CN101671383A - 单体7-乙氧基灵芝酸o及单体灵芝酸t分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种有机物提纯技术领域的单体7－乙氧基灵芝酸O及其单体灵芝酸T的分离纯化方法，包括：制备干菌体提取液，筛选含有7－乙氧基灵芝酸O条带的组分，结晶处理，制成提纯晶体；使用反向液相色谱分析灵芝酸晶体的晶体纯度；使用甲醇溶液溶解灵芝酸晶体，并向甲醇溶液中添加盐酸，然后置于酸解反应器内进行酸解处理获得单体灵芝酸粗液，最后经旋转蒸发处理后结晶制得单体灵芝酸T。本发明能直接得到纯度超过98％的灵芝酸T单体或95％以上纯度的7－乙氧基灵芝酸O单体，易于操作，方便推广，可为今后单体灵芝酸相关的药物开发和生产奠定稳固的基础。

Description

单体7-乙氧基灵芝酸O及单体灵芝酸T分离纯化方法

技术领域

本发明涉及的是一种有机物提纯技术领域的方法，具体是一种单体7-乙氧基灵芝酸O及单体灵芝酸T分离纯化方法。

背景技术

灵芝作为一种名贵药材，在中国及东南亚地区有着悠久的药用历史。现代医药研究表明，灵芝酸是灵芝重要的活性成分之一，具有抗癌，抗HIV病毒，抗炎症反应等药理功能(Acta.Pharmacol.Sin.，25(11)，1387～1395，2004所示。以往的研究大多是用灵芝抽提物(也即灵芝酸混合物)来研究其抗癌活性，故难以真正阐明灵芝酸的药理作用机制。近五年来，随着生物技术相关领域的研究进展，国际上有几个研究小组开始陆续使用单体灵芝酸来完成MTT等抗肿瘤活性筛选实验，并对其相关的抗癌机制进行了报道，如灵芝酸D和X等(Molecule & Cell Proteomics，7(5)，949～961，2007；Life Sciences77(3)，pp.252～265所示。现有技术表明，灵芝酸T和Me具有显著的抑制癌细胞生长和转移的功效(Life Science，80(3)，205～211，2006；Process Chemistry，44(8)，928～933，2009；CN200510026378.X)。这些研究工作显示了灵芝酸将作为一种极具潜力的辅助抗癌药物。然而，现行低产率的分离技术极难满足相关实验和开发对单体灵芝酸的大量需求，因此单体灵芝酸制备工艺的开发将成为今后相关药理研究和药物开发过程中的关键环节之一。

目前国内外尚无报道过大量制备单体灵芝酸的方法及工艺。现阶段对于单体灵芝酸的制备分离仅限于毫克级水平，主要用于结构分析及体外活性筛选。这些研究中所用各种单体灵芝酸纯品均是从几公斤甚至几十公斤的灵芝干细胞中，经提取、粗分离、及贵重精密仪器如制备液相色谱仪，精制分离得到的(Agric.Biol.Chem.，51(4)，1149～1153，1987；Chem.Pharm.Bull.，50(6)，837～840，2002)。这些分离纯化的方法虽可以得到少量的单体灵芝酸，然而操作流程繁琐复杂(大多需要5步以上的分离步骤)，回收率低，设备成本投入巨大，故难以成为一种单体灵芝酸的大量制备工艺。随着近年来对于单体灵芝酸体内药理实验和药品商业开发的不断深入，对于单体灵芝酸的需求量迅速扩大，市场前景广阔，所以急需一种快速、低成本、高纯度、易于工业化的分离纯化技术来满足市场对其的需求。

常压硅胶柱层析是一种传统的吸附色谱，主要基于由物质的不同极性所造成吸附能力差异来进行分离纯化。在化合物的制备方面，相比于制备液相，制备薄层色谱，制备高速逆流色谱技术，常压硅胶柱层析具有操作简单，成本低廉，易于扩大化，相关的工业化应用成熟等优点，目前，常压硅胶柱层析在工业界广泛应用于化合物制备方面，如化工产品的分离纯化，天然产物的初步分离等。

结晶是一种历史悠久的分离技术，是利用溶质之间溶解度的差别进行分离纯化的一种扩散分离操作，具有成本低，产品成固态，易于商品化等优点，所以常作为化工，生物制品的最后一步分离纯化工艺，是氨基酸，有机酸和抗生素生产过程中重要的分离纯化手段。目前，冷结晶，真空和蒸发结晶是结晶工艺的主要方式，相比而言，由于真空和蒸发结晶容易在浓缩的过程中富集杂质，并且较高的处理温度也对生物产品的稳定不利。因此，冷结晶技术作为大规模单体灵芝酸分离纯化的最后一道工艺可能十分合适。

酸催化工艺已广泛用于各个化工行业，如生物质的酸化水解，柠檬酸合成，树脂聚合等多个行业。具有技术成熟，配套设备完善，工艺简单，易于操作等优点，是一项符合大规模，工业化生产要求的工艺技术。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种单体7-乙氧基灵芝酸O及单体灵芝酸T分离纯化方法，采用常压硅胶柱层析和冷结晶法对灵芝干细胞的提取液进行分离纯化，得到的7-乙氧基灵芝酸O精制品，另外通过酸解工艺，可以获得具有优良抗癌活性的单体灵芝酸T。从而保证了在低成本和高纯度的情况下满足对于单体灵芝酸大量制备的需求，并亦能满足对于该工艺未来工业化的预期要求。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及单体7-乙氧基灵芝酸O的分离纯化方法，包括以下步骤：

第一步、使用有机溶剂对灵芝干菌体进行超声波辅助抽提，制成干菌体提取液。

所述的有机溶剂为氯仿、乙酸乙酯或乙醇中的一种或其组合；

所述的灵芝干菌体是指液体发酵得到的灵芝细胞经烘干处理后得到干燥菌丝体；

所述的灵芝细胞的获得方式如下：

67军军直卫生所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCN0.5.75的菌株；

上海吴淞中学发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCN0.5.110的菌株；

日本京大发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCN0.5.533的菌株；

中国贵州发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCN0.5.616的菌株；

中科院微生物研究所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC N0.5.644的菌株；

中国农业科学院发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCN0.5.653的菌株。

所述的超声波辅助抽提是指：采用有机溶剂对灵芝干菌体为1∶1至1∶300的质量比进行配比后置于超声清洗仪中进行抽提，工作功率为40～160W，设置环境温度为5～60℃，抽提时间为5～80min，抽提1～5次。

第二步、将干菌体提取液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状，然后将其溶解于乙醚中，用常压硅胶层析色谱采取湿法上样进行分离纯化处理，制成干菌体分离液，再通过TLC薄层层析法检测干菌体分离液的灵芝酸组成，筛选出含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分。

所述的旋转蒸发处理是指采用旋转蒸发仪，设置环境温度为50℃以下进行浓缩蒸发。

所述的常压硅胶层析色谱的填充材料为50至400目的硅胶；设置柱径比为1∶2至1∶50；流动相为乙醚，配以小于等于40％的石油醚或己烷作为极性调节剂；

所述的采取湿法上样是指：设置上样量小于等于柱体积的20％；设置流速为全流速的20％～100％的范围内；柱温小于等于50℃，同时使用自动馏分收集器收集流出液，单管收集时间小于等于30min；

所述的TLC薄层层析法是指：将吸附剂均匀地铺在硅胶板上形成薄层后，将干菌体分离液点滴在薄层上，然后用展开剂展开，使混合物得以分离，然后检测干菌体分离液的灵芝酸组成。对比标准品，筛选出含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分，获得纯化后的单体灵芝酸O；

所述的吸附剂为硅胶；

所述的硅胶板为254nm荧光薄层硅胶板；

所述的展开剂的组分及体积比为甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸＝13∶4∶0.4。

第三步、合并TLC检测中含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分，通过旋转蒸发仪蒸发至干得到固体粗产品，向固体粗产品中加入有机溶剂得到粗产品溶液，向粗产品溶液中加入7-乙氧基灵芝酸O碎晶后置于结晶器中进行结晶处理，制成粗提纯晶体，将粗提纯晶体二次结晶处理后可得到95％以上纯度的单体7-乙氧基灵芝酸O。

所述的粗产品溶液的浓度为5～200mg/mL，其中的溶剂为乙醇、乙酸乙酯或乙醚。

所述的结晶处理是指：设置结晶器的环境温度为-20~20℃，结晶时间为1~2天。

所述的二次结晶处理是指：将粗提纯晶体溶解于乙醇、乙酸乙酯或乙醚中稀释至浓度小于粗产品溶液的浓度，然后进行结晶处理，反复进行上述稀释～结晶操作两次，制成单体7-乙氧基灵芝酸O。

本发明还涉及单体灵芝酸T的分离纯化方法，包括以下步骤：

步骤一、使用有机溶剂对灵芝干菌体进行超声波辅助抽提，制成干菌体提取液；

步骤二、将干菌体提取液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状，然后将其溶解于乙醚中，用常压硅胶层析色谱采取湿法上样进行分离纯化处理，制成干菌体分离液，再通过TLC薄层层析法检测干菌体分离液的灵芝酸组成，筛选出含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分。

步骤三、合并TLC检测中含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分，通过旋转蒸发仪蒸发至干，得到固体粗产品，向固体粗产品中加入有机溶剂得到粗产品溶液，向粗产品溶液中加入7-乙氧基灵芝酸O碎晶后置于结晶器中进行结晶处理，制成提纯晶体。

步骤四、过滤提纯晶体后得到灵芝酸晶体，同时将过滤后的母液回流至结晶器中循环使用；使用反向液相色谱分析灵芝酸晶体的晶体纯度，当晶体纯度大于80％则继续操作步骤五，否则稀释粗产品溶液的浓度后重复步骤三的操作。

所述的反向液相色谱的填充材料为反相硅胶C18，粒径5μm，柱长150mm；流动相为90％的HPLC级的甲醇，柱温为25℃，流速1mL/min，检测波长为225nm。

步骤五、使用甲醇溶液溶解灵芝酸晶体，并向甲醇溶液中添加盐酸，然后置于酸解反应器内进行酸解处理获得单体灵芝酸粗液，最后经旋转蒸发处理后结晶制得单体灵芝酸T

所述的酸解灵芝酸的方法为：采用向7-乙氧基灵芝酸O的甲醇水溶液中加入0.005％至1％的1mol/L的盐酸来催化生成灵芝酸T。其中甲醇的含水量控制在0～50％之间，反应物的浓度不超过300mg/mL，反应温度为10～80℃，反应时间为0.2～8小时。

本发明能直接得到纯度超过98％的灵芝酸T单体或95％以上纯度的7-乙氧基灵芝酸O单体，整合三项常规分离制备技术，不依靠任何精密分析制备仪器，低成本地得到大量高纯度的单体灵芝酸。使用单根300mL柱体积的硅胶层析柱，最大产率可达到1.5克/天/200克硅胶，具有其他现存单体灵芝酸分离工艺无法与其相比的规模和价格优势，易于操作，方便推广，可为今后单体灵芝酸相关的药物开发和生产奠定稳固的基础。

附图说明

图1为实施例1中灵芝酸粗提液的高效液相分析色谱图。

图2为实施例1中经硅胶柱层析后的7-乙氧基灵芝酸O粗品的高效液相分析色谱图。

图3为实施例1中经结晶得到的7-乙氧基灵芝酸O的高效液相分析色谱图。

图4为实施例1灵芝酸T精制品的高效液相分析色谱图。

图5为实施例2中经结晶得到的7-乙氧基灵芝酸O的高效液相分析色谱图。

图6为实施例4灵芝酸T精制品的高效液相分析色谱图。

图7为实施例5灵芝酸粗提液的高效液相分析色谱图。

图8为实施例5中经硅胶柱层析后的7-乙氧基灵芝酸O粗品的高效液相分析色谱图。

图9为实施例8灵芝酸粗提液的高效液相分析色谱图。

图10为实施例8中经硅胶柱层析后的7-乙氧基灵芝酸O粗品的高效液相分析色谱图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1.称取100g从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入2L氯仿，超声提取30分钟，提取5次，过滤，旋转蒸发得到浸膏状物质7.3g，高效液相色谱分析如图1)。

2.将上述浸膏状物质溶于25mL乙醚中，通过事前填充平衡好的常压硅胶柱进行纯化分离，填充200g干硅胶，粒径200～300目，柱径比1∶10，以含10％石油醚的乙醚作为流动洗脱，柱体积约为300mL，流速为5mL/min(全流速)，通过自动收集器收集各流分。各并相应组分，并蒸发至干，得到固体3.1g，高效液相色谱分析如图2所示。

3.加入50mL乙醚溶解所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶两天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体1.6g，纯度为87.4％，高效液相色谱分析如图3所示。

4：加入100mL甲醇溶解所得固体，并加入1mL 1mol/L的盐酸水溶液，置于60℃的酸解反应器中反应0.5小时，停止反应后，使用旋转蒸发仪浓缩该溶液至60mL，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干，得到灵芝酸T晶体1.0g，纯度为98.1％，高效液相色谱分析如图4所示。

此实施例说明：这套整合三项传统技术的新型灵芝酸分离工艺具有优秀的实用性，实践效果达到预期中低成本，高纯度分离纯化灵芝酸的要求。

实施例2

1.称取100g从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入2L氯仿，超声提取30分钟，提取3次，过滤，旋转蒸发得到浸膏状物质7.2g，高效液相色谱分析如图1所示)。

2.将上述浸膏状物质溶于25mL乙醚中，通过事前填充平衡好的常压硅胶柱进行纯化分离，填充200g干硅胶，粒径200～300目，柱径比1∶10，以含10％石油醚的乙醚作为流动洗脱，柱体积约为300mL，流速为5mL/min(全流速)，通过自动收集器收集各流分。各并相应组分，并蒸发至干，得到固体3.1g。

3.加入200mL乙醚溶解所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶三天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体0.55g，纯度为96.6％，高效液相色谱分析如图5所示。

4：加入6mL甲醇溶解所得固体，并加入0.01mL 1mol/L的盐酸水溶液，置于60℃的酸解反应器中反应1小时，停止反应后，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干，得到灵芝酸T晶体0.42g，纯度为98.5％。

对比实施例1，本实施例表明：在7-乙氧基灵芝酸O的结晶过程中，浓度降低有利于结晶纯度的提高，但回收率会有一定下降。

实施例3

1.称取100g从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入2L氯仿，超声提取30分钟，提取2次，过滤，旋转蒸发得到浸膏状物质7.0g，高效液相色谱分析如图1所示。

2.将上述浸膏状物质溶于25mL乙醚中，通过事前填充平衡好的常压硅胶柱进行纯化分离，填充200g干硅胶，粒径200～300目，柱径比1∶10，以含10％石油醚的乙醚作为流动洗脱，柱体积约为300mL，流速为5mL/min(全流速)，通过自动收集器收集各流分。各并相应组分，并蒸发至干，得到固体3.0g。

3.加入30mL乙醚溶解所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体2.2g，纯度为70.6％。

4.加入70mL乙醚溶解上步所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶两天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体0.74g，纯度为91.6％。

5.加入25mL甲醇溶解所得固体，并加入0.1mL 1mol/L的盐酸水溶液，置于60℃的酸解反应器中反应1小时，停止反应后，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干，得到灵芝酸T晶体0.35g，纯度为98.2％。

对比实施例1，本实施例表明：在7-乙氧基灵芝酸O的结晶过程中，浓度升高不利于得到高纯度的结晶体，需要重复结晶来提高结晶纯度。

实施例4

1.称取100g从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入2L氯仿，超声提取30分钟，提取2次，过滤，旋转蒸发得到浸膏状物质7.0g。

2.将上述浸膏状物质溶于25mL乙醚中，通过事前填充平衡好的常压硅胶柱进行纯化分离，填充200g干硅胶，粒径200～300目，柱径比1∶10，以含10％石油醚的乙醚作为流动洗脱，柱体积约为300mL，流速为4.5mL/min(全流速)，通过自动收集器收集各流分。各并相应组分，并蒸发至干，得到固体3.0g。

3.加入100mL乙醚溶解所得固体后，置于4℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体0.35g，纯度为92.6％。

4.加入50mL 70％甲醇溶解所得固体，并加入0.1mL 1mol/L的盐酸水溶液，置于60℃的酸解反应器中反应0.4小时，停止反应后，置于4℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干，得到灵芝酸T晶体0.26g，纯度为98.8％，高效液相色谱分析如图6所示。

对比实施例1，本实施例表明：在酸催化反应中，在溶剂中添加水可以进一步提高该反应的速率，并且灵芝酸T在含水的甲醇中结晶比纯甲醇中更容易。

实施例5

1.称取100g从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入4L乙酸乙酯，超声提取15分钟，提取5次，过滤，旋转蒸发得到浸膏状物质8.9g，高效液相色谱分析如图7所示。

2.将上述浸膏状物质溶于15mL乙醚中，通过事前填充平衡好的常压硅胶柱进行纯化分离，填充200g干硅胶，粒径200～300目，柱径比1∶10，以含30％石油醚的乙醚作为流动洗脱，柱体积约为300mL，流速为3.5mL/min(全流速)，通过自动收集器收集各流分。各并相应组分，并蒸发至干，得到固体3.5g，高效液相色谱分析如图8所示。

3.加入100mL乙醚溶解所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体1.0g，纯度为87.6％。

4：加入100mL 90％甲醇溶解所得固体，并加入5ml 1mol/L的盐酸水溶液，置于60℃的酸解反应器中反应8小时，停止反应后，使用旋转蒸发仪浓缩该溶液至40mL，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干，得到灵芝酸T晶体0.52g，纯度为98.7％。

实施例6

1.称取100g从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入4L乙酸乙酯，超声提取15分钟，提取5次，过滤，旋转蒸发得到浸膏状物质8.9g。

2.将上述浸膏状物质溶于15mL乙醚中，通过事前填充平衡好的常压硅胶柱进行纯化分离，填充200g干硅胶，粒径200～300目，柱径比1∶10，以含30％石油醚的乙醚作为流动洗脱，柱体积约为300mL，流速为2.8mL/min(80％流速)，通过自动收集器收集各流分。各并相应组分，并蒸发至干，得到固体4.0g

3.加入100mL乙醚溶解所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体1.3g，纯度为80.6％。

4：加入250mL 50％甲醇溶解所得固体，并加入0.5mL 1mol/L的盐酸水溶液，置于60℃的酸解反应器中反应1小时，停止反应后置于4℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干，得到灵芝酸T晶体0.12g，纯度为98.2％。

对比实施例5，本实施例表明：在常压色谱中，低流速不利于物质的分离，可能是由于谱带的展宽所造成的。

实施例7

1.称取100g从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入4L乙酸乙酯，超声提取15分钟，提取5次，过滤，旋转蒸发得到浸膏状物质8.9g。

2.将上述浸膏状物质溶于15mL乙醚中，通过事前填充平衡好的常压硅胶柱进行纯化分离，填充200g干硅胶，粒径200～300目，柱径比1∶10，以含30％石油醚的乙醚作为流动洗脱，柱体积约为300mL，流速为3.5mL/min(全流速)，通过自动收集器收集各流分。各并相应组分，并蒸发至干，得到固体3.5g

3.加入200mL乙醚溶解所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体0.6g，纯度为94.5％。

4.加入8mL甲醇溶解所得固体，并加入0.05mL 1mol/L的盐酸水溶液，置于60℃的酸解反应器中反应1小时，停止反应后置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干，得到灵芝酸T晶体0.12g，纯度为98.2％。

以上三个实施例表明：使用乙酸乙酯提取，会提取出更多的杂质，这对色谱分离不太有利，因此乙酸乙酯不是首选的提取溶剂，但考虑到毒性小的特点，比之氯仿，仍有其优势。

实施例8

1.称取20g从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入2L乙醇，超声提取60分钟，提取2次，过滤，旋转蒸发得到浸膏状物质2.4g，高效液相色谱分析如图9所示。

2.将上述浸膏状物质溶于20mL乙醚中，通过事前填充平衡好的常压硅胶柱进行纯化分离，填充60g干硅胶，粒径100目，柱径比1∶30，以乙醚作为流动洗脱，柱体积约为100mL，流速为2mL/min(全流速)，通过自动收集器收集各流分。各并相应组分，并蒸发至干，得到固体1.0g，高效液相色谱分析如图10)。

3.加入100mL乙醚溶解所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体0.1g，纯度为82.5％。

4.加入3mL甲醇溶解所得固体，并加入0.5ml 1mol/L的盐酸水溶液，置于40℃的酸解反应器中反应4小时，停止反应后置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干，得到灵芝酸T晶体50mg，纯度为95.2％，重复结晶一次，得到灵芝酸T晶体20mg，纯度98.7％。

对比实施例1，本实施例表明：使用乙醇提取，会提取出更多的杂质，这对色谱分离有一些不利的影响，但由于乙醇具有不错的环境友好性，在这个体系内，  乙醇是一种具有潜力，待开发的提取溶剂。

实施例9

1.称取20g从灵芝菌丝体发酵得到的干细胞粉，加入2L乙醇，超声提取60分钟，提取2次，过滤，旋转蒸发得到浸膏状物质2.4g。

2.将上述浸膏状物质溶于20mL乙醚中，通过事前填充平衡好的常压硅胶柱进行纯化分离，填充60g干硅胶，粒径100目，柱径比1∶30，以乙醚作为流动洗脱，柱体积约为100mL，流速为1mL/min(50％流速)，通过自动收集器收集各流分。各并相应组分，并蒸发至干，得到固体1.2g。

3.加入20mL乙醚溶解所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶一天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体0.3g，纯度为64.5％。

4.加入3mL乙醚溶解上步所得固体后，置于-20℃的结晶器中结晶两天，过滤，吹干后，得到7-乙氧基灵芝酸O晶体50mg，纯度为85.6％。加入3mL 50％甲醇溶解所得固体，并加入0.5l 1mol/L的盐酸水溶液，置于40℃的酸解反应器中反应1小时，停止反应后置于4℃的结晶器中结晶6小时，过滤，吹干，得到灵芝酸T晶体10mg，纯度为97.8％。

综合实施例，相比200～300目的硅胶，100目的在分离能力方面表现较差，分离后的粗产品纯度低，因此，相对颗粒度小的硅胶在这个体系的分离中具有更好的特性。在条件允许的情况下，可尽量选择颗粒度小的硅胶作为填料。

为了确认所得产物，对上述晶体粉末进行了高分辨率质谱和核磁共振鉴定，质谱数据与标准品一致，NMR数据请见下表，和文献中的数据一致(J.Nat.Prod.52(3)，595～605，1989所示。

7-乙氧基灵芝酸O和灵芝酸T的13C-NMR数据表

Claims (10)

1.一种单体7-乙氧基灵芝酸O的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步、使用有机溶剂对灵芝干菌体进行超声波辅助抽提，制成干菌体提取液；

第二步、将干菌体提取液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状，然后将其溶解于乙醚中，用常压硅胶层析色谱采取湿法上样进行分离纯化处理，制成干菌体分离液，再通过TLC薄层层析法检测干菌体分离液的灵芝酸组成，筛选出含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分；

第三步、合并TLC检测中含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分，通过旋转蒸发仪蒸发至干，得到固体粗产品，向固体粗产品中加入有机溶剂得到粗产品溶液，向粗产品溶液中加入7-乙氧基灵芝酸O碎晶后置于结晶器中进行结晶处理，制成粗提纯晶体，将粗提纯晶体经二次结晶处理后得到单体7-乙氧基灵芝酸O。

2.根据权利要求1所述的单体7-乙氧基灵芝酸O的分离纯化方法，其特征是，所述的灵芝干菌体是指液体发酵得到的灵芝细胞经烘干处理后得到干燥菌丝体。

3.根据权利要求1所述的单体7-乙氧基灵芝酸O的分离纯化方法，其特征是，所述的旋转蒸发处理是指采用旋转蒸发仪，设置环境温度为50℃以下进行浓缩蒸发。

4.根据权利要求1所述的单体7-乙氧基灵芝酸O的分离纯化方法，其特征是，所述的常压硅胶层析色谱的填充材料为50至400目的硅胶；设置柱径比为1∶2至1∶50；流动相为乙醚，配以小于等于40％的石油醚或己烷作为极性调节剂。

5.根据权利要求1所述的单体7-乙氧基灵芝酸O的分离纯化方法，其特征是，所述的TLC薄层层析法是指：将吸附剂均匀地铺在硅胶板上形成薄层后，将干菌体分离液点滴在薄层上，然后用展开剂展开，使混合物得以分离，然后检测干菌体分离液的灵芝酸组成，对比标准品，筛选出含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分，获得纯化后的单体灵芝酸O。

6.根据权利要求1所述的单体7-乙氧基灵芝酸O的分离纯化方法，其特征是，所述的展开剂的组分及体积比为甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸＝13∶4∶0.4。

7.根据权利要求1所述的单体7-乙氧基灵芝酸O的分离纯化方法，其特征是，所述的粗产品溶液的浓度为5～200mg/mL。

8.一种单体灵芝酸T的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、使用有机溶剂对灵芝干菌体进行超声波辅助抽提，制成干菌体提取液；

步骤二、将干菌体提取液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状，然后将其溶解于乙醚中，用常压硅胶层析色谱采取湿法上样进行分离纯化处理，制成干菌体分离液，再通过TLC薄层层析法检测干菌体分离液的灵芝酸组成，筛选出含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分；

步骤三、合并TLC检测中含有7-乙氧基灵芝酸O条带的组分，通过旋转蒸发仪蒸发至干，得到固体粗产品，向固体粗产品中加入有机溶剂得到粗产品溶液，向粗产品溶液中加入7-乙氧基灵芝酸O碎晶后置于结晶器中进行结晶处理，制成提纯晶体；

步骤四、过滤提纯晶体后得到灵芝酸晶体，同时将过滤后的母液回流至结晶器中循环使用；使用反向液相色谱分析灵芝酸晶体的晶体纯度，当晶体纯度大于80％则继续操作步骤五，否则稀释粗产品溶液的浓度后重复步骤三的操作；

步骤五、使用甲醇溶液溶解灵芝酸晶体，并向甲醇溶液中添加盐酸，然后置于酸解反应器内进行酸解处理获得单体灵芝酸粗液，最后经旋转蒸发处理后结晶制得单体灵芝酸T。

9.根据权利要求8所述的单体灵芝酸T的分离纯化方法，其特征是，所述的反向液相色谱的填充材料为反相硅胶C18，粒径5μm，柱长150mm；流动相为90％的HPLC级的甲醇，柱温为25℃，流速1mL/min，检测波长为225nm。

10.根据权利要求8所述的单体灵芝酸T的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤五，采用向7-乙氧基灵芝酸O的甲醇水溶液中加入0.005％至1％的1mol/L的盐酸来催化生成灵芝酸T。其中甲醇的含水量控制在0～50％之间，反应物的浓度不超过300mg/mL，反应温度为10～80℃，反应时间为0.2～8小时。

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