CN101648929A - 烟梗所含的木脂素类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的烟梗所含的木脂素类化合物(I)及其制备方法和应用。系将烟梗样品粉碎后以70％的乙醇分3次用超声提取，合并提取液，过滤，减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物并浓缩成浸膏，浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用高效液相半制备色谱进一步分离，即得到所需新化合物。对该化合物进行了抗抗氧化活性和抗HIV－1活性筛选，实验结果显示化合物显示出较强的抗氧化和抗HIV－1活性。

Description

烟梗所含的木脂素类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于烟草化学领域，更具体地说，本发明涉及烟梗中一种新的木脂素类化合物制备方法及其活性。

背景技术

木脂素(lignan)又称木脂体，是一类由二分子苯丙素衍生物聚合而成的化合物。多以二聚体的形式存在，少数为三聚体和四聚体，它们存在于许多种植物中，所在部位各异，甚至在植物的分泌物、人类和动物的尿液中也有发现。木脂素大多呈游离状态，也有的与糖结合成甙存在于植物中。富含木脂素类化合物的植物在民间有着相当长的医用历史，如：小檗科鬼臼等多种值物中所含的鬼臼毒素(podophyllotoxin)及其衍生物具抗肿瘤的活性，五味子素(schizandrin)能降低谷丙转氨酶(GPT)而用于治疗肝炎，厚朴酚(maganolol)具肌肉松弛作用，牛蒡子甙(arctiin)对风热感冒有效等。由于植物木脂素成分结构类型多，立体化学复杂，具有多种生物活性，国内外对该领域的研究十分活跃。

烟梗是烟叶之粗梗叶脉，约占叶重的25％-30％。烟梗是烟草工业的副产物，目前多作弃置处理。研究表明，烟梗中含有多种有用的化学成分，其特殊天然植物素，如烟碱、果胶、烟酸及茄呢醇等，在精细化工、日化、食品、轻工、医药等行业都有着广泛的应用。我国是烟草大国，每年有数十万吨烟梗资源被废弃，既造成环境污染，同时也是对自然资源的浪费。目前，已有从烟草废弃物中提取烟碱、茄尼醇、植物蛋白等，这些研究成果为烟草废弃物综合利用开辟了一条新途径。但是，至今还没有烟梗中木脂素类化合物的报道，本发明从烟梗中分离得到了一种具有生物活性的新木脂素化合物，为烟梗的综合利用提供了新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的木脂素类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种从烟梗中提取所述化合物的方法。

本发明进一步的目的是提供所述化合物在抗氧化和抗HIV-1中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

A.本发明从烟梗中分离出一种新的木脂素类化合物，该化合物具有显著的抗氧化和抗HIV-1活性。

本发明的新的木脂素类化合物具有下述结构式：

该化合物的命名为：烟草木脂素A(Toblignan A)。

B.本发明提供了一种所述化合物的制备方法，该方法采用以下步骤：

1.烟梗样品粉碎后以70％的乙醇分3次用超声提取；2.合并提取液，减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物，并将提取液浓缩成浸膏；3.浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用高效液相半制备色谱进一步分离，即得到所需的该新化合物。

C.本发明对所述的新化合物进行了抗氧化和抗HIV-1活性检测，化合物显示出良好的抗氧化活性和抗HIV-1效果，可为医药工业提供有药用价值的新化合物或先导化合物。

附图说明

图1为化合物的高分辨质谱(HRESIMS)；

图2为化合物的核磁共振氢谱(¹H NMR)；

图3为化合物的核磁共振炭谱(¹³C NMR)；

图4本发明的化合物和kobusinol A结构对比，图中，a为本发明化合物的结构式；b为kobusinol A的结构式；

图5为化合物的HSQC相关谱；

图6为化合物HBMC相关谱；

图7为化合物COSY相关谱；

图8为化合物ROESY相关谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

——化合物的制备

烟梗样品采于云南玉溪。将烟梗样品取样3.0kg粉碎到30目，以70％的乙醇用超声提取3次，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏63.8g。浸膏用适量氯仿溶解后用80g粗硅胶(80-100目)拌样，1.5kg硅胶(160-200目)装柱进行硅胶柱层析，氯仿∶丙酮(1∶0→0∶1)梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分(纯氯仿、氯仿-丙酮20∶1、氯仿-丙酮9∶1、氯仿-丙酮8∶2、氯仿-丙酮3∶2、氯仿-丙酮1∶1、氯仿-丙酮1∶2、纯丙酮)，其中氯仿-丙酮(8∶2)洗脱部分4.26g用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以60％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C₁₈(9.4×250mm，5μm)半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为300nm，每次进样50μL，收集15.8min的色谱峰，多次累加后蒸干，再次用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，可得该新化合物。

实施例2

——化合物的鉴定

本发明化合物为白色无定形粉末；紫外光谱(溶剂为甲醇)，λ_max(log ε)：280(4.18)，206(5.36)nm；红外光谱(溴化钾压片)3462，2958，2874，1687，1652，1621，1528，1485，1462，1398，1354，1245，1208，1121，1098，1055cm^-1；旋光(溶剂为甲醇)[α]_D ^25.3+3.6(c 0.26)。

HRES IMS(附图-1)显示本发明化合物准分子离子峰m/z 367.1523[M+Na]⁺(计算值为367.1521)，结合¹H和¹³C NMR谱(图-2和图-3，数据归属见表-1)给出其分子式C₂₀H₂₄O₅，不饱和度为9。¹H和¹³C NMR谱信号表明化合物中有2个苯环(包括6个双键次甲基碳(δ_C110.9、116.3、120.1、113.2、116.6、121.8)，1个甲基(δ_C15.0)，2个次甲基(δ_C49.5、49.2)，1个氧化的次级甲基(δ_C89.2)，1个亚甲基(δ_C38.5，1个氧化的亚甲基(δ_C73.4)，2个甲氧基(δ_C55.9、56.0)。本发明化合物的¹³C-NMR数据与已知化合物kobusinol A(图-4)比较表明两者非常相似，不同之处仅为该化合物中苯环上少了1个甲氧基信号而苯环上双键次甲基碳信号相同，说明1个甲氧基被羟基取代，经HMBC相关谱(图-6)证实本发明化合物中C-3、C-3’位为甲氧基，C-4，C-4’位为羟基；并近一步经过ROESY相关谱(图-8)证实了本发明化合物的立体结构。至此，化合物的结构式最终被确定，命名为烟草木脂素A(Toblignan A)。

表-1化合物的¹H和¹³C NMR数据

实施例3

——化合物抗氧化活性检测

抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL为初筛浓度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPPH乙醇溶液(6.5×10⁵mol/L)190μL/孔，加入待测样品10μL/孔，空白孔加10μL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为517nm；样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算：

DPPH清除率(％)＝(A_空白-A_样品)/A_空白×100％

A_空白：空白对照组吸光度值；A_样品：加样品组吸光度值。

样品平行5次检测，计算半数清除浓度IC50测定结果为6.87μg/L，表明化合物具有良好的抗氧化活性。

实施例4

——对本发明化合物的抗HIV活性检测

1.HIV-1感染性滴定

按Johnson&Byington所述方法改良进行滴定；按Reed&Muench方法计算病毒的TCID₅₀(50％Tissue Culture Infection Dose)。

2.样品对C8166宿主细胞的细胞毒性检测

4×10⁵/ml C8166细胞悬液100ul与待测化合物溶液混合，设三个重复孔。同时设置不含化合物的对照孔，温度37℃，5％CO₂培养三天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800ELISA仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC₅₀值(50％Cytotoxic Concentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的化合物浓度。

3.样品对HIV-1_IIIB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制试验

将8×10⁵/mL C8166细胞50μL/孔接种到含有100μL/孔倍比稀释化合物的96孔细胞培养板上，然后加入50μL的HIV-1_IIIB稀释上清(M.O.I.0.0016)。设三个重复孔。同时设置不含化合物的正常细胞对照孔。37℃，5％CO₂培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC₅₀(50％EffectiveConcentration)为抑制合胞体形成50％时的化合物浓度。

4.样品对HIV感染细胞的保护作用试验

将8×10⁵/ml MT₄细胞50ul/孔接种到含有100μl/孔倍比稀释化合物的96孔细胞培养板上，培养板的一半孔加入50μl的HIV-1_IIIB稀释(M.O.I.0.006)，另一半孔加入50μl培养基。每个浓度梯度2个重复孔，同时设置不含化合物的对照孔和空白对照孔，37℃、5％CO₂培养，第三天每孔补加100μl新鲜培养基，第五天或第六天采用MTT比色法检测细胞存活率。ELx800ELISA仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。用公式计算出化合物对正常细胞的毒性和对HIV-1_IIIB感染细胞的保护作用。

5.计算公式

根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed&Muench法计算出化合物抑制病毒的50％有效浓度(EC₅₀)，50％抑制细胞生长浓度(CC₅₀)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeutic index)为：TI＝CC₅₀/EC₅₀。

细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100

细胞生长抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100

HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100

感染细胞的保护率(％)＝

(实验孔OD值-阳性对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值-阳性对照孔OD值)×100

6.实验结果

实验结果清楚地表明，该化合物显示出一定的抗HIV-1活性，其治疗指数为112.8，揭示了本发明的化合物在制备抗爱滋病的药物中有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种具有下述结构式的化合物：

2.权利要求1所述化合物的制备方法，该方法采用以下步骤：

(1)烟梗样品粉碎后以70％的乙醇分3次用超声提取，合并提取液；

(2)减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物并浓缩成浸膏。

(3)浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用高效液相半制备色谱进一步分离，即得到所需的化合物。

3.权利要求1所述的化合物作为抗氧化剂的应用。

4.权利要求1所述的化合物在制备抗HIV-1药物中的应用。

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