CN101649317B - 一种硅胶膜型dna快速提取及保存的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硅胶膜型DNA快速提取及保存DNA的方法。本发明利用硅胶膜高盐低PH条件下吸附DNA，低盐高PH条件下释放DNA的特性，通过一种新颖的含有细胞裂解剂、核酸酶抑制剂的溶液处理硅胶膜后，无需预先提取DNA的过程，直接将细胞裂解并将DNA吸附在硅胶膜上，同时由于核酸酶抑制剂的存在，该吸附DNA的硅胶膜可长期保存，避免DNA的降解。在提取过程中通过洗脱液I的洗脱作用，将膜上的盐分和细胞残留物漂洗后，膜上吸附纯净的DNA。通过洗脱液II的洗脱作用，将膜上结合的DNA洗脱至溶液中。整个DNA提取和保存过程操作快速、简便、廉价。

Description

一种硅胶膜型DNA快速提取及保存的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用硅胶膜从细菌或者体液中提取及保存DNA的一种方法。

背景技术

目前，从细菌或者体液中提取DNA的技术已经被广泛应用，提取和保存DNA的方法也多种多样。

传统的DNA提取方法是酚氯仿法，该方法廉价，应用范围广，但是由于大量使用有机溶剂容易引起环境污染。利用树脂、硅胶和硅胶膜吸附DNA特性而研发的DNA提取试剂盒，环境污染小，但是操作步骤繁琐，需要裂解液裂解细胞后通过多步离心获得纯化的DNA，成本较高并且采用上述方法均不能长期保存DNA。

DNA保存目前普遍采用的技术仍然是低温贮藏，利用低温抑制核酸内切酶对DNA的降解。采用该方法需要低温冰箱，保存条件要求高，同时也不利于DNA的运输。

DNA在水溶液中呈酸性，带负电荷，硅胶膜表面的硅-氧键水化形成的硅烷醇基团也呈弱酸性，带负电，因此两者之间会产生静电排斥不能互相结合。当溶液中存在一定浓度的阳离子后，通过形成阳离子桥中和DNA和硅烷醇基团之间的表面负电荷，从而使DNA的磷酸基团与硅烷醇基团之间形成氢键，使DNA牢固的吸附在硅胶膜表面。同时与硅胶膜结合的DNA抵抗核酸内切酶降解的能力比溶液中的DNA强100倍。盐浓度是影响DNA与硅胶膜结合的重要因素，DNA与硅胶膜结合能力与盐浓度呈正比。PH值直接影响DNA磷酸基团与硅胶膜的带电性，是氢键形成的基础，PH值在5-7之间，有利于DNA的吸附。当PH值超过7，通过氢键吸附DNA的能力开始降低。因此高盐、低PH值条件下硅胶膜特异性吸附DNA，反之当处于低盐或水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅烷醇基团与DNA磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放DNA。

DNA的提取和保存主要有以下几种途径：一：现场采集菌液或者体液，立即提取DNA并低温保存。二：现场采集样本，低温冻存防止核酸酶降解，然后运送至实验室提取DNA后低温冻存。采用方法一的缺陷是采集现场需要离心机、超净工作台等实验室设备，对于野外采集样本或者不具备实验室条件的场所无法使用该方法提取和保存DNA。采用方法二的缺陷是菌液或者体液低温运输不方便，如果不需立即提取DNA，样本必须一直低温贮藏，成本较高。

因此研发一种既能快速提取DNA又能保存DNA的方法非常必要。

发明内容

本发明目的是通过对硅胶膜进行处理后，使样本DNA直接吸附在硅胶膜上，同时抑制核酸内切酶的活性，从而可以长期保存DNA；通过洗脱吸附DNA的硅胶膜，可快速获得纯化的DNA。

本方法利用上述的硅胶膜结合DNA原理，保存DNA采用如下步骤：(1)配制由Tris-HCL、EDTA、SDS、异硫氰酸胍组成的裂解缓冲液，将PH值调制5.0-7.0；(2)将硅胶膜浸泡在裂解缓冲液中，使硅胶膜充分吸收缓冲液；(3)将硅胶膜放置再洁净环境下晾干或者烘干；(4)将菌液或者体液滴在制备的硅胶膜上；(5)将上述吸附DNA的硅胶膜常温保存即可。

从吸附DNA的硅胶膜洗脱DNA采用如下步骤：(1)将上述吸附DNA的硅胶膜放置在洗脱液I中洗涤后离心，吸弃洗脱液I；(2)重复步骤(1)；(3)通过离心后干燥方式去除洗脱液I；(4)加入洗脱液II，离心后获得含有纯化DNA的溶液，可用于后续PCR、酶切、转化等反应。

本发明通过将硅胶膜经过裂解缓冲液浸泡后，在高盐、低PH值的条件下使硅胶膜具有裂解细胞释放DNA、吸附DNA、抑制核酸内切酶活性这三种特性，从而使滴在硅胶膜上的菌液或者体液的DNA释放并吸附在硅胶膜的硅烷醇基团上，并且由于硅胶膜结合的DNA抵抗核酸内切酶降解的能力增强以及核酸酶抑制剂的存在，使DNA能长期室温保存。洗脱DNA时，将吸附DNA的硅胶膜放入含有乙醇有机溶剂的洗脱液I中反复洗涤，使硅胶膜上的盐分以及蛋白质溶解于洗脱液中而硅胶膜硅烷醇基团与DNA磷酸基团之间的氢键并不会被破坏。通过离心后干燥的方式去除洗脱液I，避免对后续分子生物学实验操作产生影响。加入洗脱液II，在低盐或者水溶液状态下硅胶膜释放DNA进入洗脱液II中。

所述裂解缓冲液含有Tris-HCL、SDS、EDTA和异硫氰酸胍。Tris-HCL作用是可以提供PH5.0-7.0的缓冲液，低PH值影响DNA磷酸基团与硅胶膜的带电性，有利于氢键的形成，浓度范围为50mmol/L-100mmol/L；SDS作用是裂解细菌或者体液细胞的细胞膜，释放DNA，浓度范围为1％-5％；EDTA作用是螯合二价金属离子，由于核酸内切酶的活性需要有Mg2+的存在，螯合二价金属离子可以抑制核酸内切酶活性，浓度范围为15mmol/L-20mmol/L；异硫氰酸胍的作用是提供高盐环境，形成阳离子桥中和DNA和硅烷醇基团之间的表面负电荷，从而使DNA的磷酸基团与硅烷醇基团之间形成氢键，使硅胶膜具备吸附DNA的能力，同时高盐环境能灭活核酸内切酶，保护DNA，浓度范围为3-5mol/L，可用盐酸胍代替。

所述洗脱液I为含乙醇的有机溶剂，浓度范围为85％-95％，可用异丙醇代替。洗脱液I作用是溶解硅胶膜所含盐分以及蛋白质、脂质，糖类等细胞裂解后的杂质。洗脱液I不会破坏DNA与硅胶膜之间的结合。洗脱液I必须通过离后的杂质。洗脱液I不会破坏DNA与硅胶膜之间的结合。洗脱液I必须通过离心后干燥的方法彻底去除，避免破坏后续测序、PCR、酶切、转化等分子生物学实验的反应体系。

所述洗脱液II为低盐溶液，浓度范围10mmol/L-2.5mmol/L Tris-HCL，可用纯水代替，在低盐或者纯水条件下硅胶膜硅烷醇基团与DNA磷酸基团之间的氢键被破坏，硅胶膜的硅烷醇基团与DNA磷酸基团之间产生静电排斥，从而使DNA脱离硅胶膜进入溶液中。低盐溶液或纯水的量视对DNA浓度的要求而定。

本发明中硅胶膜经过处理后具备释放DNA、吸附DNA、抑制核酸内切酶活性这三种特性。采集菌液或者体液时非常简便，只需将样本加到硅胶膜表面即可。硅胶膜上盐分立即溶解于所加样本溶液中，形成高盐、低PH的环境，细胞膜裂解后释放DNA，DNA的磷酸基团立即与硅胶膜的硅烷醇基团形成氢键结合，DNA吸附在硅胶膜表面。由于核酸内切酶抑制剂的存在，DNA具备抵抗核酸内切酶降解的能力。该硅胶膜便于样本采集、运输和室温保存。避免了传统方法中多步离心提取和低温保存的繁琐步骤。

本发明DNA洗脱过程简单，只需通过4个步骤的洗涤离心即可获得纯化的DNA，可用于随后的测序、PCR、酶切、转化等分子生物学实验。

附图说明

图1从大肠杆菌DH5a提取质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图。M为DNA标记；1为用本发明硅胶膜型DNA快速提取及保存的方法提取的质粒DNA；2为使用商品化质粒提取试剂盒提取的质粒DNA；3为传统的酚氯仿法提取的质粒DNA。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

1.1.取6克Trisbase、8克SDS、1.5克EDTA、80克异硫氰酸胍于500ml容量瓶中，加300ml超纯水，浓盐酸调PH至5.0，加去离子水定容至500ml，制备成裂解缓冲液。

2.裁剪1cm²的硅胶膜放入平皿中，吸200ul上述裂解缓冲液滴加在硅胶膜上，晾干。

3.将过夜增菌的菌液取30ul滴加在晾干的硅胶膜上，室温晾干。将干燥的硅胶膜放置在无外源DNA污染的塑料袋中避光保存。

实施例2

1.取出保存的硅胶膜，放入1.5ml离心管中，加入1ml用超纯水配制的85％乙醇，放置在水平震荡器上震荡3分钟，吸弃乙醇，短暂离心后吸弃残留乙醇。

2.重复步骤(1)，通过两次洗涤去除硅胶膜上盐分以及残留的细菌杂质。

3.短暂离心后打开离心管盖，室温下放置10分钟，去除乙醇。

4.加入100ul超纯水，放置在水平震荡器上震荡10分钟，短暂离心，所得水溶液中含有细菌基因组DNA和质粒DNA，可用于后续测序、PCR、酶切、转化等反应。

Claims (1)

1.一种硅胶膜型DNA快速提取及保存的方法，其特征在于通过如下步骤：

(1)配制裂解缓冲液，裂解缓冲液由50mmol/L-100mmol/L Tris-HCL、15mmol/L-20mmol/L EDTA、1％-5％SDS、3-5mol/L异硫氰酸胍或盐酸胍组成；

(2)将硅胶膜浸泡在裂解缓冲液中，使硅胶膜充分吸收缓冲液后干燥；

(3)将菌液或者体液滴在制备的硅胶膜上，常温保存。