CN101670098B - 重组人胸腺素α原在制备预防及治疗脂肪肝药物中的应用 - Google Patents

Abstract

重组人胸腺素α原在制备预防及治疗脂肪肝药物中的应用，涉及一种胸腺素α原。提供胸腺素α原，特别是重组人胸腺素α原在制备预防及治疗脂肪肝药物中的应用。重组人胸腺素α原具有降低体重，减少脂肪细胞大小，减少体内脂肪指数、肝脏指数和抑制脂肪肝的产生方面的功能。重组人胸腺素α原具有有效抑制体内脂肪的堆积、降低血脂水平、调节体内脂肪代谢正常、达到治疗和改善脂肪肝的症状的功能。重组人胸腺素α原可用于制备预防及治疗脂肪肝药物。所述脂肪肝包括酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝。送药途径包括口服和皮下注射等。胸腺素α原，还包括所有从哺乳动物提取的胸腺素α原、基因工程表达的胸腺α原、胸腺素α1和胸腺5-肽。

Description

重组人胸腺素α原在制备预防及治疗脂肪肝药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种胸腺素α原，尤其是涉及胸腺素α原在预防及治疗脂肪肝药物中的应用。

背景技术

脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变。脂肪性肝病正严重威胁国人的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，已被公认为隐蔽性肝硬化的常见原因。脂肪肝是一种常见的临床现象，而非一种独立的疾病。其临床表现是轻者无症状，重者病情凶猛。一般而言，脂肪肝属可逆性疾病，早期诊断并及时治疗常可恢复正常。正常人的肝内总脂肪量，约占肝重的5％，内含磷脂、甘油三酯、脂酸、胆固醇及胆固醇脂。脂肪量超过5％为轻度脂肪肝，超过10％为中度脂肪肝，超过25％为重度脂肪肝。当肝内总脂肪量超过30％时，用B超才能检查出来，被B超检查确诊为“脂肪肝”。而脂肪肝患者，总脂量可达40％-50％，有些达60％以上，主要是甘油三酯及脂酸，而磷脂、胆固醇及胆固醇脂只少量增加。

根据脂肪肝发病原因，脂肪肝分为肥胖性脂肪肝、酒精性脂肪肝、营养失调性脂肪肝、药物性脂肪肝、妊娠急性脂肪肝、糖尿病性脂肪肝等。根据肝组织病理学变化，可将脂肪肝分为三个时期：I期为不伴有肝组织炎症反应的单纯性脂肪肝，II期为伴有肝组织炎症和纤维化的脂肪性肝炎，III期为脂肪性肝硬化。

脂肪肝是一种常见的临床现象，而非一种独立的疾病。引起脂肪肝的病因很多，其临床表现轻者无症状，重者病情凶猛，主要表现为肝脏受损。一般而言，脂肪肝属可逆性疾病早期诊断并及时治疗常可恢复正常。治疗原则是去除病因调整饮食，增加运动，合理用药。

近年来，随着物质供应的丰富和生活方式的改变，超重与肥胖的发病率与日俱增，长期高糖、高脂肪和高胆固醇食物是引起糖尿病和肥胖的重要外因之一。肥胖不仅对于心血管危害严重，而且肥胖也是2型糖尿病独立的高危因素，80％～90％的2型糖尿病患者伴有超重或肥胖。体重的增加与患2型糖尿病的危险性高度相关。目前比较流行的是使用体重指数(BM I)来判断人是否超重或者肥胖，体重指数BMI＝体重(kg)÷身高的平方(m²)，正常BMI值在18-24之间。如果把BMI＜23的糖尿病发病风险定为1.0，则BMI≥25的风险为5.5，即患糖尿病的危险性增加了5.5倍；BMI≥30的风险为25，BMI≥35kg/m2的风险为72。肥胖患病率越高的国家，糖尿病的患病率也越高，如太平洋岛国瑙鲁，70％人群为肥胖，近一半的国民为糖尿病患者。肥胖，是形成2型糖尿病的环境因素中最重要的，肥胖是2型糖尿病自然病程的起源。肥胖先引起胰岛素抵抗(胰岛素降血糖的效应下降)，胰岛代偿性分泌更多的胰岛素，以保持糖代谢正常，此时患者会有高胰岛素血症。当胰岛出现缺陷时，胰岛素分泌量代偿不了胰岛素抵抗，则导致餐后血糖升高，又称为糖耐量减低(IGT)。IGT进一步损害胰岛功能，当空腹血糖升高超过7.0mmol/L和(或)餐后血糖超过11.1mmol/L时，患者就被诊断为2型糖尿病。腹部肥胖又被称为中心性肥胖，更易造成胰岛素抵抗。中心性肥胖是指腰围男性≥90cm，女性≥85cm，主要是由内脏脂肪增多堆积造成的。内脏脂肪组织具有内分泌功能，它的增多使其分泌的激素水平发生紊乱，从而拮抗了胰岛素的降糖作用；相反，皮下脂肪组织的内分泌功能相对较弱。因而，对于相同体重的肥胖者，中心性肥胖者的胰岛素抵抗要比均匀性肥胖者更为严重，也更难以纠正。2型糖尿病发生后，人体糖代谢和脂代谢进一步紊乱，致使血糖升高、血脂升高、脂肪重新分布，也会一定程度上加重肥胖的程度。由此肥胖和2型糖尿病形成了互为因果的恶性循环。

1984年，Haritos等(1、Haritos AA，Goodall GJ，Horecker BL，Prothymosin alpha：isolation andproperties of the major immunoreactive form of thymosin alphal in rat thymus.Proc Natl Acad SciU S A，1984，81：1008；2、Haritos AA.Alpha-thymosins：relationships in structure，distribution，andfunction.Isozymes Curr Top Biol Med Res 1987；14：123-152；3、Goodall GJ，Dominguez F，Horecker BL.Molecular cloning of eDNA for human prothymosin alpha.Proc Natl Acad Sci U S A1986；83(23)：8926-8928；4、Pan LX，Haritos AA，Wideman J，Komiyama T，Chang M，Stein S et al.Human prothymosin alpha：amino acid sequence and immunologic properties.Arch BiochemBiophys 1986；250(1)：197-201)从大鼠胸腺分离出一种含有111个氨基酸残基的多肽，其N端含已发现的所有胸腺素α原家族成员的序列，因此命名为胸腺素α原，人ProTα由109个氨基酸残基组成，与大鼠ProTα的序列相比，有6个位点的差异，包括4个位点的替代和2个位点的缺失。

1985年，Haritos等(Komiyama T，Pan LX，Haritos AA，et al.The primary structure of ratparathymosin.ProcNatlAcad Sci U S A 1986；83(5)：1242-1245。)发现大鼠ProTA能增强小鼠抗白色念珠菌(Candida albicans)感染的能力。1986年Pan又发现ProTα能刺激转移抑制因子(MIF)的释放，其作用比Tα1强10～20倍(1、Haritos AA，r.Blacher，S.Stein，J..Horecker.Parathymosin alpha：a peptide from rat tissues with structural homology to prothymosinalpha.Proc Natl Acad Sci U S A，82：1050-1053；2、Pan LX，Haritos AA，Wideman J，et al.Humanprothymosin alpha：amino acid sequence and immunologic properties.Arch Biochem Biophys 1986；250(1)：197-201)。1987年，Sαlvin等(1、Salvin SB，Horecker BL，Pan LX，Rabin BS.The effectof dietary zinc and prothymosin alpha on cellular immune responses of RF/J mice.Clin ImmunolImmunopathol 1987；43(3)：281-288)发现腹腔注射ProTα能增强RF/J小鼠产生抗体的能力，锌能加强这种作用，能使青年大鼠和老年大鼠的细胞免疫和体液免疫都增强。Papanastasiou(Papanastasiou M，Baxevanis CN，Papamichail M.Promotion of murine antitumor activity byprothymosin alpha treatment：I.Induction of tumoricidal peritoneal cells producing high levels oftumour necrosis factor alpha.Cancer Immunol Immunother1992；35(2)：145-150。)发现，CBA/2小鼠如果腹腔接种肿瘤细胞，一般8～12天之内产生腹水，10～14天后死亡，20％的经过ProTα处理的小鼠不产生腹水，并能够使不产生腹水中的40％～60％的小鼠寿命可以延长到70天。当腹腔注射ProTα时，能够增强巨噬细胞、提高N K，LA K细胞的活性(1、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2killer cells：in vitro evaluation of combination withprothymosin alpha.Lymphokine Cytokine Res 1994；13(3)：175-182；2、Baxevanis CN，GritzapisAD，Dedoussis GV，.Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosinalpha.Cancer Immunol Immunother 1994；38(4)：281-286)；增强MHC限制的细胞免疫(1、Baxevanis CN，Thanos D，Reclos GJ，J et al.Prothymosin alpha enhances human and murine MHCclass II surface antigen expression and messenger RNA accumulation.J Immunol 1992；148(7)：1979-1984；2、Baxevanis CN，Thanos D，Reclos GJ，et al.Prothymosin alpha enhanceshuman and murine MHC class II surface antigen expression and messenger RNA accumulation.JImmunol 1992；148(7)：1979-1984)，抑制系统性红斑狼疮(Baxevanis CN，Reclos CJ，PapamichailM et al.Prothymosin alpha restores the depressed autologous and allogenic mixed lymphocyteresponses in patient with systemic lupus erythematosus.Immuopharmaco immunotoxico，1987，9：429)，促进IL-2，MIF的分泌和TN F-α，IFN-γ的合成；促进IL-2受体的表达(1、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Spanakos G，.Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo byprothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother 1995；40(6)：410-418；2、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cells：in vitro evaluation of combination withprothymosin alpha.Lymphokine Cytokine Res 1994；13(3)：175-182；3、Baxevanis CN，GritzapisAD，Dedoussis GV，.Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer ImmunolImmunother 1994；38(4)：281-286；4、Voutsas IF，Baxevanis CN，Gritzapis AD，etal.Synergy between interleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxicT lymphocytes against autologous human carcinomas.Cancer Immunol Immunother 2000；49(8)：449-458；5、Cordero OJ，Sarandeses CS，Lopez JL，et al.Prothymosin alpha enhances IL-2receptor expression in norma human T-lymphoctyes.Int J Immunpharmacol，1991，13：1059)，从而产生非特异性肿瘤杀伤作用，同时，诱导肿瘤特异性细胞毒T细胞(CD8+)和辅助性T细胞(CD4+)的特异性抗肿瘤作用。ProTα在疾病早期可以刺激淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokien activated killer cells，LAK)活性，它是通过增加淋巴细胞与靶细胞的结合进而增加IFN-γ和IL-2的分泌来实现的(1、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2killer cells：in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha.LymphokineCytokine Res 1994；13(3)：175-182；2、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction oflymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother1994；38(4)：281-286)。单独使用ProTα时可以刺激TNF-α和IL-2的分泌，如果与IL-2联合使用时，可增加NK细胞CD56，CD16/56和CD25及CD18/11黏附分子的表达。在IFN-γ存在的条件下，ProTα主要通过增加CD54(细胞黏附分子配体)的表达，刺激单核细胞与集结的肿瘤细胞的结合，达到清除肿瘤细胞的目的(1、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Spanakos G，.Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha.CancerImmunol Immunother 1995；40(6)：410-418；2、Lopez-Rodriguez JL，Cordero OJ，Sarandeses C，.Interleukin-2 killer cells：in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha.LymphokineCytokine Res 1994；13(3)：175-182；3、Baxevanis CN，Gritzapis AD，Dedoussis GV，.Induction oflymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha.Cancer Immunol Immunother1994；38(4)：281-286；4、Voutsas IF，Baxevanis CN，Gritzapis AD，et al.Synergy betweeninterleukin-2and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytesagainst autologous human carcinomas.Cancer Immunol Immunother 2000，49(8)：449-458。)。近来研究表明，ProTα在DNA疫苗中还可以起到疫苗佐剂的效果(1、Jin Y，Cao C，Li P，Liu X，Huang W，Li C et al.Boosting immune response to hepatitis B DNA vaccine by coadministration ofProthymosin alpha-expressing plasmid.Clin Diagn Lab Immunol 2005；12(12)：1364-1369；2、ShiauAL，Chen CC，Yo YT，Chu CY，Wang SY，Wu CL.Enhancement of humoral and cellular immuneresponses by an oral Salmonella choleraesuis vaccine expressing porcine prothymosin alpha.Vaccine 2005；23(48-49)：5563-5571)。

近来发现与ProTα同样是“天然无结构蛋白”(natively unstructured protein)的一种核蛋白P8与ProTα能够形成复合物，将P8带入核内，共同完成抗凋亡和促进细胞分裂的活性，并且发现如果两者中只有其中一种蛋白高表达并没有类似的功能，已经有许多研究表明P8在胰岛β细胞的增殖中发挥重要作用(Malicet C，Dagorn JC，Neira JL，Iovanna JL.INSERM U.624，Stress Cellulaire，Marseille，France.p8 and prothymosin alpha：unity is strength.Cell Cycle.2006；5(8)：829-830)。

最新研究表明，ProTα能够与Nrf2-Keap1复合物中的Keap1相结合，使Nrf2从Keap1抑制状态脱离出来，Nrf2与Keap1的解偶连。脱离了束缚的Nrf2转移进入细胞核内，与Maf蛋白结合成异二聚体后识别并与ARE结合，启动第II相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因的转录，提高细胞抗氧化应激能力。研究结果发现，ProTα与Nrf2-Keap1复合物中的Keap1结合是特异性的，突变的ProTα(MProTα)无法行使该功能。广泛存在的ProTα为细胞内恒定的抗氧化基因的基本水平的表达，以达到防止细胞被氧化损伤的目的发挥了重要作用。(Olga V.Markova，Alexandra G.Evstafieva，Svetlana E.Mansurova，Sergey S.Moussine，LarisaA.Palamarchuk，Mikhail O.Pereverzev，Andrey B.Vartapetian and Vladimir P.Skulachev，Prothyomosin alpha interaction with KEAP1 doesn′t lead to prothymosin alpha ubiquination anddegradation，Mol Biol(Mosk).2007，41(5)：868-875)。

至今还未发现任何有关胸腺素α原与预防和治疗脂肪肝以及在抑制肥胖肥胖方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供胸腺素α原，特别是重组人胸腺素α原在制备预防及治疗脂肪肝药物中的应用。

本发明所述重组人胸腺素α原基因序列为：

atgtcagacg cagccgtaga caccagctcc gaaatcacca ccgaggactt aaaggagaag    60

aagggagttg tggaagaggc ggaaaatgga agagacgccc ctgctcacgg gaatgctaat    120

gaggaaaatg gggagccgga ggctgacaac gaggtagatg aagaagagga agaaggtggg    180

gaggaagaag gtgatggtga ggaagaggat ggagatgaag atgagggagc tgagtcagct    240

acgggcaagc gggcagctga agatgatgag gataacgatg tcgataccca gaagcagaag    300

accgacgagg atgactag。

相应的蛋白序列为：

Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Lys Glu Lys

Lys Gly Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala His Gly Asn Ala Asn

Glu Glu Asn Gly Glu Pro Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly

Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Glu Gly Ala Glu Ser Ala

Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asn Asp Val Asp Thr Gln Lys Gln Lys

Thr Asp Glu Asp Asp*。

本发明所述重组人胸腺素α原具有降低体重，减少脂肪细胞大小，减少体内脂肪指数、肝脏指数和抑制脂肪肝的产生方面的功能。

本发明所述重组人胸腺素α原具有有效抑制体内脂肪的堆积、降低血脂水平、调节体内脂肪代谢正常、达到治疗和改善脂肪肝的症状的功能。

由此可见，本发明所述重组人胸腺素α原可用于制备预防及治疗脂肪肝药物。所述脂肪肝包括酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝。送药途径包括口服和皮下注射等。

本发明所述胸腺素α原，还包括所有从哺乳动物提取的胸腺素α原、基因工程表达的胸腺α原、胸腺素α1和胸腺5-肽。

附图说明

图1为ProTα PCR产物检测图谱。在图l中，1为ProTαPCR产物，2为Puc Mix 8：分子量标准，bp：碱基对；1116bp，883bp，692bp，501bp，404bp，331bp分别代表不同大小DNA。

图2为ProTα和pGEX-6p-1(EcoRI+BamHI)酶切图谱。在图2中，1为Puc Mix 8：分子量标准；2为含ProTα质粒EcoRI+BamHI酶切；3为pGEX-6p-1EcoRI+BamHI酶切；1116bp，883bp，692bp，501bp，404bp，331bp分别代表不同大小DNA。

图3为pGEX-6p-1-ProTα(EcoRI+BamHI)酶切鉴定图谱。在图3中，1，2，3为酶切图谱；4为分子量标准；bp为碱基对单位；116bp，883bp，692bp，501bp，404bp，331bp分别代表不同大小DNA。

图4为融合蛋白GST-ProTα表达的SDS-PAGE电泳图谱。在图4中，结果证明在预计的位置有目的蛋白的高表达(箭头所指)。(1，2，3，4，5分别为IPTG诱导前，诱导1h，诱导2h，诱导3h，诱导4h，菌体蛋白电泳图；6为Marker：蛋白分子量标准，KD，蛋白分子量单位，千道尔顿；97kDa，66kDa，45kDa，30kDa，20kDa，14kDa分别代表不同分子量大小标准蛋白。

图5为GST-ProTα渗透休克实验样品SDS-PAGE电泳图谱。在图5中，1为Marker：蛋白分子量，KD，蛋白分子量单位，千道尔顿；2为渗透样品对照；3为低渗样品；97kDa，66kDa，45kDa，30kDa，20kDa，14kDa分别代表不同分子量大小标准蛋白。

图6为GST-ProTαGlutathione Sepharose 4B柱色谱图。在图6中，横坐标为时间(min)，纵坐标为吸光值(u)；吸脱峰代表样品出峰特征图，UV280检测代表紫外波长。

图7为GST-ProTαGlutathione Sepharose 4B纯化样品电泳图谱。在图7中，1为Marker：蛋白分子量，KD，蛋白分子量单位，千道尔顿；2为上样对照；3为穿透；4为洗脱样品；97kDa，66kDa，45kDa，30kDa，20kDa，14kDa分别代表不同分子量大小标准蛋白。

图8为GST-ProTα(EK酶)酶切图谱。在图8中，1为酶切前对照，2，酶切1h；3，酶切2h；4，Marker；5，酶切3h；6，酶切4h。箭头所指为ProTα蛋白(KD，蛋白分子量单位，千道尔顿)(16kDa，14kDa，10kDa，8kDa，分别代表不同分子量大小标准蛋白)。

图9为ProTα酶切后过Glutathione Sepharose 4B柱样品电泳图谱。在图9中，1～3为ProTα酶切洗脱；4～6为酶切穿透；7～9为酶切对照；10为Marker：标准，KD，蛋白分子量单位，千道尔顿；97kDa，66kDa，45kDa，30kDa，20kDa，14kDa分别代表不同分子量大小标准蛋白。

图10为ProTαQFF柱纯化样品电泳图谱。在图10中，1为Marker蛋白分子量标准；2～3为样品：ProTα样品；KD代表蛋白质分子量，千道尔顿；16kDa，14kDa，10kDa，8kDa，6kDa分别代表不同分子量大小标准蛋白。

图11为ProTαdot-blot实验。在图11中，1为阴性对照；2～3为样品。

图12为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠胆固醇水平的影响。在图12中，PTα/5μg，PTα/10μg分别代表5μg用药量和10μg用药量；横坐标为不同组别，纵坐标为胆固醇浓度(mmol/L)。

图13为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠甘油三脂水平的影响。在图13中，PTα/5μg，PTα/10μg分别代表5μg用药量和10μg用药量；横坐标为不同组别，纵坐标为甘油三脂浓度(mmol/L)。

图14为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠脂肪指数的影响。在图13中，PTα/5μg，PTα/10μg分别代表5μg用药量和10μg用药量；横坐标为不同组别，纵坐标为脂肪指数。

图15为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠体重的影响。在图15中，PTα/5μg，PTα/10μg分别代表5μg用药量和10μg用药量；横坐标为不同组别，纵坐标为体重(克)。

图16为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠肝脏指数的影响。在图16中，PTα/5μg，PTα/10μg分别代表5g用药量和10μg用药量；横坐标为不同组别，纵坐标为肝脏指数。

图17为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠脂肪细胞大小的影响。在图17中，A：对照组；B：代表5μg用药量；C：代表10μg用药量；标尺为200μm。

图18为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠肝脏的影响。在图18中，A：对照组；B：代表5μg用药量；C：代表10μg用药量；D：代表喂养普通饲料组。

图19为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠肝脏的影响。在图19中，A：对照组；B：代表5μg用药量；C：代表10μg用药量；D：代表喂养普通饲料组。

图20为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠体重的影响。在图20中，(a)5μg用药量与对照组，(b)10μg用药量与对照组；A：对照组；B：代表5μg用药量；C：代表10μg用药量。

图21为本发明实施例重组人胸腺素α原对小鼠肝脏的影响。在图21中，A：对照组；B：代表5μg用药量；C：代表10μg用药量；D：代表喂养普通饲料组。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例所采用的材料与方法说明如下。

1.实验取材

重组人前胸腺原α原制备方法如下：

质粒：pGEX-6p-1，BL21、重组菌株pGEX-6p-1-ProTα，DH5a-7、BL21菌株由本实验室周克夫保存，ProTα基因克隆及重组菌株pGEX-6p-1-ProTα的构建方法参见本申请人的发明专利申请(申请号为200710009083.0)。

本发明在原先构建的pGEX 6P-1-ProTα基础上将pGEX-6p-1-ProTα中的融合蛋白中的PP酶切位点，改成EK酶切位点，因此分别重新合成ProTα上游引物和下游引物如下：

上游引物：5-CCCCTGGGATCCGATGACGATGACAAGTCAGACGCAGCCGTAGACA-3；

下游引物：3pGEX Sequencing Primer(24bp)：5-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3

经过PCR及酶切后将ProTα基因片断插入原核表达载体pGEX 6P-1中，再经过诱导表达获得融合蛋白，融合蛋白经过EK酶酶切将融合蛋白中的GST切除并经过一系列过柱纯化后获得本发明所使用的重组ProTα蛋白重组ProTα的构建及蛋白表达。

表达构建：

1、目的片断的PCR反应；

2、载体与目的片断的酶切回收；

3、连接，转化及转化子酶切鉴定。

融合蛋白表达。

融合蛋白纯化：

1.蛋白的酶切；

2.酶切后目的蛋白的捕获与纯化。

Glutathione Sepharose 4B柱。

Q Sepherose F.F.柱。

试验动物为昆明种小鼠，SPF级，(20±2)g，6-7周龄，雄性，厦门大学实验动物中心提供，合格证号0501452。

高糖高脂饲料由江苏双狮实验动物饲料有限公司配制，配方：基础料60％，猪油10％，

蔗糖10％，奶粉5％，胆固醇3％，鸡蛋10％，麻油2％。

2.实施方法

动物分组

40只小鼠随机分为A，B，C，D 4组，每组10只按如下方法进行喂食，A，B，C组每天喂养高糖高脂高胆固醇饲料，D组喂养常规饲料，每只食物定量5g/d，同时B组，C组分别口服ProTα10和20μg/d，分上、下午两次服完。A组，D组口服相同体积的PBS。连续3个月。实验结束，称量动物体重，眼眶取血，离心分离血清用于以下生化指标检测。

胆固醇采用酶比法。

甘油三脂采用酶比法。

处死动物后，分离肝脏，生殖器周围脂肪和肾脏周围脂肪，按公式器官指数＝器官重量/100g体重，分别计算肝脏指数和脂肪指数。

肝脏病理切片，HE染色及PAS染色均参考文献(人体寄生虫学实验技术，陈佩惠等编著，北京：科学出版社，1988.9)，按常规方法进行固定、包埋和染色处理。

本实验所有数据通过SPSS(version 13.0，SPSS Inc.)软件进行分析处理，其结果参见图12～21。

从图1～11的结果发现，当喂养高糖高脂高蛋白饲料的同时口服重组人前胸腺原α原，能够明显增强小鼠糖耐量作用，减轻体重增长趋势，降低肝脏指数，有效减轻脂肪肝的发生。同时发现，用药组腹腔脂肪细胞大小明显比对照组小，脂肪指数用药组比对照组小。血清生化指标检测发现，用药组甘油三脂和胆固醇水平明显比对照组低。以上结果经过统计分析均达到显著差异水平(P＜0.05)。

综合上述结果分析证明，重组人胸腺原α原在预防和治疗因为喂养高糖、高脂、高蛋白饲料引发的脂肪肝，抑制肥胖及其相关疾病具有突出的功能。

序列表

本发明所述重组人胸腺素α原基因序列为：

atgtcagacg cagccgtaga caccagctcc gaaatcacca ccgaggactt aaaggagaag    60

aagggagttg tggaagaggc ggaaaatgga agagacgccc ctgctcacgg gaatgctaat    120

gaggaaaatg gggagccgga ggctgacaac gaggtagatg aagaagagga agaaggtggg    180

gaggaagaag gtgatggtga ggaagaggat ggagatgaag atgagggagc tgagtcagct    240

acgggcaagc gggcagctga agatgatgag gataacgatg tcgataccca gaagcagaag    300

accgacgagg atgactag。

相应的蛋白序列为：

Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Lys Glu Lys

Lys Gly Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala His Gly Asn Ala Asn

Glu Glu Asn Gly Glu Pro Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly

Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Glu Gly Ala Glu Ser Ala

Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asn Asp Val Asp Thr Gln Lys Gln Lys

Thr Asp Glu Asp Asp *。

Claims (1)

1.重组人胸腺素α原在制备预防及治疗脂肪肝药物中的应用，所述重组人胸腺素α原基因序列为：

atgtcagacg cagccgtaga caccagctcc gaaatcacca ccgaggactt aaaggagaag     60

aagggagttg tggaagaggc ggaaaatgga agagacgccc ctgctcacgg gaatgctaat    120

gaggaaaatg gggagccgga ggctgacaac gaggtagatg aagaagagga agaaggtggg    180

gaggaagaag gtgatggtga ggaagaggat ggagatgaag atgagggagc tgagtcagct    240

acgggcaagc gggcagctga agatgatgag gataacgatg tcgataccca gaagcagaag    300

accgacgagg atgactag；

相应的蛋白序列为：

Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Lys Glu Lys

Lys Gly Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala His Gly Asn Ala Asn

Glu Glu Asn Gly Glu Pro Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly

Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Glu Gly Ala Glu Ser Ala

Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asn Asp Val Asp Thr Gln Lys Gln Lys

Thr Asp Glu Asp Asp *。

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