制出射流钻孔（fluid    drilling）技术。已经对预发芽的种子使用了射流钻孔方法，例如D.Gray，“Comparison    of    Fluid    Drilling    and    Con-Ventional    Establishment    Techniques    on    Seedling    Emergence    and    Crop    Uniformity    in    Lettuce，”J.Hort.Science，52：23-30（1978）。並且已提出射流钻孔可适用于将体细胞胚直接移植到大田里，例如D.A.Evans    and    W.R.Sharp，“Application    of    Tissue    Culture    Technology    in    the    Agricultural    Industry，”in    Application    of    Plant    Cell    and    Tissue    Culture    to    Agriculture    and    Industry，D.T.Tomes    et    al.，eds.（University    of    Guelph    Press，PP.212-13，1982）。但是射流钻孔技术成本高且要求农业团体购买机械设备以及发展新技术。因而阻碍了这种技术变更。此外，射流钻孔方法也未考虑到种子或体细胞胚的精密种植。
为了克服射流钻孔的缺陷，已经提出制造人工种子，将体细胞胚单独封装在由3.2%凝胶和96.8%水组成的水合凝胶中（例如，K.Redenbaugh，J.Nichol，M.E.Kossler，and    B.Paasch，“Encapsulation    of    Somatic    Embryos    for    Artificial    Seed    Production”In    Vitro    20：256-257，1984）。然后可以使用传统的真空传感器播种机种植包含有植物组织的水合胶囊。但是这种水合胶囊含有也被水合的封装的植物组织，其所含水分与胶囊的水含量相等。在包胶封装时，预先经过脱水的分生组织、体细胞胚或组织培养的幼苗会吸收水分达到水合胶的含水量。
已经提出将体细胞胚在聚环氧乙烷溶液中进行脱水，参看S.L.Kitto    and    Jules    Janeck，“Production    of    Synthetic    Seeds    by    Encapsulating    Asexual    Embryos    of    Carrot”J.Amer.Soc.Hort.Sci.110（2）：277-282（1985）。但是未经涂敷的胚承受不住脱水。此外，虽然经过涂敷的胚群经受住脱水，但没有产生完整的幼苗。
本发明认为，将植物组织脱水至低于植物组织饱和含水量，可以为更完全的发育和成熟创造条件，以便产生更富有活力的、无性系均匀的以及完整的幼苗。此外，就水合水平而论，经脱水的植物组织更类似于真实的种子。因而脱水的植物组织可以按照与真实种子十分类似的方式进行加工、贮存和处理。
因而本发明总的目的是提供一种能使体细胞胚和接合子胚分离和成熟的技术以提供人工种子。
根据本发明，将全能分生组织封装在凝胶或聚合物中並通过缓慢或快速干燥除去部分水分，以使植物组织不再饱含水分，创造出脱水植物种子类似物。
根据本发明的另一个观点，通过缓慢或快速处理对全能分生组织进行脱水，使植物组织不再饱含水分。经过这样脱水的分生组织随后经涂敷或不经涂敷直接种植。
根据本发明的另一个观点，通过诱发形成体细胞胚将分生组织分离。然后将这些胚封装到一种凝胶或聚合物中並脱水除去部分水分，以使植物组织不再饱含水分。在干燥处理过程中胚可以继续发育。
根据本发明的另一个观点，从体细胞组织中提取并将分生组织包封起来，由于分生组织有潜在能力分化产生完整的植物体，因而不需诱导体细胞胚胎发生。
根据本发明的另一个观点，从体细胞组织中提取，将其从种皮中取出並包封在经过脱水除去部分水分的凝胶或聚合物中。
根据本发明的又一个观点，通过诱发形成体细胞胚将分生组织隔离。然后在胚发育过程中或在胚发育结束时将这些胚脱水至低于组织完全饱和度。
本发明特别有利于产生用传统种植方法加速优良的无性系或杂化物向大田里转移的脱水植物种子类似物。
植物分生组织是机体的单元。某些分生组织有能力产生完整的植物体，另一些分生组只产生选择组织。那些产生完整植物体的分生组 织叫做全能组织。重演个体发育是胚的一个固有性能。这种能力归于分生组织，而种子胚中的其他结构均附属于这种分生组织。
按照本发明可以将除去种皮的合子胚用胶囊包封起来，以提供必要的分生组织。还可以将分生组织（也叫全能组织）同许多源隔离开，包括由植物的体细胞组织诱导形成这样的组织。
通常与分生组织包含在一起的附属结构和化合物可以用各种佐剂来代替或加以补充，这些佐剂包括将改变植物或其环境，能使该组织茁壮生长並更有效地争夺资源的微生物和生物活性化合物。可以将这些不同的佐剂一起混合在均匀的溶液中，然后形成胶体。作为一种供选择的方案，可以将这些分生组织注射到预制的凝胶中，或者层积在一个核心（例如含有分生组织）上构成一个各组分按供给和释放的特定顺序排列的多层被囊。作为另一个可供选择的方案，可以将被囊的各组分制成微胶囊，或者进行相反处理，以阻止或控制被囊内的其他佐剂或材料。再有一个可供选择的方案，可以在凝胶进行脱水时将这些组分加到凝胶中。
根据本发明的一个观点，通过将这些组分包封在凝胶或聚合物中並干燥除去部分水分，把分生组织和佐剂结合在一起以便运送。凝胶和聚合物可以控制分生组织的萌芽和发育以及佐剂的释放及其作用。此外，根据本发明的另一个观点，在组织脱水的过程中将分生组织和佐剂结合以便于运送。
分生组织的选择
植物种子是一个机构，它逐渐演化使植物的子一代能够转移到适于发育和生长的地点。植物种子的基本组成部分是分化产生完整植物体的分生组织。
从大多数植物和作物中可以很容易得到植物种子。种子生产方法对于这一产业来说是人们所熟知的。例如，见J.Janick，R.W.Schery，F.W.Woods，V.W.Ruttan，“Plant    Science”（W.H.Freeman，San    Francisco，1974）;以及H.T.Hartmann    and    D.E.Kester，“Plant    Propagation”（Prentice-Hall，Englewood    Cliffs，N.J.，1975）。因此，按照本发明，意图在于将任何可以得到的植物种子除去皮后胶囊包封起来。
可以将培养的植物组织从许多源分离出，包括体细胞组织、合子组织或种系组织。不管其来源如何，这种组织必须经过分生组织阶段，以便进行器官发生並发育成新生的植物体。
通常与繁殖无关的体细胞组织源，在适当的诱导情况下可以产生分生组织。
作为制备包封的体细胞胚的第一步，必须选择能够体细胞胚胎发生的作物品系。关于一份有代表性的这类植物种的目录，请参看D.A.Evans    and    D.R.Sharp，“Application    of    Tissue.Culture    Technology    in    the    Agricultural    Indust-ry”in    Application    and    Plant    Cell    and    Tissue    Culture    to    Agriculture    and    Industry，D.T，Tomes    et    al.，editors，（University    of    Guelph    Press，Page    214，1982）。随着进一步的试验和技术的精细还可能出现更多的能够体细胞胚胎发生的植物种。
一旦选定了合适的作物品系，就可以采用任何已知技术进行体细胞胚的制备。例如苜蓿，见K.A.Walker    and    S.J.Sato， “Morphogenesis    in    Callus    Tissue    of    Medicago    Sativa：the    Role    of    Ammonium    Ion    in    Somatic    Embryogenesis，”Plant    Cell    Tiss.Org.Cult.1：109-121（1981）。关于这一领域的其他已知技术，例如，见Street，H.E.，ed.，“Plant    Tissue    and    Cell    Culture”University    of    Califonia    Press（1977）。
某些其他植物种的体细胞组织不经过形成体细胞胚的中间体就能进行枝条器官发生。见T.Murashige，“Plant    Propagation    Through    Tissue    Culture”Ann.Rev.Plant    Physiol.25：135-146（1974）。从这些植物得到的组织可以不经过予先胚胎发生阶段用胶囊包封起来，而后从这些组织长出成熟的植物。
作为一个供选择的方案，例如当植物种不能体细胞胚胎发生时，可以使用合子胚。这些合子胚可以在培养物或悬浮液中生长，然后在不带天然种皮的情况下用胶囊包封起来。
在某些远缘杂交中，形成了能育胚，但胚乳不能发育，于是胚死亡。因此这种杂交看来似乎是不育的，但是，把上述胚从出了故障的胚珠分离后，可以得到有生存力的子一代。可以将合子胚同其种皮分离，然后同促进其生长並增强其生存能力的佐剂一起用胶囊包封起来。例如，见M.Monnier，“Cultnre    of    Zygotic    Embryos，”Frontiers    of    Plant    Tissue    Culture，T.A.Thorpe，ed.（The    International    Association    for    Plant    Tissue    Culture，University    of    Calgary，Alberta，Canada，P.277-280，1978）。
包封培养基凝胶
一般认为，对种子涂敷各种物质可以促进其萌芽和发育。例如，曾报导，对种子涂敷Super    Slurper（USDA）会形成有吸水能力的储液空间，它提高了在干旱环境中的发芽率。
有人提出，易腐败的食物可以通过涂敷配合的碳水化合物进行保存，例如Earle的美国专利No.3395024。还有一些对种子涂敷脱水材料的报导，例如用藻酸盐作粘结化合物，见美国专利No.3545129和3698133;Dexter，S.T.and    T.Miyamota，Agron    J.，51：338（1959）。
根据本发明，可以将分生组织包封在提供适宜的胶封基质（下文中称为“凝胶”）的任何培养基或聚合物中。一般地，允许气体扩散而使分生组织或胚能进行呼吸。凝胶应提供一个其强度足以抗外部磨损和有害作用力且其柔韧性足以允许胚生长及其在适当时候萌发的胶囊。
在本发明中使用的凝胶，最好是，但不仅仅是水凝胶或聚合物。它们在凝胶基质区域内含水，但可以随着植物组织脱水而被脱水或者可以以干燥形式置于脱水的胚周围。最好是将各种凝胶作为混合物或以层叠的形式结合起来使用，以获得所要求的结果。当凝胶本身干燥时可以作为植物组织的防护剂。
已发现可用于包封脱水形式的分生组织的凝胶有：藻酸钠、TullanoxTM（烘制的二氧化硅、Tulco ，Inc.，Ayer，Mass.，01432）以及Terra-SorbTM（一种胶化的淀粉水解聚丙烯腈接枝共聚物，Industrial Services International，Inc.）。其他适用的聚合物包括，但不限于：
表1    凝胶剂
Ⅰ.天然聚合物
A.离子键（要求配位剂）
带有明胶的藻酸盐
果胶酸盐
帚叉藻聚糖
果胶
沙菜聚糖（Hypnean）
葡聚糖
罗望子胶（Tamarind）
果阿胶
B.疏水相互作用
直链淀粉
琼脂
琼脂糖
带明胶的琼脂
明胶
淀粉
支链淀粉
玉米皮胶（Cornhull    Gum）
淀粉阿拉伯半乳聚糖
达瓦树胶
Gum    Karagan
Ti    Gum
表1    凝胶剂
Ⅰ.天然聚合物
A.离子键（要求配位剂）
带有明胶的藻酸盐
果胶酸盐
帚叉藻聚糖
果胶
沙菜聚糖（Hypnean）
葡聚糖
罗望子胶（Tamarind）
果阿胶
B.疏水相互作用
直链淀粉
琼脂
琼脂糖
带明胶的琼脂
明胶
淀粉
支链淀粉
玉米皮胶（Cornhull    Gum）
淀粉阿拉伯半乳聚糖
达瓦树胶
Karagan胶（Gum    Karagan）
Ti胶（Ti    Gum）
海昌（羟乙基异丁烯酸酯）
2-甲基-5-乙烯基吡啶-异丁烯酸盐-异丁烯酸
C.离子键
带有聚（乙烯基甲基吡啶鎓）氯化物的聚（苯乙烯磺酸）钠
带有聚（乙烯基苄基三甲基铵）氯化物的聚（苯乙烯磺酸）钠
带有强碱聚阴离子的强酸聚阴离子
Bordon Poly Co.2113
Figure 87100861_IMG3
（乙烯基乙酸酯均聚物）（Borden Co.）
Gelvatol
Figure 87100861_IMG4
（聚乙烯醇树脂）（Monsanto）
Ⅳ.稳定化合物
A.商品名
Super Sluper
Figure 87100861_IMG5
（USDA，SEA-AR，Nor，Reg.Res.Lab）
Viterra （Union Carbide）
Laponite （Laporte（United States）Inc.）
Gelrite
Figure 87100861_IMG8
（Kelco）
Seakem
Figure 87100861_IMG9
（FMC Corporation）
Seaplaque
Figure 87100861_IMG10
（FMC Corporation）
Seaprep
Figure 87100861_IMG11
（FMC Corporation）
IsoGel
Figure 87100861_IMG12
（FMC Corporation）
B.有机化合物
Methylan    Clear    Wallpaper    Paste
乳糖
蜡
蛋白质胶体
C.无机化合物
1.粘土
2.用水溶性塑料例如甲基赛璐珞片（methylcel）粘合的化合物：
飘尘
长石
Celrite
斑脱岩
蛭石
硅藻土
石灰
碳酸钙
3.其他
氧化钙
碳酸镁
碳酸氢钠
尿素
选择最适宜的凝胶
选择用于包封的凝胶通常应具有下列特性（尽管本发明可以以其他方式实施）：
1.适于保护分生组织和使其减少震动的柔软性;
2.内部材料应具有可溶性或形成乳浊液的特性，以使它可以接受和含有佐剂，包括但不限于含水物质或疏水物质;
3.提供防护机械应力屏障的外表面，便于加工并维持分生组织 生存;
4.足够的胶凝强度，以保持被囊完整，但在萌芽时还应使分生组织能够突破以及释放佐剂。
5.不损伤被包封的分生组织而脱水至低于饱和点的性能。
佐剂的选择
已公认，向土壤中、植物的根围以及植物表面加佐剂可以促进植物定居、生长和发育。业已证实，有控制地释放佐剂可以对植物生长提供额外的促进作用。见T.J.Roseman    and    S.Z.Mansdorf“Controlled    Release    Delivery    Systems”（Marcel    Dekker，Inc.，N.Y.，1983）。此外，已公认，为了低温贮藏进行冷冻的植物组织需要防护剂，见K.K.Kartha，“Cryopreservation    of    Plant    Cells    and    Organs”（Newsletter    International    Association    for    Plant    Tissue    Culture，No.45，P.2-15，1985）。
已发现用于包封和涂敷脱水至低于饱和的分生组织的佐剂包括二甲亚砜和葡聚糖。
其他适用的佐剂包括，但不限于：
表2    佐剂
Ⅰ.防护剂
A.渗透化合物
1.蔗糖
2.葡萄糖
3.氯化钙
4.氯化钾
5.海藻糖
6.甘油
7.脯氨酸
B.非渗透化合物
1.聚乙烯吡咯烷酮
2.羟乙基淀粉
3.甘露醇
4.山梨醇
5.聚乙二醇
6.低聚糖
7.聚胺
8.α-生育酚（维生素E）
Ⅱ.农药
A.除草剂
1.苯氧基化合物
2，4-滴
2甲4氯丁酸
2，4，5-涕
治草醚
2.苯甲酸、乙酸及苯二甲酸化合物
草灭平
麦草畏
溴苯腈
草克乐
3.二硝基苯胺、亚硝酸盐、酰胺、乙酰胺和酰基苯胺
氟乐灵
氟草胺
黄草消
4.氨基甲酸酯
苏达灭
黄草灵
Thiobencard
5.杂环氮衍生物
毒草定
杀草强
百草枯（Paraquate）
西玛三嗪
6.尿素化合物
敌草隆
除草定
杀草定
异丙隆
7.金属有机物和无机物
甲胂二钠
8.其他除草剂
矿油
石油芳香烃
乙氧氟甲草醚（Oxyfluorfen）
噻草平
Fluridome
地散磷
扑草灭
赛克津
克草猛
扑草净
拿草特
氯苯胺灵
草不缘
B.杀虫剂
1.环状化合物
内氯甲桥萘
七氯
林丹
灭蚁灵
三嗪农
2.氨基甲酸酯
虫螨威
灭扑威
3.动植物衍生及无机化合物
鱼藤酮
Thiocyclam
4.二苯基化合物
滴滴涕
甲氧滴滴涕
敌蚊隆
胺三氮螨
5.有机磷酸酯
百治磷
硝苯硫酸酯
马拉硫磷
甲拌磷
亚胺硫磷
Penncap M
Figure 87100861_IMG13
（Pennwalt Corp.）
Knoxout 2FM
Figure 87100861_IMG14
（Pennwalt Corp.）
C.杀菌剂
1.无机物
硫酸铜
2.金属有机物
丁二酸镉（Mallinckrodt    Chemical    Works）
3.抗菌素和细菌素
链霉素
环己酰亚胺
Piomy
4.氨基甲酸酯
福美铁
福美锌
福美双
5.有机杀菌剂
萎锈灵
克菌丹
地茂散
苯菌灵
Metalaxyl
D.熏蒸剂、驱虫剂和杀鼠剂
1.熏蒸剂
溴甲烷
二硫化碳
二氯丙烯
威百亩
2.驱虫剂
福美双
萘二甲酐
3.杀鼠剂
杀鼠灵
内氯甲桥萘
Ⅱ.肥料和营养素
过磷酸钙
磷酸钙
磷酸钾
硝酸钾
硝酸钙
硝酸铵
氮
磷酸盐
钾
硫
钙
镁
氨基酸
Ⅳ.能源
糖
碳水化合物
腺苷三磷酸
Ⅴ.微生物
大肠杆菌（Eschericia    coli）
Azospirillum    species
假单胞菌属（Pseudomonas    species）
固氮菌属（Azotobacter）
氰细菌（Cyanobacteria）
Bacillum    thuringiensis
菌根真菌（Mycorrhizal    fungi）
根瘤菌类（Rhizobia    species）
枯草杆菌（Bacillus    subtilis）
Bacterioides    ruminicola
硝酸钙
硝酸铵
氮
磷酸盐
钾
硫
钙
镁
氨基酸
Ⅳ.能源
糖
碳水化合物
腺苷三磷酸
Ⅴ.微生物
大肠杆菌（Eschericia    coli）
固氮螺旋菌（Azospirillum    species）
假单胞菌属（Pseudomonas    species）
固氮菌属（Azotobacter）
氰细菌（Cyanobacteria）
苏云金杆菌（Bacillum    thuringiensis）
菌根真菌（Mycorrhizal    fungi）
根瘤菌类（Rhizobia    species）
枯草杆菌（Bacillus    subtilis）
拟杆菌属类菌体（Bacterioides    ruminicola）
毛状螺旋菌属（Lachnospira    multiparus）
曲霉菌属（Aspergillus    fumigates）
头孢镰刀菌（Fusarium    oxysporum）
拟青霉属（Paecilomyces    species）
黄杆菌属（Flavobacterium    species）
无色杆菌属（Achromobacter    species）
曲霉属（Aspergillus    species）
节杆菌属（Arthobacter    species）
放线菌类（Actinomycete    species）
含盐基质上生的细菌（Halophytic    bacteria）
亚硝化胞菌属（Nitrosomonas    species）
硝化细菌（Nitrobacter    species）
硫矿化细菌（Sulfur    mineralizng    bacteria）
杆状病毒（Baculovirum    species）
玉蜀黍NPV（Heliothis    zea    NPV）
Californica自噬NPV（Autographa    Californica    NPV）
Ⅵ.生长调节剂和激素
赤霉酸
细胞分裂素类
促长啉
萘乙酸
吲哚丁酸
对氯苯氧乙酸乙烯
吲哚基醋酸
加到藻酸钠溶液中，经常使用的浓度是每毫升5至20分生组织。由于分生组织的合适尺寸随植物种、源和发育阶段而改变，因而这一浓度也会变化。
随后可以以特定佐剂使用率的特定浓度向藻酸钠和分生组织溶液中加入要包封的特定佐剂。举例来说，农药可以以每毫升藻酸钠溶液0.0002至2.0000毫升按配方制造的农药（2×10-6至2克活性组分）的浓度添加，常用的浓度是每毫升0.002至0.200毫升按配方制造的农药（2×10-4至0.18克活性组分）;例如，肥料可以以每毫升藻酸钠溶液0.1至200毫克的浓度添加;例如，微生物可以以每毫升藻酸钠溶液1至1012微生物的浓度添加，常用的浓度是每毫升104至1010微生物。碳源可以以每毫升藻酸钠溶液1至500毫克的浓度加入，常用的浓度是每毫升5至100毫克。防护剂可以以每毫升藻酸钠溶液1至1000毫克的浓度加入，常用的浓度是每毫升10至500毫克。
在此之后，可以将分散有佐剂和分生组织的凝胶溶液一滴一滴地加到配位剂中。作为一个供选择的方案，可以采用这一技术领域中的任何已知方法将凝胶溶液和配位剂混合。这些方法可以包括，通过一个从一个源喷出凝胶微滴，而从另一个源对微滴涂以配位剂的振动喷嘴，一步法形成微滴並添加配位剂。作为进一步可供选择的方案，可以不添加配位剂，将带有植物组织的凝胶溶液脱水至低于完全饱和，达到0.1%至99.9%饱和度，一般情况下是1%至80%。
氯化钙（或其他配位剂）可以以1至1000毫摩尔的浓度配制成溶液，常用浓度是20至500毫摩尔，最理想的浓度是50至300毫摩尔。其他的配位剂具有不同的优选浓度范围。
对于选定的凝胶浓度和配位剂浓度，凝胶形成时间和凝胶溶液的温度是相关参数。温度的选择应避免损伤分生组织，通常应在1至50℃范围内，常用范围是10-40℃，最佳范围是20-40℃。
在允许的温度范围内，可以选择一个达到符合完全形成凝胶的最短胶凝时间的具体数值。一般凝胶会立刻形成，而配位所需时间则长得多。对于浓度为每100毫升3.2克水的藻酸钠溶液、浓度为50毫摩尔的氯化钙溶液及25℃的反应温度，在5至120分钟内达到充分胶凝，通常是10-90分钟，一般在20-60分钟内胶凝充分完成。作为一个供选择的方案，如果以300毫摩尔氯化钙代替50毫摩尔氯化钙，胶凝的时间缩短至2-5分钟。
作为一个进一步可供选择的方案，随后可将已配位的凝胶及植物组织脱水至0.1-99.9%的饱和度，常用的是1-80%。
脱水过程可以是快的，1分钟至5天内发生，通常是30分钟至1天。或者反过来，脱水过程也可以是慢的，5天至3个月内发生，通常是7至28天。
上述凝胶特性对于每一种凝胶是可以调整的，但一般由凝胶的浓度参数和化学性质所决定。
被囊硬化
在包封之后，需要通过多种已知技术提高凝胶基质外表面的刚度。这样，可以将较软的凝胶用于包封和包含适宜的添加剂，並且在外表面上可以提高抗磨损和渗透能力，同时又不损失分生组织的生存能力。
可以对被包封的分生组织进行不完全脱水，这将导致产生刚度较高的外表面。
作为一个供选择的方案，可以对由选定的凝胶包封的分生组织再 涂敷一层薄的、刚度较高的凝胶，或者可以将其嵌入一个可以通过商业途径买到的明胶囊中。
此外，还可以用各种本技术领域已知的化学试剂硬化处理该表面，来提高凝胶表面破裂抗力。
这些技术包括（不是全部）：
表3    被囊涂料化合物
Ⅰ.凝聚
明胶和阿拉伯树胶
带有硝酸纤维素的卵磷脂和脑磷脂
带有硝酸纤维素的石蜡油
Ⅱ.界面聚合
带有己二胺的癸二酰氯化物
Ⅲ.丹宁酸
柿子丹宁
中国棓丹宁
Ⅳ.聚氨基酸
聚乌氨酸
聚赖氨酸
聚瓜氨酸
聚精氨酸
聚组氨酸
聚谷氨酰胺
聚亮氨酸氨基酸组合（Combination    of    Poly-L-Amino    acids）
Ⅴ.戊二醛
带明胶的戊二醛
Ⅵ.明胶胶囊
Ⅶ.肠涂料（Enteric    Coating）
甲基乙烯基醚/马来酐
苯乙烯马来酸共聚物
苯乙烯马来酐共聚物
乙烯/马来酐共聚物
Ⅷ.疏水聚合物
乙基纤维素
异丙基肉豆蔻酸酯
聚乙酸乙酸酯酞酸酯
淀粉乙酸酯酞酸酯
纤维素乙酸酯酞酸酯
萨冉树脂
丁基橡胶
Ⅸ.其他化合物
角蛋白
虫胶
加拿巴蜡
石蜡
蜡
脂肪
类脂
甘油三酸酯
乙烯乙烯基乙酸酯共聚物
苄基纤维素
矿脂
Elvax 4260
Figure 87100861_IMG15
（乙烯乙烯基乙酸酯丙烯酸三元共聚物，Dupont，Wilmington，DE）
鲸蜡代用品（J.B.Ross    co.，Jersey    City，N.J.）
Elvax 310
Figure 87100861_IMG16
（乙烯乙烯基乙酸酯共聚物，Dupont）
Gantrez ES-435
Figure 87100861_IMG17
（GAF Corporation）
在利用使胶囊外表面硬化的方法时，必须小心谨慎，以避免损伤分生组织。例如，用戊二醛交联凝胶基质将提供表面强度，但如果施加戊二醛的时间过长，它将完全穿透凝胶，损伤分生组织。施加戊二醛的时间随凝胶材料、凝胶涂层厚度及溶液的温度不同而改变。
已经指出，上述某些处理，例如聚赖氨酸将会改变凝胶的贮水特性，但是不改变破裂强度。因此，通过多种处理的适当组合可以将大部分凝胶特性调整到所需要的值。
在农业生产中，一般地说收获最好是在适当的季节进行並且最好在短时间内完成。因此，在凝胶处理之前或在凝胶处理过程中，最好是通过对本技术领域已知的方法，例如使用有丝分裂阻抑剂或通过筛子筛分使分生组织或胚的萌发同步进行，这样，任何已定的一批包封的分生组织、体细胞胚或不带种皮的种子将在大体相同的时间萌芽。可以使用各种盐控制和阻止分生组织萌芽，特别是渗透活性的一价盐。
高的渗透势也将控制分生组织萌芽。例如，以每升水中的重量（克）计浓度为6-20%（一般是8-15%，最好是10-14 %）的蔗糖，当包封在藻酸钙被囊中时可以控制从种皮分离的芸苔属植物合子胚的萌芽。当将包封的芸苔属植物合子胚和蔗糖贮存在一个密封的容器中，这种萌芽控制至少持续一个月有效。当放置在Schenk    and    Hildebrandt培养基（SH）（Can.J.Bot.50：199-204，1972）上时，这些胚以与对照物相等的比率迅速而均匀地萌芽了。
作为盐或蔗糖的替代物，脱落酸也影响合子胚萌芽。例如，浓度为10-3-10-6摩尔的脱落酸，通常为10-4至10-5摩尔，可以同样地控制分离的芸苔属植物胚萌发。
作为另一个可供选择的方案，在0-10℃低温下（一般为2-8℃）贮存包封的种子或胚同时配合使用任何盐、蔗糖或脱落酸也可以控制分离的胚萌发。
在包封或种植之后，可能需要对包封的分生组织进行贮藏，将其移植至大田、温室或苗圃中，以及按照与植物种子一致的方式对其进行处理。可以将这些包封的分生组织种植在苗圃里或温室中，因为作物种不经过适应某些气候阶段就不能承受外界气候条件。另一方面，对于比较耐寒的作物种，可以通过在植物种子技术领域中所使用的多种方法将包封的分生组织直接种植到大田里。
本发明的方法具有以下的优点和效能：
根据本发明的方法，可将培养的植物组织与有害的环境隔绝;并可诱导分生组织、体细胞胚或组织培养的幼苗进一步成熟，以使植物组织更容易、更快並且更均匀地形成完整的植物。
形成更茁壮并且发充更完全的分生组织、体细胞胚或组织培养的幼苗。本发明的方法还可控制植物组织的发育进程，从而减少或消除体细胞克隆和其他的变化。应用本发明的方法，可减少植物组织的水分，从而减少新陈代谢、DNA合成以及细胞分裂并确保抑制发育，为经过改良的提高了贮藏寿命的植物组织创造条件。应用本发明的方法使植物组织脱水，其效果是使DNA修复，以及使发育基因关闭，启动萌芽和生长基因，还可以获得激素平衡和质膜完整性，为更完全成熟和整个植物恢复创造条件。本发明的方法还提供一个供遗传学上改良或转化幼苗用的无性繁殖系统，其中被修饰基因或染色体不会稳定地整合到植物基因组中。应用本发明的方法还可以缩短由分生组织、体细胞胚或组织培养幼苗形成成熟的或富有活力的籽苗所需的时间;并可提供一种将培养的植物组织同促进籽苗群丛定居的佐剂一起运送的培养基;减少在培养的植物组织发育和将其在大田里种植之间的加工量;减少在培养的植物发育和生长过程中对于特殊加工方法和特殊技术的需要，因而由于适合于现有种子栽培方法而克服引进这一新技术的阻力;提供了大规模地、经济地无性繁殖优良植物或杂交植物的方法。
为了说明本发明，用各种分生材料、凝胶介质和佐剂进行了下述实验。所有标示百分比（%）的量，除非另有说明都是每100毫升克。
实施例A：（紫苜蓿体细胞胚）
1.没有培养基脱水的裸露紫苜蓿体细胞胚
将紫苜蓿（Medicago    sativa    L.strain    RA-3）的愈伤组织在补充有50微摩尔2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-滴）和5微摩尔激动素的Shenk    and    Hildebrandt培养基（Medium    and    Techniques    for    Induction    and    Growth    of    Monocotyledenous    and    Dicotyledenous    Cell    Culture    Can.J.Bot.50：199-204，1972）中暴露至3-4天，诱发其形成体细胞胚。然后将组织转移到没有2，4-滴和激动素的SH再生培养基中。这一处置方法在下列文献中有详细说明：K.A.Walker，et    al.“The    Hormonal    Control    of    Organ    Formation    in    Callus    of    Medicago    sativa    L.Cultured    In    Vitro，”Am.J.Bot.65：654-659（1978）;K.A.Walker，et    al.，“Organog-enesis    in    Callus    Tissue    of    Medicago    Sativa，The    Temporal    Separation    of    Induction    Process    from    Differentiation    Processes，”Plant    Sci.Lett.16：23-30（1979）;及D.Stuart    and    S.Strickland，“Somatic    Embryogenesis    from    Cell    Cultures    of    Medicago    Sativa    L.，”Plant    Sci.Lett.34：134-181，1984，正如本文其他部分引证这些文献一样，在这里引入上述文献以供参考。
没有培养基在相对湿度10-20%的无菌气氛条件下于25℃将紫苜蓿体细胞胚风干15至25分钟。将体细胞胚置于补充有1.5%（重量/体积）麦芽糖和25μM赤霉酸而不是1.5%蔗糖的半浓度的Shenk    and    Hildebrandt培养基上，以确定成活率。
20分钟后体细胞胚被干燥至完全饱和的体细胞胚鲜重的8%。成活的体细胞胚是体细胞胚总数的43%。经过脱水的体细胞胚有43%萌芽，而未经脱水的对照物萌芽率为30%。
1a.作为一个可供选择的脱水持续时间，将体细胞胚脱水15分钟，成活率是88%。
1b.作为一个可供选择的干重，将体细胞胚脱水至其鲜重的64%，成活率为80%。
2.用培养基脱水的裸露紫苜蓿体细胞胚
重复A.1的实验程序，但附加一条，即体细胞胚是在一个悬浮在补充有1.5%（重量/体积）麦芽糖而不是1.5%（重量/体积）蔗糖的半浓度Shenk    and    Hildbrandt液体培养基中的滤纸筏上进行风干。将一张滤纸折叠，然后插入一个Magenta    Box（Magenta    Corporation    Cnicago    IL）中，使滤纸的边缘处在液体培养基中，而其中心的平展区在培养基的上面。在风干开始时，带有胚的筏悬浮于80毫升的培养基中。20天后培养基已蒸发至68毫升。这些体细胞胚以30%的比率产生幼苗，相比之下未经风干的体细胞胚（对照物）为21%。
2a.作为供选用的培养基体积，使用60毫升的培养基。20天后培养基已蒸发至48毫升。体细胞胚以41%的比率产生幼苗，相比之下对照物为21%。
2b.作为供选用的培养基体积，使用40毫升的培养基。20天后培养基已蒸发至25毫升。体细胞胚以32%的比率产生幼苗，相比之下对照物为21%。
2c.作为供选用的培养基体积，使用20毫升的培养基。20天后培 养基已蒸发至7毫升。体细胞胚以33%的比率产生幼苗，而对照物为21%。
3.包封经过脱水的紫苜蓿体细胞胚
重复实施例A，1的实验程序，但在体细胞胚脱水之后增加一最后步骤，即将经过脱水的体细胞胚悬浮于2%（重量/体积）藻酸钠混合物中并在100毫摩尔的氯化钙溶液中配位形成藻酸钙珠粒。体细胞胚萌芽为总数的57%。
3a.作为一种供选用的包封培养基，使用一种TullanoxTM（Tulco
Figure 87100861_IMG18
，Inc.）（烘制的二氧化硅）涂敷脱水的体细胞胚。涂敷方法是使体细胞胚在TullanoxTM粉末中滚动。体细胞胚的成活率为42%。
4.使经过包封的紫苜蓿体细胞胚脱水
重复实施例A，1的实验程序，但有一点不同，在脱水之前将体细胞胚包封在用100毫摩尔氯化钙配位的2%藻酸盐溶液中。体细胞胚的成活率为总数的90%。
4a.作为一种供选用的包封基质，在脱水之前用2%（重量/体积）藻酸钠涂敷体细胞胚。成活率为80%。
4b.作为一种供选用的包封基质，在脱水之前用2%（重量/体积）的Terra-Sorb
Figure 87100861_IMG19
（Industrial Services International Inc.）涂敷体细胞胚。成活率为80%。
5.防护剂
重复实施例A，4a的实验程序，不同的是向藻酸钠混合物中加入5%（重量/体积）二甲亚砜。体细胞胚的成活率为90%。
5a.作为一种供选用的防护剂，使用10%（重量/体积）葡 聚糖。体细胞成活率为50%。
6.长时间脱水
重复实施例A，1的实验程序，不同的是，将体细胞胚在一个密封的陪氏培养皿中，于4℃缓慢脱水110天，该培养皿中有含3%（重量/体积）蔗糖、10毫摩尔铵和30毫摩尔L-脯氨酸的Shenk    and    Hildebrandt培养基。110天后培养基完全干透。体细胞胚成活率为27%。
7.体细胞胚成熟
重复实施例A，1的实验程序，不同的是，将再生后的体细胞胚放在含3%（重量/体积）蔗糖和10微摩尔脱落酸的Shenk    and    Hildebrandt培养基上，以进行14天的成熟。随后将胚在一个没有培养基的敞口陪氏培养皿中脱水60分钟。然后将胚放置在含1.5%（重量/体积）蔗糖的半浓度Shenk    and    Hildebrandt培养基上，以使其萌芽。这些胚以85%的比率萌芽，而没有经过脱落酸成熟处理的胚发芽率为0%。
实施例B：（旱芹体细胞胚）
1.裸露的体细胞胚
由放在含0.5-25微摩尔激动素的Shenk    and    Hildebrandt培养基上的、生长了2星期的幼苗的下胚轴和子叶诱发旱芹（Apium    graveolens    L.Strain    Calmario）愈创组织。在转移至含25毫摩尔硝酸铵的Shenk    and    Hildebrandt培养基后一到三个月形成了体细胞胚。为了固定和保持胚，使体细胞胚在含12%蔗糖的Shenk    and    Hildebrandt培养基上成熟。蔗糖渗透剂抑制了胚萌芽。在除去渗透剂后胚萌发了，其发芽率与未受抑 制的胚相同。
1a.作为一种可供选用的脱水剂，用12%的麦芽糖代替蔗糖。麦芽糖抑制了萌芽。在除去渗透剂后，受到抑制的胚发芽了，其发芽率与未经抑制的胚相同。
1b.作为一种可供选用的脱水剂，用10-4至10-7毫摩尔脱落酸代替蔗糖。脱落酸抑制了萌芽。在渗透剂被除去后，受抑制的胚以与未受抑制的对照物相等的发芽率萌芽。
1c.作为一种可供选用的脱水剂，用0.26至0.44毫摩尔的氯化钠代替蔗糖。氯化钠抑制了萌芽。在渗透剂被除去后，受抑制的胚以与未受抑制的对照物相等的发芽率萌芽。
1d.作为一种可供选用的脱水剂，用0.04至0.4摩尔甘露醇代替蔗糖。甘露醇抑制了萌芽。在除去该渗透剂后，受抑制的胚发芽了，其发芽率与未受抑制的对照物相等。
实施例C：（油菜合子胚）
1.裸露的合子胚
在授粉后2或4周，从野地果生长的油菜（Brassica    campestris    L.植物上去掉花卵囊。从包含在花卵囊内的胚珠上切下合子胚，将其放在20毫升琼脂固化的Monnier的12%（重量/体积）蔗糖培养基（M.Monnier，“Culture    of    Zygotic    Embryos”Frontiers    of    Plant    Tissus    Culture，T.A.Thorpe，Ed.，International    Association    for    Plant    Tissue    Culture，University    of    Calgary，Alberta，Canada，PP.277-280，1980）上，然后在盛有150毫升Drierite的密封容器中将其放置2星期。在这样的干燥条件下胚 没有发芽而是继续成熟。当转移至Monnier的2%蔗糖培养基中时，胚以100%的发芽率萌芽，相比之下未经干燥的胚发芽率是90%。
1a.作为一种可供选用的干燥剂，将100毫升3.43摩尔的硫酸溶液放入装有分离的合子胚的密封容器中。在干燥后将胚转移至Monnier的蔗糖培养基时，胚以与未经脱水的胚相等的发芽率萌芽。
2.包封的合子胚
重复实施例C，1的实验程序，但增加将合子胚包封在用100毫摩尔藻酸钙配位的2%（重量/体积）藻酸钠溶液中的步骤。将经过包封的合子胚在盛有含12%（重量/体积）蔗糖的藻酸钠混合物的密封容器中贮存2星期。当放置在带有2%（重量/体积）蔗糖的Shenk    and    Hildebrandt培养基上时，经过包封的合子胚很快以75%的发芽率萌发，相比之下对照物发芽率为60%。
2a.作为一种供选用的发芽抑制剂，用10-6摩尔的脱落酸代替蔗糖。萌芽被完全抑制达2星期之久。当将胚转移至Monnier的2%培养基时，胚以20%的发芽率萌芽。
3.在被囊中脱水
按实施例c，2的实验程序，将油菜（Brassica campestris L.）合子胚包封起来。使被囊在硫酸溶液上方干燥一星期。这时，胚周围的藻酸盐已经干燥，其破裂强度大于60公斤/厘米2（新包封的胚破裂强度为7-15公斤/厘米2）。将经过干燥的被囊放置在含有2%（重量/体积）蔗糖的培养基（见实施例c，1）中，胚开始发芽，幼苗以45%的比率再生，相比之下对照物的萌芽率为60%。
为了清楚理解起见，对上述发明已进行了详细说明，但应意识到，在不超出所附权利要求的精神和范围内，可以对本发明进行多种改进。

Claims (34)

1、一种用于分离有潜力分化产生完整植物体的全能分生组织以产生天然植物种子的类似物的方法，该方法包括：
对上述的分生组织进行脱水，以使该组织的饱和水含量低于99.9%。
2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的分生组织基本上不含植物附属结构。
3、按照权利要求2所述的方法，其特征在于分生组织来自体细胞组织。
4、按照权利要求3所述的方法，其特征在于体细胞组织是由紫苜蓿（Medicago  Sativa  L.）、旱芹（Apium  graveolens  L.）和油菜（Brassica  campestris  L.）构成的组中选出的一种植物。
5、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的分生组织来自合子组织。
6、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的分生组织来自种系组织。
7、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的分生组织是已被诱发形成发芽分生组织的组织。
8、按照权利要求3所述的方法，其特征在于，通过进一步诱导体细胞胚成熟而提高发芽率和植物再生率。
9、按照权利要求3所述的方法，其特征在于对体细胞胚进行缓慢脱水。
10、按照权利要求8所述的方法，其特征在于，在脱水之前使体细胞胚在脱落酸培养基上成熟。
11、按照权利要求8所述的方法其特征在于，通过使用从含有蔗糖、麦芽糖、脱落酸、氯化钠和甘露醇的组中选出的一种控制化学制剂抑制发芽，使体细胞胚进一步成熟。
12、一种用于分离有潜力分化产生完整植物体的全能组织以产生天然植物种子的类似物的方法，该方法包括：
将上述经过分离的分生组织包封在允许所述植物体发育的水合胶囊中;以及
对该胶囊进行脱水，直至分生组织的饱和含量低于99.9%。
13、按照权利要求12所述的方法，其特征在于包封所述的分生组织，基本上不含有植物的附属结构。
14、按照权利要求13所述的方法，其特征在于分生组织取自体细胞胚。
15、按照权利要求14所述的方法，其特征在于体细胞组织是由紫苜蓿（Medicago  Sativa  L.）、旱芹（Apium  graveolens  L.）和油菜（Brassica  campestris  L.）构成的组中选出的一种植物。
16、按照权利要求12所述的方法，其特征在于所述的分生组织取自合子组织。
17、按照权利要求12所述的方法，其特征在于所述的分生组织取自种系组织。
18、按照权利要求12所述的方法，其特征在于所述的分生组织是已被诱发形成发芽分生组织的组织。
19、按照权利要求12所述的方法，其特征在于所述的凝胶包含一种或多种性质不同的凝胶剂。
20、按照权利要求12所述的方法，其特征在于所述凝胶还包含生物活性佐剂。
21、按照权利要求12所述的方法，其特征在于凝胶选自由藻酸钠、用钙盐配位的藻酸钠以及Terra-Sorb 组成的组。
22、按照权利要求21所述的方法，其特征在于向凝胶中加入一种防护剂，该防护剂选自二甲亚砜和葡聚糖。
23、一种用于分离有潜力分化产生完整植物体的全能分生组织以产生天然植物种子的类似物的方法，该方法包括：
将所述的分生组织脱水，以使该组织的饱和含量低于99.9%;以及
将上述经过分离、脱水的分生组织包封在允许所述植物体发育的水合凝胶囊中。
24、按照权利要求23所述的方法，它还包括对含有脱水分生组织的上述水合凝胶囊进行脱水，以使该凝胶的饱和含量低于99.9%。
25、按照权利要求23所述的方法，其特征在于包封所述的分生组织，基本上不含有植物的附属结构。
26、按照权利要求23所述的方法，其特征在于分生组织取自体细胞组织。
27、按照权利要求23所述的方法，其特征在于体细胞组织是由紫苜蓿（Medicago  Sativa  L.）、旱芹（Apium  graveolens  L.）和油菜（Brassica  campestris  L.）构成的组中选出的一种植物。
28、按照权利要求23所述的方法，其特征在于所述的分生组织取自合子组织。
29、按照权利要求23所述的方法，其特征在于所述的分生组织取自种系组织。
30、按照权利要求23所述的方法，其特征在于所述的分生组织是已被诱发形成发芽分生组织的组织。
31、按照权利要求23所述的方法，其特征在于所述的凝胶包含一种或多种性质不同的凝胶剂。
32、按照权利要求23所述的方法，其特征在于所述的凝胶还含有生物活性佐剂。
33、按照权利要求23所述的方法，其特征在于凝胶是用钙盐配位的藻酸钠。
34、按照权利要求23所述的方法，其特征在于凝胶是烘制的二氧化硅。
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