PL236566B1 - Peptyd chemerynowy, kompozycja farmaceutyczna zawierająca taki peptyd, oraz jego zastosowanie - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy peptydów chemerynowych, kompozycji farmaceutycznej zawierającej te peptydy, oraz zastosowanie tych peptydów do leczenia stanów patologicznych nabłonków, w tym w szczególności do stosowania przeciw zakażeniom bakteryjnym i grzybiczym oraz do leczenia chorób związanych z uszkodzeniem lub ze stanem zapalnym skóry, płuc czy przewodu pokarmowego.

Description

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Wynalazek dotyczy peptydów chemerynowych, kompozycji farmaceutycznej zawierającej te peptydy, oraz tych peptydów do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu zakażeń bakteryjnych lub grzybiczych, zwłaszcza dotyczących komórek nabłonkowych, w tym do leczenia chorób związanych ze stanem zapalnym skóry, płuc czy przewodu pokarmowego.

Stan techniki

Znane są peptydy stosowane jako środki farmaceutyczne. Przykładowo w opisie patentowym US nr 6191113 ujawniono peptyd wykazujący aktywność hamującą wzrost komórek mięśni gładkich, a zatem użyteczny w profilaktyce i leczeniu stanów patologicznych związanych ze wzrostem komórek mięśni gładkich, takich jak stwardnienie tętnic, restenoza po plastyce naczyniowej, zwężenie światła po przeszczepie naczynia krwionośnego i mięsak mięśnia gładkiego. W opisie patentowym US nr 6184208 ujawniono inny peptyd, który, jak to stwierdzono, moduluje procesy fizjologiczne, takie jak aktywność przybierania masy nabłonkowej strefy wzrostu i wzrostu włosów.

Chemeryna jest białkowym produktem genu o nazwie TIG2 (ang. Tazarotene-Induced Gene 2). Nazwa TIG2 jest wynikiem indukcji genu dla chemeryny przez tazaroten (pochodną kwasu retinowego), który jest lekiem używanym do leczenia chorób skóry, takich jak łuszczyca czy rak płaskonabłonkowy. Chemeryna jest naturalnym ligandem dla receptora metabotropowego CMKLR1 i jako chemoatraktant uczestniczy w regulacji napływu niektórych komórek układu odporności do miejsc zapalenia (Wittamer 2003, Zabel 2005). Ponadto, chemeryna pełni ważną rolę w regulacji metabolizmu, zarówno poprzez wpływ na różnicowanie komórek tłuszczowych (Bozaoglu 2007, Góralski 2007), jak i kontrolę produkcji i wydzielania insuliny przez komórki trzustki (Takahashi 2011).

Z literatury wiadomo, że głównym miejscem powstawania chemeryny jest wątroba i tkanka tłuszczowa, które mogą być odpowiedzialne za stosunkowo wysokie stężenie tego białka we krwi (nM). Chociaż chemeryna jest również syntetyzowana przez komórki nabłonkowe, w stanach patologicznych skóry takich jak np. łuszczyca dochodzi do drastycznego zahamowania ekspresji tego białka (Nagpal, 1997; Albanesi, 2007). Chemeryna jest syntetyzowana w postaci nieaktywnego prekursora (prochemeryny), która krąży w krwioobiegu. Aktywacja prochemeryny zachodzi dzięki działaniu enzymów proteolitycznych modyfikujących koniec karboksylowy tego białka (Zabel 2006). Sekwencja końca C chemeryny jest kluczowa dla aktywności chemotaktycznej. Enzymami aktywującymi chemerynę mogą być proteazy serynowe i cysteinowe biorące udział w kaskadzie krzepnięcia krwi oraz procesach zapalnych (Zabel 2006).

Proteoliza końca C prochemeryny jest konieczna do ujawnienia aktywności chemotaktycznej, jednakże może również obniżać lub znosić aktywność chemeryny (Zabel 2006). Wyniki te z jednej strony wskazują na proteolityczną modyfikację jako na mechanizm kontrolujący chemotaktyczną aktywność chemeryny, ale z drugiej strony wskazują na podatność chemeryny na proteolizę.

Peptydy antybakteryjne (ang. AntiMicrobial Peptides, AMP) stanowią grupę niskocząsteczkowych (od 20 do 60 aminokwasów) związków powszechnie występujących w naturze (od bakterii do organizmów wielokomórkowych). Cechą charakterystyczną AMP jest ich kationowość (dodatni ładunek elektryczny związany z obecnością takich aminokwasów jak lizyna i arginina) oraz amfipatyczność (polarność w budowie, przy czym jeden z biegunów cząsteczki ma charakter hydrofilowy a drugi hydrofobowy). Wśród AMP produkowanych przez komórki ludzkie najlepiej przebadane są defensyny i katelicydyny (Zasloff 2002).

Defensyny to peptydy antybakteryjne o zwartej strukturze, którą stabilizują 3 mostki dwusiarczkowe. Z kolei, jedyny znany przedstawiciel ludzkich katelicydyn - cząsteczka LL37 - jest uważany za peptyd liniowy, który przyjmuje strukturę alfa helisy w zetknięciu z błoną komórkową bakterii. Konsekwencją tego procesu jest utrata integralności błony bakteryjnej, prowadząca do śmierci mikroorganizmów (Zasloff 2007).

Ze względu na narastającą antybiotykooporność wielu szczepów bakterii, AMP są uważane za związki atrakcyjne pod względem medycznym jako alternatywa dla antybiotyków. Ma to związek ze sposobem działania AMP na bakterie, który opiera się w znacznym stopniu na szybkim „dziurawieniu” błony komórkowej bakterii; co za tym idzie zdolność bakterii do wykształcenia oporności bakterii na te związki jest ograniczona (Zasloff 2007). Dodatkowym argumentem wskazującym na brak oporności bakterii na AMP jest przykład nizyny (AMP) i antybiotyku penicyliny, które zostały odkryte niemal w tym

PL 236 566 B1 samym czasie (lata dwudzieste XX wieku). Nizyna, która powszechnie jest wykorzystywana w konserwacji żywności zachowała do dnia dzisiejszego aktywność antybakteryjną, podczas gdy penicylina jest już nieskuteczna w leczeniu wielu infekcji (Hsu, 2004).

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych AMP o właściwościach przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych, które mogą znaleźć zastosowanie w medycynie.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest peptyd chemerynowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, charakteryzujący się tym, że zawiera od 11 do 37 aminokwasów i posiada sekwencję aminokwasów składającą się z co najmniej 11 kolejnych aminokwasów zawartych we wzorze ogólnym:

X-X-A1 -A2-A3-X-X-A1 -A3-X-X-X-X-X-C-X-A3-A3-X-A1 -A3-X-X-X-C-X-X-A3-X-X-X-A3-A3-A3-A3-C-X, gdzie:

A1 oznacza aminokwas wybrany z grupy: W, Y i F,

A2 oznacza aminokwas wybrany z grupy: L, I i V,

A3 oznacza aminokwas wybrany z grupy: K, R i H,

X oznacza dowolną białkową resztę aminokwasową,

C oznacza cysteinę, przy czym jego sekwencja aminokwasowa została wybrana spośród sekwencji przedstawionych jako Seq Id. No.: 1-15.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna nadająca się do leczenia i zapobiegania zakażeń bakteryjnych i grzybiczych, zwłaszcza dotyczących komórek nabłonkowych, zawierająca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik charakteryzująca się tym, że jako substancję aktywną zawiera peptyd według wynalazku określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również peptyd według wynalazku określony powyżej do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu zakażeń bakteryjnych lub grzybiczych, zwłaszcza dotyczących komórek nabłonkowych. Korzystnie, jest on przeznaczony do podawania na powierzchnię skóry.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dotyczy peptydu o długości co najmniej 11 aminokwasów, wybranego z grupy peptydów pochodzących z białka chemeryny, którego sekwencja zawiera się we wzorze ogólnym: X-X-A1-A2-A3-X-X-A1-A3-X-X-X-X-X-C-X-A3-A3-X-A1-A3-X-X-X-C-X-X-A3-X-X-X-A3-A3-A3-A3-C-X, gdzie:

A1 oznacza aminokwas wybrany z grupy: W, Y i F,

A2 oznacza aminokwas wybrany z grupy: L, I i V,

A3 oznacza aminokwas wybrany z grupy: K, R i H,

X oznacza dowolną resztę aminokwasową,

C oznacza cysteinę oraz ich dopuszczalne farmaceutycznie sole.

Wskazany powyżej wzór ogólny stanowi sekwencję konsensusową i został opracowany w oparciu o sekwencje peptydów pochodzących z ludzkiej chemeryny o potwierdzonej eksperymentalnie aktywności przeciwbakteryjnej, które zostały następnie poddane dalszej analizie bioinformatycznej opisanej szczegółowo w poniższych przykładach wykonania. Dzięki temu należy oczekiwać, że nie obejmuje on przypadkowych peptydów nie posiadających pożądanej aktywności przeciwbakteryjnej. Bazując na ujawnionym wzorze ogólnym specjalista będzie w stanie zaproponować peptydy według wynalazku o sekwencjach innych niż przykładowe Seq Id No.: 1-15.

Peptyd według wynalazku może pokrywać się z peptydem 37 aminokwasowym zgodnym z powyższą sekwencją konsensusową, ale może również stanowić jego krótszy fragment zawierający od 11 do 37 aminokwasów.

Szczególną realizacją wynalazku jest fragment białka chemeryny o sekwencji

GIFVRLEFKL QQTSCRKRDW KKPECKVRPN GRKRKCL.

Kolejną szczególną realizację wynalazku stanowi jeden spośród następujących peptydów:

PL 236 566 Β1

	i i i < >! f i I I II II II e 1 1 1 > ι ι ι ι ι i ι ι i
Nazwa peptydu	Sekwencja
p4	VRLEFKLQQTSCRKRDWKKP
p5	DWKKPECKVRPNGRKRKCLA
c1	VRLEFKLQQTSCRKR
c2	DWKKPECKVRPNGRKRK
c3	GIFVRLEFKLQQTSCRKR
c4	RKRDWKKPECKVRPNGR
c5	QTSCRKRDWKKPECKVRPNGRKRK
c6	VRLEFKLQQTSCRKRDWKKPECK
c7	KLQQTSCRKRDWKK
s1	LKIDWRINNPTCKHKOFRHS
s2	LKFDLRIHDATCKHKQFRHT
s3	FRWNFKWRNPSCRHRHYKQS
s4	VRLEFKLAATSCRKRDWKKP
s5	VRLEFRLQQTSCRRRDWRRP

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca jeden lub więcej peptydów według wynalazku.

W innym przykładzie wykonania, przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie peptydu według wynalazku do wytwarzania leku do zwiększenia ochronnych właściwości komórek nabłonkowych.

Korzystnie, gdy zwiększenie ochronnych właściwości komórek nabłonkowych uzyskuje się poprzez zapobieganie i/lub leczenie chorób bakteryjnych i grzybiczych.

Równie korzystnie, gdy zwiększenie ochronnych właściwości komórek nabłonkowych uzyskuje się poprzez przeciwdziałanie uszkodzeniom lub stanom zapalnym skóry, płuc czy przewodu pokarmowego.

Zaletą zastosowania peptydów chemerynowych jako czynników przeciwbakteryjnych zamiast rekombinowanej chemeryny jest możliwość oddzielenia funkcji przeciwbakteryjnych tego białka od innych funkcji takich jak na przykład chemotaksja. Inne funkcje są bowiem zlokalizowane w innych domenach chemeryny i mogą one powodować niepożądane lub nie dające się przewidzieć skutki podczas leczenia.

Inną zaletą peptydów chemerynowych według wynalazku jest ich mniejsza podatność na degradację przez enzymy proteolityczne. Jak wspomniano powyżej, chemeryna jest wyjątkowo podatna na proteolizę, natomiast mniejsze jej fragmenty będące przedmiotem wynalazku są z założenia bardziej oporne na ten proces. Ponadto fragmenty te, mające mniejszą masę cząsteczkową, mogą łatwiej przenikać do miejsc objętych zakażeniem.

Dodatkową zaletą stosowania peptydów będących przedmiotem wynalazku są konkurencyjne koszty ich syntezy.

Opis figur i tabel zawierających dane eksperymentalne

Przedmiot wzoru przemysłowego został uwidoczniony w przykładzie wykonania na załączonym rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia sekwencję ludzkiej chemeryny;

Fig. 2 przedstawia wzorzec sekwencyjny w formacie PROSITE; Motyw ma długość 37 reszt aminokwasowych i odpowiada sekwencji zaznaczonej na Fig. 1;

Fig. 3 przedstawia sekwencję białka chemeryny, z podkreśleniami pokazującymi pozycję testowanych peptydów w sekwencji białka;

PL 236 566 B1

Fig. 4 przedstawia wyniki wskazujące na to, że chemerynowy peptyd 4 (p4) hamuje wzrost bakterii E. coli; w testach mikrorozcieńczeń (MBD, ang. micotitre broth dilution assay) oraz dyfuzji radialnej (RDA, ang. radial diffusion assay);

Fig. 5 przedstawia wyniki wskazujące na to, że peptyd chemerynowy p4 w stężeniu 100 gM jest bardziej skuteczny niż katelicydyna (LL37) w hamowaniu wzrostu bakterii E. coli i grzybów C. albicans;

Fig. 6 przedstawia wyniki wskazujące na to, że peptyd chemerynowy p4, w stężeniu > 40 gM jest przynajmniej równie skuteczny jak znany czynnik antybakteryjny lizozym w hamowaniu wzrostu bakterii E. coli i grzybów C. albicans;

T a b e l a I przedstawia wyniki wskazujące na to, że peptyd chemerynowy p4 wykazuje szeroką aktywność przeciwbakteryjną, gdyż hamuje 13 (wszystkie testowane) mikroorganizmy, które mogą kolonizować skórę;

Fig. 7 przedstawia wyniki wskazujące na to, że peptyd chemerynowy p4 powoduje lizę bakterii w warunkach zależnych od pH i stężenia NaCI;

Fig. 8 przedstawia rozkład częstości występowania poszczególnych reszt aminokwasowych chemeryny utworzony na podstawie puli peptydów obdarzonych dodatnim ładunkiem i zdolnymi przyjąć strukturę amfipatycznej alfa-helisy lub skręconej beta kartki;

Fig. 9 przedstawia wyniki wskazujące na to, że aminokwasy w sekwencji podstawowej peptydu p4, mogą być zastępowane przez określone aminokwasy oraz, że sekwencja może różnić się długością.

Fig. 10 przedstawia wyniki wskazujące na to, że peptyd p4 hamuje wzrost bakterii in vivo.

Przykład realizacji wynalazku

Synteza peptydów chemerynowych

Efekt przeciwbakteryjny i przeciwgrzybiczny peptydów chemerynowych wykazano w oparciu o badania prowadzone na zsyntetyzowanych 14 peptydach pochodzących z białka chemeryny, każdy o długości około 20 aminokwasów, pokrywających całą sekwencje chemeryny. Umiejscowienie peptydów w strukturze białka chemeryny przedstawiono na Fig. 3, gdzie na górnym panelu zilustrowano całą sekwencję chemeryny, a podkreślenia wskazują pozycję testowanych peptydów w sekwencji białka. Dodatkowo na Fig. 3 kursywą zaznaczono 20-aminokwasowy peptyd sygnałowy. Sekwencja pogrubiona przedstawia peptyd p4 stanowiący podstawę wynalazku.

Sekwencja białka ludzkiej chemeryny została także pokazana na Fig. 1 (numer gi.4506427, oznaczenie rekordu bazy danych NCBI Protein: NP_002880, zakres reszt aminokwasowych od pozycji 63 do 99 o długości 37 aminokwasów zaznaczono kolorem czerwonym). Z kolei na Fig. 2 przedstawiono wzorzec sekwencyjny w formacie PROSITE, gdzie poszczególne pozycje w sekwencji rozdzielone są myślnikiem, X oznacza dowolną resztę aminokwasową, a notacja [nnn] (np. [KRH]) oznacza wystąpienie na danej pozycji wskazanych reszt aminokwasowych (tu: lizyny, argininy i histydyny). Powyższy wzorzec opisuje sekwencje o długości 37 reszt aminokwasowych.

Punktem wyjścia przy konstrukcji wzorca z Fig. 2 był wzorzec sekwencyjny zidentyfikowany przez program MEME dla puli 500 peptydów, których sekwencję wygenerowano komputerowo na podstawie utrwalonych ewolucyjnie podstawień aminokwasowych opisywanych przez macierz punktacji PAM250. W ostatecznym wyrażeniu regularnym (Fig. 2), redukcja informacji o zmienności na poszczególnych pozycjach motywu pozwoliła wskazać te pozycje motywu, które cechują się największą konserwatywnością. Zastosowanie wzorca sekwencyjnego z Fig. 2 do przeszukiwania bazy danych sekwencji aminokwasowych, daje takie same wyniki jak w przypadku profilu sekwencyjnego zidentyfikowanego przez program MEME.

W wydaniu 2012_10 bazy danych Uniprot/Swissprot zawierającym 214 310 sekwencji znajduje się pięć fragmentów sekwencji chemeryny odpowiadających temu wzorcowi (podano sekwencję aminokwasową, gatunek z którego pochodzi sekwencja chemeryny oraz zakres reszt). Małymi literami zaznaczono reszty aminokwasowe oznaczone jako dowolne (X) w zaprezentowanym wzorcu:

giFVRIeFKIqqtsCrKRdWKkpeCkvRpngRKRKCI	człowiek	63-99
giFVRIeFKIqqtsCrKRdWKkpeCkvRpngRKRKCI	orangutan	63-99
gqFVRIeFKIqqtsCrKKdWRkedCkvKpngRKRKCI	wół	63-99
gtFVRIeFKIqqtsCfKKdWKnpeCkiKangRKRKCI	chomik	65-101
gtFVRIeFKIqqtnCpKKdWKkpeCtiKpngRRRKCI	mysz	65-101

PL 236 566 Β1

Miarą unikalności opisywanego wzorca jest przewidywane prawdopodobieństwo uzyskania przypadkowego dopasowania między sekwencją a wzorcem, które dla wydania 2012_10 bazy danych Uniprot/Swissprot jest rzędu 10¹⁰. Oznacza to, że przy 200 000 razy większej liczbie sekwencji w bazie danych (tj. dla ponad 42 mld sekwencji), jedna z sekwencji zostałaby przypadkowo dopasowana do wzorca przedstawionego na Fig. 2.

Przykładowe sekwencje peptydów według wynalazku ilustruje Tabela 1

Tabela 1

Ndzwa peptydu	Sekwern j.i	Luzba amirinkwusow	Ladurek t ałknwity	Względny średni moment hydrofobowy
p4	VRLEFKLQQTSCRKRDWKKP	20	+5	0,375
p5	DWKKPECKVRPNGRKRKCLA	20	+6	0,295
c1	VRLEFKLQQTSCRKR	15	+4	0,625
c2	DWKKPECKVRPNGRKRK	17	+6	0,496
c3	GIFVRLEFKLQQTSCRKR	18	+4	0,476
c4	RKRDWKKPECKVRPNGR	17	+6	0,389
c5	QTSCRKRDWKKPECKVRPNGRK	24	+9	0,322
	RK
c6	VRLEFKLQQTSCRKRDWKKPECK	23	+5	0,238
c7	KLQQTSCRKRDWKK	14	+5	0,137
s1	LKIDWRINNPTCKHKQFRHS	20	+5	0,511
s2	LKFDLRIHDATCKHKQFRHT	20	+4,5	0,521
s3	FRWNFKWRNPSCRHRHYKQS	20	+7	0,511
s4	VRLEFKLAATSCRKRDWKKP	20	+5	0,363
s5	VRLEFRLQQTSCRRRDWRRP	20	+5	0,375

W Tabeli 1 ujęto kilka grup peptydów. Peptydy p4 i p5 pochodzą z ludzkiej chemeryny i są przedmiotem szczegółowej analizy zaprezentowanej na Fig. 3-6. Peptydy c1-c7 pochodzą z sekwencji ludzkiej chemeryny będącej przedmiotem wynalazku. Peptydy s1-s5 są peptydami zaprojektowanymi in silico na podstawie symulowanych podstawień aminokwasowych opisywanych macierzą PAM250 dla peptydu p4. Dla każdego peptydu podano jego sekwencję aminokwasową, długość (liczba reszt aminokwasowych), ładunek całkowity przy pH = 6,0, który charakteryzuje środowisko interfazy woda/błona bakteryjna, oraz względny średni moment hydrofobowy wyznaczony przy założeniu struktury przestrzennej peptydu jako skręconej beta kartki, co odpowiada periodyczności 160 stopni w projekcji Edmundsona.

Hamowanie wzrostu bakterii E. coli przez chemerynowy peptyd 4 (p4)

Zsyntetyzowane chemicznie peptydy chemerynowe p1-p14, obejmujące całą sekwencję chemeryny (Fig. 3) zostały przetestowane pod kątem aktywności przeciwbakteryjnej względem dwóch szczepów bakteryjnych E. coli HB101 (Fig. 4A) oraz E. coli ATCC 25922 (Fig. 4B). Aktywność przeciwbakteryjną peptydów chemerynowych badano za pomocą dwóch standardowych testów: MBD (Fig. 4A) oraz RDA (Fig. 4B, Fig. 4C). W teście MBD bakterie były hodowane w medium MHB do fazy logarytmicznego wzrostu, a następnie inkubowane w medium hodowlanym MHB z zaznaczonymi peptydami w stężeniu 100 μΜ. Po 24 godz. inkubacji bakterie były wysiewane na płytki z agarem i medium MHB, a wyrosłe kolonie liczono. Bakterie bez dodatku peptydów, traktowano jako próbę kontrolną (100%), a uzyskane wyniki przedstawiono jako

PL 236 566 Β1 procent próby kontrolnej. Wyniki testu MBD pokazują średnią uzyskaną z 4 niezależnych doświadczeń wraz z odchyleniem standardowym (Fig. 4A). W teście RDA badano strefę hamowania wzrostu bakterii wysianych na płytkę zawierającą medium TSB z dodatkiem 0,15 M NaCI i agarozy (Fig. 4B) lub jedynie medium TSB i agarozę (Fig. 4C). Peptydy podawano do wyciętych na płytkach studzienek w stężeniu 100 μΜ. Po nocnej inkubacji oceniano stopień zahamowania wzrostu jako strefę przejaśnienia wokół studzienki z peptydem, mierzoną w milimetrach [mm]. Wyniki testu RDA obrazują średnią uzyskaną z 3 niezależnych doświadczeń wraz z odchyleniem standardowym (Fig. 4B, Fig. 4C).

Skuteczność peptydu chemerynowego w hamowaniu wzrostu bakterii

Dodatkowo wykazano, iż peptyd chemerynowy p4 w stężeniu 100 μΜ jest bardziej skuteczny w hamowaniu wzrostu bakterii E. coli i grzybów C. albicans niż katelicydyna LL37 (Fig. 5) i przynajmniej równie skuteczny w stężeniu > 40 μΜ jak lizozym, testowany w porównywalnym stężeniu 40 μΜ (Fig. 6).

Za pomocą testu RDA badano strefę hamowania wzrostu wymienionych mikroorganizmów przez peptyd chemerynowy p4 oraz katelicydynę LL37 (oba związki w stężeniu 100 μΜ). Dodatkowo, porównywano aktywność peptydu chemerynowego p4, w stężeniach od 195 μΜ, 130 μΜ, 40 μΜ, 13 μΜ i 4 μΜ i wykazano porównywalny efekt peptydu chemerynowego p4 w stężeniu 40 μΜ lub silniejszy w stężeniu > 130 μΜ do lizozymu w stężeniu 40 μΜ. Test RDA wykonano jak opisano powyżej. Wyniki testu RDA obrazują średnią uzyskaną z 3 (Fig. 5) lub 2 (Fig. 6) niezależnych doświadczeń i odchylenie standardowe. Gwiazdką zaznaczono wyniki istotne statystycznie (test t studenta, p < 0,005).

Wykazano również, że peptyd chemerynowy hamuje 13 szczepów bakterii, które mogą powodować zakażenia skóry (Tabela I). W teście minimalnych rozcieńczeń wymienione bakterie po osiągnięciu fazy logarytmicznego wzrostu, były inkubowane w 10mM buforze fosforanowym pH 7.4 z dodatkiem 1% TSB przez 2 godz. w 37°C. Do medium dodawano p4 w stężeniach; 100 μΜ, 50 μΜ, 25 μΜ, 12 μΜ, 6 μΜ, 3 μΜ i 1,5 μΜ oraz 0,8 μΜ. Ρο 24 godz. inkubacji bakterie były wysiewane na płytki z agarem, a wyrosłe kolonie liczono. Oznaczano MICtj., najmniejsze stężenie peptydu, w którym osiągnięto 100% zahamowanie wzrostu bakterii.

Wyniki zamieszczone w Tabeli II obrazują średnią uzyskaną z 3 niezależnych doświadczeń wraz z odchyleniem standardowym. Wyniki te świadczą o wszechstronnym działaniu przeciwbakteryjnym peptydu p4.

Dodatkowo, otrzymane wyniki MIC są lepsze lub przynajmniej porównywalne z wartościami MIC innych peptydów przeciwbakteryjnych, takich jak defensyny (Zasloff 2002, 2007).

Tabela 2. Wartości MIC peptydu 4 dla podanych szczepów bakteryjnych zbadane w teście minimalnych rozcieńczeń.

Szczep bakterii	MIC (μΜ)
E. coli HB101	3-6
E. coli AT CC 11775	3-6
S. aureus ATCC 6538	12
S. capitis ATCC 27840	6
S. hominis ATCC 27844	6-12
S. epidermidis ATCC 12228	12
S. epidermidis ATCC 14990	12
P. aeruginosa ATCC 10145	6
Streptococcus infantis ATCC 700779	6
Streptococcus sanguinis ATCC 10556	12
Streptococcus agalactiae ATCC 13813	12
Dermabacter hominis AT CC 49369	12
C. albicans AT CC 24433	6

PL 236 566 B1

Zastosowanie peptydu p4 w stężeniu 10 μΜ skutkowało uwolnieniem białek cytoplazmatycznych do środowiska, co przemawia za perforacją błony komórkowej bakterii E. coli przez peptyd p4. Hamujący wpływ p4 na wzrost E. coli zależy od warunków środowiska takich jak pH oraz zawartość soli (Fig. 6). Wykazano także, że peptyd chemerynowy p4 powoduje lizę bakterii w warunkach zależnych od pH (Fig. 7A) i stężenia NaCI (Fig. 7B).

Peptyd p4 w stężeniu 10 μΜ inkubowano przez 30 min ze szczepem E. coli stabilnie transfekowanym enzymem beta-galaktozydazą. Eksperymenty wykonywano w 20 mM buforze cytrynianowo-fosforanowym o podanym pH oraz buforze fosforanowym pH=7 z dodatkiem wskazanych stężeń NaCI. Kontrolę stanowiły komórki traktowane 1% roztworem Tritonu X100, które uznano za zlizowane w 100%. Aktywność beta galaktozydazy uwolnionej do medium hodowlanego mierzono kalorymetrycznie po dodaniu substratu dla beta-galaktozydazy. Wynik przedstawia średnią z trzech niezależnych doświadczeń wraz z odchyleniem standardowym.

Podsumowując należy stwierdzić, że pochodzący z chemeryny peptyd 4 (p4) i w mniejszym stopniu peptyd 5 (p5), który zawiera fragment wspólny z p4 wykazały silne działanie hamujące wzrost bakterii E. coli w testach mikrorozcieńczeń (MBD) oraz dyfuzji radialnej (RDA), co pokazano na Fig. 4. Peptyd p4 hamował także wzrost innych mikroorganizmów, takich jak: S. aureus, P. aeruginosa oraz C. albicans (Fig. 5), oraz kilku innych szczepów Staphylococcus czy Streptococcus (Tabela 2). Na podkreślenie zasługuje fakt, że wszystkie testowane mikroorganizmy (ogółem 13), które mogą kolonizować skórę, były hamowane przez peptyd chemerynowy p4. Ponadto, peptyd p4 w stężeniu 100 μM wykazywał silniejszy efekt antybakteryjny i przeciwgrzybiczny niż katelicydyna LL37, powszechnie uważana za jeden z najbardziej wszechstronnych i efektywnych AMP (Fig. 5). Równocześnie, peptyd p4 w stężeniu 40 μM działał podobnie do lizozymu (Fig. 6), kolejnego czynnika przeciwbakteryjnego o bardzo dużej skuteczności działania.

Dodatkowo przeprowadzono systematyczną analizę bioinformatyczną sekwencji ludzkiej chemeryny, która polegała na wyznaczeniu dla każdego peptydu (sekwencji kolejnych reszt aminokwasowych chemeryny) o długości między 11 a 37 reszt, wartości całkowitego ładunku przy pH=6,0 oraz względnego średniego momentu hydrofobowego (RMHM). W badaniach wykazano, że oba wymienione parametry są skorelowane z aktywnością przeciwbakteryjną badanych peptydów wywodzących się z sekwencji ludzkiej chemeryny z p < 0,05. Obliczenia RMHM przeprowadzono przy założeniu jednej z dwóch wybranych struktur peptydów: alfa-helisy i skręconej beta kartki. Na podstawie puli peptydów obdarzonych dodatnim ładunkiem i zdolnymi przyjąć strukturę amfipatycznej alfa-helisy (Fig. 8, linia zielona, ładunek peptydu > +2 i RMHM > 0.2) lub skręconej beta kartki (Fig. 8, linia czerwona, ładunek peptydu > +2 i RMHM > 0.2) i niebieska (ładunek peptydu > +3 i RMHM > 0.3), utworzono rozkład częstości występowania peptydów chemerynowych spełniających ww. warunki.

Na podstawie Fig. 8 można stwierdzić, że N-końcowy fragment ludzkiej chemeryny wykazuje preferencje do przyjmowania struktury dwóch amfipatycznych helis, natomiast odcinek sekwencji od reszty 63 do 99 włącznie (który obejmuje całą zastrzeganą sekwencję o długości 37 aminokwasów) cechuje zdolność tworzenia struktury skręconej beta kartki. Pozostaje to w zgodzie z wynikami przewidywania struktury drugorzędowej chemeryny (Cole, 2008). Ponieważ chemeryna jest względnie niewielkim białkiem można założyć, że opisane preferencje strukturalne będą cechować również fragmenty jej sekwencji oddziałujące z błonami lipidowymi. Przeprowadzona analiza jednoznacznie wskazuje, że fragment chemeryny o sekwencji GIFVRLEF KLQQTSCRKR DWKKPECKVR może być źródłem dodatnio naładowanych peptydów potencjalnie silnie oddziałujących z błonami bakteryjnymi, których powierzchnia ma charakter lekko anionowy (pH ok. 6). Analiza struktury przestrzennej przykładoweg o transbłonowego białka bakteryjnego OmpA (PDB ID: 2GE4) wskazuje, że peptyd w konformacji skręconej beta kartki musi mieć długość co najmniej 11 reszt aminokwasowych aby rozciągał się na całą szerokość błony lipidowej (Cierpicki, 2006). Ponieważ zarówno peptyd p4 jak i p5 najprawdopodobniej przyjmują strukturę skręconej beta kartki po związaniu się z błoną lipidową, minimalna długość peptydu chemerynowego o właściwościach przeciwbakteryjnych powinna zatem wynosić 11 reszt aminokwasowych.

Na podstawie uzyskanych wyników eksperymentalnych dotyczących aktywności przeciwbakteryjnej peptydu p4 oraz peptydu p5, jak również opisanych powyżej wyników analiz bioinformatycznych, zaproponowano model aktywnego peptydu przeciwbakteryjnego o długości > 11 < 37, w którym kluczowe są aminokwasy oznaczone jako A1-A3, a X stanowi dowolny aminokwas. Zastrzegany peptyd o długości 37 aminokwasów obejmuje sekwencje peptydów p4 i p5.

PL 236 566 B1

Metodologia postępowania oparta jest na wykorzystaniu wzorca peptydu przeciwbakteryjnego przedstawionego na Fig. 2, o dł. min. 11 i max 37 aminokwasów, w którym pozycje A1, A2 i A3 stanowią pozycje kluczowe wybrane w oparciu o oryginalną sekwencję chemeryny i konieczność zachowania max wartości całkowitego ładunku przy pH = 6,0 oraz względnego średniego momentu hydrofobowego (RMHM). Peptyd jest syntetyzowany chemicznie i testowany przeciwbakteryjnie w testach in vitro (RDA, MBD) i/lub in vivo.

W celu wykazania, że zaproponowany model trafnie przewiduje funkcje przeciwbakteryjne wykonano eksperymenty, których wyniki zilustrowano na Fig. 9. Za pomocą testu RDA, porównano właściwości przeciwbakteryjne peptydu chemerynowego p4, oraz c6, c7 i s4, s5 względem E. coli. Peptyd c6 (23 aminokwasy) i c7 (14 aminokwasów) pochodzą z sekwencji ludzkiej chemeryny. Z kolei, peptydy s4 (QQ podstawione AA) i s5 (wszystkie K zamienione na R) są peptydami zaprojektowanymi in silico na podstawie symulowanych podstawień aminokwasowych opisywanych macierzą PAM250 dla peptydu p4. Testowane peptydy wybrano w ten sposób aby dokonać podstawień w miejscach oznaczonych jako X w sekwencji ogólnej (peptyd s4-podstawienie dotyczy X w pozycji 11 i 12) lub w pozycji kluczowej, tj A3 (peptyd s5-podstawienie dotyczy A3 w pozycji 9, 17, 21 i dodatkowo X w pozycji 22). Uzyskane wyniki potwierdzają wysoką aktywność przeciwbakteryjną wszystkich testowanych analogów p4.

Wyniki uzyskane dla peptydu c6 i c7, wskazują, że zmiana długości peptydu pozwala zachować aktywność antybakteryjną cechującą peptyd p4. Z drugiej strony, nie zmieniając długości peptydu, a dokonując podstawień punktowych, których charakter wynika z przeprowadzonych analiz in silico i jest zgodny z zastrzeganym wzorcem sekwencyjnym (Fig. 2), pokazano, że aktywność syntetycznych peptydów s4 i s5 dorównuje lub nawet nieznacznie przewyższa aktywność peptydu p4 (Fig. 9).

Hamowanie wzrostu bakterii przez peptyd p4 w środowisku skóry.

W celu zbadania czy peptyd chemerynowy p4 hamuje wzrost bakterii in vivo, wykorzystano myszy z genetycznym deficytem chemeryny (KO) i odpowiadające im pod względem szczepu, płci i wieku myszy C57BI6 (oznaczone jako WT), które zawierają chemerynę w skórze. Myszy z całkowitym deficytem chemeryny, stanowią dogodny model do badań podatności skóry na zakażenia bakteryjne w przypadku kiedy ekspresja chemeryny ulega zahamowaniu, tak jak ma to miejsce w przypadku niektórych chorób skóry u ludzi, np. łuszczycy. Z kolei, w przypadku myszy WT, badano w jaki sposób dodatek peptydu p4, wpływa na zdolności nabłonka do hamowania wzrostu bakterii, w środowisku w którym występuje endogenna chemeryna. Na ogoloną skórę grzbietu myszy KO i WT przyklejono uszczelkę gumową o średnicy około 1 cm, która utworzyła komorę inkubacyjną, w której skóra stanowiła dno komory. Do komory podano 5 μl peptydu p4 w stężeniu 1 mM w buforze fosforanowym (lub sam bufor) i po wyschnięciu, bakterie S. aureus (10⁷ CFU 10 w objętości 45 μl). Ze względu na to, że objętość roztworu w którym podano peptyd stanowiła 1/10 całkowitej objętości roztworu umieszczonego w komorze, końcowe stężenie peptydu p4 w komorze inkubacyjnej wyniosło 100 μM. Po 24 godz. inkubacji, płyn usunięto i wysiano na płytki z agarem w celu policzenia kolonii bakterii. Uzyskane wyniki wyrażono jako % kontroli (liczby nad słupkami), którą stanowiły bakterie S. aureus hodowane równolegle in vitro (Fig. 10). W warunkach in vitro, wzrost bakterii nie był hamowany przez czynniki przeciwbakteryjne obecne w skórze myszy dlatego ilość koloni bakterii hodowanych in vitro oznaczono jako 100%. Wyniki (Fig. 10) przedstawią średnią z dwóch pomiarów uzyskanych w jednym doświadczeniu i są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Wyniki wskazują, na silnie działanie przeciwbakteryjne peptydu chemerynowego p4 w środowisku skóry, zarówno pozbawionych chemeryny (spadek z 86% do 0.36%) jak i posiadających chemerynę (spadek z 0.75% do 0.12%).

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Peptyd chemerynowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, znamienny tym, że zawiera od 11 do 37 aminokwasów i posiada sekwencję aminokwasów składającą się z co najmniej 11 kolejnych aminokwasów zawartych we wzorze ogólnym: X-X-A1-A2-A3-X-X-A1-A3-X-X-X-X-X-C-X-A3-A3-X-A1-A3-X-X-X-C-X-X-A3-X-X-X-A3-A3A3-A3-C-X, gdzie:

   A1 oznacza aminokwas wybrany z grupy: W, Y i F,

   A2 oznacza aminokwas wybrany z grupy: L, I i V,

   A3 oznacza aminokwas wybrany z grupy: K, R i H,

   PL 236 566 B1

   X oznacza dowolną resztę aminokwasową,

   C oznacza cysteinę przy czym jego sekwencja aminokwasowa została wybrana spośród sekwencji przedstawionych jako Seq Id. No.: 1-15.
2. 2. Kompozycja farmaceutyczna nadająca się do leczenia i zapobiegania zakażeń bakteryjnych i grzybiczych, zwłaszcza dotyczących komórek nabłonkowych, zawierająca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera peptyd określony w zastrz. 1.
3. 3. Peptyd określony w zastrz. 1 do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu zakażeń bakteryjnych lub grzybiczych, zwłaszcza dotyczących komórek nabłonkowych.
4. 4. Peptyd do stosowania według zastrz. 3, znamienny tym, że jest przeznaczony do podawania na powierzchnię skóry.