CN101641114A

CN101641114A - 炎症和/或内毒素休克的治疗

Info

Publication number: CN101641114A
Application number: CN200880009305A
Authority: CN
Inventors: 戴维·R·格里夫斯; 安德烈亚斯·鲁斯; 詹纳·L·卡什
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: University of Oxford science and Technology Innovation Co., Ltd.
Priority date: 2007-03-22
Filing date: 2008-03-25
Publication date: 2010-02-03
Anticipated expiration: 2028-03-25
Also published as: CN102838658B; JP5934298B2; EP2131852B1; GB0705488D0; US8906865B2; WO2008114037A1; ES2663379T3; US20100150990A1; EP2131852A1; US20150320826A1; DK2465522T3; CN101641114B; JP2010522228A; EP2465522B8; PL2465522T3; JP2014237663A; EP2465522A1; EP2465522B1; AU2008228012B2; AU2008228012A1

Abstract

本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C－末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物用于治疗受试者体内炎症和/或内毒素休克和/或处理受试者体内伤口和/或降低受试者体内炎性趋化因子水平的应用，以及衍生自凯莫瑞蛋白的C－末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物用于炎症和/或内毒素休克的治疗，和/或伤口处理，或用于降低炎性介质的水平的应用。

Description

炎症和/或内毒素休克的治疗

技术领域

本发明涉及炎症和/或内毒素休克的治疗和/或炎性趋化因子的水平的降低，并涉及用于炎症和/或内毒素休克的治疗，或用于炎性介质的水平降低的组合物。

背景技术

炎症是许多人类和动物疾病的致病机理的组成部分，而且也作为人类或动物身体组织的物理、化学或外伤性损伤的结果而发生。通常，免疫应答导致内源性化学介质的全身释放，这会导致血管舒张、中性白细胞迁移、趋化作用、及脉管的渗透性增加。无论免疫应答发生在何处以及是由什么引起的，其原因基本上是相同的。应答可以为急性的(短暂的)或者可以是慢性的(持续的)。

内毒素休克，有时也被称为感染性休克，被认为是由于血管内暴露于由炎症样应答导致的大量内毒素而发生的。暴露于内毒素导致产生大量细胞因子，包括TNFα和IL-1。补体系统和凝结级联(coagulation cascade)，包括因子VII也受到刺激。这种反应的结果可以是组织损伤、发热、血管舒张、心动过速和血管内凝固。

炎性应答通常是有益的，使得炎症部位进入的营养素、氧、抗体和治疗性药物增加，以及纤维蛋白的形成增加和毒素稀释。然而，如果炎症是不希望的或延长的，则会造成组织的损伤。在这样的情况下，通常使用抗炎性药物。存在两种主要类型的抗炎性药物，皮质激素类和非甾体抗炎药(NSAIDs)。这些药物中的大多数具有不希望的副作用。延长的皮质激素给予通常与拟态的库欣病(Cushing′s disease)的严重副作用相关，库欣病是一种由皮质醇产生过剩而导致的肾上腺机能障碍。其他可能的副作用包括体重增加、胸部、面部、颈部和上背部脂肪沉积、水肿、高血压、糖尿病、伤口愈合不良、容易发生感染、皮肤变薄、情绪不稳定和抑郁。NSAIDS的最严重的副作用是肾衰竭、肝功能衰竭、溃疡以及损伤或手术后的持续出血。一些个体对NSAIDs过敏，而患有哮喘的人对阿司匹林的严重过敏反应存在较高风险。因此，需要鉴定具有抗炎性作用的可选药剂。

凯莫瑞(Chemerin，一种脂肪细胞因子，是孤独G蛋白偶联素受体chemerin R的内源性配体)是一种存在于人类炎性渗出物(包括腹水和滑液)中的丰富蛋白(Wittamer V et al.J Exp Med.2003年10月6日；198(7)：977-985；Meder Wet et al.FEBS Lett.2003年12月18日；555(3)：495-499)。人类凯莫瑞(Chemerin)是作为称为前体凯莫瑞(ProChemerin)的163个氨基酸(aa)前体(小鼠(Musmusculus)，鼠类等同物为162aa)而分泌的，其经历N-和C-末端截短以产生137aa的趋化蛋白(小鼠中为140aa)(Wittamer V et al.J Exp Med.2003年10月6日；198(7)：977-985；Zabel BA et al.J BiolChem.2005年10月14日；280(41)：34661-34666；Wittamer V et al.JImmunol.2005年7月1日；175(1)：487-493；Samson M et al.Eur JImmunol.1998年5月；28(5)：1689-1700)。凯莫瑞的预测结构表明了与趋化因子的结构类似性，它已经被描述为“相反的”趋化因子，潜在地具有无序的羧基-末端、α-折叠片和β-螺旋氨基-末端结构域(Zabel BA et al.Exp Hematol.2006年8月；34(8)：1021-1032)。该结构使人联想到存在于组织蛋白酶和激肽原中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)折叠，其也经历蛋白水解过程以实现活化(Zabel BAet al.Exp Hematol.2006年8月；34(8)：1106-1114；Colman RW，BiolChem.2001年1月；382(1)：65-70；Yamasaki K et al.FASEB J.2006年10月1日2006；20(12)：2068-2080)。

发明内容

根据第一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞(Chemerin)蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于治疗炎症的药物中的应用。

根据另一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于制备内毒素休克的药物中的应用。

根据另一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于降低一种或多种炎性介质水平的药物中的应用。

根据又一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物，以用于治疗炎症、和/或治疗内毒素休克、和/或降低一种或多种炎性介质的水平。

该一种或多种炎性介质可以包括介导炎症的细胞因子、趋化因子和脂质。该炎性介质可以包括选自包含由以下物质组成的组中一种或多种趋化因子：TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、G-CSF、MCP-2(CCL8)、GROα(CXCL 1)、GROβ(CXCL2)、IL-8(CXCL8)、TECK(CCL25)、MCP-1(CCL2)、干扰素γ和RANTES(CCL5)。优选地，该药物能够降低TNFα的水平。

出人意料的是，衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽具有抗炎特性，可以用于治疗、预防或改善炎症和/或内毒素休克。

该药物可以具有治疗和/或预防应用。

优选地，该肽在约5到约30个氨基酸之间。更优选地，所述肽在约5到约25个氨基酸之间，优选地，所述肽在约5到约20个氨基酸之间。

优选地，该肽包含约5到约30个衍生自Chemierin蛋白的C-末端的氨基酸，或它们的类似物或衍生物。更优选地，所述肽在约5到约25个氨基酸之间，优选地，所述肽在约5到约20个氨基酸之间。

凯莫瑞(Chemerin)蛋白是指凯莫瑞的处理形式，其中前体凯莫瑞的前体(PreProChemerin)中存在的N-末端氨基酸已经被蛋白水解去除，前体凯莫瑞(ProChemerin)前体中存在的C-末端氨基酸已经被蛋白水解去除，从而产生称为凯莫瑞的蛋白的活性截短形式。

优选地，该肽来生自人类形式或非人形式的凯莫瑞。优选地，该肽来自人类或哺乳动物形式的凯莫瑞。哺乳动物非人凯莫瑞可以来自啮齿动物，如大鼠或小鼠、马、狗、猫、牛、羊或猪。

优选地，衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端中的肽具有至少30％或更高的同一性。优选地，所述肽与天然存在的凯莫瑞蛋白的C-末端肽序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的同一性。

优选地，该肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端中的约最后5个到约最后30个，优选约最后10个到约最后25个氨基酸具有至少30％或更高的序列同一性。优选地，该肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端中的约最后5个到约最后30个，优选约最后10个到约最后25个氨基酸具有至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的序列同一性。

优选地，该肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端中的最后30个氨基酸中的5到25个氨基酸具有至少30％或更高的序列同一性。优选地，该肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端的最后30个氨基酸中的5到25个氨基酸具有至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的序列同一性。

关于凯莫瑞蛋白中的“最后的氨基酸”是指该蛋白C-末端的氨基酸。

图2A中给出了人类和鼠凯莫瑞、前体凯莫瑞(ProChemerin)和前体凯莫瑞前体(PreProChemerin)的全长序列，Seq ID no：31、32、33中分别反映了对于人类蛋白质，而Seq ID no：34、35、36中分别反映了小鼠蛋白质。优选地，凯莫瑞肽具有Seq ID No：31或34的序列。来自其他物种，如牛和大鼠的凯莫瑞蛋白的序列可以容易地从GenBank获得并且本领域技术人员可以容易地获得。

优选地，该肽与Seq ID no：31(|人类序列)和Seq ID no：34(小鼠序列)的凯莫瑞的最后5到最后30个氨基酸具有至少30％或更高，更优选40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的序列同一性。

百分比氨基酸序列同一性被定义为在比对序列以及在必要时引入空位(gap)以获得最大的百分比序列同一性之后，序列中的与天然存在的凯莫瑞蛋白中的氨基酸相同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比序列同一性的比对(Alignment)可以以本领域技术人员公知的许多方式实现，包括，例如，利用BLAST和ALIGN算法。

该肽可以包含相对于凯莫瑞蛋白C-末端的天然序列的添加、插入、缺失、倒位或易位，以使得该肽与具有天然序列的肽相比，具有至少50％的抗炎活性，和/或至少50％的抗内毒素休克活性，和/或将一种或多种炎性介质水平降低至少50％的能力。

术语“类似物”或“衍生物”是指这样的肽，其具有与天然存在的序列不同的序列，但是与具有天然存在序列的肽一起观察时，其包含基本上相同或更多，以及至少约50％、优选约60％、70％、80％或90％的抗炎活性、和/或抗内毒素休克活性、炎性介质减少活性。

肽类似物或衍生物可以具有任何氨基酸残基，包括N或C-末端残基的一个或多个缺失、插入、或修饰。该肽可以被乙酰化、酰化、烷基化、糖基化等。该肽还可以在C或N末端或C和N末端包含另外的氨基酸。

该肽、类似物或衍生物可以为融合蛋白的部分。

与天然存在的氨基酸序列相比，该肽可以包括一个或多个保守的氨基酸置换。

优选地，一种或多种所述肽包含选自包含以下的序列组的序列：

PHGYFLPGQFA(Chemerin11-小鼠；C11m；Seq ID No：1)；

PHGYFLPGQFAF(Chemerin12-小鼠；C12m；Seq ID No：2)；

PHGYFLPGQFAFS(Chemerin13-小鼠；C13m；；Seq ID No：3)；

AGEDPHGYFLPGQFA(Chemerin15-小鼠；C 15m；Seq ID No：4)；

AGEDPHGYFLPGQFAF(Chemerin16-小鼠；C16m；Seq ID No：5)；

AGEDPHGYFLPGQFAFS(Chemerin17-小鼠；C17m；Seq ID No：6)；

DPHGYFLPGQFA(Chemerin12A-小鼠；C12Am；Seq ID No：7)；

EDPHGYFLPGQFA(Chemerin13A-小鼠；C13Am；Seq ID No：8)；

GEDPHGYFLPGQFA(Chemerin14A-小鼠；C14Am；Seq ID No：9)；

DPHGYFLPGQFAF(Chemerin13B-小鼠；C13Bm；Seq ID No：10)；

EDPHGYFLPGQFAF(Chemerin14B-小鼠；C14Bm；Seq ID No：11)；

GEDPHGYFLPGQFAF(Chemerin15A-小鼠；C 15Am；Seq ID No：12)；

DPHGYFLPGQFAFS(Chemerin14C-小鼠；C14Cm；Seq ID No：13)；

EDPHGYFLPGQFAFS(Chemerin15B-小鼠；C15Bm；Seq ID No：14)；

GEDPHGYFLPGQFAFS(Chemerin16A-小鼠；C16Am；Seq ID No：15)；

PHSFYFPGQFA(Chemerin11-人类；C11h；Seq ID No：16)；

PHSFYFPGQFAF(Chemerin12-人类；C12h；Seq ID No：17)；

PHSFYFPGQFAFS(Chemerin13-人类；C13h；Seq ID No：18)；

AGEDPHSFYFPGQFA(Chemerin15-人类；C15h；Seq ID No：19)；

AGEDPHSFYFPGQFAF(Chemerin 16-人类；C 16h；Seq ID No：20)；

AGEDPHSFYFPGQFAFS(Chemerin 17-人类；C 17h；Seq ID No：21)；

DPHSFYFPGQFA(Chemerin12A-人类；C12Ah；Seq ID No：22)；

EDPHSFYFPGQFA(Chemerin13A-人类；C 13Ah；Seq ID No：23)；

GEDPHSFYFPGQFA(Chemerin14A-人类；C14Ah；Seq ID No：24)；

DPHSFYFPGQFAF(Chemerin13B-人类；C13Bh；Seq ID No：25)；

EDPHSFYFPGQFAF(Chemerin14B-人类；C14Bh；Seq ID No：26)；

GEDPHSFYFPGQFAF(Chemerin 15A-人类；C 15Ah；Seq ID No：27)；

DPHSFYFPGQFAFS(Chemerin 14C-人类；C 14Ch；Seq ID No：28)；

EDPHSFYFPGQFAFS(Chemerin15B-人类；C 15Bh；Seq ID No：29)；以及

GEDPHSFYFPGQFAFS(Chemerin16A-人类；C16Ah；Seq ID No：30)或它们的类似物或衍生物。

优选地，一种或多种该肽包含选自包括以下序列的组的序列：

AQAGEDPHGYFLPGQFAFS(Chemerin19-小鼠；C19m；Seq IDNo：37)；以及

QRAGEDPHSFYFPGQFAFS(Chemerin19-人类；C 19h；Seq IDNo：38)；或它们的类似物或衍生物。

优选地，该肽与上文中被称为Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的一种或多种肽具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的序列同一性。

优选地，该肽与上文中被称为Seq ID No：37或38的一种或多种肽具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的序列同一性。

优选地，衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽的类似物或衍生物包括肽的小分子模拟物。

该肽、类似物或衍生物，可以从天然系统分离，或者可以合成地或重组地产生。合成的肽可以由标准的化学方法产生，包括由自动程序合成。

重组肽可以以纯化形式使用。可替换地，可以使用来自表达重组肽的细胞的上清液。

该肽、类似物或衍生物可以形成较大的蛋白或分子复合物的部分。

该肽可以为直链或环状的。

该肽可以包括耐蛋白酶的主链。

该肽可以包括在C和/或N末端的修饰。

该肽可以通过本领域已知的方法被标记，如放射性标记、荧光标记、质谱标签、生物素等。

所述药物可以包含其他活性成分，包括其他已知的抗炎药剂、和/或其他已知的抗内毒素休克药剂、和/或其他已知的降低趋化因子水平的药剂。

所述药物还可以包含药用赋形剂。该赋形剂可以包含大的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖、脂质聚集体和非活性病毒颗粒。这样的赋形剂是本领域技术人员熟知的。

所述药物还可以包含缓冲剂、增粘剂、溶剂、稳定剂和防腐剂中的一种或多种。

所述药物的给药途径可以为通过肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、动脉内、损伤内、关节内、局部、经口、直肠、经鼻、吸入、或任何其他合适的途径注射或输注。

所用的肽的剂量取决于肽、靶标和处理。给药剂量和途径确定是在普通医师的技术范围内。正常剂量的给药方案可以在约1pg/kg到约100mg/kg的范围内变化，更优选地，该剂量在约10pg/kg到约1mg/kg，更优选地在约10pg/kg到约100ng/kg的范围内变化。优选地，这些剂量是每日剂量。

出人意料的是，已经发现根据本发明的肽的低至0.32ng/kg的剂量在对小鼠体内的无菌性腹膜炎具有效能，而需要使用1.2mg/kg的地塞米松才能观察到类似程度的效能。

优选地，根据本发明的应用的药物可以意图以约10pg/kg到约1mg/kg的剂量给药，更优选地，以约10pg/kg到约100ng/kg或者约10pg/kg到约10ng/kg的剂量给药。这些剂量比所需要的地塞米松的剂量低至少三个对数级(log)。

根据本发明的另一方面，提供了治疗/处理、预防或改善受试者体内炎症的方法，包括给予受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物。

根据本发明的另一方面，提供了治疗/处理、预防或改善受试者体内内毒素休克的方法，包括给予受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物。

根据本发明的另一方面，提供了降低受试者体内的一种或多种炎性介质水平的方法，包括给予受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物。

所述治疗(处理)可以是治疗性的、预防性的或美容用的。

优选地，该肽以有效量被给予，有效量即为，足以(i)诱导或导致炎症减少，或防止或减少炎症；(ii)诱导或导致内毒素休克的减少，或防止或减少内毒素休克；和/或(iii)降低一种或多种炎性介质水平的量。

可替代地，本发明的药物可以被直接施用于医学装置以减少炎症相关的装置的风险。这可以通过将药物施用于该装置的表面或通过用一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物浸渍所述装置的表面来实现。

根据另一方面，本发明提供了用一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物浸渍的医学装置。

该医学装置可以为支架或导管。

根据又一方面，本发明提供了用一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物浸渍的伤口敷料或绷带。

本发明的任何方面所涉及的炎症可与以下病症相关，例如青少年慢性关节炎、脊柱关节病、系统性硬化症(硬皮病)、原发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(原发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、青少年淋巴细胞甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、自身免疫性炎性疾病(如变应性脑脊髓炎、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性视网膜炎、甲状腺毒症、硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病(如克罗恩病、溃疡性结肠炎、局限性肠炎、回肠末端炎、肉芽肿性肠炎、局限性回肠炎、末端回肠炎)、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、同种异体移植物排斥、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病如多发性硬化症、原发性脱髓鞘性多发性神经病或格林-巴利综合征、和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、肝胆病如传染性肝炎(甲、乙、丙、丁、戊型肝炎和其他非嗜肝病毒)、自身免疫性慢性活动型肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、谷蛋白敏感性肠病、惠普尔氏病、自身免疫性或免疫介导的皮肤疾病包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎、银屑病、变态反应病如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺部免疫性疾病如嗜酸细胞性肺炎、先天性肺纤维症和过敏性肺炎(hypersensitivitypneumonitis)、移植相关疾病包括移植排斥和移植物抗宿主病、感染性疾病包括病毒性疾病如AIDS(HIV感染)、疱疹等、细菌感染、真菌感染、原生动物感染、寄生虫感染、及呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒等、湿疹和内毒素休克。

根据另一方面，本发明提供了能够治疗、预防或改善炎症的肽，该肽选自包括具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30的序列的肽和它们的类似物或衍生物组成的组。

根据另一方面，本发明提供了能够治疗、预防或改善炎症的肽，该肽选自包括具有Seq ID No：37、38的序列的肽和它们的类似物或衍生物组成的组。

根据另一方面，本发明提供了能够治疗、预防或改善内毒素休克的肽，该肽选自包括具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30的序列的肽和它们的类似物或衍生物组成的组。

根据另一方面，本发明提供了能够治疗、预防或改善内毒素休克的肽，该肽选自包括具有Seq ID No：37、38的序列的肽和它们的类似物或衍生物组成的组。

根据另一方面，本发明提供了能够降低一种或多种炎性介质水平的肽，该肽选自包括具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30的序列的肽和它们的类似物或衍生物组成的组。

根据另一方面，本发明提供了能够降低一种或多种炎性介质水平的肽，该肽选自包括具有Seq ID No：37、38的序列的肽和它们的类似物或衍生物组成的组。

根据另一方面，本发明提供了包含一种或多种肽的药物组合物，该肽选自包括具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、和30的序列的肽和它们的类似物或衍生物组成的组。

根据另一方面，本发明提供了包含一种或多个种的药物组合物，该肽选自包括具有Seq ID No：37和38的序列的肽和它们的类似物或衍生物组成的组。

该药物组合物可以用于治疗和/或预防炎症、和/或治疗和/或预防内毒素休克、和/或用于降低一种或多种炎性介质(如细胞因子和趋化因子)的水平。

根据又一方面，本发明提供了具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的序列的肽或它们的类似物或衍生物。

根据另一方面，本发明提供了具有Seq ID No：37或38的序列的肽或它们的类似物或衍生物。

根据又一方面，本发明提供了与具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的序列的肽具有至少50％序列同一性的肽。优选地，该肽与具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的序列的肽具有至少60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。

根据又一方面，本发明提供了与具有Seq ID No：37或38的序列的肽具有至少50％的序列同一性的肽。优选地，该肽与具有Seq IDNo：37或38的序列的肽具有至少60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。

根据另一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于处理伤口的药物中的应用。

根据另一方面，本发明提供了治疗、预防或改善受试者的伤口的方法，包括给予受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽，或它们的类似物或衍生物。

根据另一方面，本发明提供了用于处理伤口的包含一种或多种肽的药物组合物，该肽选自包括具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、37或38的序列的肽或它们的类似物或衍生物组成的组。

根据另一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物，以用于炎症的治疗和/或预防、和/或内毒素休克的治疗和/或预防、和/或用于降低一种或多种炎性介质(如细胞因子和趋化因子)的水平。

根据另一方面，本发明提供了一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽，或它们的类似物或衍生物，以用于伤口的处理。

本领域技术人员将认识到上文披露的任何优选的特征能够应用于本发明的任何方面。

附图说明

以下将仅以举例的方式参照以下附图和实施例来描述本发明的优选实施方式。

图1A至图1F-图1A和图1B示出了Chemerin140以蛋白水解依赖性的方式抑制通过巨噬细胞的炎性介质的产生。利用Luminex和ELISA试验分析来自巨噬细胞或活化的巨噬细胞(用100ng/mlLPS和20ng/ml干扰素γ处理)的上清液的细胞因子表达。在所示剂量的重组体鼠凯莫瑞(Chemerin)或地塞米松存在或缺乏的情况下以及蛋白酶抑制剂亮抑酶肽(leupeptin)(15mg/ml)存在或缺乏的情况下孵育细胞。图1C-通过qRT-PCR(IL-10，TGFβ)将巨噬细胞细胞因子mRNA水平定量化和标准化为HPRT。图1D-在LPS/IFNγ-激发前用凯莫瑞(0.1-1pM)±百日咳毒素(PTX；200ng/ml)对PMΦ进行预处理。图1E-用凯莫瑞(1pM)对PMΦ预处理1小时±PTX，随后用LPS/IFNγ刺激4小时、8小时或15小时。相对于LPS/IFNγ处理的样品，***，p＜0.001；**，p＜0.01；*，p＜0.05。相对于凯莫瑞处理的样品，###，p＜0.001；##，p＜0.01；#，p＜0.05。图1F-用凯莫瑞(1pM)、凯莫瑞(1pM)+蛋白酶抑制剂(亮抑酶肽[Leu]、E-64、Pefabloc[Pef]、胃酶抑素A[Pep A]、钙蛋白酶抑制剂(Calpeptin)[Cal]、组织蛋白酶S抑制剂[Cath S]、组织蛋白酶L抑制剂[Cath L])对腹膜巨噬细胞(PMΦ)预处理1h，随后用LPS(100ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)刺激15小时。图表示出了来自3-8次独立实验的平均值±SEM。nd：低于该试验的检测限，ns，不显著；

图2A-示出了人类(上方序列)和小鼠(下方序列)凯莫瑞(Tig2)的氨基酸序列比对。利用PeptideCutter(http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/)对人类(蛋白质数据库登录号为NP_002880)和鼠(NP_082128)凯莫瑞的氨基酸序列进行比对和分析以产生预测的胰蛋白酶裂解位点(黑色垂直线)。粗体和灰色的全长序列为前体凯莫瑞的前体(PreProChemerin的序列)(人类序列为Seq ID No：33，小鼠序列为Seq ID No：36)。灰色N末端氨基酸被去除的序列为前体凯莫瑞(ProChemerin)序列(人类序列为Seq ID No：32，小鼠序列为Seq ID No：35)。灰色N末端和C-末端氨基酸被去除的粗体序列为凯莫瑞的序列(人类序列为SeqID No：31，小鼠序列为Seq ID No：34)。

还给出了C-末端肽C11m(Seq ID No：1)、C13m(Seq ID No：2)、C15m(Seq ID No：3)和C 17m(Seq ID No：4)的序列；

图2B-示出了抑制通过活化巨噬细胞产生的前-炎性介质的衍生自凯莫瑞的C-末端部分的肽。在该幅图中，标号肽C13、C15和C17分别指的是前文中描述为C13m、C15m和C17m的肽；

图3-示出了与Chemerin140相比显示出很少的巨噬细胞趋化性能的凯莫瑞肽。在该幅图中，标号肽C11、C13、C15和C17分别指的是前文中描述为C11m、C13m、C15m和C17m的肽；

图4A至图4H-示出了由凯莫瑞(Chemerin)、凯莫瑞肽和凯莫瑞处理的上清介导的趋化性。使经过或未经过百日咳毒素预处理(PTX；200ng/ml)30分钟的PMΦ(0.4×10⁶)朝向改良的Boyden室的底部孔中的化学引诱物迁移超过4小时(图4A；rmChemerin，图4B；C15，图4C；C11，图4D；C13，图4E；C19，图4F；C6，图4G；C8)。图4H-使PMΦ(7.5×10⁵)朝向改良的Boyden室的底部孔中的来自未处理的巨噬细胞和用LPS/IFNγ±凯莫瑞或C15处理的巨噬细胞的条件培养基迁移超过4小时。图表示出了每个处理组的平均迁移指数±SEM(n＝4次独立的实验)。相对于PMΦ+PTX，***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P＜0.05(学生氏t检验)。该图中的参考符号肽C11、C13、C15和C19分别是指前文中描述为C11m、C13m、C15m和C19m的肽；

图5-示出了巨噬细胞显示出朝向来自凯莫瑞-处理的巨噬细胞的条件培养基的趋化性降低。在该图中，参考符号肽C15和C17分别是指前文中描述为C15m和C17m的肽；

图6-示出了Chemerin15-小鼠抑制酵母聚糖-诱导的腹膜炎。该图中的参考符号肽C15是指前文中描述为C15m的肽。Z是指酵母聚糖；

图7A至图7G-示出了chemerin15改善了小鼠中酵母聚糖-诱导的腹膜炎。图7A和图7B-C57B 16/J小鼠被i.p.给药PBS或chemerin15(0.32ng/kg)，1小时后再注射PBS或酵母聚糖(10μg，每个腔～2×10⁶个颗粒)。在多个时间点(图7A和图7B；5-6只小鼠/处理)或4小时后(图7C-图7E；6-15只小鼠/组)通过腹膜灌洗收集腹膜渗出物细胞。图7C至图7E-将灌洗液中的总细胞数定量化，并利用FACS分析确定细胞组成(中性白细胞与单核吞噬细胞)。细胞用2.4G2抗-FcγRII/III阻断，并用Ly-6G-PE和7/4-FITC染色。在两个群周围构建门(gate)，这两个群是中性白细胞(N；7/4高，Ly-6G高)和炎性单核细胞(Mo；7/4高，Ly-6G低)。图7E-示出了每个处理组在酵母聚糖后4小时的典型FACS图。图7F-通过ELISA分析腹膜灌洗液的TNFα和KC，并通过Luminex试验分析IL-6、IL-1β和MCP-1。C15；Chemerin15，Z；酵母聚糖。对于酵母聚糖-处理的动物，***，P＜0.001；**，P＜0.01**(学生氏t检验)。图7G-提前1小时(C 15预处理)或2小时后(C15后处理)对小鼠(6-8/处理)i.p.给予酵母聚糖(10μg)和C15(8Pg)或PBS。腹膜灌洗在酵母聚糖激发后4h进行。该图中的参考符号肽C15是指前文中描述为C15m的肽；

图8A-图8D-示出了抗-凯莫瑞抗体中和凯莫瑞物质并使腹膜炎恶化。图8A-PMΦ用于巨噬细胞趋化性试验(详见图7中来进行)，并使得其存在或不存在抗-rmChemerin抗体或对照IgG的情况下朝向RANTES、凯莫瑞或C15迁移。图表示出了对于每个处理组的平均迁移指数±SEM(n＝4次独立的实验)。相对于化学引诱物，***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P＜0.05。图8B-在存在或不存在抗-rmChemerin抗体或对照IgG的情况下，PMΦ用1pM C15或1pM凯莫瑞预处理达1小时，随后用LPS(100ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)刺激15小时。16小时后通过ELISA(n＝4个独立的实验)测定巨噬细胞上清液中的RANTES的平均表达±SEM。相对于LPS/IFNγ-处理的样品，**，P＜0.01；*，P＜0.05。图8C和图8D-C57B16/J小鼠i.p.给予PBS、抗-rmChemerin抗体(100ng/小鼠)或对照IgG(100ng/小鼠)，1小时后注射PBS或酵母聚糖(10μg/腔)。在酵母聚糖注射后4小时和24小时通过腹膜灌洗收集腹膜渗出物细胞，并如图7中所示进行处理。Z；酵母聚糖，ChAB；抗-rmChemerin抗体。相对于酵母聚糖-激发的小鼠**，P＜0.01。该图中的参考符号肽C15是指前文中描述为C15m的肽；

图9-示出了仅注射0.32ng/kg C15m不会诱导中性白细胞或巨噬细胞募集，但是会降低腹膜TNFα水平。该图中的参考符号肽C15是指前文中描述为C15m的肽；

图10-示出了修饰的Chemerin13-人类肽抑制鼠巨噬细胞中RANTES和TNFα转录物表达。该图中的参考符号肽hC13是指修饰的C13h肽；

图11-示出了C17m不影响C140-诱导的巨噬细胞趋化性。该图中的参考符号肽C17是指前文中描述为C17m的肽；

图12-示出了Chemerin15-小鼠和Chemerin17-小鼠抑制由酵母聚糖刺激的鼠巨噬细胞的TNFα分泌。该图中的参考符号肽C15和C17分别是指前文中描述为C15m和C17m的肽。Dexa是指地塞米松；

图13-为棋盘分析，示出了Chemerin140和Chemerin15-小鼠诱导真正的巨噬细胞趋化性而不是化学运动性。该图中的参考符号肽C15是指前文中描述为C15m的肽；

图14A-图14B-示出了chemerin15在酵母聚糖腹膜炎中抑制单核细胞和中性白细胞募集超过C15和酵母聚糖剂量的范围。图14A-C57B16/J小鼠(5-6只动物/处理)被i.p给予PBS或C 15(0.32ng/kg)，1小时后注射PBS或酵母聚糖剂量范围(10μg-1mg；A)。图14B-小鼠(5-6只动物/处理)i.p给予PBS或C 15剂量范围(4-40pg/小鼠)，1h后注射PBS或酵母聚糖(10μg；2×10⁶个颗粒/腔)。酵母聚糖激发后4小时通过腹膜灌洗收集腹膜渗出物细胞。如图7中所描述的，将灌洗液中的总细胞数定量化，并利用FACS分析确定细胞组成(中性白细胞与单核吞噬细胞)。C15；Chemerin15，Z；酵母聚糖。相对于酵母聚糖处理的动物，***，P＜0.001；**，P＜0.01**；P＜0.05*(学生氏t检验)。该图中的参考符号肽C15或chemerin15是指前文中描述为C15m的肽；以及

图15-示出了由巨噬细胞的酵母聚糖识别的荧光测定，其被表达为相对识别指数。实验在各种浓度的存在或缺乏C15的情况下进行。数据代表四次集合的、标准化的实验的平均数(±s.e.m.)。

具体实施方式

本文中的参考符号Chemerin140或C140是指序列ID No：34的140个氨基酸的小鼠凯莫瑞(Chemerin)蛋白(Chemerin-140-小鼠)。

实施例

Chemerin140对被蛋白酶抑制剂消除(abrogated)的活化巨噬细胞施加抗炎作用

先前的研究已经表明由多形核细胞(PMN)在脱粒后释放的丝氨酸蛋白酶裂解前体凯莫瑞(ProChemerin)的C-末端并释放其趋化潜能(Wittamer V et al.J Immunol.2005年7月1日；175(1)：487-493)。然而，通过凯莫瑞的进一步蛋白水解处理所产生的肽的抗炎作用是具备新颖性和创造性的。

在多种条件下培养鼠腹膜巨噬细胞(PMθ，本文中也称为PMΦ)：未处理；LPS(100ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)，15小时；凯莫瑞(1pM)预处理1小时，随后LPS/IFNγ，15小时；亮抑酶肽(蛋白酶抑制剂；15mg/ml)和凯莫瑞(1pM)，1小时，随后LPS/IFNγ，15小时；或地塞米松(阳性对照；1μM，预处理1小时，随后LPS/IFNγ，15小时。

分析来自凯莫瑞+脂多糖/干扰素-γ(LPS/IFNγ)-处理的巨噬细胞的上清液的趋化因子含量，结果表明，与LPS/IFNγ-处理的样品相比，凯莫瑞处理的细胞表现出显著低水平的TNFα(70％)、IL-12p40(54％)、RANTES(CCL5；40％)、IL-6(42％)和IL-1β(60％)(n＝5；p＜0.001，图1A和图1B)。这种抗炎作用受到广谱蛋白酶抑制剂(亮抑酶肽)的抑制(其在被加入到巨噬细胞时防止任何抗炎作用)，表明在这些抗炎肽的产生中另外的凯莫瑞裂解的重要性(图1A和图1F)。

通过利用抗-凯莫瑞中和抗体，进一步表明的是这些作用是凯莫瑞特异性的；所述抗体去除了凯莫瑞的抗炎作用(图8B)。

图1A中的柱状图示出了如通过Luminex试验±SEM确定的细胞因子的平均表达。对于每个处理，实验用一式三份的测定进行。示出了采用来自C57B 16/J小鼠的不同组的细胞的三次独立实验的代表性数据。除非另外陈述，相对于LPS/IFNγ-处理的样品，p＜0.001***；p＜0.01**。Dexa是指地塞米松(1mM)。

图1B示出了与上文中关于图1A中讨论的类似的结果，还有另外的数据表明0.1pM、0.5pM和1.0pM的不同浓度的凯莫瑞的作用。

此外，图1C表明凯莫瑞诱导用于抗炎细胞因子TGFβ(54％)和IL-10(89％)的mRNA的表达。

凯莫瑞的作用是剂量依赖性的，在1pM观察到最大应答(图1B和图1C)，并且对百日咳毒素敏感，表明这与Gai-偶联的GPCR有关(图1D)。

此外，在给予LPS/IFNγ后4h、8h和15h观察到抗炎作用，而在所有的时间点抗炎作用均被PTX消除(图1E)。

先前的研究已经表明，粒细胞在脱粒后释放的丝氨酸蛋白酶裂解前体凯莫瑞(prochemerin)的C-末端并释放其趋化潜能(Wittamer，V.，et al，(2005)，J Immunol 175：487-493)。研究了鼠凯莫瑞可经历由鼠MΦ活化后释放的酶进行的进一步蛋白水解处理的可能性。如上文中关于图1A所讨论的，凯莫瑞与亮抑酶肽(一种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂)的同时给药消除了其抗炎效果(图1A和图1F)。E-64(一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂)也表现出这种效果，同时酸性蛋白酶抑制剂胃酶抑素A(Pepstatin A)和丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc对于MΦ活化的凯莫瑞-介导的抑制不起作用(图1F)。这些数据表明凯莫瑞以半胱氨酸蛋白酶依赖的方式对MΦ活化起到抑制作用。组织蛋白酶L抑制剂(Z-FF-FMK)、组织蛋白酶S抑制剂(Z-FL-COCHO)和钙蛋白酶I和II抑制剂、钙蛋白酶抑制剂(calpeptin)被用于进一步探测凯莫瑞裂解中涉及的特异性半胱氨酸蛋白酶(图1F)。发现凯莫瑞的抗炎作用依赖于钙蛋白酶和组织蛋白酶S却独立于组织蛋白酶L。总之，结果首次表明经典地活化的鼠MΦ能够通过母体分子的特异性半胱氨酸蛋白酶-介导的裂解将凯莫瑞转化为MΦ活化的有效的肽抑制剂，最可能包括钙蛋白酶II和组织蛋白酶S。

具有抗炎活性的C-末端凯莫瑞肽

利用Ensembl中的序列比对功能设计一系列11-20aa肽作为重要的保守残基的指示物(指征，indicator)并命名为C11m(P144-A154；PHGYFLPGQFA Seq ID No：1)、C13m(P144-S156；PHGYFLPGQFAFS Seq ID No：3)、C15m(A140-A154；AGEDPHGYFLPGQFA Seq ID No：4)和C17m(A140-S156；AGEDPHGYFLPGQFAFS Seq ID No：6)、C19(A138-S156；AQAGEDPHGYFLPGQFAFS Seq ID No：37)、N19(E23-K41；ELSETQRRSLQVALEEFHK Seq ID No：44)和M20(K86-K105；KPECTIKPNGRRRKCLACIK Seq ID No：45)。图2A示出了对于这些肽中的一些的序列比对。凯莫瑞肽(1pM-100nM)在根据所述的试验方案的巨噬细胞活化试验中被表征。

鼠PMθ在多种条件下被培养：未处理的、LPS(100ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)，15小时；凯莫瑞肽(浓度为1pM-100nM)预处理1h，随后LPS/IFNγ，15小时。显示的浓度代表在两个实验中对于每一种肽的最佳有效剂量。图2B中的柱状图表示RANTES的平均表达和TNFα蛋白±SEM。对于每个处理，实验用一式三份的测定进行。示出了采用来自C57B16/J小鼠的不同组的细胞的五次独立实验的代表性数据。相对于LPS/IFNγ处理的样品。p＜0.01**；p＜0.001***。

C-末端肽C13m(100pM)、C15m(1pM)和C17m(1pM)抑制LPS/IFNγ-诱导的RANTES分泌(C13m-32％；C15m-41％；C17m-49％)和TNFα表达(C13m-10％；C15m-56％；C17m-66％，图2B)。C15m和C17m抑制巨噬细胞活化达到类似于在使用相同浓度的C130时的程度。

表1中示出了类似的结果，其中C-末端肽C 13和C 19中度抑制LPS/IFNγ-诱导的RANTES和TNFα表达，最佳剂量为100pM(表1)。然而，Chemerin15(C15)以与凯莫瑞具有类似的效能和潜能(最佳剂量1pM)保持了由蛋白水解的凯莫瑞示出的抗炎活性并抑制细胞因子表达。此外，C11、N-末端肽(N19)、中流肽(中段肽，midstream peptide)(M20)和对照肽(乱序的C15；C15-S，GLFHDQAGPPAGYEF；Seq ID No：39，和突变型C15；C15-M，AGEDPHGYALPGQAA；Seq ID No：40)在MΦ活化试验中缺乏抗炎活性。还发现在通过凝固和纤维蛋白溶解级联的蛋白酶的前体凯莫瑞(prochemerin)裂解期间去除的6aa(RALRTK；Seq ID No：41)和8aa(FSRALRTK；Seq ID No：42)肽，分别称为C6和C8在MΦ活化试验中未检出抗炎活性。

表1

参照表1，如图1B所述培养凯莫瑞-来源的肽的抗炎活性-鼠PMΦ，并用LPS(100ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)激发(challenge)15h，使用/不用肽(0.1pM-100nM)预处理1h。当肽表现出抗炎特性时，LPS/1FNγ-诱导的巨噬细胞活化的百分比抑制代表用最佳剂量的效果(1pM凯莫瑞和C 15或100pM C13和C19)。肽序列为：C11(P144-A154；PHGYFLPGQFA)、C13(P144-S156；PHGYFLPGQFAFS)、C15(A140-A154；AGEDPHGYFLPGQFA)、C19(A138-S156；AQAGEDPHGYFLPGQFAFS；Seq ID：No.37)、N19(E23-K41；ELSETQRRSLQVALEEFHK Seq ID No：44)和M20(K86-K105；KPECTIKPNGRRRKCLACIK Seq ID No.45)。对照肽：乱序的C15(C15-S；GLFHDQAGPPAGYEF)和突变型C15(C15-M；AGEDPHGYALPGQAA；F148A&F153A)。数据代表通过ELISA和Luminex试验测定的4-8次独立的实验的由经典地活化的巨噬细胞产生的细胞因子的平均百分比抑制。

Chemerin140，而不是其C-末端衍生的抗炎肽，是有效的巨噬细胞化学引诱物

改良的博伊登室(Boyden-chamber)试验用于展示C140的巨噬细胞化学引诱物特性。观察到小鼠Chemerin140在10nM时具有最佳趋化性的典型钟形曲线，其后下降，推测接着会发生受体脱敏或化学引诱物梯度的破坏(breakdown)(图3)。这也在图4A中示出，还有其他的数据表明百日咳毒素预处理(PTX：200ng/ml)的作用。

PMθ(0.5×10⁶)朝向改良的博伊登室底部的孔中的化学引诱物(Chemerin140或凯莫瑞肽)迁移超过4h。将过滤器固定在4％甲醛中，随后用DAPI对迁移的细胞核实施染色并使其可视化。无血清培养基(SFM)用作阴性对照，巨噬细胞化学引诱物RANTES(25ng/ml；3nM)用作阳性对照。图表示出了对于每个处理组(n＝5-6)的平均迁移指数(化学引诱物％阈值区/SFM％阈值区)±SEM。对于SFM处理的孔，p＜0.001***；p＜0.01**；p＜0.05*。

与C140(1pM-50nM)或阳性对照CC趋化因子RANTES(25ng/ml；3nM)相比，观察到C11m、C13m和C15m(1pM-100nM)具有很小的趋化活性。在100pM C15m以及10nM C13m和C11m处观察到最大的巨噬细胞迁移。然而，C17m在所有的测试浓度都没有表现出趋化活性(0.1pM-500nM；n＝5独立的实验；(图3)。结果还在图4B-图4D中示出，还有其他的数据示出了百日咳毒素预处理(PTX：200ng/ml)的作用。参照图4E，C 19在所有的测试浓度也都没有表现出趋化活性(0.1pM-500nM；图4E)。因此，已经确定衍生自凯莫瑞的肽保留了抗炎活性但却不表现出对MΦ的趋化活性，这表明存在能够被治疗性开发的凯莫瑞的不同的功能-特异性成分。人们发现衍生自前体凯莫瑞(prochemerin)的肽，C6和C8，缺乏MΦ抗炎活性，在所有的测试浓度也均不能诱导MΦ迁移(0.1pM-500nM；图4F-G)。因此，数据似乎表明主要的趋化物质是裂解的凯莫瑞分子本身，或还没有鉴别出的肽。

表明凯莫瑞和chemerin15诱导由巨噬细胞的化学引诱物产生的普遍抑制的其他实施例

考虑到MΦ-来源的化学引诱物在炎症期间的免疫细胞募集中的既定作用(Glabinski，A.R.，et at.，(1998).Neuroimmunomodulation5：166-171；Huang，D.J.et al.，(2001).J.Exp.Med.193：713-726)，条件培养基使用来自趋化性试验中的未处理的MΦ和由凯莫瑞+LPS/IFNγ、C15+LPS/IFNγ处理和仅由LPS/IFNγ处理的MΦ，以评估通过凯莫瑞和合成的C-末端肽对MΦ活性的抑制程度，C15会进一步影响MΦ募集(参见图4H)。未处理的MΦ-条件培养基本身并不表现出对于MΦ的趋化活性(迁移指数1.0±0.15)；然而，LPS/IFNγ-处理的巨噬细胞培养基诱导MΦ趋化性的显著提高(迁移指数9.3±0.4；图4H)。此外，MΦ表现出从凯莫瑞+LPS/IFNγ和C15+LPS/IFNγ-处理的巨噬细胞朝向条件培养基的趋化性分别降低49％和55％(图4H)。这表明凯莫瑞和C 15诱导MΦ-来源的MΦ化学引诱物的大范围的普遍抑制以达到影响条件培养基的趋化活性的程度。

进一步的第二趋化性试验显示出受到抑制的朝向来自Chemerin140-小鼠、Chemerin15-小鼠和Chemerin17-小鼠-处理的巨噬细胞的上清的巨噬细胞趋化性。这些结果表明用C 15m和C17m预处理活化的巨噬细胞使得由巨噬细胞释放的化学引诱物的量和/或生物活性降低，因此这些肽可以显著地减少向炎症部位的持续的单核细胞/巨噬细胞募集。

在第二趋化性试验中使用来自用C140+LPS/IFNγ、C15m+LPS/IFNγ、C17m+LPS/IFNγ和仅用LPS/IFNγ处理的巨噬细胞的条件培养基以评估与通过C140及其C-末端肽的巨噬细胞活化的抑制相关的潜在的病理生理反应(repercussions)。

使细胞(0.5×10⁶)朝向改良的博伊登室的底部孔中的化学引诱物(凯莫瑞肽)或条件培养基迁移超过4小时。无血清培养基(SFM)用作阴性对照。将过滤器固定在4％甲醛中，随后用DAPI将细胞核染色并使其可视化。柱状图表明对于每个处理组的平均迁移指数(化学引诱物％阈值区/SFM％阈值区)±SEM。每个柱代表至少三个孔，每个处理取6幅图。除非另外指明，p＜0.001***；p＜0.01**显著性是相对于LPS/IFNγ条件培养基。AB是指抗-鼠凯莫瑞抗体。

从图5中表示的结果可以看出，巨噬细胞-条件培养基本身并不表现出对于巨噬细胞的趋化活性，然而，LPS/IFNγ-处理的巨噬细胞培养基诱导巨噬细胞趋化性的显著提高。此外，巨噬细胞表现出朝向来自C 140+LPS/IFNγ、C 15m+LPS/IFNγ和C 17m+LPS/IFNγ-处理的巨噬细胞的条件培养基的趋化性降低，表明C140、C15m和C17m诱导巨噬细胞化学引诱物的大范围普遍抑制的能力。

为了排除凯莫瑞-处理的上清液包含凯莫瑞-衍生的趋化蛋白/肽的可能性，在评估巨噬的细胞迁移之前将上清液与中和凯莫瑞抗体一起孵育。凯莫瑞没有表现有助于在凯莫瑞-处理的上清液中的迁移。

Chemerin15-小鼠抑制酵母聚糖-诱导的腹膜炎

腹膜炎可以通过引起急性炎性反应的酵母聚糖颗粒(酵母细胞壁成分)的腹膜内注射而被诱导。酵母聚糖-诱导的腹膜炎遵循小鼠腹膜腔中中性白细胞然后是单核细胞的已知的时间依赖性聚集(综述参见Lawrence T et al.Nat Rev Immunol.2002年10月；2(10)：787-795)。这个模型已经被用于证明确定的介质(mediator)脂氧素A4(Lipoxin A4)和膜联蛋白-1的前-溶解(pro-resolving)特性，该特性通常伴随着较早的组织结构和功能的恢复以及中性白细胞和单核细胞的渗出的抑制而缩短炎症的时程。文献中报道的先前的实验使用了一定剂量范围的酵母聚糖A颗粒(10μg-1mg)(Taylor PR et al.Eur J Immunol.2005年7月；35(7)：2163-2174；AritaM et al.J.Biol.Chem.2006年8月11日；281(32)：22847-22854)。

考虑到凯莫瑞的高趋化潜能和对于蛋白水解的固有需求，使用C-末端合成肽chemerin15对无菌腹膜炎模型中的抗炎作用进行体内表征，这是因为C15在很大程度上缺乏趋化活性(图3和图4B)，而且还起到相当于蛋白水解的凯莫瑞的抗炎作用(表1)。

参照图6中示出的结果，这一研究使用10μg/小鼠(每个定居巨噬细胞1-2个颗粒)，因为这被认为更接近地代表病理生理剂量。

更具体地，雄性C57B 16/J小鼠(8-12周)被腹膜内注射0.5mlPBS或0.5ml Chemerin15-小鼠(0.32ng/kg)，接着在1小时后注射0.5ml PBS或酵母聚糖(2×10⁶个颗粒/腔)。4小时后，将动物处死，用5ml PBS-3mM EDTA冲洗腹膜腔。利用台盼蓝排除测试获得总细胞计数。为了测定细胞组成(中性白细胞与单核吞噬细胞)，用2.4G2抗-FcgRII/III mAB对细胞阻断(block)5分钟并用PE-共轭的抗-小鼠Ly-6G和FITC-共轭的抗-小鼠7/4mAB染色10分钟。在用CellQuest软件进行FACS分析前将细胞固定在1％甲醛中。在两个群的周围构建门(gate)，这两个群为中性白细胞(N；7/4^高，Ly-6G^高)和炎性单核细胞(Mo；7/4^高)。C15是指Chemerin15-小鼠。相对于酵母聚糖-处理，Z是指酵母聚糖，p＜0.01**；p＜0.05*。

中性白细胞(7/4^高，Ly-6G^高)、单核细胞(7/4^高，Ly-6G^低)和定居巨噬细胞群(7/4^低，Ly-6G^低)根据Gordon S and Taylor PR NatRev Immunol.2005；5(12)：953；Taylor PR et al.Eur J Immunol.2003年8月；33(8)：2090-2097；和Taylor PR et al.Eur J Immunol.2005年7月；35(7)：2163-2174来确定。

这一研究结果表明用0.32ng/kg(8pg/小鼠)剂量的C15m处理的小鼠表现出酵母聚糖-引发的单核细胞和中性白细胞募集分别降低42％和52％(图6)。在用C15m处理的小鼠中TNFα的水平也降低。

上述结果被进一步研究。为了确定C15肽在体内的抗炎特性，持续超过48小时进行时程实验。通过FACS分析根据公开的试验方案(Taylor，P.R.et al.，(2005)Eur J Immunol 35：2163-2174；Taylor，P.R.，(2003).Eur J Immunol 33：2090-2097)来确定腹膜灌洗液中的中性白细胞(7/4^高，Ly-6G^高)和单核细胞(7/4^高，Ly-6G^低)群。酵母聚糖给予到小鼠腹膜腔内产生炎性细胞外渗入腹膜腔中的时间依赖，其遵循急性炎性应答的典型特征(图7A-图B，实线)。中性白细胞是渗透至腔内的第一白细胞，可在给予酵母聚糖后2小时检测到，白细胞在4小时达到峰值(1.95×10⁶个细胞)。单核细胞流入发炎的腹膜腔在4小时后可首次检测到(0.69×10⁶个细胞)，在注射酵母聚糖后24小时达到峰值(1.25×10⁶个细胞)，其后下降。在酵母聚糖激发前1小时用8pg/小鼠(≈0.32ng/kg)剂量的C15预处理，使得中性白细胞提前到2小时达到峰值，约为酵母聚糖激发的小鼠的峰值大小的50％(从1.25×10⁶降到0.62×10⁶个细胞；图7A，点线)。可在2小时(50％)、4小时(66％)和4小时(50％)观察到C15对中性白细胞浸润的显著抑制。8pg的单一剂量的C15肽在减少所有时间点的发炎的腔中的腹膜单核细胞的数量方面也是有效的，在4小时(63％)、8小时(61％)、和48小时(64％；图7B，点线)可观察到超过60％的抑制。单核细胞浸润比率在酵母聚糖注射后2-4小时最高(0.51×10⁶/h)，C 15的给予降低了流入发炎的腔中的比率(0.18×10⁶/h)。因此，酵母聚糖-激发前的单一剂量的C15肽提供了针对酵母聚糖-诱导的腹膜炎症的显著保护，超过实验的48小时的持续时间。

时程实验鉴定酵母聚糖后4小时时间点为C15的抗炎活性生效的合适的时间点。在该研究中，单一剂量的C15产生酵母聚糖-引发的中性白细胞和单核细胞募集的剂量依赖性的下降，该募集在8pg/小鼠C15(≈0.32ng/kg；图7C-图7E和图16A-图16B)时最大。当C15在酵母聚糖-激发前1小时被给予时，中性白细胞数量从1.9×10⁶减少到0.78×10⁶(减少63％；图7C)，单核细胞水平从0.69×10⁶减少到0.30×10⁶(减少62％；图7D，图7E中示出了代表性的在4小时时间点的FACS图)。给予C15还显著地减少了在4h时腹膜灌洗液中前-炎性细胞因子的表达，包括TNFα(51％)、L-1β(67％)、IL-6(67％)、MCP-1(59％)、和KC(38％；图7F)。还发现在以与C15的相同剂量和时间体内给予时，缺乏体外抗炎活性的对照肽C15-S和C15-M(表1)不是保护性的，这是通过单核细胞和中性白细胞水平来判断的(图7C-图7D)。当在酵母聚糖注射后2小时给予相同剂量的C15时，给予酵母聚糖后4小时仍然可观察到单核细胞(0.69×10⁶到0.42×10⁶个细胞；减少42％)和中性白细胞募集(1.9×10⁶到0.83×10⁶个细胞；减少60％)的显著抑制(图7G)。这表明C15能够在已经建立的炎性情况(setting)下减少中性白细胞和单核细胞募集，并提供了C15/C15-衍生物可以代表靶向炎性病状的引人注目的药效团的另一指征。

内源性凯莫瑞物质的阻断使腹膜炎症恶化

通过在酵母聚糖激发前4小时或24小时对小鼠i.p注射中和单克隆抗-rmChemerin抗体(ChAb)或对照IgG 1h来研究凯莫瑞和凯莫瑞-衍生的肽的潜在内在作用。先前发现ChAb能够体外抑制C15和凯莫瑞-诱导的MΦ趋化性和抗炎作用，而对照IgG不具备该作用(图8A-图8B)。在体内，发现相对于对照IgG-处理的小鼠，内源性凯莫瑞物质的中和导致在4小时时间点腹膜中性白细胞的数量增加63％而单核细胞水平提高45％，以及在酵母聚糖注射后24小时腹膜中性白细胞和单核细胞的水平提高170％和86％(图8C-图8D)。在24小时内腹膜炎症的加重表明凯莫瑞物质在体内重要的内源性抗炎作用。

仅使用Chemerin15-小鼠不诱导中性白细胞或巨噬细胞募集但是降低TNFα水平

雄性C57B 16/J小鼠(8-12周)经腹膜内注射0.5ml PBS或0.5ml Chemerin15-小鼠|(0.32ng/kg)。4小时后，将每个处理组的三只动物处死，用5ml PBS-3mM EDTA冲洗腹膜腔。利用台盼蓝排除试验获得总细胞计数。为了确定细胞组成(中性白细胞与单核吞噬细胞)，用2.4G2抗-FcgRII/III mAB将细胞阻断(block)5分钟并用PE-共轭的抗-小鼠Ly-6G和FITC-共轭的抗-小鼠7/4mAB染色10分钟。在用CellQuest软件进行FACS分析前将细胞固定在1％甲醛中。在两个群周围构建门(gate)，这两个群为中性白细胞(N；7/4^高，Ly-6G^高)和炎性单核细胞(Mo；7/4^高，Ly-6G^低)。C15是指Chemerin15-小鼠。相对于PBS-处理，p＜0.01**。Ns是指没有统计学上的显著差异p＞0.05。

从图9中的结果可以看出，0.32ng/kg的C15m不会造成单核细胞或中性白细胞迁移。然而，观察到TNFα的显著减少。

研究小鼠无菌腹膜炎的这个模型广泛用于实验医学和药理学，代表由中度组织创伤或感染造成的轻微炎症。所述结果显示C15m能过实现治疗性抗炎作用。

修饰的Chemerin13-人类抑制鼠巨噬细胞中Rantes和TNFα转录物的表达

在各种条件下培养鼠腹膜巨噬细胞(PMθ)：未处理的、LPS(100ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)，15小时，修饰的Chemerin13-人类(1nM)预处理1小时，随后LPS/IFNγ15小时。柱状图显示由qRT-PCR确定的并被标准化为管家基因(看家基因，housekeeper)，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的细胞因子转录物的平均表达。对于每个处理，实验以一式三份的测定进行，n＝1独立的实验。对于LPS/IFNγ-t处理的样品，除非另外指出，p＜0.01**；p ＜0.05*。修饰的C13h肽的序列为NH₂-FHSFYFPGQFAFS-COOH(Seq ID No：43)-在这个序列中，C13h中的N末端P被氨基酸F取代，该肽因此被称为修饰的C13h。

从图10中的结果可以看出，修饰的C13h使TNFα和RANTES的表达显著减少。

Chemerin 17-小鼠不影响C140诱导的巨噬细胞趋化性

在用BioGEL珠刺激腹膜4天后，募集PMθ。用5ml PBS-2mMEDTA灌洗雄性C57B16/J小鼠的腹膜腔。细胞经离心并重悬浮在补充有0.5％BSA和25mM Hepes的RPMI中。使细胞(0.5×10⁶)朝向底部孔中的化学引诱物(C140、C17m或C17m+C140)迁移超过4小时。将过滤器固定在4％甲醛中，随后用DAPI对细胞核进行染色并使其可视化。无血清培养基用作阴性对照(-/-)。细胞在趋化性试验前与百日咳毒素(PTX)一起预孵育30分钟。图11中的柱状图示出了每个处理组的平均迁移指数±SEM。每个柱代表至少三个孔并且每个处理至少取3幅图。除非另外指出，对于SFM处理的孔，p＜0.001***；p＜0.01**；p＜0.05*。

图11中的结果表明C17m与C140的共同给予不显示影响巨噬细胞向C140迁移。

Chemerin15-小鼠和Chemerin17-小鼠抑制通过用酵母聚糖刺激鼠巨噬细胞的TNFα分泌

在多种条件下培养PMθ：未处理的；酵母聚糖15h；凯莫瑞(1pM)预处理1小时+酵母聚糖15小时。柱状图显示通过ELISA±SEM测定的TNFα的平均表达。对于每个处理，实验用一式三份的测定进行。图12中示出了采用来自不同供体细胞的三次独立实验的代表性数据。对于酵母聚糖-处理的样品，p＜0.001***；p＜0.01**。Dexa是指地塞米松(1mM)，nd是指低于检测下限(0.25ng/ml)。

可以看出，用C15m(1pM)和C17m(1pM)处理可抑制酵母聚糖-诱导的TNF表达(C15m；21％，C17m；30％)。因此，C15m和C17m抑制由细菌(LPS)和酵母(酵母聚糖A)诱导的巨噬细胞活化。

棋盘(Checkerboard)分析表明Chemerin140和Chemerin15-小鼠诱导巨噬细胞趋化性而非化学运动性

棋盘分析允许区分趋化性和化学运动性。趋化性是通过在较低的孔中向较高浓度的化学引诱物迁移而示出的。化学运动性是指无方向性细胞运动增加，并且其发生与存在的浓度梯度无关。棋盘分析是这样进行的：将细胞与C140(10-500pM)或C15m(10-1000pM)一起预孵育，并使它们在较低的孔中分别朝向C140(10-1000pM)或C15m(10-1000pM)迁移以形成浓度的棋盘。

更具体地，在用BioGEL珠刺激腹膜4天后募集PMθ。用5mlPBS-2mM EDTA灌洗雄性C57B16/J小鼠的腹膜腔。细胞经离心并重悬浮在补充有C57B16/J的RPMI中。在趋化性试验前将细胞(0.5×10⁶)与C140或C15m一起孵育30分钟，随后使其在底部孔中朝向化学引诱物迁移超过4小时。将过滤器固定在4％甲醛中，随后用DAPI对细胞核进行染色并使其可视化。无血清培养基(SFM)用作阴性对照(-/-)，CC趋化因子RANTES用作阳性对照(25ng/ml)。图13中的柱状图示出了对于每个处理组的平均迁移指数±SEM。每个柱代表至少三个孔并且每个处理至少取3幅图。相对于SFM-处理的孔，p＜0.001***。

已经发现C140和C15m在迁移入博伊登室的下部孔时引发真正的趋化性而不是化学活动性，这种迁移仅在其中具有较高浓度的化学引诱物时发生，而在过滤器的上侧具有较高浓度的化学引诱物时则不发生。

C15m被显示为比C140弱得多的巨噬细胞趋化性的引诱物。

C15诱导酵母聚糖的巨噬细胞吞噬作用

为了通过巨噬细胞在体外识别酵母聚糖，通过用PBS中的冰冷2mM EDTA灌洗从在用Biogel珠(2％w/v)处理前4天已经腹膜内处理的小鼠分离出腹膜渗出物细胞。以2.5×10⁵个细胞/孔的密度将巨噬细胞平铺在Optimen培养基中的24孔板中。在0.1pM、1pM、10pM、100pM或1nM Chemerin15的存在下，在识别试验中，细胞在加入添加有异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的酵母聚糖(Invitrogen)之前用培养基冲洗细胞三次，巨噬细胞/颗粒比率为10∶1。载体＝没有Chemerin15的对照样品。FITC-酵母聚糖摄取之后进行FACS分析，FITC-酵母聚糖摄取被表达为相对识别指数，即，摄取酵母聚糖的％细胞的比率×C15处理的巨噬细胞的几何平均数/用载体处理的巨噬细胞的几何平均数的比。

图15中示出的结果表明，Chemerin15诱导酵母聚糖的巨噬细胞吞噬。巨噬细胞吞噬作用的诱导在Chemerin15浓度为10pM时最大。这些结果表明凯莫瑞肽可以通过增加巨噬细胞对凋亡细胞(apoptotic cell)、细胞碎片、病原体和病原体产物的吞噬而加速伤口修复。

讨论

多种介质协同急性炎症的初始事件是已知的。例如，脂质-来源的类花生酸(eicosanoids)、细胞因子和趋化因子调节血管变化和炎性细胞募集。前-炎性细胞因子，包括TNFα和IL-1γ活化内皮细胞中的信号传递途径，导致粘附分子表达的上调，促进循环白细胞的捕获。上文指出的结果显示衍生自Chemerin140的C-末端肽能够抑制炎性应答的所有成分。结果还显示衍生自Chemerin140的C-末端肽能够降低趋化因子水平并能够用作用于内毒素休克的治疗剂。

在该研究中使用的所有肽均为凯莫瑞-衍生的，并显示出难以置信的高效能(10^-12M)，这种高效能确保这些介质加入到补体-来源的化学吸引素、C5a des-arg(10^-12M)、甲酰-甲二磺酰基-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP；10^-11M)、白三烯B4(LTB4；10^-11M)、TNFα(10^-11M)、LPS(10^-15M)和IL-1(10^-14M)的行列中。申请人知道还没有药物制剂被证明在10^-11M-10^-15M表现出药理作用。实际上，地塞米松通常以微摩尔范围的浓度体外给予，并且在酵母聚糖-诱导的腹膜炎模型中在30μg/小鼠(1.2mg/kg)处实现单核细胞和中性白细胞流入的50％下调。Chemerin15-小鼠将单核细胞和中性白细胞的募集下调到与30μg地塞米松类似的程度。在该鼠炎症模型中，Chemerin15-小鼠以仅8pg/小鼠(0.32ng/kg)的剂量就能产生相当的抗炎作用。

第二趋化性试验使得来自巨噬细胞活化试验的上清液的趋化潜能被定量化，并确定了凯莫瑞-介导的趋化因子抑制对介质趋化特性的影响。这些结果的分析揭示了与单独的LPS/IFNγ相比，巨噬细胞向来自凯莫瑞+LPS/IFNγ-处理的巨噬细胞的上清液的迁移下降，这表明了巨噬细胞化学引诱物的大范围普遍抑制。给出的实施例表明，与C140相比，凯莫瑞-来源的抗炎肽的化学引诱物特性是有限的或不具备化学引诱物特性。

总之，结果显示凯莫瑞的C-末端肽在体外和体内均表现出非常强的抗炎性能。

材料和方法

动物

所有的动物研究都得到了地方伦理认可并按照英国内政部规则(动物法，科学程序法案(Guidance on the Operation of Animals，Scientific Procedures Act)，1986)进行。

抗体和试剂

抗人凯莫瑞、抗鼠Chemerin AB、hChemerin 137(序列ID no：31，可以作为重组体Glu21-Ser157从RandD获得)、mChemerin 140(SeqID no：34)、抗-mRANTES Capture AB、抗-mRANTES Detection AB、mRANTES、mTNFα、抗-mTNF αCapture AB、抗-mTNFαDetectionAB均购自R&D Systems。凯莫瑞肽(ClIm、C13m、C13h、C15m、C17m)通过生物合成被合成(www.biosyn.com)。地塞米松、脂多糖(大肠杆菌(E.coli))、亮抑酶肽从Sigma Aldrich获得。干扰素γ(IFNγ)购自Peprotech。OPD片从Dakocytomata获得，抗生蛋白链菌素(Streptavidin)-HRP和StrepAv-HRP稀释缓冲剂购自Endogen。Luminex 6-plex试剂盒(IL-12p40，IL-1β，IL-6，MCP-1，TNFα，IL-10)由Bio-rad提供，并利用Bio-rad分析仪和X软件分析。

巨噬细胞活化的抑制-巨噬细胞活化试验

将无菌磷酸盐-缓冲盐水(PBS)中的1ml 2％BioGEL聚丙烯酰胺珠腹膜内注射(ip)入C57B1/6J小鼠。ip BioGEL给予后四天，根据英国内政部准则通过CO₂方法处死小鼠。用10ml无菌PBS-2mM EDTA冲洗腹膜腔以获得BioGEL-引起/引发的细胞渗透物。获得的细胞的悬浮液在4℃在1000xg离心5分钟。弃上清，将细胞沉淀重悬浮在补充有2mM谷氨酰胺、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的6mls OptiMEM培养基中。巨噬细胞在冰上与特克(Turk′s)溶液一起孵育5-10分钟后利用血球细胞计数器定量化。将细胞悬浮液(2mls；1.5×10⁶/孔)平铺在六孔组织培养板(直径为35mm：Costar，UK)中，并使其在37℃在包含5％CO₂的湿润气氛中附着2小时以通过附着来分离巨噬细胞群。通过细胞离心涂片(cytospinning)、用亚甲蓝和曙红对细胞进行染色并基于细胞形态学计数，这得到了大于95％的纯度。未粘附的细胞(主要为粒细胞)被丢弃，孔用无菌PBS冲洗三次以去除松散附着的细胞或死细胞。为了评估巨噬细胞活化的潜在抑制和由此带来的前-炎性介质的表达减少，将巨噬细胞(1.5×10⁶细胞/孔)与凯莫瑞肽(C11m，C13m，C15m，C17m；10^-12-10^-8M)或阳性对照(地塞米松；1μM)一起预孵育1小时，随后用LPS(100ng/ml)和IFNγ(20ng/ml)激发15小时。为了确定其对PTX的敏感性和对蛋白水解的依赖性，将细胞与PTX(200ng/ml)或亮抑酶肽(15μg/ml)一起预孵育。其他的细胞仅用肽处理。收集上清液，储存在-20℃以用于酶联免疫吸附试验(ELISA)和Luminex实验。将细胞裂解以通过TRIZOL方法提取总RNA。将裂解物储存在-80℃，按照制造商的指导手册(Qiagen，RNeasy Mini Prep Kit)来提取RNA。

通过ELISAs和Luminex检测分泌的蛋白

通过ELISA评估细胞上清液中RANTES、肿瘤坏死因子(TNFα)和CCL9的浓度。通过Luminex流式微珠法(Luminexmultiplex bead assay)(Bio-rad 6多微珠阵列法(Bio-rad 6 plexassay))确定IL-12p40、IL-10、IL-1β、TNFα、MCP-1(单核细胞化学引诱物蛋白-1)和IL-6水平。ELISA的检测下限为0.1-0.5ng/ml，Luminex法的检测下限为10-50pg/ml。

RNA制备和RT-PCR

利用Qiagen RNeasy试剂盒提取总RNA，利用Sybr-Green方法使其被反转录并经受qRT-PCR。利用2-AACT方法分析数据(Livak，KJ.&Schmittgen T.D.(2001)，Methods 25：402-408)。

趋化性试验

通过利用透孔膜(ChemoTX，6-mm直径，8-μm孔径)来评估细胞迁移。简言之，收集BioGEL-引发的细胞并将其置于补充有25mMHepes和0.1％牛血清白蛋白的RPMI中的透孔膜上(250000个细胞/膜)。使细胞朝向凯莫瑞肽(1pM-100nM)迁移4小时。通过在将细胞置于透孔膜上之前30分钟将细胞与百日咳毒素(PTX，200ng/ml，Sigma-Aldrich)一起预孵育30分钟来阻断经由G蛋白偶联受体的信号转导。在膜的下侧迁移的细胞被固定(3％甲醛)并用DAPI染色。迁移被定量为共焦显微镜下DAPI染色的细胞核中的像素数(2幅照片/膜，每个处理至少3个平行的孔)。利用MetamorphOffline软件分析图像以确定被迁移的细胞占据的百分比阈值区域(TA)。通过划分处理TA无血清培养基TA获得迁移指示物(migration indices)。对于第二趋化性试验，以50000个细胞/膜使用ChemoTx 3-mm直径，8-μm孔膜。

鼠腹膜炎

C57BL6/J小鼠在i.p.给予500μl 10μg酵母聚糖A前1小时i.p.给予500μl Chemerin15-小鼠(0.32ng/kg)或仅给予载体(无菌PBS)。4小时后将其人道处死后，通过用5ml无菌PBS-3mM EDTA进行腹腔灌洗来收集腹膜渗出物。获得无细胞灌洗液以用于ELISA，制备渗出物细胞以用于下述分析。

差别白细胞计数和FACS分析

C57BL6/J小鼠在i.p.给予500μl 10μg酵母聚糖A前1小时i.p.给予500μl Chemerin15(0.32ng/kg)或载体(PBS)。2小时、4小时、8小时、16小时、24小时和48小时后，将其人道处死。制备灌洗细胞的等分试样以用于总的和差别的白细胞计数测定。为了确定细胞组成(PMN与单核细胞)，用抗-小鼠2.42G FcμII/III(0.5μg/0.1×10⁶个细胞)阻断细胞10分钟，并用FITC-共轭的抗-小鼠7/4和PE-共轭的抗-小鼠Ly-6G(0.5μg/0.5×10⁶个细胞；克隆rmC5-3和RB6-8C5，分别来自BD Pharmingen)染色(10分钟)。在FACSCalibur流式细胞仪上用CellQuest软件对细胞进行分析。对于每个样品，最少获得10,000个事件。在三个群周围构建门，这三个群是中性白细胞(7/4^高，Ly-6G^高)、单核细胞(7/4^高，Ly-6G^低)和定居巨噬细胞(7/4^低，Ly-6G^低)。测量每个群中的总事件百分比。此外，收集无细胞灌洗液以用于ELISA和Luminex试验。

统计

利用GraphPad Prism软件进行学生氏t检验和一元ANOVA。

P28328BKB-序列表

序列表

<110>ISIS创新有限公司(ISIS Innovation Limited)

<120>炎症和/或内毒素休克的治疗

<130>P28328BKB

<140>PCT/GB2008/001020

<141>2008-0325

<150>GB 0705488.5

<151>2007-03-22

<160>45

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>1

Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala

1 5 10

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>2

Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>3

Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

1 5 10

<210>4

<211>15

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>4

Ala Gly Glu Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala

1 5 10 15

<210>5

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<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>5

Ala Gly Glu Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10 15

<210>6

<211>17

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>6

Ala Gly Glu Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe

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Ser

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>7

Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala

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<210>8

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<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>8

Glu Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala

1 5 10

<210>9

<211>14

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>9

Gly Glu Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala

1 5 10

<210>10

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<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>10

Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10

<210>11

<211>14

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>11

Glu Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10

<210>12

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<212>PRT

<213>Mus sp.

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Gly Glu Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe

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Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

1 5 10

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<212>PRT

<213>Mus sp.

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Glu Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

1 5 10 15

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<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>15

Gly Glu Asp Pro Gis Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

1 5 10 15

<210>16

<211>11

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>16

Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala

1 5 10

<210>17

<211>12

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>17

Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10

<210>18

<211>13

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>18

Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

1 5 10

<210>19

<211>15

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>19

Ala Gly Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala

1 5 10 15

<210>20

<211>16

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>20

Ala Gly Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10 15

<210>21

<211>17

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>21

Ala Gly Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10 15

Ser

<210>22

<211>12

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>22

Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala

1 5 10

<210>23

<211>13

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>23

Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala

1 5 10

<210>24

<211>14

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>24

Gly Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala

1 5 10

<210>25

<211>13

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>25

Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10

<210>26

<211>14

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>26

Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10

<210>27

<211>15

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>27

Gly Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe

1 5 10 15

<210>28

<211>14

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>28

Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

1 5 10

<210>29

<211>15

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>29

Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

1 5 10 15

<210>30

<211>16

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>30

Gly Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

1 5 10 15

<210>31

<211>137

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>31

Glu Leu Thr Glu Ala Gln Arg Arg Gly Leu Gln Val Ala Leu Glu Glu

1 5 10 15

Phe His Lys His Pro Pro Val Gln Trp Ala Phe Gln Glu Thr Ser Val

20 25 30

Glu Ser Ala Val Asp Thr Pro Phe Pro Ala Gly Ile Phe Val Arg Leu

35 40 45

Glu Phe Lys Leu Gln Gln Thr Ser Cys Arg Lys Arg Asp Trp Lys Lys

50 55 60

Pro Glu Cys Lys Val Arg Pro Asn Gly Arg Lys Arg Lys Cys Leu Ala

65 70 75 80

Cys Ile Lys Leu Gly Ser Glu Asp Lys Val Leu Gly Arg Leu Val His

85 90 95

Cys Pro Ile Glu Thr Gln Val Leu Arg Glu Ala Glu Glu His Gln Glu

100 105 110

Thr Gln Cys Leu Arg Val Gln Arg Ala Gly Glu Asp Pro His Ser Phe

115 120 125

Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

130 135

<210>32

<211>143

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>32

Glu Leu Thr Glu Ala Gln Arg Arg Gly Leu Gln Val Ala Leu Glu Glu

1 5 10 15

Phe His Lys His Pro Pro Val Gln Trp Ala Phe Gln Glu Thr Ser Val

20 25 30

Glu Ser Ala Val Asp Thr Pro Phe Pro Ala Gly Ile Phe Val Arg Leu

35 40 45

Glu Phe Lys Leu Gln Gln Thr Ser Cys Arg Lys Arg Asp Trp Lys Lys

50 55 60

Pro Glu Cys Lys Val Arg Pro Asn Gly Arg Lys Arg Lys Cys Leu Ala

65 70 75 80

Cys Ile Lys Leu Gly Ser Glu Asp Lys Val Leu Gly Arg Leu Val His

85 90 95

Cys Pro Ile Glu Thr Gln Val Leu Arg Glu Ala Glu Glu His Gln Glu

100 105 110

Thr Gln Cys Leu Arg Val Gln Arg Ala Gly Glu Asp Pro His Ser Phe

115 120 125

Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser Lys Ala Leu Pro Arg Ser

130 135 140

<210>33

<211>163

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>33

Met Arg Arg Leu Leu Ile Pro Leu Ala Leu Trp Leu Gly Ala Val Gly

1 5 10 15

Val Gly Val Ala Glu Leu Thr Glu Ala Gln Arg Arg Gly Leu Gln Val

20 25 30

Ala Leu Glu Glu Phe His Lys His Pro Pro Val Gln Trp Ala Phe Gln

35 40 45

Glu Thr Ser Val Glu Ser Ala Val Asp Thr Pro Phe Pro Ala Gly Ile

50 55 60

Phe Val Arg Leu Glu Phe Lys Leu Gln Gln Thr Ser Cys Arg Lys Arg

65 70 75 80

Asp Trp Lys Lys Pro Glu Cys Lys Val Arg Pro Asn Gly Arg Lys Arg

85 90 95

Lys Cys Leu Ala Cys Ile Lys Leu Gly Ser Glu Asp Lys Val Leu Gly

100 105 110

Arg Leu Val His Cys Pro Ile Glu Thr Gln Val Leu Arg Glu Ala Glu

115 120 125

Glu His Gln Glu Thr Gln Cys Leu Arg Val Gln Arg Ala Gly Glu Asp

130 135 140

Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser Lys Ala Leu

145 150 155 160

Pro Arg Ser

<210>34

<211>140

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>34

Thr Val Gly Thr Glu Pro Glu Leu Ser Glu Thr Gln Arg Arg Ser Leu

1 5 10 15

Gln Val Ala Leu Glu Glu Phe His Lys His Pro Pro Val Gln Leu Ala

20 25 30

Phe Gln Glu Ile Gly Val Asp Arg Ala Glu Glu Val Leu Phe Ser Ala

35 40 45

Gly Thr Phe Val Arg Leu Glu Phe Lys Leu Gln Gln Thr Asn Cys Pro

50 55 60

Lys Lys Asp Trp Lys Lys Pro Glu Cys Thr Ile Lys Pro Asn Gly Arg

65 70 75 80

Arg Arg Lys Cys Leu Ala Cys Ile Lys Met Asp Pro Lys Gly Lys Ile

85 90 95

Leu Gly Arg Ile Val His Cys Pro Ile Leu Lys Gln Gly Pro Gln Asp

100 105 110

Pro Gln Glu Leu Gln Cys Ile Lys Ile Ala Gln Ala Gly Glu Asp Pro

115 120 125

His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

130 135 140

<210>35

<211>146

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>35

Thr Val Gly Thr Glu Pro Glu Leu Ser Glu Thr Gln Arg Arg Ser Leu

1 5 10 15

Gln Val Ala Leu Glu Glu Phe His Lys His Pro Pro Val Gln Leu Ala

20 25 30

Phe Gln Glu Ile Gly Val Asp Arg Ala Glu Glu Val Leu Phe Ser Ala

35 40 45

Gly Thr Phe Val Arg Leu Glu Phe Lys Leu Gln Gln Thr Asn Cys Pro

50 55 60

Lys Lys Asp Trp Lys Lys Pro Glu Cys Thr Ile Lys Pro Asn Gly Arg

65 70 75 80

Arg Arg Lys Cys Leu Ala Cys Ile Lys Met Asp Pro Lys Gly Lys Ile

85 90 95

Leu Gly Arg Ile Val His Cys Pro Ile Leu Lys Gln Gly Pro Gln Asp

100 105 110

Pro Gln Glu Leu Gln Cys Ile Lys Ile Ala Gln Ala Gly Glu Asp Pro

115 120 125

His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser Arg Ala Leu Arg

130 135 140

Thr Lys

145

<210>36

<211>162

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>36

Met Lys Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ala Leu Trp Leu Gly Thr Arg Gly

1 5 10 15

Thr Val Gly Thr Glu Pro Glu Leu Ser Glu Thr Gln Arg Arg Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ala Leu Glu Glu Phe His Lys His Pro Pro Val Gln Leu Ala

35 40 45

Phe Gln Glu Ile Gly Val Asp Arg Ala Glu Glu Val Leu Phe Ser Ala

50 55 60

Gly Thr Phe Val Arg Leu Glu Phe Lys Leu Gln Gln Thr Asn Cys Pro

65 70 75 80

Lys Lys Asp Trp Lys Lys Pro Glu Cys Thr Ile Lys Pro Asn Gly Arg

85 90 95

Arg Arg Lys Cys Leu Ala Cys Ile Lys Met Asp Pro Lys Gly Lys Ile

100 105 110

Leu Gly Arg Ile Val His Cys Pro Ile Leu Lys Gln Gly Pro Gln Asp

115 120 125

Pro Gln Glu Leu Gln Cys Ile Lys Ile Ala Gln Ala Gly Glu Asp Pro

130 135 140

His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser Arg Ala Leu Arg

145 150 155 160

Thr Lys

<210>37

<211>19

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>37

Ala Gln Ala Gly Glu Asp Pro His Gly Tyr Phe Leu Pro Gly Gln Phe

1 5 10 15

Ala Phe Ser

<210>38

<211>19

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>38

Gln Arg Ala Gly Glu Asp Pro His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe

1 5 10 15

Ala Phe Ser

<210>39

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Scrambled C15

<400>39

Gly Leu Phe His Asp Gln Ala Gly Pro Pro Ala Gly Tyr Glu Phe

1 5 10 15

<210>40

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Mutant C15

<400>40

Ala Gly Glu Asp Pro His Gly Tyr Ala Leu Pro Gly Gln Ala Ala

1 5 10 15

<210>41

<211>6

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>41

Arg Ala Leu Arg Thr Lys

1 5

<210>42

<211>8

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>42

Phe Ser Arg Ala Leu Arg Thr Lys

1 5

<210>43

<211>13

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Modified C13h

<400>43

Phe His Ser Phe Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser

l 5 10

<210>44

<211>19

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>44

Glu Leu Ser Glu Thr Gln Arg Arg Ser Leu Gln Val Ala Leu Glu Glu

1 5 10 15

Phe His Lys

<210>45

<211>20

<212>PRT

<213>Mus sp.

<400>45

Lys Pro Glu Cys Thr Ile Lys Pro Asn Gly Arg Arg Arg Lys Cys Leu

1 5 10 15

Ala Cys Ile Lys

20

Claims

1.衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于治疗炎症的药物中的应用。

2.衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于治疗内毒素休克的药物中的应用。

3.衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于降低一种或多种炎性介质水平的药物中的应用。

4.一种治疗、预防或改善受试者体内的炎症的方法，包括给予所述受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物。

5.一种治疗、预防或改善受试者体内的内毒素休克的方法，包括给予所述受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物。

6.一种降低受试者体内的一种或多种炎性介质的水平的方法，包括给予所述受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物。

7.根据权利要求3所述的应用或权利要求6所述的方法，其中，所述一种或多种炎性介质选自包括TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、G-CSF、MCP-2(CCL8)、GROα(CXCL1)、GROβ(CXCL2)、IL-8(CXCL8)、TECK(CCL25)、MCP-1(CCL2)、干扰素γ和Rantes(CCL5)的组。

8.衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于处理伤口的药物中的应用。

9.一种治疗、预防或改善受试者的伤口的方法，包括给予所述受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物。

10.根据权利要求1、2、3、7或8所述的应用，其中，所述药物用于治疗和/或预防和/或美容应用，或者根据权利要求4、5、6、7或8所述的方法，其中，所述治疗/处理为治疗性的和/或预防性的和/或美容用的。

11.根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽在约5到约30个氨基酸之间。

12.根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽包含衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的约5到约30个氨基酸，或它们的类似物或衍生物。

13.根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽与所述凯莫瑞蛋白的天然存在的C-末端具有至少30％或更高的同一性。

14.根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽与根据Seq ID no：31(人类序列)和Seq ID no：34(小鼠序列)的凯莫瑞蛋白的最后5个至最后30个氨基酸具有至少30％的序列同一性。

15.根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述类似物或衍生物具有包含天然存在的序列的肽的至少约50％的所述抗炎活性、和/或所述抗内毒素休克活性、和/或所述炎性介质水平降低活性。

16.根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽中的一种或多种具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的序列或者为它们的类似物或衍生物；或

根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽中的一种或多种具有Seq ID No：37和38的序列或者为它们的类似物或衍生物。

17.根据权利要求16所述的应用或方法，其中，所述肽与Seq IDNo：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的一种或多种肽具有至少30％的序列同一性；或根据权利要求16所述的应用或方法，其中，所述肽与SeqID No：37或38中的一种或多种肽具有至少30％的序列同一性。

18.根据权利要求1至15中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽类似物或衍生物包含衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽的小分子模拟物。

19.根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽、或它们的类似物或衍生物，旨在以约10pg/kg到约1mg/kg的剂量给药。

20.根据权利要求19所述的应用或方法，其中，所述肽、或它们的类似物或衍生物，旨在以约10pg/kg到约100ng/kg的剂量给药。

21.用一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物浸渍的医学装置。

22.用一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物浸渍的伤口敷料或绷带。

23.一种药物组合物，包含一种或多种选自包括具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的序列的肽以及它们的类似物或衍生物组成的组中的肽、以及药用稀释剂、载体或赋形剂；或

一种药物组合物，包含一种或多种选自包括具有Seq IDNo：37和38的序列的肽及它们的类似物或衍生物组成的组中的肽、以及药用的稀释剂、载体或赋形剂。

24.根据权利要求23所述的组合物在炎症的治疗和/或预防、和/或内毒素休克的治疗和/或预防、和/或用于降低一种或多种炎性介质的水平中的应用。

25.根据权利要求23所述的组合物在处理伤口中的应用。

26.具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的序列的肽或它们的类似物或衍生物；或者具有序列Seq ID No：37或38的肽或它们的类似物或衍生物。

27.一种肽，与具有Seq ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的序列的肽具有至少50％的序列同一性；或

一种肽，与具有Seq ID No：37或38的序列的肽具有至少50％的序列同一性。

28.一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽，或它们的类似物或衍生物，在炎症的治疗和/或预防、和/或内毒素休克的治疗和/或预防、和/或用于降低一种或多种炎性介质如细胞因子和趋化因子的水平；或用于伤口的处理中的应用。