CN101671388A

CN101671388A - 血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用

Info

Publication number: CN101671388A
Application number: CN200810222101A
Authority: CN
Inventors: 曹国栋; 陈俊; 罗玉敏; 吉训明; 邢娟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2008-09-09
Publication date: 2010-03-17
Anticipated expiration: 2028-09-09
Also published as: CN101671388B

Abstract

本发明公开了一种血脑屏障穿透性促红细胞生成素，属于生物制药领域。血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于：在野生型EPO或野生型EPO的衍生物的羧基末端连接有具有蛋白转导功能PTD，选自：(1)HIV TAT；(2)由5－10个精氨酸组成的多聚精氨酸；(3)果蝇控制触角基因的同源结构域；(4)单纯疱疹病毒VP22。本发明的创新性在于：与野生型EPO相比EPO－TAT具有两个优势：第一，EPO－TAT可显著减少治疗脑卒中所需EPO的剂量，从而明显减轻了EPO的副作用；第二，EPO－TAT可以延长脑卒中治疗时间，从而使更多脑卒中病人达到治疗。

Description

血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用

技术领域

本发明涉及一种促红细胞生成素及其应用，具体地说是一种血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用，属于生物制药领域。

背景技术

近年来，促红细胞生成素(EPO)已经成为在缺血性脑卒中神经保护治疗方面最有前景的药物之一。在体外和体内的缺血损伤模型的研究中，EPO都显示具有强烈的神经保护作用。最近，一个应用EPO治疗急性脑卒中的临床试验证明：EPO可以减少脑卒中患者脑梗死面积，促进神经功能的恢复。因此，在脑卒中治疗中，尤其对错过治疗时间窗，不适合应用组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂治疗的患者，EPO显示了一个潜在的令人鼓舞的临床应用前景。但是，EPO的临床应用也面临着一个重大的挑战：如何能更有效地使EPO穿透血脑屏障(BBB)EPO通过与神经元的受体结合而发挥作用，而EPO与神经元的结合能力远远低于EPO与红母细胞的结合能力，约为其千分之一。此外，由于BBB的作用，注射到体内的EPO只有大约1％穿过BBB而进入大脑，所以，要使EPO在脑内达到有效浓度，须加大注射剂量。临床上已报道用于治疗脑卒中的EPO剂量为33000U/次，每天一次，此剂量远远高于治疗贫血的维持剂量3500U/次，每周两次。实验室用于治疗脑卒中的剂量则更高，为5000U/kg体重。此外，EPO在血液中的半衰期短，需要多次注射才能维持其神经保护作用。大剂量，反复多次注射EPO可能致使其红细胞比容增加[8]，刺激血小板生成，增加微小梗塞灶，形成大梗死灶的危险性亦增加，从而，严格地限制甚至阻止了EPO在脑卒中治疗中的应用。因此，通过促进或增加EPO穿透BBB的能力，将大大降低EPO的用量，从而，降低EPO的促红细胞生成作用和其他潜在副作用，大大地增进EPO在脑卒中治疗中临床应用的可能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种对血脑屏障具有穿透性的促红细胞生成素。

本发明要解决的另一个技术问题是：提供促红细胞生成素在制备治疗缺血性脑卒中神经保护治疗药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

血脑屏障穿透性促红细胞生成素，在野生型EPO或野生型EPO衍生物的羧基末端连接有具有蛋白转导功能的蛋白转导序列(PTD)。蛋白转导序列包括：

(1)HIV TAT；

(2)由5-10个精氨酸组成的多聚精氨酸；

(3)果蝇控制触角基因的同源结构域；

(4)单纯疱疹病毒VP22。

所述HIV TAT标记为含有11个氨基酸残基RGRKKRRQRRR的肽或来自HIV TAT的其它肽段。

所述野生型EPO的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2；成熟的人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表SEQ ID No.3；具有蛋白转导功能的人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表SEQ ID No.4；具有蛋白转导功能的突变型人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5至No.11。

所述野生型EPO的衍生物包括由氨基酸定点突变而产生的突变型EPO、甲酰化EPO(Carbamylated EPO)、或无唾液酸EPO(asiaoerythropoietin EPO)。

所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素在制备药物中的应用，所述药物是治疗脑卒中、急性心肌梗死、外伤性脑损伤、脊髓损伤、急性外伤性器官损伤、急性中毒、急性器官衰竭以及麻醉意外、外伤或疾病引起的呼吸或心跳暂停而引起的全身器官衰竭的药物。

我们构建了表达EPO-TAT融合蛋白和二氢叶酸还原酶(DHFR)的双顺反子质粒，将此载体导入DHFR缺失的中国仓鼠细胞后，用DHFR的相似体氨甲喋林进行筛选，诱导，扩增导入的DNA，使蛋白表达倍增。简而言之，用PCR方法将HIV的TAT加至EPO cDNA的3’端，同时引入六个组氨酸残基组成的his-6标记，用于分离、纯化EPO-TAT融合蛋白。PCR扩增的EPO-TAT-his-6用EcoRV和EcoRI消化后插入pIRES-EYFP质粒(Clontech，Mountain View，USA)，然后用鼠的(DHFR)置换EYFP，详细步骤见下述具体实施方式实施例1。

EPO是一种糖基化蛋白，只有糖基化的EPO才有生物学活性。大肠杆菌由于缺乏糖基化的酶而不具有糖基化机制。因此，为获得适当的糖基化作用，EPO需在哺乳动物体系里表达。最常用的体系是缺乏DHFR的CHO细胞，此细胞由于缺乏DHFR，可用DHFR类似物氨甲喋林进行选择性扩增导入的DNA。详细步骤见实施例2。

人类EPO cDNA(序列SEQ ID No.1)编码193个氨基酸(序列SEQ ID No.2)，EPO初级蛋白合成后，其氨基端含27个氨基酸残基的信号肽经切割后变为成熟EPO(序列SEQ ID No.3)。因此成熟的人类EPO为166个氨基酸。本发明所采用的野生型EPO的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2；成熟的人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表SEQ ID No.3；具有蛋白转导功能的人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表SEQ ID No.4；具有蛋白转导功能的突变型人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5至No.11。

本发明的优点与效益在于：本发明已经建立了一个稳定的哺乳动物细胞株，它可以产生和分泌具有生物学活性的(糖基化的)EPO融合蛋白，而此蛋白含有来自HIV反式作用转录激活子(TAT)的蛋白转导域(PTD)(图1-2)。我们前期数据实验表明：(1)体外实验证明EPO-TAT与野生型EPO一样，具有对缺血缺氧以及兴奋性损伤具有很强的神经保护作用(图3)；(2)全身给药后在鼠脑内EPO-TAT的转运量比野生型EPO的转运量增加了2.5倍(图4)；(3)重要的是，我们发现在鼠局灶性脑缺血模型中，EPO-TAT减少脑梗死的效率远远高于野生型EPO，如图5所示：1000U/kg的EPO-TAT可明显减少脑梗死体积，其效果与使用5000U/kg野生型EPO相似；(4)此外，因为TAT增加了EPO通过BBB的转运率，所以EPO-TAT比野生型EPO在脑内能更快更早达到有效的治疗浓度，延长了治疗的有效时间窗。

与野生型EPO相比EPO-TAT具有两个优势：第一，EPO-TAT可显著减少治疗脑卒中所需EPO的剂量，从而明显减轻了EPO的副作用；第二，EPO-TAT可以延长脑卒中治疗时间窗，从而使更多脑卒中病人达到治疗。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1-A为EPO-TAT全基因序列示意图。

图1-B为表达质粒pEPO-TAT-IRES的物理图，用PCR方法将HIV TAT加至EPO cDNA的3′端，同时引入由六个组氨酸残基组成的his-6标记，用于分离、纯化EPO-TAT融合蛋白。PCR扩增的EPO-TAT-his-6用EcoRV和EcoRI消化后插入pIRES-EYFP质粒(Clontech)，然后用鼠DHFR置换EYFP。

图2为稳定表达EPO-TAT融合蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株的建立及其EPO-TAT融合蛋白的制备及纯化。pEPO-TAT-DHFR转染CHO DG44细胞(DHFR-/-)。用氨甲喋啉进行诱导扩增，剂量从5pM逐渐扩增到20uM。取2μl培养基上清液用Western blot分析EPO-TAT的表达。如图2-A所示，我们成功地分离纯化了EPO-TAT，分子量约36-45kD(泳道5-7)，其分子量比没有TAT的野生型EPO(泳道2-4)商用标准EPO(泳道1)大1～2kD。图2-B显示特定表达的EPO-TAT融合蛋白。

图3为小鼠体内实验证明，TAT能增加EPO血脑屏障通过率。腹腔注射EPO-TAT或EPO(5000U/kg BW)3小时后收集血浆和脑脊液(CSF)。通过ELSIA检测在血浆(图3-A)或脑脊液(图3-B)中EPO蛋白含量。数据为平均数±标准差(n＝4)表示。*p＜0.05，**p＜0.01，与盐水对照组比较。##p＜0.01，与野生型EPO组比较。

图4为体外实验，提示EPO-TAT具有抗OGD和NMDA的脑保护作用。用1U/ml的EPO-TAT或EPO处理制备的皮层神经元24h后，然后给与OGD或NMDA毒性的刺激。图4-A示暴露于90分钟OGD后给予正常糖氧浓度24小时后的神经元。取培养基检测LDH活性，作为细胞死亡的标记。图中数据显示的是与单独OGD对照组的LDH释放比例。图4-B示神经元接受200μM NMDA刺激15分钟后恢复到正常培养基，再培养24小时。细胞核用烟酸己可碱染色，计数浓缩及片段化的细胞核比例。TAT-GFP融合蛋白作为对照。数据表示为平均值±标准误，每视野取12-18个点，由3名与实验无关的技术员计数。***p＜0.001与OGD对照。**p＜0.01与单纯NMDA对照。

图5为小鼠体内实验，证明与野生型EPO相比，EPO-TAT更能有效减少小鼠大脑中动脉阻塞模型脑梗死体积。小鼠缺血60min注即刻腹腔注射EPO-TAT或EPO，缺血72h后TTC染色。图5-A分别为对照组，EPO-TAT和野生型EPO的MCAO大鼠脑的冠状切面TTC染色照片。图5-B为。数据用平均数±标准差表示(n＝9)。**p＜0.01与空白对照组比较，#p＜0.05与EPO(1000U/kg)比较。多组间比较使用方差分析(ANOVA)和post hoc Student-Newman-keuls tests。

具体实施方式

实施例1：载体制备

一、人类EPO cDNA的扩增

人类EPO cDNA编码193个氨基酸，EPO初级蛋白合成后，其氨基端含27个氨基酸残基的信号肽经切割后变为成熟EPO。因此成熟的人类EPO为166个氨基酸。最近研究发现第166号氨基酸精氨酸也被切割。基于上述研究结果，我们在构建含有HIV TAT转导序列的融合蛋白时，将HIV的TAT以及用于分离纯化的组氨酸标签加于EPO cDNA的3’端，同时将第166号精氨酸删除。含有HIVTAT标签的人类EPO cDNA用PCR方法从人类肾脏Marathon-ready cDNA文库(Clontech，USA)中扩增。引物设计依照已发表的人类EPO cDNA序列(基因序列号：NM000799)。其中上游序列含有EcoRV及KOZAK序列(划线部分)5’ACgATATCgCCACCATgggggTgCACgAATgT CTTgC-3’。下游为95bp的长引物，从3’至5’依次含有EPO下游序列(小写部分)，编码11个氨基残基的HIV TAT标签(下划线部分)，六个组氨酸组成的组氨酸标签(斜体部分)以及EcoRV克隆位点(方框部分)。在不同肽段之间加入甘氨酸残基(黑体部分)，便于从功能上分隔不同肽段以及肽段的自由旋转。EPO-TAT下游引物序列为：5’AGT

TCAATGATGATGATGATGGTGACCGCGTCGGCGCTGTCGGCGTTTTTTGCGGCCAT AACCgtcccctgccctgcaggcctcccctg-3’。PCR反应条件为：上述两引物各10pmol，Marathon cDNA 2μl，Accuprime^TM Taq DNA polymerase(Invitrogen，Carlsbad，美国)1μl，dNTP 200μM。94℃预变性2分钟后，94℃变性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸50秒，28个循环后用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。克隆入AT克隆载体pGEM-T easy(Promega，Madison，美国)。质粒扩增及酶切鉴定后进一步进行DNA测序。EPO-TAT全基因序列示意图如图1-A所示。

二、含TAT标签的EPO表达载体的构建

将上述测序后的EPO-TAT全基因用EcoRV及EcoRI双酶切后，亚克隆至pIRES-EYFP表达载体中(clontech，美国)。命名为pEPO-TAT-EYFP。此载体含有CMV启动子，同时含有心脑炎病毒的内核糖体自启动位点，因此一条mRNA可以同时翻译两种不同蛋白。小鼠二氢叶酸还原酶DHFR经PCR扩增，测序鉴定后，用SmaI及BsrGI双酶切。亚克隆至经相同酶切的pEPO-TAT-EYFP载体中，组成既表达EPO-TAT融合蛋白，又表达筛选标记酶DHFR的双顺反子真核表达载体pEPO-TAT-DHFR，见图1-B。

实施例2：为表达EPO-TAT融合蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)稳定细胞株的建立及其EPO-TAT融合蛋白的制备及纯化

一、表达EPO-TAT融合蛋白的CHO稳定细胞株的建立

将载体pEPO-TAT-DHFR用XhoI酶线性化后，回收纯化。用转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)将线性化的质粒导入DHFR缺失的CHO细胞株DG44(Duke大学惠赠)。转染24h后，1∶12传代，改用无核苷酸的α-MEM培养基(Invitrogen，美国)培养，同时加入5pM的氨甲喋林，2周后挑选单个克隆转入6孔板继续培养。取10μl培养基用Western blot或稀释1000倍后用ELISA鉴定EPO-TAT高表达细胞株。取其中六个EPO-TAT高表达株，加入氨甲喋林至50pM，继续培养2周后传代，按上述方法依次增加氨甲喋林至500pM，5nM，50nM，500nM，5μM以及至最终浓度20μM。上清用Western blot和ELISA鉴定EPO-TAT的表达，结果见图2-A。

二、EPO-TAT融合蛋白的制备及纯化：经一系列的浓度的氨甲喋林筛选后，我们获得了EPO-TAT高表达细胞株。其中11号细胞株EPO-TAT的分泌量达到1000U/ml，大量扩增后，收集培养基用Ni-NTA琼脂糖层析柱(QIAGEN，Valencia，美国)回收纯化EPO-TAT融合蛋白。简言之，培养基用NaOH将其PH值调至8.0，加入5M NaCl至终浓度为300mM。将5ml Ni-TAT琼脂糖加入层析柱中，用PBS洗柱两遍后，将N1-TAT琼脂糖加入培养基中。4℃振摇结合2小时后，将Ni-TAT琼脂糖培养基加入层析柱中，用磷酸盐缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑imidazole，pH8.0)洗柱6遍，然后加入洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole，PH8.0)10ml洗脱EPO-TAT融合蛋白。将洗脱的EPO-TAT融合蛋白加入Slide-A-Lyzer透析盒中(PIERCE，Rockford，美国)，置于1000ml PBS中进行透析，每8小时更换一次PBS，透析6次后收集蛋白。SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮兰染色鉴定蛋白纯度。用ELISA试剂盒(R&D System，Minneapolis，美国)进行定量分析。

理论上未糖基化的EPO-TAT分子量应为23kD，Western blot法确定纯化的EPO-TAT融合蛋白分子量为36至40kD(图2-B)，表明我们生产的EPO-TAT为糖基化的。用此法提纯的EPO-TAT纯度可达90％，浓度高达50U/μl。纯化的蛋白经0.2μm滤器过滤后分装，冻存于-80℃或冷冻真空抽干备用。

实施例3：检测TAT介导的EPO是否能增加EPO通过血脑屏障

我们制备TAT标记的EPO的目的是提高其穿透血脑屏障而增加EPO在大脑内的治疗浓度。为进一步证明此问题，我们给成年大鼠腹腔注射EPO-TAT或野生型EPO(未融合TAT)，剂量为5000U/公斤体重。注射3h后，收集血浆和脑脊液并使用ELISA试剂盒(R&D System)测定EPO含量，该试剂盒的敏感性为0.8mU/ml。我们发现这个试剂盒在测量EPO-TAT和野生型EPO的敏感性上没有差别。如图3所示，血中EPO-TAT的含量明显高于野生型EPO。脑脊液样本的监测结果显示EPO-TAT通过BBB的效率明显高于野生型EPO(大约增加2.5倍)。这些数据支持EPO-TAT能增强EPO通过BBB的能力。ELISA按厂家说明进行，脑脊液的收集按Frankman SP(Physiol Behav.1986；37(3)：489-63)所报道的方法。简言之，大鼠用1.5％异氟烷/30％O₂/70％N₂O混和气体麻醉后，切开枕部外皮肤，暴露枕骨下膜，用25号针头插入小脑延髓池，轻轻吸取给200μl脑脊液。取2μl稀释后在显微镜下计数红细胞。血浆中EPO浓度约为脑脊液的1000倍。因此红细胞污染若大于0.01％V/V或红细胞计数大于500/ml，该脑脊液样品作废。

实施例4：EPO-TAT具有抗OGD和NMDA的脑保护作用

一、大鼠皮层神经元原代培养：

按Cao等报道的方法进行(Cao G，J Neurosci.2001，21a913a0：4678x-46901)。简言之，取怀孕16至17天的SD大鼠胚胎，用剪刀将大脑皮层组织剪成约1mm³小块，用0.01％胰酶缓冲液37℃消化30分钟后，加入马血清灭活胰酶，用吸管吹打后过滤190g离心10分钟后收集细胞，重悬于Neurobasal培养基(invitrogen)后种于poly-D-lysine coated 24孔板(3×10⁵)或100mm盘(5×10⁶)中，同时加入50×B27添加剂(invitrogen)。每72小时更换一次液体。用Neurobasal培养基所得神经元纯度为95％。

二、缺糖缺氧模型(OGD模型)

上述培养的神经元至第11天时，更换新鲜培养基，同时加入B27(-)添加剂(invitrogen)。12小时后，更换为无糖培养基MEM-PAK(UCSF cell culture，San Francisco，美国)。将上述细胞置于缺氧培养室(Billups-Rothenberg，Del Mar，美国)，通入95％氩气/5％二氧化碳气体90分钟。更换新鲜培养基及给予正常浓度氧气，继续培养24小时。为证明EPO-TAT融合蛋白是否对缺糖缺氧所致神经元损伤具有保护作用，神经元提前24小时用EPO-TAT或常规EPO(1U/ml)预处理，然后给予缺糖及缺氧，24小时后取培养基上清检测LDH活性，作为细胞死亡的标记。

三、NMDA毒性模型

生长至11天的原代培养神经元更换新鲜培养基，加入B27(-)添加剂，同时加入EPO-TAT或常规EPO(1U/ml)，半小时后加入200μM NMDA作用15分钟后更换为新鲜培养基及B27(-)添加剂。同时加入EPO-TAT或常规EPO。24小时后用Hoechest染色细胞核。计数浓缩及片段化的细胞核比例。TAT标签的绿色荧光蛋白作为阴性对照。

为了确定纯化的EPO-TAT蛋白是否具有生物活性，我们验证了其在缺氧和葡萄糖缺乏(OGD)或NMDA毒性诱导的神经细胞死亡中的作用。90分钟缺氧后，给予正常浓度的氧和葡萄糖，24小时后测定LDH值。如图4-A所示，EPO-TAT显著保护由OGD造成的原代皮层神经元损伤，其效果与商用标准EPO(R&D System，Minneapolis，美国)相似。我们又深入研究了EPO-TAT抗NMDA毒性的保护作用(图4-B)。阴性对照TAT标签的绿色荧光蛋白(TAT-GFP)在上述两种模型中没有保护作用，但是EPO和EPO-TAT都能显著降低由NMDA诱导的细胞凋亡及坏死。这些数据证明EPO-TAT融合蛋白具有生物活性，而且TAT的加入不会减少EPO的神经保护作用。

实施例5：EPO-TAT在小鼠大脑中动脉阻塞模型中的脑梗死体积的影响

一、小鼠短暂局部脑缺血模型的制作：利用单股尼龙缝合线栓塞左侧大脑中动脉制作局部脑缺血模型。取体重25-30g，2-3月龄雄性C57/B6小鼠(TheJackson Laboratory，Bar Harbor，美国)，1.5％异氟烷/70％N₂O/30％O₂混和气体气管插管吸入麻醉。手术全程动物的直肠温度通过反馈恒温加热毯维持在37.0±0.5℃之间，栓塞时使用鼠尾血压监测器监测小鼠的平均动脉压，于栓塞后15分钟取动脉血行血气分析。栓塞60分钟后于各指定时间点拔出线栓恢复血供造成再灌注。手术完毕解除麻醉，小鼠被放回笼内饲养在20℃恒温的空调屋内。

二、梗死体积测定：梗死体积的测定采用Yang所描述方法(Stroke.1994，25(1)：165-70)。概括如下：于再灌注不同时间点处死动物，快速取出脑组织，冠状位切片，共6片，每片厚2毫米，将切好的脑片放入用PBS配置的2％TTC(氯化2，3，5-三苯基四氮唑)溶液中，37.5℃水浴20分钟，然后将其放入4％的多聚甲醛中固定15分钟后取出拍照。使用图像分析系统(MCID，St.Catherine’s，加拿大)。计算机图像分析系统计算各层脑组织面积。公式为：梗塞面积＝非梗塞面积-梗塞侧正常脑组织面积，这样可以减小脑水肿对计算梗塞面积的影响。总的梗塞体积＝各层梗塞面积×层厚(2mm)。为了验证TTC染色测定梗死体积的准确性，实验室进行了组织学染色与之对比。将动物处死后快速取脑，将脑组织放入2-甲基-丁烷在30℃下冰冻。行冠状位连续冰冻切片，每片厚20μm，每隔0.5mm取一张脑片(每个脑组织大概可取22-24张脑片)。切好的脑组织切片进行甲酚紫染色，按上述的方法进行梗塞体积的计算。

我们进一步证实了EPO-TAT在小鼠脑缺血再灌注模型中的神经保护作用。C57/B6小鼠大脑中动脉栓塞60分钟再灌注72小时后造成同侧半球梗死，TTC染色显示梗死体积大约为32mm³。缺血后再灌注即刻使用1000U/kg EPO-TAT可明显减少梗死体积(P＜0.01，与空白对照组比较)，其效果与5000U/kg野生型EPO相似(图5-A和5-B)。表明EPO-TAT能显著促进EPO穿透血脑屏障而进入大脑，因而可显著降低EPO的注射剂量。

序列表

<110>曹国栋、陈俊、罗玉敏、吉训明、邢娟

<120>血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用

<130>

<160>68

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>582

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>1(人类促红细胞生成素cDNA)

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240

atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300

gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360

catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420

gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480

actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540

aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582

<210>2

<211>193

<212>PRT

<213>人属，人种

<400>2(人类促红细胞生成素氨基酸序列)

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro

1 5 10 15 20

Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu

25 30 35 40

Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys

45 50 55 60

Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65 70 75 80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala

85 90 95 100

Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu

105 110 115 120

His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg

125 130 135 140

Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145 150 155 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu

165 170 175 180

Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

185 190

<210>3

<211>166

<212>PRT

<213>人属，人种

<400>3(成熟的人类促红细胞生成素氨基酸序列)

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys

1 5 10 15 20

Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr

25 30 35 40

Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala

45 50 55 60

Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser

85 90 95 100

Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser

105 110 115 120

Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys

125 130 135 140

Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165

<210>4

<211>178

<212>PRT

<213>人属，人种

<400>4(具有蛋白转导功能的人类促红细胞生成素氨基酸序列)

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys

1 5 10 15 20

Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr

25 30 35 40

Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala

45 50 55 60

Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser

85 90 95 100

Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser

105 110 115 120

Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys

125 130 135 140

Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

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<213>人属，人种

<400>5(具有蛋白转导功能的突变型(R14E)人类促红细胞生成素氨基酸序列)

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<213>人属，人种

<400>6(具有蛋白转导功能的突变型(R14A)人类促红细胞生成素氨基酸序列)

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1 5 10 15 20

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165 170 175 178

<210>7

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<212>PRT

<213>人属，人种

<400>7(具有蛋白转导功能的突变型(S100A)人类促红细胞生成素氨基酸序列)

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1 5 10 15 20

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<212>PRT

<213>人属，人种

<400>8(具有蛋白转导功能的突变型(S100E)人类促红细胞生成素氨基酸序列)

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<212>PRT

<213>人属，人种

<400>9(具有蛋白转导功能的突变型(R103A)人类促红细胞生成素氨基酸序列)

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1 5 10 15 20

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<210>10

<211>178

<212>PRT

<213>人属，人种

<400>10(具有蛋白转导功能的突变型(R103E)人类促红细胞生成素氨基酸序列)

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys

1 5 10 15 20

Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr

25 30 35 40

Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala

45 50 55 60

Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

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105 110 115 120

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Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

165 170 175 178

<210>11

<211>178

<212>PRT

<213>人属，人种

<400>11(具有蛋白转导功能的突变型(S104I)人类促红细胞生成素氨基酸序列)

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys

1 5 10 15 20

Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr

25 30 35 40

Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala

45 50 55 60

Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser

85 90 95 100

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105 110 115 120

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125 130 135 140

Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

165 170 175 178

Claims

1.血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于：在野生型EPO或野生型EPO的衍生物的羧基末端连接有具有蛋白转导功能的蛋白转导序列；蛋白转导序列包括：

(1)HIV TAT；

(2)由5-10个精氨酸组成的多聚精氨酸；

(3)果蝇控制触角基因的同源结构域；

(4)单纯疱疹病毒VP22。

2.根据权利要求1所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于：所述HIV TAT标记为含有11个氨基酸残基RGRKKRRQRRR的肽或来自HIV TAT的其它肽段。

3.根据权利要求1所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于：具有蛋白转导功能的人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表SEQ ID No.4；具有蛋白转导功能的突变型人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表中SEQ IDNo.5至No.11。

4.根据权利要求1所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于：所述野生型EPO的衍生物包括由氨基酸定点突变而产生的突变型EPO、甲酰化EPO、或无唾液酸EPO。

5.权利要求1至4中任何一项所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素在制备药物中的应用，其特征在于：所述药物是治疗脑卒中、急性心肌梗死、外伤性脑损伤、脊髓损伤、急性外伤性器官损伤、急性中毒、急性器官衰竭以及麻醉意外、外伤或疾病引起的呼吸或心跳暂停而引起的全身器官衰竭的药物。